CN106164344A - 使用蛋白融合展示技术高通量测定物质间相互作用的方法 - Google Patents

使用蛋白融合展示技术高通量测定物质间相互作用的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106164344A
CN106164344A CN201580018385.7A CN201580018385A CN106164344A CN 106164344 A CN106164344 A CN 106164344A CN 201580018385 A CN201580018385 A CN 201580018385A CN 106164344 A CN106164344 A CN 106164344A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
protein
associated proteins
target substance
inclusion body
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201580018385.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106164344B (zh
Inventor
李升九
金宥妌
甘钟植
金河成
李大熙
郑兴采
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Original Assignee
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB filed Critical Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Publication of CN106164344A publication Critical patent/CN106164344A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106164344B publication Critical patent/CN106164344B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Abstract

本发明涉及用于测定结合蛋白和靶物质之间相互作用的方法，包括使用相互作用陷阱(IT)细胞测定结合蛋白和靶物质之间相互作用的步骤。IT细胞具有展示在细胞内包涵体表面的结合蛋白，通过表达可形成包含结合蛋白的活性蛋白颗粒的融合蛋白，即不溶性聚集物(包涵体)。其使得结合蛋白的内在相互作用和活性得到表现，不影响展示在细胞中的结合蛋白活性及遗传信息。此外，本发明涉及筛选文库的方法，还包括以单个细胞单位的回收步骤。此外，本发明还涉及细胞和细胞文库，其将靶物质从细胞外导入细胞，同时保留展示在细胞内包涵体表面的结合蛋白活性和遗传信息，还包括含有编码融合蛋白的多核苷酸的结构或者表达结合蛋白展示在活性包涵体上的融合蛋白。通过使用本发明方法能够提供高通量筛选(HTS)，其中通过过表达结合蛋白敏感地标记与其相互作用的靶物质，由于与已知筛选方法相比具有显著高450倍的信噪比，HTS具有高筛选效率，能容易分离单个细胞单位，从而使用荧光显微镜或流式细胞仪可超高速寻找及提取多种文库中的相互作用蛋白。此外，通过将不易在细胞中表达的任意外源靶物质在细胞外表达后导入细胞中，本发明可快速容易地测定细胞内物质间相互作用。本发明可用于多种领域，例如开发抗体/人工抗体、制备新相互作用蛋白以及测定和优化靶蛋白和候选物质间相互作用。

Description

使用蛋白融合展示技术高通量测定物质间相互作用的方法
技术领域
本发明涉及一种用于测定结合蛋白与靶物质之间的相互作用的方法，包括使用相互作用陷阱(IT)细胞测定结合蛋白和靶物质之间的相互作用的方法。IT细胞具有展示在细胞内包涵体表面的结合蛋白，通过表达可形成包含结合蛋白的活性蛋白颗粒的融合蛋白，即不溶性聚集物(包涵体)。所述方法包括增加细胞透性，其不影响展示在活性包涵体上的结合蛋白活性及遗传信息。此外，本发明涉及筛选文库的方法，还包括以单个细胞单位的回收。此外，本发明还涉及细胞和细胞文库，其特征在于可将靶物质从细胞外导入细胞内，同时保留展示在细胞内包涵体表面的结合蛋白活性和遗传信息；还包括含有编码融合蛋白的多核苷酸构建或者使得结合蛋白展示在活性包涵体上的融合蛋白。
背景技术
所有通过活有机体实施的方法是通过细胞内蛋白介导的相互作用网络复合体(相互作用组)建立的。控制相互作用中的任何问题可影响整个网络并且可引发疾病。因此，其是一个用于理解和控制参与相互作用的蛋白的平台，可用于理解网络复合体，并且其对于研究疾病治疗和开发治疗制剂也是非常重要的。
关于这点，已通过以下对多种用于理解体内蛋白相互作用的筛选方法进行了研究：通过靶向具有已知功能和特性的细胞内蛋白构建蛋白文库(细胞内蛋白的相互作用配体)；从文库中仅选择与所述靶相互作用的蛋白并验证其特性(Hening Lin and VirginiaW.Cornish.,2002.Screening and Selection Methods for Large-Scale Analysis ofProtein Function.Angew.Chem.Int.Ed 41；4402～25)。
目前，大多数文库筛选方法可主要分为无细胞系统和表面展示系统。常规的文库筛选方法中，代表性的无细胞系统实例可包括核糖体展示和体外区室化(IVC)方法，表面展示系统的实例可包括噬菌体展示和细菌/酵母展示方法。
首先，核糖体展示是用于通过RT-PCR扩增肽类mRNA的方法，其通过形成mRNA-核糖体-肽三元复合体共轭到靶，从所述复合体解离后可通过RT-PCR扩增。核糖体展示的优势在于其可提供的文库最大容量可达1013，由于全部过程在体外进行所以不需要转化。但是，核糖体展示的劣势在于仅有27％呈现为复合体，并且展示在mRNA-核糖体上的蛋白尺寸是受限制的，并且在核糖体复合体的稳定性和技术灵敏度等方面也是有限的(Hanes,J andPluckthun,A.,1997.In vitro selection and evolution of functional proteins byusing ribosome display.Proc.Natl.Acad.Sci.94:4937～42)。
体外区室化(IVC)是基于分散在油(代替体内)中的水性乳剂进行对基因区室化的方法，并且在所述乳剂中使区室化的基因转录及翻译，以此形成蛋白文库。可制成至少109个体积为1mL的小滴，这些小滴可作为独立的微反应器，其在多种外界条件下(温度、pH、盐浓度)是稳定的。但是，乳剂可在蛋白回收过程中使用有机溶剂被破坏，并且所用的有机溶剂可减低蛋白活性，因此回收的蛋白可能在体内不具有活性(Dan S.Tawfik and AndrewD.Griffiths.,1998.Man-made cell-like compartments for molecularevolution.Nat.Biotechnol.16；652-56)。
噬菌体展示，目前最常用于文库筛选，是基于对固定靶的结合亲和力筛选文库的方法，使用通过共轭到噬菌体展示末端的pIII蛋白展示的文库蛋白，并且噬菌体展示的优势在于其可容易地筛选文库中大量的克隆。但是，由于1到5中结合蛋白展示在噬菌体的pIII蛋白上，并且在将其固定到珠子和平板底部时才使用靶，多种结合可能同时发生，因此产生亲和力效应，即显示出个体蛋白对靶的实际亲和力不同的问题。此外，由于所述方法的特点，需要洗脱步骤。关于这点，存在的限制是当展示的蛋白与靶具有高结合亲和力时，所展示的蛋白不能容易地从固定相洗脱。此外，用于噬菌体展示中筛选文库的平移法(panning method)的限制在于其具有低信噪比，因此获得具有对靶结合亲和力的蛋白需要3到5次平移过程，还有限制在于其具有高假阳性率(George P.Smith and ValeryA.Petrenko,1997.Phage Display.Chem.Rev.97:391～410)。
表面展示，被开发用于克服噬菌体展示的限制，是用于在微生物例如细菌和酵母表面稳定表达蛋白作为表面锚定基序的方法，并且由于在使用荧光探针共轭的靶筛选文库时使用荧光激活的细胞分选(FACS)，表面展示方法的优势在于其能够高通量筛选(1×109细胞/h)，并且与噬菌体展示的平移法相比具有较低的非特异本底。但是，表面展示系统需要蛋白文库成功地突出细胞壁之外，同时使成功通过膜的蛋白稳定地展示到细胞表面且共轭到细胞表面的蛋白没有三维结构改变(即保持蛋白活性)。为此目的，能够辅助蛋白通过膜到达细胞表面的非常有效的信号序列以及所述蛋白需要成功地突出到细胞外，因此表面展示系统的限制在于展示在细胞表面的蛋白大小及蛋白数量等(Eric T.Boder andK.Dane Wittrup,1997.Yeast surface display for screening combinatorialpolypeptide libraries.Nat.Biotech.15；553～57)。
