ES2746230T3 - Producción de materias primas no tóxicas y productos terminados sometidos a prueba por medio de un método basado en bacterias probióticas innovador para determinar la toxicidad hacia las bacterias probióticas - Google Patents
Producción de materias primas no tóxicas y productos terminados sometidos a prueba por medio de un método basado en bacterias probióticas innovador para determinar la toxicidad hacia las bacterias probióticas Download PDFInfo
- Publication number
- ES2746230T3 ES2746230T3 ES14761689T ES14761689T ES2746230T3 ES 2746230 T3 ES2746230 T3 ES 2746230T3 ES 14761689 T ES14761689 T ES 14761689T ES 14761689 T ES14761689 T ES 14761689T ES 2746230 T3 ES2746230 T3 ES 2746230T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- probiotic
- toxicity
- raw material
- food
- bacterial strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/02—Food
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/335—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Lactobacillus (G)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Método para determinar la toxicidad de una materia prima alimenticia o farmacéutica que comprende una primera etapa en la que una materia prima alimenticia o farmacéutica se pone en contacto con una carga bacteriana preestablecida de una cepa bacteriana probiótica usada como marcador de toxicidad y una segunda etapa de determinación de la reducción de dicha carga bacteriana debido a la toxicidad ejercida por dicha materia prima alimenticia o farmacéutica hacia dicha cepa bacteriana probiótica, en el que dicha primera etapa comprende preparar: - una primera muestra de prueba que comprende el marcador de la cepa bacteriana probiótica a una concentración preestablecida, preferiblemente a una concentración comprendida de desde 1x106 hasta 1x109 UFC/g, el sustrato de cultivo óptimo para el crecimiento de dicha cepa bacteriana probiótica y la materia prima alimenticia o farmacéutica que va a someterse a prueba, y - una segunda muestra de prueba (referencia interna) que comprende la misma cepa bacteriana probiótica de dicha primera muestra a la misma concentración preestablecida y el sustrato de cultivo óptimo para el crecimiento de dicha cepa bacteriana probiótica y en el que dicha segunda etapa comprende realizar un recuento bacteriano en dichas muestras de prueba primera y segunda para proporcionar un recuento de las bacterias que sobrevivieron en contacto con la materia prima y para expresar el % de mortalidad inducida por dicha materia prima en la cepa probiótica usada como marcador, en el que la cepa bacteriana probiótica usada como marcador de toxicidad se selecciona de.
Description
DESCRIPCIÓN
Producción de materias primas no tóxicas y productos terminados sometidos a prueba por medio de un método basado en bacterias probióticas innovador para determinar la toxicidad hacia las bacterias probióticas
La presente memoria descriptiva divulga un método para la producción de materias primas y de productos terminados destinados a las industrias alimentaria y farmacéutica y carentes de toxicidad, que es detectable por medio de un método innovador - basado en bacterias probióticas - para analizar la toxicidad hacia las bacterias probióticas.
Los documentos CN 102304482A y CN 102268471A divulgan una cepa de Bifidobacterium longum LJM002, que es ultrasensible a acefato y es una cepa de trabajo para detectar el residuo de esta sustancia en alimentos y un método de microorganismos para detectar el residuo de acefato en alimentos.
Todos los materiales o las sustancias que están en la base de la fabricación y producción de otros productos a través del uso de procedimientos de procesamiento e industriales apropiados que permiten que se obtenga el producto final deseado se consideran materias primas.
Las materias primas usadas en la producción de productos o complementos alimenticios o dispositivos médicos o productos farmacéuticos incluyen, a modo de ejemplo, aromatizantes, extractos, coformulantes de origen orgánico y/o inorgánico, aditivos tecnológicos, vitaminas, proteínas, aminoácidos, peptonas, polímeros naturales y/o sintéticos y todavía más.
A modo de un ejemplo ilustrativo y por tanto no exhaustivo, pueden prepararse aromatizantes y/o extractos a partir de plantas y/o su fruto.
Se conoce bien que las plantas que tienen frutos y el fruto en sí mismo se tratan actualmente, por ejemplo, con sustancias químicas para protegerlos frente a los ataques de microorganismos u hongos o insectos de manera que permiten que el fruto crezca hasta que alcanza la madurez fisiológica y luego se recogen y se consumen.
De manera similar, se conocen bien los siguientes tratamientos citados, una parte de las sustancias químicas usadas permanece adsorbida sobre la superficie exterior del fruto, denominada comúnmente piel o cáscara. Las sustancias químicas que se adsorben también persisten en los sucesivos lavados del fruto con agua.
La piel (exocarpio) es la capa externa protectora de un fruto (epidermis, a su vez compuesta de cutícula y tejido esclerenquimático) o un vegetal que puede desprenderse. La capa externa protectora también se denomina de manera indebida cáscara.
Además, no puede excluirse que una parte de las sustancias químicas adsorbidas sobre la superficie exterior del fruto puede penetrar en el fruto en sí mismo (en la pulpa) como resultado de la absorción de dichas sustancias químicas desde el exterior hacia el interior del fruto.
Actualmente, se usa parte del fruto recogido para producir extractos y/o aromatizantes vegetales naturales (materias primas) que tienen aplicación en las industrias alimentaria, farmacéutica y nutricéutica.
Habitualmente, los extractos y/o aromatizantes vegetales naturales se obtienen mediante extracción mecánica y/o química a partir del fruto completo (piel y pulpa) o a partir de la piel y/o pulpa tratadas por separado, por medio del equipo y/o de las técnicas conocidas por el experto en la técnica.
Por ejemplo, en el caso de aromatizantes y/o extractos y/o compuestos orgánicos obtenidos mediante extracción con disolventes, puede producirse que incluso llevando a cabo varias etapas de lavado con agua y/o disolventes químicos no se logre eliminar completamente todo el disolvente usado; por tanto, incluso una presencia mínima puede provocar toxicidad a las bacterias probióticas.
Por tanto, es deseable ser capaces de tener un método que tenga alta sensibilidad y capaz de identificar hasta cuando existe una toxicidad residual en una sustancia o una materia prima dada para programar los procedimientos de purificación o lavado o precipitación que van a usarse para presentar la materia prima libre de toxicidad a las bacterias probióticas.
Lo mismo se aplica con referencia a un extracto de proteínas o con referencia a la preparación de aminoácidos. En este caso también se usan reactivos y/o disolventes químicos que pueden quedar como residuo y provocar toxicidad a las bacterias probióticas.
El mismo problema también puede presentarse con referencia a materias primas inorgánicas, tales como, por ejemplo dióxido de silicio, usado ampliamente para formular productos terminados.
Con referencia tanto a extractos y/o aromatizantes vegetales naturales obtenidos mediante extracción mecánica y/o química y con referencia a las otras materias primas mencionadas anteriormente, preparados por medio de procedimientos de síntesis y/o extracción, no puede ignorarse el hecho de que pueden permanecer, dentro de la materia prima, cantidades mínimas de sustancias o compuestos dotados de una naturaleza “tóxica” que confiere una determinada toxicidad intrínseca a la materia prima por sí misma.