因此，为克服目前筛选系统的限制，需要开发有效并且高效的筛选系统，其应具有提高的筛选灵敏度并因此能够筛选具有多种结合亲和力(范围从数毫摩尔到数纳摩尔)的靶，并且具有高信噪比，因而能够容易地从文库内的多种蛋白中筛选细胞中期望的蛋白和具有特异性结合的结合蛋白。
为解决上述问题，提供了当将数种结合蛋白通过固定到单一基质而链接到靶并且使用荧光介导的检测方法增加信噪比时扩增检测信号的方法。开发的具有所述特征的测定方法的实例可包括使用具有自组装性能的铁蛋白通过纳米组装的交互式检测方法(Sangkyu Lee et al.,2011.Small-Molecule-Based Nanoassemblies as InducibleNanoprobes for Monitoring Dynamic Molecular Interactions Inside LiveCells.Angew Chem Int Ed Engl 50；8709-13)，使用纳米颗粒作为固定化基质用于与生物分子的相互作用和催化作用的方法(Wenwan Zhong.,2009.Nanomaterials influorescence-based biosensing.,394；47～59)。
最近，报道了通过将酶固定进入包涵体(IB)蛋白(蛋白的不溶性沉淀)利用生物催化的研究(Jozef Nahalka,Bernd Nidetzky,2007.Fusion to a pull-down domain:anovel approach of producing trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase asinsoluble enzyme aggregates.Biotechnology and Bioengineering.97；454～61)。
包涵体(IB)通常是指无活性聚集体，但是近期的报道显示某些包涵体是能够保持蛋白质大部分原有的生化活性的活性蛋白颗粒(Antonio Villaverd et al.,2005.Aggregation as bacterial inclusion bodies does not imply inactivation ofenzymes and fluorescent proteins.Microbial Cell Factories 4；1-6)。当将活性蛋白颗粒用作固定化基质时，藉此向其固定酶和荧光蛋白，并测定所述酶和荧光蛋白的活性结果，显示与未固定的酶和荧光蛋白的活性相比可保持高达30％到100％的活性，显示出可有效地提高酶的稳定性、再循环能力等，因此在酶工业中对利用活性蛋白颗粒的研究是非常活跃的。
此前，本发明人已证实了来自纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)的II型纤维素结合结构域(CBD)可在大肠杆菌(E.coli)中通过自聚集形成包涵体(IB)，由此通过利用在真核细胞和细菌细胞中都可以表达的蛋白都可以聚集形成包涵体颗粒的现象，开发了检测体内生物分子间相互作用的方法(韩国专利公布公开No.10-2013-0023057)。但是，上述方法的限制在于其只允许检测都可在体内表达的细胞内生物分子之间的相互作用，并且由于其信噪比低而很难以单个细胞单位有效地区分并回收与靶物质相互作用的结合物质。此外，所述方法的限制在于靶物质必须限于能够在细胞内合成的物质，例如蛋白质、肽、核酸等，并且只有荧光蛋白可被用作荧光信号。也就是说，所述方法的缺点在于可从外部导入的多种形式的靶物质无法被使用，并且多种形式的荧光化学物质不能被用作荧光信号。
发明内容
技术问题
本发明开发了一种系统，可直接检测生物分子和外界物质之间发生的相互作用，其通过增加细胞壁透性以避免任何对包涵体上展示的结合蛋白活性和遗传信息的影响，并且将外源靶物质导入展示于包涵体上将与其互作的结合蛋白所在的细胞中，结果证实信噪比提高450倍或更高，由此可在单个细胞水平直接检测物质之间的相互作用。此外，本发明实质上构建了文库并进行了筛选，结果证实可通过分子之间的相互作用的高通量筛选而选择性地回收能够与靶蛋白相互作用的结合蛋白，并且发现通过最多2次重复筛选可检测到纳摩尔水平的高亲和力结合物，从而完成本发明。
技术方案
本发明的一个目的是提供筛选文库的方法，包括提供包含构建的细胞文库，所述构建包含编码含有结合蛋白和活性包涵体蛋白的融合蛋白的多核苷酸；在细胞文库中表达所述融合蛋白，以此形成相互作用陷阱(IT)细胞，其中所述结合蛋白展示于包涵体上；通过增加细胞透性依据步骤(b)将荧光物质共轭的靶物质导入细胞中；和基于共轭到靶物质的荧光物质的荧光强度测定结合蛋白和靶物质之间的相互作用并以单个细胞单位回收细胞。
本发明的另一个目的是提供测定结合蛋白和靶物质之间相互作用的方法，包括提供细胞，其包含构建，所述构建包含对编码含有结合蛋白和活性包涵体蛋白的融合蛋白的多核苷酸；在细胞中表达所述融合蛋白，以此形成相互作用陷阱(IT)细胞，其中所述结合蛋白展示于包涵体上；通过增加细胞透性依据步骤(b)将荧光物质共轭的靶物质导入细胞中；和基于共轭到靶物质的荧光物质的荧光强度测定结合蛋白和从细胞外导入的靶物质之间的相互作用。
本发明的又一个目的是提供了细胞，其包括构建，所述构建包含对含有编码结合蛋白和活性包涵体蛋白融合蛋白的多核苷酸。
本发明的又一个目的是提供了细胞文库，其包括构建，所述构建包含编码含有结合蛋白和活性包涵体蛋白的融合蛋白的多核苷酸。
本发明的又一个目的是提供了相互作用陷阱(IT)细胞和细胞文库，其中表达了含有结合蛋白和活性包涵体蛋白的融合蛋白，并且将结合蛋白展示在包涵体上。
有益效果
本发明的方法提供了靶物质的敏感标记，其由于结合蛋白的过表达可相互作用，并由于与传统筛选方法相比具有显著更高的信噪比(提高450倍)而提高筛选效率，并且本发明的方法还可以单个细胞单位容易地分离细胞，因而可提供能够使用荧光显微镜和流式细胞仪从大量的文库中筛选并分离相互作用蛋白的高通量筛选(HTS)技术。此外，不易体内表达的任意外源靶物质中的生物分子之间的相互作用可通过将其在细胞外表达后引入细胞中而迅速容易地测定。本发明可用于多个领域，包括开发抗体/人工抗体、制备新的相互作用蛋白以及测定并优化靶蛋白和候选药物之间的相互作用。
附图说明
图1：以示意图示出了本发明代表性的图解，表明细胞内颗粒展示可高速测定物质之间的相互作用，及使用其测定相互作用的结果；
图2：以方法的视角示出了细胞内颗粒展示技术的完整示意图；
图3：示出了相互作用陷阱(IT)细胞的图像，其中使用可形成活性包涵体的CBD蛋白展示了结合蛋白(VLR)和荧光蛋白(mRFP)，并且仅在荧光显微镜下观测了通过超声破碎从IT细胞分离的包涵体；
图4：示出了根据存在/不存在结合蛋白的活性包涵体展示测定用于本发明开发的增加细胞透性的细胞融化/冷冻过程影响的结果；
图5：示出了流式细胞仪测定的结果，证实了虽然在本发明开发的增加细胞透性过程期间细胞冷冻过程可保持展示在活性包涵体上的结合蛋白的活性和表达，但其不足以导入外源靶物质；
图6：示出了流式细胞仪测定的结果，其证实了在本发明开发的增加细胞透性过程期间通过使用酸性溶液处理经过细胞冷冻过程的包涵体细胞而导入外源靶物质，其中A和B示出了依据酸性溶液的种类和pH导入外源靶物质的结果，C示出了EDTA(能够渗透外部细胞膜的螯合剂)和酸性溶液之间的透性结果；
图7：示出的结果证实了通过图6中优化的透性而导入到细胞内的结合蛋白和外源靶物质之间的相互作用，其中A所示的荧光图像证实了结合蛋白和靶物质之间的相互作用，B所示的基于靶物质荧光强度的结果依据增加IT细胞透性之后的培养时间通过靶物质和结合蛋白之间的相互作用确定了细胞内导入靶物质的水平；
图8：示出了流式细胞仪测定结果，通过增加细胞透性的优化方法经由活性包涵体证实了结合蛋白和靶物质之间的相互作用是能够保持本质特征的特异性结合；
图9：示出了通过增加活性包涵体细胞的细胞透性检测的细胞内和细胞外变化的结果，其中图9A示出了使用蛋白测定系统ExperionTM Pro260(Bio-rad)测定的通过增加细胞透性的细胞内蛋白变化的结果，图9B示出了在电子显微镜下观测的增加细胞透性之前及其后活性包涵体细胞的变化；
图10：示出的基于定量PCR(RT-PCR)的结果证实了即使在本发明开发的增加细胞透性的过程之后由于活性包涵体蛋白而大部分地保持了细胞内结合蛋白的遗传信息；
图11a：示出的结果使用模式蛋白和模式靶物质证实了经过本发明开发的增加细胞透性过程的细胞内颗粒展示，并且示出的流式细胞仪测定结果和荧光图像结果证实了通过增加细胞透性导入外源靶物质产生的结合蛋白和靶物质之间的相互作用；
图11b：示出的基于定量PCR(RT-PCR)和凝胶电泳测定的结果使用模式蛋白和模式靶物质证实了经过本发明开发的增加细胞透性过程的细胞内颗粒展示，并且示出的结果证实了即使在本发明开发的增加细胞透性的过程之后大部分地保持了IT细胞中结合蛋白的遗传信息；
图11c：示出的使用流式细胞仪和电子显微镜测定的结果使用模式蛋白和模式靶物质证实了经过本发明开发的增加细胞透性方法的细胞内颗粒展示，并且示出的结果证实了增加细胞透性之前或其后活性包涵体中的变化；
图12：示出了使用本发明开发的增加细胞透性的过程利用C20通过多种不同分子量葡聚糖-FITC处理的细胞透性水平结果，C20为通过细胞内颗粒展示技术获得的葡聚糖-FITC共轭物；
图13：示出了荧光图像(A)，通过使用本发明开发的增加细胞透性的优化方法将靶物质导入细胞内依据对结合蛋白亲和力的存在/不存在的蛋白之间相互作用的流式细胞仪测定结果(B)，以及使用增加细胞透性的优化方法将靶物质导入细胞内依据亲和力差异存在/不存在的结合蛋白和靶物质之间相互作用的流式细胞仪测定结果(C)；
图14：示出的结果证实了可使用细胞内颗粒展示筛选文库。示出了将具有结合蛋白和靶物质之间相互作用的包涵体细胞(PPI+)和不具有结合蛋白和靶物质之间相互作用的包涵体细胞(PPI-)混合建立文库类似环境后，使用流式细胞仪通过共轭到靶物质的GFP的荧光分析细胞(其中结合蛋白与靶物质相互作用)后回收具有高GFP荧光的10,000个大肠杆菌细胞(PPI+)，通过PCR扩增测定的筛选效率结果。
图15a：示出了使用实质文库通过细胞内颗粒展示进行筛选的结果，并且图示了寻找多种靶结合蛋白的筛选过程的结果；
图15b：示出了使用实质文库通过细胞内颗粒展示进行筛选的结果，并示出了全部结构的示意图，其中示出了氨基酸残基，用于构建用作模型结合蛋白的repebody随机文库；
图15c：示出了使用实质文库通过细胞内颗粒展示进行筛选的结果，并使用流式细胞仪验证了从文库筛选所选择的每种蛋白结合物与靶之间的相互作用；
图16：示出了通过等温滴定量热法(ITC)的H2(其是筛选实质文库获得的sfGFP蛋白结合物)的结合亲和力测定结果；
图17：示出了电子显微镜下观测到的CBD活性包涵体蛋白的图像；
图18：示出了本发明的文库筛选系统和传统文库筛选系统之间的比较结果。
具体实施方式
为实现上述目标，一方面，本发明提供了靶物质特异文库的筛选方法，包括：(a)提供细胞文库，其所含构建包括编码包含结合蛋白和活性包涵体蛋白的融合蛋白的多核苷酸；(b)在所述细胞文库中表达融合蛋白，以形成相互作用陷阱(IT)细胞，其中结合蛋白展示在包涵体上；(c)通过增加细胞透性依据步骤(b)将荧光物质共轭的靶物质导入细胞中；和(d)依据共轭到靶物质的荧光物质的荧光强度测定结合蛋白和靶物质之间的相互作用，并以单个细胞单位回收细胞。
步骤(c)的增加细胞透性的实施可无限制地通过本领域惯用的方法实施，只要增加细胞透性的方法不影响细胞内包涵体上展示的结合蛋白活性和遗传信息并且可允许靶物质通过有缝隙的膜导入细胞即可。特别地，增加细胞透性的方法可包括冷冻细胞、融化冷冻的细胞以及使用酸性溶液处理细胞，例如(i)在-80℃到-10℃下冷冻细胞；(ii)在室温到37℃下融化所冷冻的细胞；以及(iii)使用酸性溶液处理所述融化的细胞。酸性溶液的种类和pH可不具体限制，并且酸性溶液的pH可以是4到6。所述方法可以是优化的方法，其可增加细胞透性而不影响细胞内包涵体上展示的结合蛋白活性和遗传信息并且可允许靶物质通过有缝隙的膜导入细胞内，从而可将外源靶物质导入细胞内并能产生结合蛋白和靶物质之间的相互作用。
在本发明的一个示例性实施方案中，增加细胞透性方法的实施是通过将步骤(b)中的细胞(其中表达结合蛋白)离心形成沉淀；冷冻所得的细胞；在37℃融化所冷冻的细胞；并使用酸性溶液，并且尤其是使用0.1M柠檬酸(pH 4)处理。
本发明筛选文库的方法还可包括获得以单个细胞单位回收的细胞中存在的融合蛋白，以及分离和扩增编码融合蛋白的基因。蛋白回收或者基因的分离和扩增可通过本领域广泛使用的任意方法实施。
上述本发明的方法可代替传统的文库筛选方法，例如核糖体展示、噬菌体展示和细胞表面展示。本发明的方法是用于测定相互作用的方法，能够通过直接检测外源靶蛋白与包涵体上展示的结合蛋白在活性包涵体中共定位的现象容易地检测相互作用，其中含有结合蛋白的活性蛋白颗粒即CBD蛋白标签在细胞中形成在包涵体中，以用作IT细胞。特别地，本发明方法的优点在于其以高浓度(≒3×105蛋白/细胞,cf)将细胞内结合蛋白过表达到包涵体中，并且敏感标记与酵母表面表达系统相互作用的靶物质(3×104蛋白/细胞)，因此由于与传统筛选方法相比可显著提高信噪比而可提供更高的筛选效率，并且适用于多种结合亲和力。此外，本发明方法的优点在于即使使用痕量的靶物质也可产生高信号强度，因此可证实与低表达率靶物质的相互作用，并且其是一种高通量的筛选系统，其能够基于共轭到靶物质的荧光使用流式细胞仪分析在靶物质和结合蛋白之间具有相互作用的细胞并且能够通过简单实验和简单方法筛选文库，因为其是基于大肠杆菌的系统。
发明人证实了来自纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)的II型纤维素结合结构域(CBD)可在大肠杆菌(E.coli)中自聚集形成包涵体，并开发了用于检测细胞内生物分子之间相互作用的方法，这通过在真核细胞和细菌细胞中都可以表达的蛋白都可以聚集形成包涵体颗粒的现象(韩国专利申请公开No.10-2013-0023057)。
因此，在上述专利申请中发明人形成了IT细胞，其中使用能够通过活性包涵体陷俘相互作用的CBD蛋白展示了具有实质特征的结合蛋白(抗体、抗体模拟物、相互作用蛋白、配体结合蛋白、药物靶蛋白等)。本发明人还开发了蛋白文库筛选系统，其可利用本发明开发的增加细胞透性的优化方法通过将外界靶物质导入细胞内来直接检测荧光共轭的靶物质(例如蛋白、核酸或低分子量物质)和展示在包涵体上的结合蛋白之间的相互作用，并且还能够通过高通量检测单细胞水平的分子相互作用而选择性地回收与靶物质相互作用的结合蛋白(图1)。
具体地，本发明开发的可作为特定特征的增加细胞透性的方法特征在于能够在细胞内稳定地保持结合蛋白的遗传信息而并不丢失其中大部分，同时可稳定地保持细胞内在活性包涵体上展示的结合蛋白的活性及表达。
一般地，增加细胞透性的方法是用于通过化学/物理方法或者通过完全地移除细胞壁/膜使体内生物分子胞外分泌的方法来增加细胞壁/膜透性的方法。也就是说，其可以是通过渗透作用、超声波破碎机等完全破坏细胞的方法或者是使用甲苯等用于胞外分泌细胞内蛋白及遗传信息同时保留细胞形状的方法(Hansruedi Felix.,1982.Permeabilizedcells.Analytical Biochemistry 120；211-34)。
本发明开发的增加细胞透性的方法特征在于，即使将细胞透性增加到允许自由移动的程度，细胞内/细胞外蛋白也不会将活性包涵体上展示的结合蛋白及遗传信息丢失到细胞外，并且保持细胞形状。
此外，在本发明的一个示例性实施方案中，证实活性包涵体的存在能够影响结合蛋白中遗传信息的存在，该结果与之前报道的在包涵体中发现了核糖体RNA、RNA聚合酶等一致(Ursula Rinas and James E.Bailey.,1992.Protein compositional analysis ofinclusion bodies produced in recombinant Escherichia coli,AppliedMicrobiology and Biotechnology 37；609-14)。
也就是说，本发明通过在细胞内过表达结合蛋白已克服了现有表面表达系统的局限性(可展示蛋白的大小和数量以及细胞表面分泌的问题)，并且在包涵体中高浓度展示的结合蛋白的优点在于其能够敏感地标记与结合蛋白相互作用的靶物质，因而能够显示的信号强度比通过现有细胞表面表达获得的信号强度高数百到数十万倍，因此具有比现有筛选方法显著提高的信噪比，从而使得能够容易地测定生物材料之间的相互作用(图18)。
此外，本发明不仅可保留结合蛋白的内源活性，而且即使使用本发明开发的增加细胞透性的优化方法之后，结合蛋白的遗传信息也很少丢失，因为结合蛋白是展示在活性包涵体上的。
本文中，术语“融合蛋白”是指将两种或更多种蛋白融合产生的蛋白，特别地融合蛋白包含结合蛋白和CBD蛋白。此外，可通过遗传重组方法产生本发明的融合蛋白，具体地，结合蛋白的表达可通过将构建转化到宿主细胞的方法来证实。此外，融合蛋白还可包含荧光蛋白。
本发明的构建是重组载体，其可操作地连接了编码本发明融合蛋白组成成分的多核苷酸。本文中，术语“可操作地连接”是指连接了表达控制序列以能够控制编码融合蛋白组成成分的多核苷酸的转录和翻译，并且其还包括保留精确的翻译框以使得由多核苷酸序列编码的融合蛋白组成成分能够通过所述多核苷酸在表达控制序列(包括启动子)的控制下表达产生。
本文中，术语“结合蛋白”是指能够与靶物质相互作用的蛋白。结合蛋白可包括需要大规模生产用于商业应用的蛋白，也可指选自抗体、抗体模拟物、相互作用蛋白、配体结合蛋白、药物靶向蛋白等的结合蛋白，其可作为与靶物质相互作用的受体，但不限于此。此外，结合蛋白不仅可以指能够与靶蛋白相互作用的天然蛋白，也可以指负责结合功能的结构域或多肽，但不限于此。
具体地，编码结合蛋白的多核苷酸可以是来自包含编码多种蛋白的基因的文库的多核苷酸。其可从生物器官的全基因组获得，例如全基因组DNA和cDNA文库。此外，编码结合蛋白和靶物质的多核苷酸可从全基因组的子集例如扣除文库或缩减文库(sized library)中获得。例如，结合蛋白可以是In-VLR5-c或In-VLR5c-D3E8，其是人工抗体蛋白，其中internaline B(InB)蛋白的N-末端、经过修饰的可变淋巴细胞受体(VLR)蛋白重复单元、和VLR蛋白的C-末端共轭在一起(韩国专利No.10-1255682)。