Por tanto, con referencia a extractos vegetales naturales y/o con referencia a las otras materias primas mencionadas anteriormente, no puede excluirse la presencia de sustancias tóxicas dentro de ellos en una cantidad variable que puede depender del tipo de cultivo adoptado para el fruto y/o las condiciones de operación adoptadas para llevar a cabo la extracción mecánica y/o química.
En cualquier caso, cualquier sustancia tóxica presente en los extractos y/o aromatizantes vegetales naturales y/o las materias primas en general puede dar lugar a dos tipos de problemas: uno indirecto y uno directo.
El primero, o problema indirecto, se refiere a la influencia que la ingestión de dichas sustancias tóxicas puede tener en la alteración de la microflora probiótica intestinal y, por tanto, también en la fisiología del aparato digestivo, hasta el punto de influir en la absorción de vitaminas, péptidos bioactivos y metabolitos, y de manera similar permite la producción de aminas biogénicas dañinas, que se conoce que alteran la permeabilidad intestinal y crean una serie completa de problemas de salud, incluso llegando a la producción de nitrosamina, unas sustancias carginogénicas bien conocidas, produciéndose dichas aminas biogénicas por cepas que se han beneficiado de esta alteración. A este respecto, debe destacarse que, si la flora probiótica bacteriana se altera como resultado de un aumento en la colonización de bacterias patogénicas coliformes, tales como, por ejemplo E. coli, dotadas con propiedades de descarboxilación capaces de transformar un aminoácido en una amina eliminando el grupo carboxilo, se producen cantidades anómalas de aminas biogénicas dañinas.
Además, un desequilibrio en la microflora intestinal parece ser capaz de contribuir a la aparición de diversas patologías: diabetes y enfermedades autoinmunitarias o, como se ha hipotetizado, desempeña un papel en las respuestas inmunitarias locales y sistémicas desequilibradas a determinados alérgenos alimenticios.
El segundo, o problema directo, implica los efectos que dichas sustancias tóxicas, todavía capaces de destruir las células de bacterias probióticas, pueden tener en individuos de infancia o en la fase de crecimiento debido a una acción tóxica inmediata y/o acumulada, no sólo contra células bacterianas sino también contra células eucariotas, particularmente sensibles en las fases de diferenciación y crecimiento.
Por tanto, permanece una necesidad de ser capaces de producir materias primas y productos terminados de una manera sin duda no tóxica y de tener un método para determinar la toxicidad de un extracto y/o un aromatizante y/o una materia prima en general que es seguro, simple y práctico para su uso, económico y que puede repetirse. En particular, permanece una necesidad de tener un método para determinar la toxicidad hacia las bacterias probióticas de los componentes individuales que constituyen un producto terminado tal como un alimento, un complemento, o un dispositivo médico o un fármaco.
El solicitante ha encontrado una manera innovadora de producir materias primas y productos terminados no tóxicos, sometiendo los extractos y/o aromatizantes y/o las materias primas en general a una nueva prueba de toxicidad para determinar su toxicidad hacia las bacterias probióticas.
El contenido de la presente invención es un método para producir materias primas y productos terminados no tóxicos gracias a la posibilidad, proporcionada por el solicitante, de ser capaces de determinar la toxicidad hacia las bacterias probióticas presentes en dichas materias primas y productos terminados por medio de un método innovador que de manera similar forma el contenido de la presente invención.
El solicitante ha encontrado que la toxicidad determinada con el método de la presente invención depende no sólo de la materia prima usada per se, sino también, y sobre todo, del tipo de extracción mecánica y/o química usada para producir dicha materia prima. De hecho, la extracción química de una materia prima puede implicar el uso de disolventes químicos, y algunas etapas de lavado o precipitación que pueden dejar toxicidad residual en la propia materia prima.
El método comprende una etapa en la que la cepa bacteriana probiótica (marcador de toxicidad) se pone en contacto con una materia prima que va a someterse a prueba usando una cantidad de materia prima igual a la que se usa normalmente en la formulación.
En términos prácticos, se prepara una primera muestra que comprende la cepa bacteriana probiótica (marcador de toxicidad), el sustrato de cultivo óptimo para dicha cepa bacteriana probiótica y la materia prima que va a someterse a prueba. Luego se prepara una segunda muestra (referencia interna) que comprende la misma cepa bacteriana probiótica usada en dicha primera muestra (marcador de toxicidad) y sólo el sustrato de cultivo óptimo (sin la materia
prima que va a someterse a prueba).
La determinación tiene lugar por medio de un recuento bacteriano en placa de dicha primera muestra y dicha segunda muestra, tal como se describe a continuación.
La razón entre el recuento bacteriano (número de células contadas sobre la placa) de dicha primera muestra y el recuento bacteriano (número de células sobre la placa) de dicha segunda muestra proporciona un número menor de 1 que, si se expresa como porcentaje, proporciona un recuento de las bacterias que sobrevivieron en contacto con la materia prima y, por tanto, también expresa el % de mortalidad inducida por dicha materia prima en las cepas bacterianas probióticas usadas como marcador.
Una primera realización se refiere a la determinación de la toxicidad de una materia prima, tal como, por ejemplo, un extracto y/o aromatizante vegetal natural y/o una materia prima en general.
En este caso, la prueba de toxicidad hacia las bacterias probióticas implica la preparación de dos pruebas en el laboratorio, tal como se describió anteriormente.
En términos prácticos, se prepara una primera muestra que comprende la cepa bacteriana probiótica (marcador de toxicidad), el sustrato de cultivo óptimo para dicha cepa bacteriana probiótica y la materia prima que va a someterse a prueba.
Luego se prepara una segunda muestra (referencia interna) que comprende la misma cepa bacteriana probiótica usada en dicha primera muestra (marcador de toxicidad) y sólo el sustrato de cultivo óptimo (sin la materia prima que va a someterse a prueba).
La determinación tiene lugar por medio de un recuento bacteriano en placa de dicha primera muestra y dicha segunda muestra, tal como se describe a continuación.
Preferiblemente, se realizan dicha prueba primera y segunda en paralelo en las mismas condiciones de operación. La razón entre el recuento bacteriano (número de células contadas sobre la placa) de dicha primera muestra y el recuento bacteriano (número de células sobre la placa) de dicha segunda muestra proporciona un número menor que 1 que, si se expresa como porcentaje, proporciona un recuento de las bacterias que sobrevivieron en contacto con la materia prima y, por tanto, también expresa el % de mortalidad inducida por dicha materia prima en las cepas bacterianas probióticas usadas como marcador.
La diferencia entre el recuento bacteriano realizado en dicha primera prueba y el recuento bacteriano realizado en dicha segunda prueba proporciona un porcentaje de mortalidad bacteriana que proporciona una indicación de la toxicidad hacia las bacterias probióticas asociada con dicha materia prima.
El solicitante, por medio de un ejemplo no exhaustivo, sometió a prueba varios aromatizantes y extractos presentes en el mercado, tales como, por ejemplo, aromatizantes de limón y arándano, que se usan también en la preparación de productos terminados. El objetivo de estas pruebas era verificar si dichos alimentos o materias primas (aromatizantes de limón y arándano) poseían una toxicidad intrínseca hacia las bacterias probióticas.
Por esta razón, dichas materias primas (aromatizantes de limón y arándano) se pusieron en contacto con cepas dadas de bacterias lácticas o bifidobacterias probióticas en condiciones de operación particulares.
Las cepas bacterianas probióticas usadas como marcador de toxicidad en el método de la presente invención pertenecen a las especies seleccionadas de los grupos que comprenden lactobacilos y bifidobacterias. La presente invención contempla el uso de una cepa bacteriana entre las enumeradas en la tabla 1.
Las pruebas realizadas en dichos alimentos o materias primas (aromatizantes de limón y arándano) mostraron una toxicidad aguda hacia las cepas bacterianas probióticas usadas como marcadores de toxicidad. En términos prácticos, se sometieron a prueba dos extractos de limón (materia prima) y dos extractos de arándano (materia prima) de diferentes proveedores. Fue posible verificar que un primer extracto de limón y uno segundo de arándano provocaron una toxicidad aguda, el 57% y el 58% de mortalidad, respectivamente, hacia las cepas bacterianas probióticas usadas que tenían una carga teórica inicial de 6x109 UFC/g. Las pruebas se realizaron usando la cepa bacteriana probiótica Lactobacillus acidophilus LA02 LMG P-21381 depositada por la compañía Anidral Srl el 31.01.2002, y la cepa bacteriana probiótica Bifidobacterium animalis subsp. Lactis BS01 LMG P-21384 depositada por la compañía Anidral Srl el 31.01.2002.
En este punto, el solicitante repitió las pruebas anteriores usando, en lugar de los aromatizantes de arándano y limón presentes en el mercado, aromatizantes obtenidos sólo a partir de la pulpa del fruto (limón y arándano) mediante prensado suave. En términos prácticos, en el caso tanto del limón como del arándano, la piel se separó de la pulpa de antemano y sólo la última se sometió a extracción mecánica en condiciones suaves, usando equipos y métodos conocidos por el experto en la técnica. En este caso, con los extractos/materias primas obtenidos de la extracción de la pulpa en condiciones suaves, se encontró que la toxicidad hacia las bacterias probióticas era inexistente; de hecho, usando una carga inicial de la cepa bacteriana probiótica igual a 6,7x109 UFC/g, se obtuvieron 6,5x109 UFC/g con zumo de arándano y 6,4x109 UFC/g con zumo de limón, por tanto valores mucho mejores que en el caso previo con muy baja toxicidad y una mortalidad cercana a cero.
Otras materias primas se sometieron a prueba de la misma manera que los extractos de limón y arándano, tal como se describe a continuación.
El solicitante sometió a prueba varios productos terminados presentes en el mercado con el objetivo de determinar el grado de toxicidad hacia las bacterias probióticas e identificar, entre las materias primas usadas en dichos productos terminados, cuáles de las materias primas usadas contribuyeron más a la toxicidad.
En una realización preferida, se determinó la toxicidad de una materia prima hacia las bacterias probióticas, siendo la materia prima por ejemplo un extracto y/o un aromatizante que está dentro de una formulación de un producto terminado que tiene, por ejemplo, un total de 5 componentes.
En este caso, la prueba de toxicidad implica la preparación de varias pruebas en el laboratorio igual al número de componentes - en este caso a modo de ejemplo existen 5 componentes, más las referencias analíticas.
Para mostrar la potencialidad de la presente invención, el solicitante sometió a prueba una serie de muestras de extracto de arándano europeo que va a usarse en la preparación de un producto terminado, por ejemplo P1.
Se determinó la toxicidad de la materia prima, el extracto de arándano europeo (lote L1, lote L2, de cuatro proveedores diferentes) que puede estar presente junto con otros componentes/ingredientes dentro de un producto terminado (P1).
En este caso, se prepararon dos pruebas. En una primera prueba, se preparó una mezcla que consistía en una cepa bacteriana probiótica, por ejemplo LS01 (usada como el marcador de toxicidad). Esta primer prueba representa la referencia analítica interna - Ref. 1. El recuento bacteriano teórico esperado fue igual a 25 DLM/dosis (referencia interna).
En una segunda prueba, se preparó una mezcla que contenía la cepa bacteriana probiótica LS01 (usada como el marcador de toxicidad) junto con un primer extracto de arándano europeo - L1 y L2, en dicho producto terminado, de diferentes proveedores.
Dichos recuentos bacterianos primero y segundo se realizaron en paralelo en las mismas condiciones de operación y con las mismas cantidades que las presentes en dicho producto terminado.
Posteriormente, se determinaron el recuento bacteriano real de dicha primera prueba -Ref. 1 y el recuento bacteriano de dicha segunda prueba. El recuento bacteriano se llevó a cabo adoptando las mismas condiciones de operación.
Proveedor V: lote 1 (L1) y lote 2 (L2) -arándano europeo Var.
Proveedor V: lote 1 (L1) y lote 2 (L2) -arándano europeo Var.
Proveedor K: lote 1 (L1) y lote 2 (L2) -arándano europeo Kem.
Proveedor K: lote 1 (L1) y lote 2 (L2) -arándano europeo Kem.
Proveedor P: lote 1 (L1) y lote 2 (L2) -arándano europeo Pac.
Proveedor P: lote 1 (L1) y lote 2 (L2) -arándano europeo Pac.
Proveedor N: lote 1 (L1) y lote 2 (L2) -arándano europeo Nut.
Proveedor N: lote 1 (L1) y lote 2 (L2) -arándano europeo Nut.
Los diversos suministros (lotes) de la materia prima, el arándano europeo, se introdujeron en la mezcla para la prueba de toxicidad basándose en su contenido de proantocianidina (al menos el 1,5% (HPLC)), para asegurar la misma concentración de ese componente en el producto terminado P1.
Tabla 2
La pruebas de la tabla 2 también se repitieron con las cepas bacterianas probióticas indicadas en la tabla 1 con los números 9, 33, 39, 46, 54, 59, 73, 84, 95, 101, 116, 130, 138, 143, 169 y 185, y los resultados obtenidos fueron muy similares a los mostrados en la tabla 2.
La diferencia entre el recuento bacteriano realizado en dicha primera prueba -Ref.1 y el recuento bacteriano realizado en dicha segunda prueba proporciona un porcentaje de mortalidad de la cepa bacteriana probiótica LS01, que proporciona una indicación de la toxicidad de dicho extracto de arándano europeo hacia dicha cepa.
La carga celular viable obtenida a partir del recuento bacteriano, tal como se determina en dicha primera prueba y en dicha segunda prueba, hace posible establecer si la materia prima sometida a prueba ejerce un efecto tóxico sobre las células de la cepa bacteriana probiótica LS01 presente en dicho producto terminado P1.
La disminución del porcentaje en el recuento bacteriano en comparación con la referencia -Ref.1 se expresa como el % de mortalidad inducida por la materia prima sometida a la prueba de toxicidad de la presente invención.