本文中，术语“活性包涵体”是指蛋白质，其具有能够展示结合蛋白同时保持包涵体中表达的结合蛋白的内源活性的特性，包括例如纤维素结合结构域(CBD)蛋白、PhaC蛋白(来自Cupriavidus necator的聚羟基丁酸酯合成酶；Bjorn Steinmann,AndreasChristmann,Tim Heiseler,Janine Fritz,Harald Kolmar.,2010.In Vivo EnzymeImmobilization by Inclusion Body Display.Appl.Environ.Microbiol.76；5563-69)、口蹄疫病毒(FMDV)VP1衣壳蛋白(Antonio Villaverd et al.,2005.Aggregation asbacterial inclusion bodies does not imply inactivation of enzymes andfluorescent proteins.Microbial Cell Factories 4；1-6)等。
本文中，术语“纤维素结合结构域(CBD)蛋白”是指来自纤维单胞菌的能够结合纤维素的II型蛋白。根据本发明的一个示例性实施方式，CBD蛋白可包括那些能够在大肠杆菌中形成包涵体的蛋白、能够形成细胞内活性颗粒且不影响与其共轭内源蛋白的活性或特征的蛋白、以及能够形成所有活性包涵体的蛋白而不限于CBD蛋白。
根据本发明的示例性实施方式，将富亮氨酸重复(LRR)蛋白InB-VLR的变体D3E8(韩国专利No.10-1255682)用作结合蛋白。D3E8是一种与IL6(即，一种靶物质)的结合亲和力为2nM的蛋白，共轭到结合蛋白的蛋白设计如下。为产生只含InVLR5c(一种与IL6无结合亲和力的蛋白)、mRFP(荧光蛋白)和II型CBD的融合蛋白，通过遗传重组方式制备了pInVLR5c-mRFP-CBD质粒载体。为产生含InVLR5c-D3E8(一种与IL6有结合亲和力的结合蛋白)、mRFP(荧光蛋白)和II型CBD的融合蛋白，通过遗传重组方式制备了pD3E8-mRFP-CBD质粒载体。这些载体被转化进入大肠杆菌宿主并用作产生融合蛋白的因子(实施例2)。
本文中，术语“细胞”是指所有生物器官的基本功能、结构单位。细胞可以是动物、植物、酵母或者细菌的细胞，且可以是细菌例如大肠杆菌、链霉菌及鼠伤寒沙门菌的细胞；酵母例如毕赤酵母的细胞；真菌的细胞；昆虫例如果蝇的细胞及夜蛾Sf9细胞；动物例如中国仓鼠卵巢(CHO)、COS、NSO、293的细胞、弓形黑色素瘤细胞，但不限于此，特别地，是细菌细胞更特别地是大肠杆菌细胞。具体地，本发明的细胞可以是细菌细胞，其中通过过表达CBD蛋白形成活性包涵体，并且所述活性包涵体可用作IT细胞。
本文中，术语“IT细胞”是指一种细胞，其中将使用能够表达结合蛋白和CBD蛋白的质粒转化的细胞过表达以使得CBD蛋白形成包涵体同时使包涵体中表达的结合蛋白以高浓度展示且具有结合蛋白的内源活性。IT细胞具体地是当将外源靶物质导入IT细胞内时，能够与在包涵体上展示的结合蛋白相互作用的细胞。
本文中，术语“靶物质”是指能够与结合蛋白相互作用的物质。此外，靶物质可不仅包括能够与结合蛋白相互作用的天然蛋白，而且包括具有功能的部分结构域或多肽，以及体内不存在的化合物。特别地，靶物质可以是可用于生物技术、医学、药理学等的有用候选物质，或者是可产生体内作用的物质，具体地是蛋白质、核酸或者化合物例如IL6。为了本发明的目标，靶物质的特征在于，其与结合蛋白不在一个细胞中同时表达，而是从外界导入的。也就是说，包涵体蛋白可用作IT细胞，其能够展示结合蛋白并且靶物质是从外界导入的。
本文中，术语“导入细胞”是指通过物理或化学方法将细胞外的物质输送到细胞内。将外界物质输送进入细胞时，所述物质是靶物质并且输送包括增加细胞膜或细胞壁的透性以用于将靶物质输送进入细胞的过程。有多种物理或化学方法能够暂时地增加细胞膜或细胞壁透性(HANSRUEDI FELIX.,1982.Permeabilized Cells.Anal.Biochem.120；211-34)，例如超声破碎、渗透作用、热处理、冷冻、融化、酸溶液处理或其组合。根据发明的示例性实施方案，通过在-20℃下冷冻大肠杆菌细胞、在37℃下融化以及通过酸性溶液处理增加细胞膜或细胞壁的透性，将外源靶物质通过有缝隙的膜导入细胞，同时保留了细胞中包涵体上展示的结合蛋白的活性和遗传信息(实施例5)。
本文中，术语“荧光物质”是指能够反应到一定的能量水平或自发地发出荧光的物质，在本发明中其可指荧光蛋白和荧光化合物。本文中，术语“荧光蛋白”可指能够反应到一定的能量水平或自发地发出荧光的多肽，可选自：由绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、修饰的绿色荧光蛋白(mGFP)、红色荧光蛋白(RFP)、单体红色荧光蛋白(mRFP)、增强型红色荧光蛋白(ERFP)、Discosoma sp.红色荧光蛋白(DsRed)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)、青色荧光蛋白(CFP)、青绿色荧光蛋白(CGFP)、增强型青色荧光蛋白(ECFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、蓟绿(AzG)、Heteractiscrispa红色荧光蛋白(HcRed)、和蓝色荧光蛋白(BFP)所组成的组，但不限于此。此外，荧光化合物可指荧光团，其能够修饰靶物质，并且可选自：由荧光蛋白、氧杂蒽衍生物(荧光素、罗丹明、俄勒冈绿、曙红和德克萨斯红)、青色素衍生物(青色素、吲哚羰花青、氧杂羰花青、硫杂羰花青和部花青)、萘衍生物(丹磺酰和氟硅酸钠衍生物)、香豆素衍生物、恶二唑衍生物(吡啶恶二唑、硝基苯并恶二唑、苯并恶二唑)、芘衍生物(级联蓝)、恶嗪衍生物(尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、恶嗪170)、吖啶衍生物(二氨基吖啶、吖啶橙和吖啶黄)、芳基次甲基衍生物(金胺、结晶紫和孔雀绿)和四吡咯衍生物(卟吩、酞菁和胆红素)所组成的组，但不限于此。
本发明中，与结合蛋白形成融合蛋白的荧光蛋白以及修饰靶物质的荧光物质可产生不同波长的荧光。具体地，每种物质发出荧光信号的波长可不同，使得荧光信号检测器可基于其差异区别每种信号。
本发明中，结合蛋白可包含或不包含荧光蛋白，但是，靶物质必须包含荧光蛋白或荧光物质。
一个示例性实施方案中，编码结合蛋白的质粒pInVLR5c-mRFP-CBD和pD3E8-mRFP-CBD包含RFP作为荧光蛋白，在靶蛋白IL6的情况下，其包含GFP作为荧光蛋白。
本文中，术语“荧光信号”是指荧光蛋白或荧光物质产生能量的波长，其可通过荧光信号检测器用数值表示。
细胞内荧光信号的测定可使用荧光显微镜或流式细胞仪完成。一个示例性实施方案中，GFP和RFP的荧光是使用流式细胞仪FACS Calibur(BD Biosciences,CA,USA)分别通过检测FL1(530/30nm)和FL2(585/42nm)PMT测定的。通过可增加细胞透性的优化方法，将可结合GFP的IL6蛋白分别导入可表达对IL6(靶物质)有结合亲和力的pD3E8-mRFP-CBD的包涵体细胞(PPI+)和可表达对IL6(靶物质)无结合亲和力的pInVLR5c-mRFP-CBD的包涵体细胞(PPI-)中，通过GFP荧光可确定对IL6结合亲和力的差异(图11)。与通过现有技术方法共表达诱饵蛋白和结合物质的细胞中获得的结果(韩国专利申请公开No.10-2013-0023057)比较，现有技术方法是通过共轭到细胞内包涵体上的结合物质的荧光信号定位及分布的差异，依据是否存在与诱饵蛋白和结合物质相互作用来测定蛋白之间的相互作用，而本发明的方法是测定靶物质荧光信号的强度，靶物质被通过可增加细胞透性的优化方法从外界导入细胞后可通过相互作用结合到结合蛋白。结果发现，本发明的方法得到显著的结果，具有450倍或更高差异的信噪比，而现有技术的方法只具有微小差异，约2倍的信噪比(图13)。
本发明的一个示例性实施方案中，将D3E8和InVLR5c用作结合蛋白，来自Cellulomonas fimi的II型CBD蛋白作为活性包涵体，IL6作为靶蛋白。但是，本发明不限于此，对本领域技术人员来说显而易见的是任意类型的结合蛋白、靶物质和活性包涵体可用于测定结合蛋白和靶物质之间的相互作用。
本发明的方法还可包括(e)基于上述步骤(d)后测定的荧光强度以单个细胞单位回收细胞，还可包括回收存在于回收的细胞中的融合蛋白或者分离和扩增编码融合蛋白的基因。回收蛋白及分离和扩增基因可通过本领域广泛使用的方法实现。
本文中，术语“回收”是指测定共轭到靶物质的荧光物质的荧光信号后从含有结合蛋白的细胞文库中选择仅经证实在结合蛋白和靶物质之间存在相互作用的那些细胞的过程。流式细胞仪可以是能够测定细胞大小、细胞内组合物和荧光强度的装置，特别是由实验人员依据所需的细胞大小、细胞内组合物及荧光强度能够分离和回收单个细胞的装置。