El solicitante aplicó además el método descrito anteriormente a extractos de limón y arándano presentes en un producto terminado, obteniendo resultados comparables a los obtenidos anteriormente con el arándano europeo. La tabla 2 muestra que existen extractos, por ejemplo el extracto de arándano europeo, que se usa comúnmente para formular productos terminados - pero la misma consideración también se aplica con referencia a otras materias primas - que confieren toxicidad a los productos terminados y, por consiguiente, también al cuerpo de individuos que usan dichos productos terminados.
Por tanto, con la presente invención es posible desarrollar formulaciones de productos terminados tales como
complementos alimenticios o dispositivos médicos o productos farmacéuticos exentos de toxicidad o con toxicidad enormemente reducida, ya que es posible identificar si las materias primas usadas confieren toxicidad hacia las bacterias probióticas.
En el contexto de la presente invención, una disminución del porcentaje en la carga bacteriana en comparación con la referencia interna [(Recuento bacteriano de la muestra de prueba)/(Recuento bacteriano de la referencia interna)] = % de mortalidad inducida por la materia prima, comprendido desde el 1 hasta el 5% significa que no hay mortalidad; un valor comprendido desde más del 5 hasta el 15% significa una mortalidad baja, todavía aceptable; un valor comprendido desde más del 15 hasta el 25% significa mortalidad media-alta, mientras que más allá del 25 % se enfrenta a mortalidad aguda.
El método de la presente invención tiene una aplicación válida, por ejemplo, en la prueba para determinar la presencia de excipientes o materias primas tóxicos usados en las formulaciones de complementos y dispositivos médicos (productos terminados tales como, por ejemplo, aromatizante de naranja, extracto de cártamo, zanahoria negra, arándano etc.).
El método de la presente invención se ilustra a continuación a modo de ejemplo y por tanto no se limita el alcance de la presente invención.
En una realización preferida, en el caso de un producto terminado que contiene, por ejemplo, los siguientes componentes A, B, C (formulación completa A+B+C), el método de la presente invención puede usarse para determinar si el producto terminado como un conjunto (A+B+C) ejerce toxicidad hacia las cepas bacterianas probióticas.
En este caso, la prueba de la toxicidad hacia las bacterias probióticas implica la preparación de dos pruebas en el laboratorio.
En términos prácticos, se prepara una primera muestra que comprende la cepa bacteriana probiótica (marcador de toxicidad), el sustrato de cultivo óptimo para dicha cepa bacteriana probiótica y la materia prima que va a someterse a prueba, en este caso la formulación A+B+C.
Luego se prepara una segunda muestra (referencia interna) que comprende la misma cepa bacteriana probiótica usada en dicha primera muestra (marcador de toxicidad) y sólo el sustrato de cultivo óptimo (sin la materia prima que va a someterse a prueba).
La determinación tiene lugar por medio de un recuento bacteriano en placa de dicha primera muestra y dicha segunda muestra.
Preferiblemente, se realizan dichas pruebas primera y segunda en paralelo en las mismas condiciones de operación. Si la razón entre el recuento bacteriano (número de células contadas sobre la placa) de dicha primera muestra y el recuento bacteriano (número de células contadas sobre la placa) de dicha segunda muestra proporciona un número menor de 1, por ejemplo 0,55 (o el 55%), significa que el recuento de las bacterias que han sobrevivido en contacto con la materia prima es del 55% y, por tanto, el % de mortalidad inducida por A+B+C en la cepa bacteriana probiótica usada como marcador es del 45%.
Si, de manera precisa, emerge una toxicidad hacia la cepa bacteriana probiótica usada como marcador, la siguiente etapa es ir y determinar cuál de los componentes A, B y C que constituyen el producto terminado (A+B+C), ejerce la toxicidad detectada.
En este caso, el método implica la preparación de tres pruebas (prueba 1, prueba 2 y prueba 3) tal como se especifica a continuación.
Por ejemplo, la prueba 1 se realiza sobre la materia prima A e implica la preparación de las siguientes muestras: (i) Se prepara una primera muestra que comprende la cepa bacteriana probiótica (marcador de toxicidad), el sustrato de cultivo óptimo para dicha cepa bacteriana probiótica y la materia prima que va a someterse a prueba, en este caso A.
(ii) Se prepara una segunda muestra (referencia interna) que comprende la misma cepa bacteriana probiótica usada en dicha primera muestra (marcador de toxicidad) y sólo el sustrato de cultivo óptimo (sin la materia prima que va a someterse a prueba).
(iii) Se realiza un recuento bacteriano en placa sobre dicha primera muestra y dicha segunda muestra.
(iv) Se determina el porcentaje de mortalidad.
De manera análoga, se preparan la prueba 2 con la materia prima B y la prueba 3 con la materia prima C con el mismo método. De esta manera, es posible identificar cuál, entre los componentes A, B y C presentes en la formulación A+B+C, es el componente que ejerce toxicidad hacia las cepas bacterianas probióticas. Las pruebas de toxicidad se realizan en las mismas condiciones de operación y a las concentraciones indicadas en el enfoque secuencial de producto terminado.
Para el recuento en placa se sigue el método, descrito a continuación a modo de ejemplo no limitativo de un método de prueba, que comprende un recuento microbiológico tradicional con resuspensión inicial de la muestra, diluciones en serie en un diluyente adecuado, la siembra en placa sobre medio agarizado y un recuento de colonias después de la incubación en condiciones óptimas. Los excipientes/materias primas que determinan una mortalidad en placa comparable con la de la muestra de referencia deben considerarse conformes (toxicidad reducida o ninguna toxicidad).
Tal como se indicó anteriormente, se realiza un recuento total, diferencial y/o selectivo (en un medio agarizado) de bacterias lácticas y bifidobacterias para uso probiótico, presentes solas o en mezcla en la muestra que va a someterse a una determinación de la concentración de células vivas, viables.
La formulación del medio de cultivo es tal como para asegurar el crecimiento de todas las diversas especies de bacterias probióticas que pertenecen a los grupos microbianos mencionados anteriormente y para permitir, si es necesario, que se discriminen añadiendo agentes selectivos (generalmente antibióticos y/o azúcares) o uno diferencial (generalmente indicadores de cambio de color de pH y/o redox).
El método proporciona para el uso del medio agarizado LAPTg, cuya formulación consiste sólo en la presencia de dos fuentes de nitrógeno diferentes, un azúcar como una fuente de carbono y extracto de levadura como fuente de vitaminas del grupo B y factores de crecimiento. La ausencia de sales orgánicas e inorgánicas y sustancias con acción selectiva permite un crecimiento floreciente de todas las diversas especies de bacterias probióticas que pertenecen a los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium.
Añadiendo un agente selectivo y/o diferencial al agar LAPTg, es posible realizar recuentos diferenciados de los probióticos presentes en una mezcla compleja. Los agentes selectivos (generalmente antibióticos y/o azúcares) o uno diferencial (generalmente indicadores de cambio de color de pH y/o redox) se seleccionan caso por caso sobre la base de las características genotípicas y fenotípicas específicas de las cepas que constituyen la mezcla.
Si la muestra que va a analizarse consiste en una mezcla de dos o más cepas de lactobacilos y bifidobacterias, es recomendable acompañar el recuento selectivo en LAPTg con una evaluación cualitativa de las cepas que constituyen la mezcla usando medio HHD. Para detalles adicionales, se hace referencia a los siguientes artículos científicos:
- Molecular Cloning a Laboratory Manual (Sambrook, Fritsch, Maniatis);
- Susceptibility of Lactobacillus spp. to antimicrobial agents. M. Danielsen A. Wind. 2002;
- Antibiotic Susceptibility of Lactobacillus and Bifidobacterium species from Human Gastrointestinal tract, S. Delgrado A.B. Florez B. Mayo de 2005;
- Norma ISO 6887-1:2000
- Preparation of LAPTg medium: FONT DE VALDEZ, G, y coll. : Influence of the recovery medium on the viability of injured freeze-dried lactic acid bacteria Milchwissenschaft 40 (9) 518-520 (1985J.
- Norma UNI EN ISO 6887-1:2000 “Buffered Peptone Water”
- A differential medium for the enumeration of homofermentative y heterofermentative lactic acid bacteria. LC. McDonald R.F. McFeeters, M.A. Daeschel y HP Felming. Applied and Environmental Microbiology. Junio de 1987: 1382-1384.
Iniciales y abreviaturas:
- concentración de células vivas, viables = n.° de células/unidades (g o ml) capaces de crecer en el medio de cultivo y formar colonias distintas (UFC/g o ml)
- UFC/g o ml = unidad formadora de colonias, es decir la unidad de medida de la concentración de células vivas, viables
- CIM = concentración inhibitoria mínima
El método proporciona para el uso del medio agarizado LAPTg, cuya formulación consiste sólo en la presencia de dos fuentes de nitrógeno diferentes, un azúcar como una fuente de carbono y extracto de levadura como una fuente de vitaminas del grupo B y factores de crecimiento. La ausencia de sales orgánicas e inorgánicas y sustancias con acción selectiva permite un crecimiento floreciente de todas las diversas especies de bacterias probióticas que pertenecen a los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium. Añadiendo un agente selectivo y/o diferencial al agar LAPTg, es posible realizar recuentos diferenciados de los probióticos presentes en una mezcla compleja. Los agentes selectivos (generalmente antibióticos y/o azúcares) o uno diferencial (generalmente indicadores de cambio de color de pH y/o redox) se seleccionan caso por caso sobre la base de las características genotípicas y fenotípicas específicas de las cepas que constituyen la mezcla (véase 8.2). Si la muestra que va a analizarse consiste en una mezcla de dos o más cepas de lactobacilos y bifidobacterias, es recomendable acompañar el recuento selectivo en LAPTg con una evaluación cualitativa de las cepas que constituyen la mezcla usando medio HHD.
Materiales y reactivos:
Medio LAPTg, medio basal:
- Bacto peptona (hidrolizado enzimático de proteína animal) 15 g
- Triptona (hidrolizado pancreático de caseína) 10 g
- Extracto de levadura 10 g
- Tween 801 ml
- Agar 15 g
- Agua destilada c.s.p. hasta 900 ml
Nota: los pesos indicados anteriormente se entienden que tienen precisión del ± 5%
Disolver los componentes en el agua destilada, excepto el agar. Comprobar el pH y corregir, si es necesario, hasta 6,55±0,05, luego añadir el agar y disolver en un baño de agua. Administrar el medio mientras que todavía está caliente en vasos de precipitados Bibby, y esterilizar en un autoclave a 121°C durante 15 minutos; después de la esterilización, el pH debe ser de 6,5±0,5 a 25°C±1.
Medio completo:
En el momento del uso, después de la disolución (8.1), añadir un volumen de una disolución de glucosa al 10%, esterilizada mediante filtración al medio basal, para tener una concentración de glucosa final de 10 g/litro.
Medio HHD:
- Fructosa 2,50 g
- KH2PO4 2,50 g
-Bacto triptona 10,00 g
- Peptona de soja 1,50 g
- Casaminoácidos 3,00 g
-Extracto de levadura 10,00 g
-Tween 80 1,00 g
- Verde de bromocresol 20,00 ml
-Agar 20,00 g
-Agua destilada 1000 ml
pH final = 6,90 0,10.
Etanol, filtros de jeringa de 0,45 |im estériles de un solo uso Minisart, diluyentes para reconstituir las muestras:
Reconstitución de los cultivos bacterianos líquidos y preparación de diluciones decimales en serie - solución salina de peptona
- Bacto peptona 1,0 g
- cloruro de sodio (NaCl) 8,5 g
- agua destilada c.s.p. hasta 1000 ml
Reconstitución de cultivos bacterianos anhidros (liofilizados) y productos terminados con probióticos en forma libre (no microencapsulados).
Cultivos bacterianos liofilizados no preparados en dosis o unidades
Tampón fosfato pH 6,8
- cloruro de sodio (NaCl) 5,00 g
- KH2PO4 3,78 g
- Na2HPO4 4,77 g
- agua destilada c.s.p. hasta 1000 ml
Sobres, cápsulas, píldoras, comprimidos, supositorios y subtapones de frascos:
Tampón fosfato pH 6,8
- cloruro de sodio (NaCl) 5,00 g
- KH2PO4 3,78 g
- Na2HPO4 4,77 g
- agua destilada c.s.p. hasta 1000 ml
Disolver los componentes en agua destilada, calentar si es necesario. Comprobar que el pH es de 6,8±0,10. Administrar los diluyentes en vasos de precipitados Bibby, esterilizar en un autoclave a 121°C durante 15 minutos, y almacenar en oscuridad a una temperatura de 4-5°C durante no más de un mes.
Si los productos terminados contienen aceites y/o sustancias lipídicas, será necesario añadir Tween 80 al 1% al tampón a pH 6,8 (5.5.2.1).
Kit anaerobio (AnaeroGen - Oxoid): se une químicamente oxígeno, produciendo CO2; las jeringas pequeñas no estériles de 10 ml también pueden comprarse en farmacias; disolución de L-cisteína-HCl al 5%fin pesar 5 g de clorhidrato de L-cisteína 1-hidratado (BDH 370553) y llevar a 100 ml con agua MQ; luego filtrar en un tubo Falcon estéril con un filtro de 0,45 |im y almacenar a 4°C±2 durante hasta 1 año (la disolución tendrá que añadirse al medio LAPTg para obtener una concentración final del 0,05%).
Procedimiento.
8.1 Disolver el medio LAPTg (5.1) en una cantidad suficiente para el número de placas que van a prepararse (véase la nota en el párrafo 8.5.5), considerando que para cada placa son necesarios aproximadamente 12 ± 1 ml de medio. Si se planea realizar un recuento en las mismas diluciones de la muestra no sólo en el medio LAPTg como tal, sino también en el mismo complementado con uno o más agentes selectivos (N), considerar el (n.° de placas) multiplicado por N. Dejar el medio en un baño de agua termostatizado a una temperatura de 45°C ± 0,5 durante al menos 3 horas;
8.2 Lista de agentes selectivos y preparación respectiva
8.2.1 Antibióticos
>VANCOMICINA
disolución madre 1 mg/ml (esterilizada mediante filtración 0,45 |im)
diluyente agua
concentración de uso 1 |ig/ml
selección positiva lactobacilos heterofermentadores obligatorios y facultativos (por ejemplo, L. plantarum, L. rhamosus, L. casei, L. paracasei, etc.).
selección negativa cepas sensibles tales como lactobacilos homofermentadores (por ejemplo, grupo L. acidophilus) y bifidobacterias.