本文中，术语“分离”是指从含有结合蛋白的细胞文库中回收经证实存在结合蛋白和靶物质之间相互作用的细胞后，从细胞中隔离编码结合蛋白的多核苷酸的过程。分离可以是指从细胞中分离DNA。DNA分离可通过本领域已知的任意方法实施，只要其与将编码结合蛋白的多核苷酸分离的受试者不相抵触即可。
本文中，术语“扩增”是指通过本领域公知的一般的多核苷酸扩增方法使上述分离的编码结合蛋白的多核苷酸大量增加的过程。依据所扩增的多核苷酸的用途可选择扩增方法，并且本领域技术人员可容易地进行该选择。
本发明的一个示例性实施方案中，检测了是否存在结合亲和力的差异可依据在包涵体上展示的结合蛋白和靶物质之间的相互作用通过共轭到靶物质的GFP荧光强度差异使用高通量流式细胞仪测定；将IT细胞(其中将与IL6结合亲和力约2nM的LRR蛋白D3E8(PPI+)展示在包涵体上)、IT细胞(其中将与IL6结合亲和力约117nM的LRR蛋白F11(PPI+)展示在包涵体上)和IT细胞(其中将InVLR5c(PPI-)展示在包涵体上)分别以1:10:10000的比率混合形成类似文库的环境；并使用流式细胞仪(FACSaria)从样品中回收10,000个对IL6具有高亲和力的大肠杆菌细胞，其将用于增加透性及导入蛋白相互作用。从回收的细胞中纯粹提取质粒，然后将其转化进入DH5α大肠杆菌细胞。将形成的菌落用于PCR扩增，并基于表型(D3E8-mRFP-CBD蛋白)检测回收的细胞中是否存在基因回收产物(图14)。
由于本发明的方法使用在细胞中过表达并共轭到包涵体中的结合蛋白，信号强度水平比通过现有细胞表面表达所获得的荧光信号高数百到数十万倍，因此基于该结果本发明的方法可用于多种蛋白质工程包括蛋白文库筛选，其包括分类形成单个细胞单位。
另一方面，本发明提供了测定结合蛋白和靶物质之间相互作用的方法，包括(a)提供包含构建的细胞文库，所述构建包含编码含结合蛋白和活性包涵体蛋白的融合蛋白的多核苷酸；(b)在细胞文库中表达融合蛋白，以此形成相互作用陷阱(IT)细胞，其中将结合蛋白展示在包涵体上；(c)通过增加细胞透性，依据步骤(b)将荧光物质共轭的靶物质导入细胞中；以及(d)基于共轭到靶物质的荧光物质的荧光强度测定结合蛋白和靶物质之间的相互作用。
步骤(c)中增加细胞透性的方法可通过本领域常用的任意方法实施，不受限制，只要该方法不影响细胞内包涵体上展示的结合蛋白的活性和遗传信息并允许将靶物质通过有缝隙的细胞导入细胞内即可。具体地，还可包含冷冻步骤、融化步骤以及使用酸性溶液处理步骤，例如(i)在-80℃到-10℃下冷冻细胞；(ii)在室温到37℃下融化冷冻的细胞；和(iii)使用酸性溶液处理融化的细胞。酸性溶液的种类及pH不受限制，例如酸性溶液的pH可以是4到6。因此，方法可以是细胞透性的优化过程，由于外源靶物质的导入可稳定保持细胞中的结合蛋白和遗传信息以及结合蛋白和靶物质之间的相互作用。
本发明一个示例性的实施方案中，增加细胞透性的方法的实施通过包括以下的方法：在步骤(b)中将其中表达了结合蛋白的细胞离心形成沉淀，然后在-20℃下冷冻，在37℃下融化沉淀并用酸性溶液(具体地使用0.1M柠檬酸(pH4))处理。
本文中，术语“微生物”是指能够表达包含本发明的结合蛋白和活性包涵体蛋白的融合蛋白从而将融合蛋白展示在细胞内包涵体中的所有种类细胞。微生物可以是真核细胞或原核细胞，但不限于此，其可以是例如大肠杆菌。
增加细胞透性的现有技术是针对细胞透性本身以通过将细胞内蛋白和遗传信息释放到细胞外来获得蛋白和遗传信息的技术，因此其意图通过增加细胞透性完全释放细胞内蛋白和遗传信息。但是，本发明人意图建立能够平和地将靶物质导入细胞内而不影响展示在活性包涵体上的结合蛋白的活性和遗传信息的增加细胞透性方法，从而建立了本发明可增加细胞透性的方法。
因此，根据本发明的增加微生物膜的细胞透性的方法具有突出的效果，其能够稳定地保持微生物细胞内包涵体上展示的结合蛋白的活性和遗传信息，并且在保持细胞形状的同时将外源靶物质导入细胞内。
在本发明的一个示例性实施方案中，增加细胞透性的实施通过方法包括：将微生物(大肠杆菌)离心形成沉淀，然后在-20℃下冷冻，在37℃下融化沉淀并用酸性溶液处理，具体地使用0.1M柠檬酸(pH 4)处理。因此，外源靶蛋白组成IT细胞，其相应于细胞透性而增加，使得可将外源靶物质自由导入细胞内，并且经证实使用IT细胞使得对蛋白之间相互作用的测量具有高灵敏度，以此使其可获得遗传信息。
另一方面，本发明提供了包含构建的细胞，所述构建包含编码含有结合蛋白和活性包涵体蛋白的融合蛋白的多核苷酸。
结合蛋白、活性包涵体蛋白、融合蛋白和细胞如上文所述。
在本发明一个示例性实施方案中，LRR蛋白用作结合蛋白、CBD蛋白用作活性包涵体蛋白、IL6蛋白用作靶物质，并且IT细胞是通过将编码结合蛋白和CBD蛋白之间的融合蛋白转化进入大肠杆菌细胞而形成的。
又一方面，本发明提供了包含构建的细胞文库，其包括编码含结合蛋白和活性包涵体蛋白的融合蛋白的多核苷酸。所述文库可以是DNA文库或DNA文库转化所得的细胞文库。
结合蛋白、活性包涵体蛋白、融合蛋白和细胞如上文所述。
本文中，术语“细胞文库”是指由包含编码与靶物质相互作用的结合蛋白的质粒的细胞组成的文库，具体地可指由结合蛋白稳定地展示在包涵体中并且可将靶物质导入其中的细胞组成的文库。细胞文库具体地可包含大肠杆菌细胞，但不限于此。
在本发明的一个示例性实施方案中，使用通过将分别展示在包涵体上的D3E8(PPI+)[与IL6(即靶物质)的亲和力约2nM的LRR蛋白]细胞、F11(PPI+)[与IL6的亲和力约117nM的LRR蛋白]细胞和InVLR5c(PPI-)[与IL6没有亲和力的LRR蛋白]细胞以1:10:10000的比率混合制备的操作型模拟物文库。在本发明另一个示例性实施方案中，构建了关于repebody(LRR蛋白)的随机文库用于通过细胞内颗粒展示系统进行筛选，并用作有效的文库。
又一方面，本发明提供了IT细胞，其中表达包含结合蛋白和活性包涵体蛋白的融合蛋白并且结合蛋白展示在包涵体上，以及相关的细胞文库。
结合蛋白、活性包涵体蛋白、融合蛋白、细胞和细胞文库如上文所述。
实施例
下文中，将通过实施例对本发明详细描述。但是，文中公开的实施例仅用作说明目的，而不应被理解为限定本发明的范围。
实施例1—基因和酶的获得
使用从韩国典型培养物保藏中心(KCTC)获得的Cellulomonas fimi KCTC9143株系的外切葡聚糖酶基因克隆II型纤维素结合结构域(CBD)基因。改良修饰的绿色荧光蛋白(GFP)基因从商业载体pEGFP(Clontech,CA,USA)获得，且含mRFP1(单体红色荧光蛋白1)基因的质粒载体pRFP由韩国科学与技术高等研究院(KAIST)(Daejeon,Korea)提供。使用了对IL6无结合亲和力的可变淋巴细胞受体(VLR)蛋白In-VLR5-c(韩国专利申请公开No.10-2010-0086055)，和repebody(InB-VLR)家族当中对IL6有结合亲和力的In-VLR5c-D3E8(KD＝2nM)、In-VLR5c-F11(KD＝117nM)，其为人工蛋白，其中internaline B(InB)蛋白的N-末端，经过修饰的重复单元，和VLR蛋白的C-末端共轭在一起。人白细胞介素-6(hIL6)是其中克隆了hIL6基因的载体。上述所有基因由KAIST(Daejeon,韩国)提供，本发明使用的所有酶均购自New England Biolabs(NEB,英格兰)。
实施例2—重组载体构建
本发明使用的所有引物由Bioneer Corporation(Daejeon,韩国)合成。引物见下表1所示。表1中限制性位点例如NdeI和KpnI用粗体显示。本发明中使用的所有基因使用表1中所示各自的引物扩增，通过重叠延伸PCR共轭，插入pET21a载体的NdeI和HindIII限制性位点，并使用大肠杆菌DH5α细胞重组。由此制备的质粒载体分别命名为pInVLR5c-mRFP-CBD、pD3E8-mRFP-CBD、pF11-mRFP-CBD、pGFP-IL6。此外，将pInVLR5c-mRFP-CBD质粒使用限制性酶NdeI和HindIII处理后插入用NdeI和HindIII处理的pET21a载体中，并使用大肠杆菌DH5α细胞重组。由此制备的质粒载体命名为pInVLR5c-mRFP。
表1
In-VLR5c-D3E8和In-VLR5c-F11基因扩增使用引物1(SEQ ID NO:1)和引物2(SEQID NO:2)，且In-VLR5c基因扩增使用引物1(SEQ ID NO:1)和引物7(SEQ ID NO:7)，分别从克隆了In-VLR5c-D3E8、In-VLR5c-F11和In-VLR5c基因的载体扩增。mRFP1基因是使用引物3(SEQ ID NO:3)和引物4(SEQ ID NO:4)从克隆了mRFP1基因的载体扩增的，且GFP基因是使用引物8(SEQ ID NO:8)和引物9(SEQ ID NO:9)从pEGFP基因扩增的。CBD基因是使用引物5(SEQ ID NO:5)和引物6(SEQ ID NO:6)从CBD扩增的(见J MicrobiolBiotechnol.2008Mar；18(3):443-8)，且hIL6基因是使用引物10(SEQ ID NO:10)和引物11(SEQ ID NO:11)从克隆了hIL6基因的载体扩增的。
实施例3—质粒提取
将实施例2中制备的质粒pInVLR5c-mRFP-CBD、pD3E8-mRFP-CBD、pF11-mRFP-CBD和pInVLR5c-mRFP转化进入大肠杆菌DH5α，接种到含氨苄西林(50μg/mL)的LB培养基(1％细菌培养用蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl)中，在37℃下震荡水浴孵育24小时。使用离心机(Universal 320R,Hettich)将培养的细胞悬液4,470×g离心5分钟，使用spin miniprep kit从弃去上清液的沉淀中提取质粒，通过电泳在1％琼脂糖凝胶中验证提取的质粒。
此外，将实施例2中制备的pGFP-IL6质粒转化进入大肠杆菌DH5α，接种到含氨苄西林(50μg/mL)的LB培养基(1％细菌培养用蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl)中，在37℃震荡水浴孵育24小时。使用离心机(Universal 320R,Hettich)将培养的细胞悬液4,470×g离心5分钟，使用spin miniprep kit从弃去上清液的沉淀中提取质粒，所分离质粒的大小及核苷酸序列通过1％琼脂糖凝胶电泳然后序列分析验证。
实施例4—蛋白表达及纯化
将实施例2中制备的质粒pD3E8-mRFP-CBD、pInVLR5c-mRFP-CBD和pInVLR5c-mRFP转化进入大肠杆菌BL21(DE3)，接种到含氨苄西林(50μg/mL)的LB培养基(1％细菌培养用蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl)中，在37℃震荡水浴孵育。当600nm的光密度(OD)达到0.5时，向培养物中加入异丙基-1-硫代β-D-半乳糖苷(IPTG；200μM)诱导CBD包涵体，并在30℃培养5小时。使用荧光显微镜(ZEISS)验证培养的细胞中存在的蛋白和蛋白包涵体(图3)。
将pGFP-IL6质粒转化进入大肠杆菌OrigamiB(DE3)，接种到含氨苄西林(50μg/mL)的LB培养基(1％细菌培养用蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl)中，在37℃震荡水浴孵育。当600nm的OD达到0.5时，向培养物中加入异丙基-1-硫代β-D-半乳糖苷(IPTG；200μM)以表达hIL6蛋白，并在30℃培养5小时。使用荧光显微镜验证培养的细胞中表达的GFP-hIL6蛋白。将经过证实表达了融合蛋白的细胞培养物在冰上超声破碎以破碎细胞膜，通过20,000×g离心20分钟再次分离裂解的细胞以除去沉淀，使用0.2μm过滤器将上清液过滤并经历随后的纯化过程。通过连接到快速高效液相色谱(FPLC)的亲和层析柱HiTrapTM Q HP(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)使用GFP-hIL6的N-末端表达的6×His-tag纯化蛋白，用PBS缓冲液(pH 7.4)脱盐，使用离心过滤器(SartoriusStedim Biotech)浓缩至40mg/mL的浓度，并在-20℃储存用于以下实施例。通过SDS-PAGE分析纯化的GFP-hIL6蛋白。
实施例5—增加IT细胞的透性
为将外源靶物质导入实施例4中培养的pD3E8-mRFP-CBD细胞或pInVLR5c-mRFP-CBD细胞，使用了本发明开发的增加细胞透性的优化方法。将大肠杆菌细胞培养物在2,480×g离心5分钟，将沉淀于-20℃下冷冻。使用PBS缓冲液(pH 7.4)在37℃下融化冷冻的大肠杆菌细胞，2,480×g离心5分钟，并去除上清液。将所得的大肠杆菌细胞用0.1M柠檬酸(pH4)处理，离心去除上清液，并使用PBS缓冲液(pH 7.4)重悬浮。
实施例6—依据包涵体展示的存在测定有缝隙细胞的基因
将实施例4中培养的pInVLR5c-mRFP-CBD细胞的透性以与实施例5中相同的方式增加，使用离心机(Universal 320R,Hettich)4,470×g离心5分钟，并分为细胞上清液和沉淀。以与细胞上清液相等的量，使用PBS缓冲液(pH 7.4)将沉淀重悬浮。将细胞上清液和沉淀重悬液分别与iQTMGreen supermix(Bio-rad)以1:1比率混合，分别用10pmol引物13(SEQ ID NO:13)和引物14(SEQ ID NO:14)处理，使用定量PCR装置CFX96(Bio-rad)测定DNA的量。
实施例7—构建基于蛋白结构的结合蛋白文库
为构建repebody文库，将LRR蛋白用作模型结合蛋白，以相同的方式使用韩国专利No.10-1356075中所用的方法。使用repebody选择两种突变单元(LRRV单元1和2)凹陷区91、93、94、115、117和118位点的6种氨基酸残基。然后将选择的氨基酸用NNK简并密码子替换，以此合成的突变引物用于文库构建。然后，使用所述引物对所述两种单元进行重叠PCR以获得文库DNA，并将文库基因取代并插入重组载体pInVLR5c-mRFP-CBD中的InVLR5c基因位点，以此固定连接到mRFP-CBD基因的文库质粒。将以此方式固定的文库通过电穿孔导入大肠杆菌DH5α中获得转化子，从而构建1×107变异水平的文库。
实施例8—构建在活性包涵体上展示的表达文库
使用储存缓冲液(2×TY培养基、50％甘油、20％葡萄糖)回收实施例7中制备的文库菌落，并4,470×g离心5分钟。弃去上清后，使用Spin Miniprep Kit分离沉淀中的文库质粒。通过电穿孔将提取的文库质粒(1μg)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)，从而构建具有1×107变异水平的表达文库。使用储存缓冲液回收表达文库菌落，在OD600为0.05时收集细胞并接种到含氨苄西林(50μg/mL)的LB培养基(1％细菌培养用蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl)中，在37℃下震荡水浴孵育。当OD600值达到0.5时，用200μM IPTG处理培养物以诱导CBD包涵体，并在30℃下培养3小时。将培养的细胞离心并弃去上清，将沉淀于-20℃下冷冻。
实施例9：使用流式细胞仪测定蛋白之间的相互作用
将经过增加细胞透性处理的pD3E8-mRFP-CBD(PPI+)或pInVLR5c-mRFP-CBD(PPI-)表达的IT细胞悬液分别用实施例4中纯化和分离的GFP-IL6蛋白(10μM)处理，搅拌30分钟以将外源靶物质导入细胞，以此诱导蛋白之间的相互作用。30分钟后，使用PBST、PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤细胞，并使用荧光显微镜(图13A)或流式细胞仪(图13B)测定结合蛋白和靶物质之间的相互作用。
使用FACS Calibur(BD Biosciences,CA,USA)实施流式细胞术，并依据SSC和FSC参数设定测定阈值。分别使用FL1(530/30nm)和FL2(585/42nm)PMT检测GFP和RFP荧光，以比率(FL1-FL2:FL2-FL1＝16％:16％)设定补偿，每种样本计数10,000个事件。使用BDCellQuest Pro(version 4.0.2,145BD Biosciences)软件收集数据，并使用Flowjosoftware(version 10)分析。
实施例10—通过细胞内颗粒展示筛选文库
通过实施例5的方法增加在实施例8中制备的冷冻沉淀的细胞透性后，将共轭到GFP的多种靶(mGFP-IL6、sfGFP.荧光素和葡聚糖-FITC)诱导以分别产生与其中展示了结合蛋白文库的包涵体的相互作用，并收集相互作用细胞。使用FACSariaTM III(BDBiosciences,CA,USA)分拣相互作用细胞，并基于SSC和FSC参数设定测定阈值。分别使用FL1(530/30nm)和FL2(585/42nm)PMT检测GFP和RFP荧光，以比率(PE-FITC:FITC-PE＝28.62:4.29)设定补偿，每种样本计数10,000个事件。使用BD FACS Diva(version 7.0BDBiosciences)软件收集数据，并使用Flowjo software(version 10)分析。
实施例11—电子显微镜(SEM、TEM)测定
将经过实施例5处理的大肠杆菌细胞在多聚甲醛-戊二醛固定剂(4℃,磷酸盐缓冲液,pH 7.2)中预固定2小时，用磷酸盐缓冲液(0.1M,pH 7.2)洗涤3次，每次10分钟，在1％的OsO4(25℃,0.1M磷酸盐缓冲液,pH 7.2)中后固定2小时。完成固定后，使用相同的缓冲液洗涤物质数次，用增加浓度的乙醇脱水，用醋酸异戊酯取代，使用临界点干燥器干燥，使用SC502溅射镀膜机覆膜至20nm厚度，并使用安装于韩国科学与技术研究院(KRIBB)的FEIQuanta 250FEG(FEI,USA)扫描电子显微镜(SEM)在10kV下观察。