Almacenamiento: alícuotas de 1,5 ml a 4°C durante 15 días o a -20°C durante hasta 4 meses.
>CLORANFENICOL
disolución madre 10 mg/ml (esterilizada mediante filtración 0,45 |im)
diluyente etanol
concentración de uso 7^ |ig/ml
selección positiva cepas con CIM > 4 |ig/ml (por ejemplo, LPC 00)
selección negativa cepas con mayor sensibilidad (CIM < 2 |ig/ml).
Almacenamiento: alícuotas de 2 ml a -20°C durante hasta 4 meses
>CUNDAMICINA CIPROFLOXACINA
disolución madre 1 mg/ml de clindamicina 10 mg/ml de ciprofloxacina (esterilizada mediante filtración 0,45 |im)
diluyente agua (en caso de mala disolución de la ciprofloxacina, añadir 1-2 gotas de ácido láctico concentrado).
concentración de uso 0,1 |ig/ml de clindamicina y 10 |ig/ml de ciprofloxacina
selección positiva grupo L. acidophilus
selección negativa L. rhamosus, L. casei, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. delbrueckii, bifidobacterias; lactococos y Streptococcus thermophilus.
Almacenamiento: alícuotas de 1,5 ml a -20°C durante hasta 6 meses para ciprofloxacina (clindamicina n.d.).
>CEFUROXIMA
disolución madre 1 mg/ml (esterilizada mediante filtración 0,45 |im)
diluyente agua
concentración de uso 0,1 |ig/ml
selección positiva cepas con CIM > 1 (por ejemplo, B. longum PCB 133)
selección negativa Streptococcus thermophilus (por ejemplo, YO 8) y otras cepas con CIM < 0,016 Almacenamiento: alícuotas de 1,5 ml a -20°C durante hasta 2 años.
>CEFOXITINA
disolución madre 10 mg/ml (esterilizada mediante filtración 0,45 ^m)
diluyente agua
concentración de uso 100 |ig/ml
selección positiva cepas con CIM > 256 (por ejemplo, LGG, LPC 08, LC 01)
selección negativa LP 01, LP 02, grupo L. acidophilus y otras cepas sensibles con CIM < 24 Almacenamiento: alícuotas de 1,5 ml a -20°C durante hasta 2 años
>MUPIROCINA
disolución madre 10 mg/ml (esterilizada mediante filtración 0,45 |im)
diluyente agua
concentración de uso 50 |ig/ml
selección positiva Bifidobacterias
selección negativa Lactobacilos.
Almacenamiento: alícuotas de 1,5 ml a -20°C durante hasta 6 meses
''CIPROFLOXACINA (selección positiva LP02 en mezcla con LF10).
disolución madre 10 mg/ml (esterilizada mediante filtración 0,45 |im)
diluyente agua (en caso de mala disolución de la ciprofloxacina, añadir 1-2 gotas de ácido láctico concentrado)
concentración de uso 5 |ig/ml
selección positiva LP02
selección negativa LF10.
Almacenamiento: alícuotas de 1,5 ml a -20°C durante hasta 6 meses
8.2.2 Otras condiciones selectivas.
8.3 Si la muestra que va a analizarse consiste en una mezcla de dos o más cepas de lactobacilos y/o bifidobacterias, es recomendable acompañar el recuento selectivo en LAPTg con una evaluación cualitativa de las cepas que constituyen la mezcla usando medio HHD. Disolver el medio mencionado anteriormente y dejarlo en un baño termostatizado tal como se describió para el medio LAPTg. Luego distribuir el medio en cantidades de 12 ± 1 ml en placas Petri y dejar solidificar;
8.4 Si se planea usar uno o más agentes selectivos, añadir la disolución de antibióticos u otro agente selectivo necesario para discriminar las cepas que constituyen la muestra a una alícuota (por ejemplo, 100 ml para aproximadamente 8 placas) del medio LAPTg disuelto, a la concentración final indicada, en un frasco estéril;
8.5 Preparar diluciones decimales sucesivas de la muestra (sección la de la norma ISO 6887-1:2000 párr. 9.2.) 8.5.1 Usar una pipeta estéril para transferir 1 ml de la dilución primaria, o 1 ml directamente del cultivo de muestra si es líquido, en un tubo de ensayo que contiene 9 ml de diluyente estéril;
8.5.2 no introducir la pipeta más profundo de 1 cm en la suspensión inicial;
8.5.3 cambiar la pipeta después de cada dilución;
8.5.4 homogeneizar por completo la dilución con un agitador mecánico, agitar con vórtex el tubo 3 veces durante un tiempo de no menos de 5 segundos, para obtener la dilución 10-2;
8.5.5 repetir estas etapas usando la dilución 10-2 y diluir adicionalmente hasta obtener una concentración de microorganismos que, cuando se cultive sobre una placa, dé un número significativo de colonias; debe indicarse que sembrar 2 diluciones decimales sucesivas (por ejemplo: 10-8, 10-9) debe permitir encontrar dos diluciones contiguas que contengan un número de células comprendido de desde 10 hasta 300. Si no existe una idea clara sobre el
número de células contenidas en la muestra, será necesario sembrar más de 2 diluciones decimales sucesivas (por ejemplo: 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10) y luego considerar sólo las que dan lugar a un número de colonias comprendido de desde 10 hasta 300.
8.6 distribuir 1 ml, extraído de las diluciones de la muestra que se consideren adecuadas (8.5.5), sobre las placas Petri;
8.7 añadir el medio LAPTg sobre la primera serie de placas y LAPTg complementado con el agente selectivo sobre la segunda serie, en cantidades de 12 ± 1 ml; debe indicarse que el tiempo transcurrido entre la reconstitución de la muestra y el momento en el que la dilución en serie entra en contacto con el medio de cultivo sobre la placa Petri (8.6) no debe exceder de 30 minutos
8.8 mezclar de manera uniforme el medio y la muestra, primero con movimientos de rotación, y luego con unos de translación horizontal y vertical;
8.9 dejar solidificar durante 15-20 minutos;
8.10 en el caso de muestras que consisten en una mezcla de dos o más cepas de lactobacilos y bifidobacterias y/o para las que se recomienda usar el medio HHD, añadir 100 |il de las diluciones apropiadas a las placas preparadas de HHD (8.3) y distribuir la muestra de manera uniforme con una espátula;
8.11 incubar las placas bocabajo a 37±1°C durante 72 h en condiciones anaerobias (Gas-Pak kit anaerobio). En cuanto a cómo usar el sistema anaerobio, seguir las instrucciones incluidas con el kit.