为通过透射电子显微镜观察，将选取的部分在多聚甲醛-戊二醛固定剂(4℃,磷酸盐缓冲液,pH 7.2)中预固定2小时，用磷酸盐缓冲液(0.1M,pH 7.2)洗涤3次，每次10分钟，并在1％的OsO4(25℃,0.1M磷酸盐缓冲液,pH 7.2)中后固定2小时。完成固定后，使用相同的缓冲液洗涤物质数次，用增加浓度的乙醇脱水，用环氧丙烷取代，使用临界点干燥器干燥，使用SC502溅射镀膜机覆膜至20nm厚度，植入Epon-812，并在60℃炉中聚合36小时。使用超薄切片机(ULTRACUT E,Leica Microsystems,Australia)将包埋的组织制备成超薄切片，用醋酸铀酰和柠檬酸铅双染，并使用透射电子显微镜(TEM,CM 20,Philips,theNetherlands)在10kV下观察。
实施例12—在包涵体上展示结合蛋白
为证实CBD包涵体是能够稳定保持展示的结合蛋白的活性及表达的活性包涵体，将结合蛋白VLR(InVLR5c)和荧光蛋白mRFP共轭到CBD标签并在大肠杆菌中过表达，从而形成包涵体细胞。通过超声破碎分离包涵体，并通过荧光显微镜检测。在包涵体的位置检测到荧光蛋白mRFP的荧光，从而证实了结合蛋白例如VLR和mRFP已展示在CBD包涵体上。在超声破碎分离的包涵体中也检测到mRFP的荧光，从而证实CBD包涵体能够稳定展示结合蛋白同时保持结合蛋白的活性(图3)。
实施例13—增加细胞透性对细胞内/外的影响
为证实本发明开发的增加细胞透性的方法对细胞的影响，使用VLR-mRFP-CBD细胞(其中结合蛋白和RFP蛋白展示在包涵体上)和VLR-mRFP细胞(其中结合蛋白和RFP熔合蛋白未展示)进行实验。使用VLR-mRFP-CBD细胞(其中结合蛋白展示在活性包涵体上)和VLR-mRFP细胞(无包涵体)实施增加细胞透性的两步方法(冷冻/融化和酸性溶液处理)，使用流式细胞仪和荧光显微镜检测两种不同细胞之间的差异。
增加细胞透性处理过程中，冷冻和融化后存在/不存在包涵体的细胞内变化使用流式细胞仪和荧光影像测定(图4)。结果证实，当结合蛋白展示在活性包涵体上时，即使冷冻/融化步骤后结合蛋白也可稳定地保持其在细胞中的表达；但是当结合蛋白未展示在包涵体上时，细胞中大多数结合蛋白会失去。该结果显示，冷冻/融化步骤可增加细胞壁的细胞透性以此将细胞内的分子释放到细胞外，或者由于结合蛋白被稳定地展示在包涵体上，其保留在细胞内而未流失到细胞外。
另外，对于将外源靶物质导入细胞内，经证实虽然细胞内导入不能通过冷冻/融化步骤单独实现(图5)，但是当使用酸性溶液或EDTA螯合剂处理经过冷冻/融化处理的包涵体细胞时可能会产生细胞内导入(图6)。如图6所示，经证实细胞内导入外源靶物质最有效的方法是用0.1M柠檬酸(pH 4)处理，以此实现优化的膜处理。
在荧光影像中观察通过增加细胞透性的优化方法转移到细胞内并展示在包涵体上的外源靶物质和结合蛋白之间的相互作用(图7A)，作为流式细胞仪的结果，靶物质在短时间内(1分钟)进入细胞并与结合蛋白相互作用(图7B)，证实了有缝隙的细胞膜是靶物质能够容易地移动的状态。
图8的结果证实了通过增加细胞透性的优化方法导入细胞内的外源靶物质和包涵体上展示的结合蛋白之间的相互作用不是非特异性的而是特异性的，其基于对靶物质亲和力的程度在保持结合蛋白内源活性的状态下相互作用。
为通过活性包涵体展示的存在/不存在证实保持结合蛋白的遗传信息，通过本发明开发的增加细胞透性的优化方法将结合蛋白展示在包涵体上的VLR-mRFP-CBD细胞和无包涵体的VLR-mRFP细胞分离为沉淀和上清液。然后，通过定量PCR(Q-PCR)证实经过增加细胞透性方法的两种不同细胞之间存在/不存在包含结合蛋白遗传信息的质粒。结果证实，大多数展示在活性包涵体上的结合蛋白的遗传信息可稳定地保持，而未展示在活性包涵体上的结合蛋白的遗传信息流失到细胞外(图10)。
实施例14—验证细胞内颗粒展示
为验证通过本发明开发的增加细胞透性的优化方法的细胞内颗粒展示技术，使用模型结合蛋白和模型靶物质进行实验。图11A数据显示，只有本发明开发的增加细胞透性的两步方法后外源靶物质才能够导入细胞中，并且导入的靶物质可通过与展示在包涵体上的结合蛋白之间的相互作用而共定位至包涵体中。
图11B的实验用于证实增加细胞透性过程后可保持细胞内的遗传信息。具体地，通过本发明增加细胞透性的方法将结合蛋白展示到活性包涵体中的repebody-mRFP-CBD细胞分别分离为沉淀和上清液，并用等量的PBS缓冲液(pH7.4)将沉淀重悬浮。使用沉淀重悬液和上清，通过定量PCR(Q-PCR)证实存在/不存在包含结合蛋白遗传信息的质粒。此外，在增加细胞透性过程之前或其后提取细胞内的质粒并通过电泳证实。结果证实，无论是否使用增加细胞透性的方法，展示在活性包涵体上的结合蛋白的遗传信息都会稳定地保持在细胞中。
结果证实，本发明是能够进行蛋白文库筛选的系统，其包括：由于结合蛋白被展示在细胞内活性包涵体上并且由于增加细胞透性的方法而保持了结合蛋白的遗传信息的特性，通过结合蛋白与靶物质之间的相互作用分级成单个细胞单位；以及以单个细胞单位回收遗传信息。
图11C示出了通过流式细胞仪和电子显微镜证实的在增加细胞透性的过程之前或其后细胞形状的结果，其证实了即使在增加细胞透性的过程之后细胞形状也可稳定地保持。
也就是说，所述结果支持了本发明开发的增加细胞透性的方法是不同于其他现有增加细胞透性的方法的新方法，其可通过增加细胞壁和细胞膜的透性将外源靶物质稳定地导入细胞中而不破坏细胞，同时可稳定地保持展示在活性包涵体上的结合蛋白及其遗传信息。
图12示出了证实可通过增加细胞透性的优化方法导入的靶物质大小的实验结果，使用了相互作用陷阱细胞，其中C20(PPI+)(使用细胞内颗粒展示系统筛选获得的葡聚糖-FITC结合蛋白)和结合蛋白(负对照，不结合葡聚糖-FITC)展示在包涵体上。使用增加细胞透性的方法处理每种细胞(PPI+和PPI-)后，将不同大小的葡聚糖-FITC(分子量3,000到5,000；70,000和250,000)导入细胞中以诱导相互作用。结果证实，分子量250,000的葡聚糖-FITC可进入细胞，从而可与展示在细胞内包涵体上的结合蛋白相互作用，并且这证实本发明增加细胞透性的方法可容易地将甚至大分子导入细胞内，并可使用大分子作为靶来诱导相互作用通过文库筛选获得蛋白结合物。
实施例15—通过细胞内颗粒展示技术测定蛋白相互作用
为证实使用上述实施例中增加细胞透性的优化方法通过细胞内颗粒展示的蛋白之间的相互作用，将D3E8(Kd＝2nM，对IL6有亲和力)和InVLR5c蛋白(对IL6无亲和力)用作模型结合蛋白并分别展示在包涵体上。将pD3E8-mRFP-CBD和pInVLR5c-mRFP-CBD质粒分别转化到大肠杆菌中，并表达融合蛋白。通过实施例5的增加细胞透性的优化方法将靶物质GFP-IL6蛋白导入细胞中，然后用荧光显微镜和流式细胞仪观测所述细胞。
结果发现，GFP-IL6荧光与细胞内包涵体上展示的RFP荧光以及结合蛋白在表达对IL6有亲和力的pD3E8-mRFP-CBD的包涵体细胞(PPI+)中共定位，而在表达对IL6无亲和力的LRR蛋白的pInVLR5c-mRFP-CBD(PPI-)细胞中，只检测到结合蛋白的RFP荧光而未检测到结合蛋白的GFP荧光(图13A)。也就是说，基于通过相互作用结合到结合蛋白的靶物质荧光强度可明显证实存在蛋白之间的相互作用。简言之，所述结果证实活性包涵体不妨碍适当折叠并形成天然形式的展示于其上的蛋白，并且活性包涵体可固定活性形式展示的蛋白。也就是说，所述结果证明本发明的方法使得能够测定蛋白之间的相互作用，但不影响结合蛋白的实质结构及内源活性。
此外，流式细胞仪测定结果证实，展示了D3E8(一种可与靶物质(IL6)相互作用的结合蛋白)的包涵体细胞(PPI+)通过与靶物质(即通过增加细胞透性的方法导入细胞中的IL6蛋白)的相互作用显示出显著增强的GFP荧光(红色实线)，但与对IL6无亲和力的结合蛋白InVLR5c的结果(灰色实线)相比仍存在显著差异(PPI-:PPI+＝1×101:5.5×103)，450倍由于存在蛋白之间的相互作用(信噪比)，因此证实了本发明的方法可清晰地确定蛋白之间相互作用的存在(图13B)。此外，依据对结合蛋白的亲和力测定蛋白之间的相互作用的结果证实了，共轭到靶物质的荧光强度随着结合蛋白亲和力的增加而增加，从而证实了本发明的方法用于测定蛋白之间的相互作用可定量分析(图13C)。
上述结果表明，本发明的方法可依据展示在包涵体上的结合蛋白和靶物质之间的亲和力和相互作用，使用荧光显微镜及流式细胞仪基于靶物质的荧光强度以单个细胞单位分离和回收包涵体。此外，由于本发明可依据共轭到从外界导入的靶物质的荧光强度确定相互作用的存在，信噪比的差异是非常显著的优势。
实施例16—使用细胞内颗粒展示技术筛选文库