Cálculo de los resultados: verificar la presencia de colonias observándolas bajo la lente del visor de placas y contar exclusivamente las placas que contienen un número de colonias comprendido de desde 10 hasta 300. El resultado se expresará como UFC, es decir unidades formadores de colonias. Expresar el resultado usando la siguiente fórmula:
IC
(ni 0,1 /12) d
en la que:
ZC es la suma de las colonias contadas sobre todas las placas
n1 es el número de placas contadas en la primera dilución
n2 es el número de placas contadas en la segunda dilución
d es la dilución de la que se obtuvieron los primeros recuentos
Ejemplo:
Placas de dilución 10-8 250
Placas de dilución 10-9 23
Resultado:
250 23
------------- = 24810_8UFC/g
(1+0,1) 10-8
Redondear el resultado obtenido a dos dígitos significativos. Los resultados del ejemplo mostrado serán por tanto de 250 10-8 UFC/g o ml en el caso de muestras líquidas (para el detalle de la expresión de resultados basándose en el tipo específico). En el caso de muestras extendidas en HHD, examinar de manera visual las diferentes morfologías de las colonias cultivadas que identifican las diversas cepas de lactobacilos y bifidobacterias presentes en la mezcla. Después de realizar el recuento y examinar las colonias cultivadas en placa (etapa 9), se tiene: en el caso de
muestras de una sola cepa, el recuento obtenido de las placas con LAPTg tal como se representa la carga total de la carga probiótica que constituye la muestra.
En el caso de muestras que consisten en una mezcla de dos o más cepas de lactobacilos y bifidobacterias:
a) el recuento obtenido de la serie de placas preparadas con el medio LAPTg como tal representa la carga total de las bacterias probióticas en la muestra sometida a análisis;
b) el recuento obtenido de la serie de placas preparadas con el medio LAPTg complementado con el agente selectivo representa la carga de la(s) cepa(s) que fueron capaces de replicarse en presencia de esa sustancia específica añadida al medio como agente selectivo.
c) a partir del recuento con respecto a las cepas probióticas individuales, obtenido con el medio selectivo, es posible derivar el recuento de la(s) cepa(s) restante(s) que no se desarrollaron en presencia del agente selectivo calculando la diferencia con el recuento total (letra a) en LAPTg como tal.
d) la siembra en medio HHD hace posible discriminar de manera visual las diferentes cepas presentes en la muestra en mezcla y enumerados de manera selectiva en medio LAPTg.
El solicitante sometió a prueba las siguientes materias primas con el método de la presente invención en varias pruebas usando las cepas bacterianas probióticas indicadas en la tabla 1 con los números 17, 22, 41, 60, 74, 98, 121, 145, 174 y 182 como marcadores de toxicidad.
Los datos experimentales muestran que en muchos casos se encontró de manera inesperada toxicidad que siempre estaba presente a diversos niveles, junto con un % de mortalidad sustancial.
Prueba del aloe: mortalidad encontrada igual al 5%.
Prueba del ácido cítrico: mortalidad encontrada igual al 2%.
Prueba de la arabinogalactana: mortalidad encontrada igual al 6%.
Prueba del aromatizante de frambuesa: mortalidad encontrada igual al 2%.
Prueba del aromatizante de frambuesa: mortalidad encontrada igual al 26%.
Prueba del arándano: mortalidad encontrada igual al 5%.
Prueba del dióxido de silicio: mortalidad encontrada igual al 50%.
Prueba del dióxido de silicio: mortalidad encontrada igual al 28%.
Prueba del dióxido de silicio: mortalidad encontrada igual al 23%.
Prueba de la goma tara: mortalidad encontrada igual al 14%.
Prueba de la vitamina B1, B2 y B6: mortalidad encontrada igual al 33%.
Prueba de la zeolita: mortalidad encontrada igual al 2%.
Claims (7)
1. Método para determinar la toxicidad de una materia prima alimenticia o farmacéutica que comprende una primera etapa en la que una materia prima alimenticia o farmacéutica se pone en contacto con una carga bacteriana preestablecida de una cepa bacteriana probiótica usada como marcador de toxicidad y una segunda etapa de determinación de la reducción de dicha carga bacteriana debido a la toxicidad ejercida por dicha materia prima alimenticia o farmacéutica hacia dicha cepa bacteriana probiótica, en el que dicha primera etapa comprende preparar:
- una primera muestra de prueba que comprende el marcador de la cepa bacteriana probiótica a una concentración preestablecida, preferiblemente a una concentración comprendida de desde 1x106 hasta 1x109 UFC/g, el sustrato de cultivo óptimo para el crecimiento de dicha cepa bacteriana probiótica y la materia prima alimenticia o farmacéutica que va a someterse a prueba, y
- una segunda muestra de prueba (referencia interna) que comprende la misma cepa bacteriana probiótica de dicha primera muestra a la misma concentración preestablecida y el sustrato de cultivo óptimo para el crecimiento de dicha cepa bacteriana probiótica y en el que dicha segunda etapa comprende realizar un recuento bacteriano en dichas muestras de prueba primera y segunda para proporcionar un recuento de las bacterias que sobrevivieron en contacto con la materia prima y para expresar el % de mortalidad inducida por dicha materia prima en la cepa probiótica usada como marcador, en el que la cepa bacteriana probiótica usada como marcador de toxicidad se selecciona de.
Tabla 1
2. Método según la reivindicación 1, en el que la cepa bacteriana probiótica usada como marcador de toxicidad se selecciona de.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho recuento bacteriano se realiza con un método que comprende una etapa de resuspensión de la muestra inicial, una etapa de preparación de diluciones en serie en un diluyente adecuado, una etapa de siembra en placa en un medio agarizado y una etapa de recuento de las colonias después de la incubación en condiciones óptimas.
4. Método según una de las reivindicaciones precedentes, en el que se determina la razón entre el recuento bacteriano (número de células contadas sobre la placa) de dicha primera muestra de prueba y el recuento bacteriano (número de células contadas sobre la placa) de dicha segunda muestra de prueba (referencia interna).
5. Método según una de las reivindicaciones precedentes, en el que las cepas bacterianas probióticas usadas como marcador de toxicidad hacia las bacterias probióticas se seleccionan de lactobacilos y bifidobacterias.
6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha materia prima alimenticia o farmacéutica se selecciona del grupo que comprende aromatizantes, extractos, coformulantes de origen orgánico y/o inorgánico, vitaminas, proteínas, aminoácidos, peptonas, polímeros naturales y/o sintéticos.
7. Método para producir productos alimenticios o complementos alimenticios o dispositivos médicos o productos farmacéuticos que comprenden materias primas que no son tóxicas hacia las bacterias probióticas seleccionadas tal como se definen en la reivindicación 1, comprendiendo dicho método el método para determinar la toxicidad de una materia prima alimenticia o farmacéutica según una o más de las reivindicaciones precedentes 1-6.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT001280A ITMI20131280A1 (it) | 2013-07-30 | 2013-07-30 | Produzione di materie prime e prodotti finiti atossici testati mediante un metodo innovativo a base di batteri probiotici per la determinazione della tossicità verso i batteri probiotici. |
| PCT/IB2014/001416 WO2015015280A1 (en) | 2013-07-30 | 2014-07-30 | Production of nontoxic raw materials and finished products tested by means of an innovative probiotic bacteria based method for determining toxicity towards probiotic bacteria |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2746230T3 true ES2746230T3 (es) | 2020-03-05 |
Family
ID=49226344
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES14761689T Active ES2746230T3 (es) | 2013-07-30 | 2014-07-30 | Producción de materias primas no tóxicas y productos terminados sometidos a prueba por medio de un método basado en bacterias probióticas innovador para determinar la toxicidad hacia las bacterias probióticas |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20160168616A1 (es) |
| EP (1) | EP3027765B1 (es) |
| JP (1) | JP2016526903A (es) |
| KR (1) | KR20160034418A (es) |
| CN (1) | CN106170556A (es) |
| BR (1) | BR112016001698A2 (es) |
| CA (1) | CA2918816A1 (es) |
| DK (1) | DK3027765T3 (es) |
| ES (1) | ES2746230T3 (es) |
| IT (1) | ITMI20131280A1 (es) |
| PL (1) | PL3027765T3 (es) |
| PT (1) | PT3027765T (es) |
| RU (1) | RU2016104616A (es) |
| WO (1) | WO2015015280A1 (es) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ITMI20062286A1 (it) * | 2006-11-28 | 2008-05-29 | Anidral Srl | Una composizione per la somministrazione di principi biologicamente attivi in ambito ginecologico e rettale nonche' i suoi usi |
| CN102304482B (zh) * | 2011-06-25 | 2013-08-07 | 温州医学院 | 一株长双歧杆菌菌株 |
| CN102268471B (zh) * | 2011-06-25 | 2014-06-11 | 温州医学院 | 一种用于筛检食品中乙酰甲胺磷残留的微生物方法 |
| CN102552525A (zh) * | 2012-01-12 | 2012-07-11 | 河北农业大学 | 一种选择性抑菌中草药配方的研制 |
-
2013
- 2013-07-30 IT IT001280A patent/ITMI20131280A1/it unknown
-
2014
- 2014-07-30 JP JP2016530627A patent/JP2016526903A/ja active Pending
- 2014-07-30 WO PCT/IB2014/001416 patent/WO2015015280A1/en active Application Filing
- 2014-07-30 PL PL14761689T patent/PL3027765T3/pl unknown
- 2014-07-30 BR BR112016001698A patent/BR112016001698A2/pt active Search and Examination
- 2014-07-30 KR KR1020167005523A patent/KR20160034418A/ko not_active Application Discontinuation
- 2014-07-30 CN CN201480043315.2A patent/CN106170556A/zh active Pending
- 2014-07-30 RU RU2016104616A patent/RU2016104616A/ru not_active Application Discontinuation
- 2014-07-30 PT PT14761689T patent/PT3027765T/pt unknown
- 2014-07-30 US US14/909,093 patent/US20160168616A1/en not_active Abandoned
- 2014-07-30 DK DK14761689.0T patent/DK3027765T3/da active
- 2014-07-30 ES ES14761689T patent/ES2746230T3/es active Active
- 2014-07-30 EP EP14761689.0A patent/EP3027765B1/en active Active
- 2014-07-30 CA CA2918816A patent/CA2918816A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2016526903A (ja) | 2016-09-08 |
| ITMI20131280A1 (it) | 2015-01-31 |
| CN106170556A (zh) | 2016-11-30 |
| WO2015015280A1 (en) | 2015-02-05 |
| PL3027765T3 (pl) | 2020-03-31 |
| EP3027765B1 (en) | 2019-07-10 |
| CA2918816A1 (en) | 2015-02-05 |
| KR20160034418A (ko) | 2016-03-29 |
| US20160168616A1 (en) | 2016-06-16 |
| RU2016104616A (ru) | 2017-09-01 |
| BR112016001698A2 (pt) | 2017-08-01 |
| PT3027765T (pt) | 2019-09-12 |
| DK3027765T3 (da) | 2019-09-02 |
| EP3027765A1 (en) | 2016-06-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11554143B2 (en) | Microbiota restoration therapy (MRT), compositions and methods of manufacture | |
| Lin et al. | Viable counts, characteristic evaluation for commercial lactic acid bacteria products | |
| Drago et al. | Microbiological evaluation of commercial probiotic products available in the USA in 2009 | |
| Weese | Microbiologic evaluation of commercial probiotics | |
| CN102548566B (zh) | 植物乳杆菌菌株用作降血胆固醇试剂 | |
| Salas-Jara et al. | Probiotic Lactobacillus fermentum UCO-979C biofilm formation on AGS and Caco-2 cells and Helicobacter pylori inhibition | |
| TWI463986B (zh) | 胚芽乳酸桿菌ｃｍｕ９９５菌株之新用途 | |
| dos Santos Leandro et al. | Survival of Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 in ice cream produced with different fat levels and after submission to stress acid and bile salts | |
| AL-Saadi | Estimation of minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of cell-free extracts of Bifidobacterium species against methicillin-resistant Staphylococcus aureus in vitro | |
| Lengsfeld et al. | Okra polysaccharides inhibit adhesion of Campylobacter jejuni to mucosa isolated from poultry in vitro but not in vivo | |
| ES2963547T3 (es) | Tratamiento del IBS con probióticos | |
| ES2746230T3 (es) | Producción de materias primas no tóxicas y productos terminados sometidos a prueba por medio de un método basado en bacterias probióticas innovador para determinar la toxicidad hacia las bacterias probióticas | |
| Abdel Hameed | Widespread acquisition of antimicrobial resistance of Klebseilla pneumoniae isolated from raw milk and the effect of cinnamon oil on such isolates. | |
| Li et al. | Probiotic properties of E nterococcus strains isolated from the silage | |
| Shova | Comparative study on the antibacterial activities of neem oil, mustard oil and black seed oil against Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus, Salmonella typhi and Pseudomonas aeruginosa | |
| Halder et al. | Highlights on the Usefulness of Probiotic Lactobacilli: A Review Based Study | |
| Moumi | Isolation of Salmonella spp. from raw meat, elucidation of their antibiotic susceptibility pattern and evaluation of the antimicrobial efficacy of Oregano (Origanum vulgare) and Black Sesame (Sesamum indicum) | |
| Majumder et al. | The Influence of Asparagus on the Growth of Probiotic Bacteria in Orange Juice | |
| Ademokoya | Evaluation of antimicrobial effect of natural honey on some enteric pathogens | |
| Kalkan et al. | Suppressing E. coli activation in probiotic yogurt during fermentation by supplemen-ting bitter melon (Momordica charantia L.) ethanol extract | |
| Alshammari et al. | Synergistic Antimicrobial Activity of Aqueous Extract Date Palm (Phoenix dactylifera) and Almond (Prunus dulcis) with Amoxicillin Against Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii. | |
| ⃰Esther Folahanmi Aluko et al. | Antimicrobial And Phytochemical Properties Of Castor Seed Oil On Arcobacter butzleri and Escherichia coli | |
| Hingston | Effect of the antibiotics gentamicin, penicillin and tetracycline on four species of Lactobacillus probiotics | |
| Govender | Sequential delivery of antibiotics and probiotics employing a dual release mechanism | |
| Khaleel et al. | Isolation and Evaluation of Antibacterial Activity of Bacteriocins Produced by Bifidobacteria sp Against Staphylococcus aureus |