已证实，使用本发明开发的细胞内颗粒展示技术可进行文库筛选。将其中分别展示了D3E8(Kd＝2nM)和F11(Kd＝117nM)蛋白(即对靶物质IL6有亲和力的结合蛋白)的包涵体细胞和其中展示了InVLR5c(PPI-)蛋白(与IL6无亲和力的LRR蛋白)的包涵体细胞以1:10:10000的比率混合形成类似文库的环境，使用流式细胞仪(FACSaria)从样品中分拣10,000个对IL6具有高亲和力的大肠杆菌细胞，其通过实施例5的方法经过了增加细胞透性的优化过程并且其中诱导了蛋白相互作用。从分拣的细胞中提取质粒，然后将其转化进入大肠杆菌DH5α细胞。将形成的菌落进行PCR扩增，并基于表型(D3E8(F11)-mRFP-CBD蛋白)检验回收的细胞中的基因回收产物。通过将表1中所示的引物12(SEQ ID NO:12)、引物13(SEQID NO:13)和引物14(SEQID NO:14)混合进行PCR扩增，基于扩增后的基因的大小证实其中存在相互作用的细胞回收产物。
结果证实，根据起始混合比率(1/1000)，单次筛选显示出约30,000倍筛效率(图14)。该结果表明，本发明可使用高通量装置流式细胞仪(FACS)从结合蛋白展示在活性包涵体上的相互作用陷阱细胞的细胞文库中，选择性地仅将其中存在蛋白之间相互作用的包涵体细胞分类，并且本发明可提供文库筛选系统，其可从选择性分类的细胞中有效地回收编码相互作用蛋白的基因。
基于上述结果，使用作为模型结合蛋白的repebody构建了实质文库，并且使用该文库进行了寻找多种靶的蛋白结合物的筛选工作(图15A到15C)。增加实施例8中制备的表达文库的细胞透性后，将GFP结合的多种靶(mGFP-IL6、sfGFP、荧光素和葡聚糖-FITC)用相互作用陷阱细胞的细胞文库处理以诱导相互作用，并分拣FACS中具有增加的信号(存在相互作用)的细胞部分(图15A)。仅对分拣细胞的repebody基因部分进行PCR，并将文库基因取代并插入pInVLR5c-mRFP-CBD的InVLR5c基因位点以产生连接到mRFP-CBD基因的质粒。通过电穿孔将质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中获得转化子，随机选择各自的菌落后通过测序验证repebody基因的序列。结果，通过进行最多只两次重复筛选，可容易地获得可结合到各自靶的多种蛋白。具体地，对于靶向sfGFP的文库筛选，可选择性地仅回收FACS测定中对靶具有期望的结合亲和力的结合蛋白细胞。依据上述结果，证明了细胞内颗粒展示技术是一种可依据蛋白相互作用快速且容易地获得蛋白结合物的文库筛选系统。
依上文所述，本发明所属领域技术人员应理解，可通过其他具体方式实施本发明而不改变本发明的技术理念或实质特征。因此，本文所公开的示例性实施方案仅用于说明目的，不应被理解为限定本发明的范围。相反地，本发明不仅意在包括所述示例性实施方案，还可包括落入权利要求所限定的本发明的精神和范围内的多种改变、修饰、等同方案及其他实施方案。

Claims (22)

1.一种用于筛选靶物质特异文库的方法，包括：
(a)提供包含构建的细胞文库，所述构建包括编码含结合蛋白和活性包涵体蛋白的融合蛋白的多核苷酸；
(b)在所述细胞文库中表达所述融合蛋白以形成相互作用陷阱(IT)细胞，其中所述结合蛋白展示在所述包涵体上；
(c)通过增加细胞透性依据步骤(b)将荧光物质共轭的靶物质导入所述细胞中；以及
(d)基于共轭到所述靶物质的所述荧光物质的荧光强度测定所述结合蛋白和所述靶物质之间的相互作用并以单个细胞单位回收细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中增加细胞透性包括：
(i)在-80℃到-10℃下冷冻细胞；
(ii)在室温至37℃下融化所冷冻的细胞；以及
(iii)使用酸性溶液处理所融化的细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述增加细胞透性使得可将所述靶物质导入所述细胞中而不影响展示在所述细胞内包涵体上的所述结合蛋白活性和遗传信息。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶物质是蛋白、核酸或化合物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白还包括荧光蛋白。
6.根据权利要求5所述的方法，其中共轭到所述靶物质的所述荧光蛋白和所述荧光具有相互不同的波长。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性包涵体蛋白是纤维素结合结构域(CBD)蛋白。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述荧光蛋白选自：由绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、修饰的绿色荧光蛋白(mGFP)、红色荧光蛋白(RFP)、单体红色荧光蛋白(mRFP)、增强型红色荧光蛋白(ERFP)、Discosoma sp.红色荧光蛋白(DsRed)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)、青色荧光蛋白(CFP)、青绿色荧光蛋白(CGFP)、增强型青色荧光蛋白(ECFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、蓟绿(AzG)、Heteractis crispa红色荧光蛋白(HcRed)和蓝色荧光蛋白(BFP)所组成的组。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞中的荧光强度是使用荧光显微镜或流式细胞仪测定的。
10.根据权利要求1所述的方法，还包括(e)提取并扩增以单个细胞单位回收的细胞中编码所述融合蛋白的基因。
11.一种用于测定结合蛋白和靶物质之间相互作用的方法，包括：
(a)提供细胞，其包括构建，所述构建包含编码含有结合蛋白和活性包涵体蛋白的融合蛋白的多核苷酸；
(b)在所述细胞中表达融合蛋白以形成相互作用陷阱(IT)细胞，其中所述结合蛋白展示在包涵体上；
(c)通过增加细胞透性依据步骤(b)将荧光物质共轭的靶物质导入所述细胞中；以及
(d)基于共轭到所述靶物质的所述荧光物质的荧光强度，测定所述结合蛋白和从细胞外导入的所述靶物质之间的相互作用。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述增加细胞透性包括：
(i)在-80℃到-10℃下冷冻细胞；
(ii)在室温至37℃下融化所冷冻的细胞；以及
(iii)使用酸性溶液处理所融化的细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述增加细胞透性使得可将所述靶物质导入所述细胞中而不影响展示在所述细胞内包涵体上的所述结合蛋白活性和遗传信息。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述靶物质是蛋白、核酸或化合物。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述融合蛋白还包括荧光蛋白。
16.根据权利要求15所述的方法，其中共轭到所述靶物质的所述荧光蛋白和所述荧光具有相互不同的波长。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述荧光蛋白选自：由绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、修饰的绿色荧光蛋白(mGFP)、红色荧光蛋白(RFP)、单体红色荧光蛋白(mRFP)、增强型红色荧光蛋白(ERFP)、Discosoma sp.红色荧光蛋白(DsRed)、蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)、青色荧光蛋白(CFP)、青绿色荧光蛋白(CGFP)、增强型青色荧光蛋白(ECFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、蓟绿(AzG)、Heteractis crispa红色荧光蛋白(HcRed)和蓝色荧光蛋白(BFP)所组成的组。
18.根据权利要求11所述的方法，其中所述细胞中的荧光强度是使用荧光显微镜或流式细胞仪测定的。
19.一种细胞，其包括构建，所述构建包含编码含有结合蛋白和活性包涵体蛋白的融合蛋白的多核苷酸。
20.一种细胞文库，其包括构建，所述构建包含编码含有结合蛋白和活性包涵体蛋白的融合蛋白的多核苷酸。
21.根据权利要求20所述的细胞文库，其中所述文库是DNA文库或用其转化的细胞文库。
22.一种相互作用陷阱(IT)细胞及细胞文库，其中表达含结合蛋白和活性包涵体蛋白的融合蛋白并且所述结合蛋白展示在包涵体上。
CN201580018385.7A 2014-02-07 2015-02-06 使用流式细胞仪测定蛋白纳米颗粒分子间相互作用的方法 Active CN106164344B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2014-0014334 2014-02-07
KR20140014334 2014-02-07
PCT/KR2015/001226 WO2015119447A1 (ko) 2014-02-07 2015-02-06 단백질 융합 디스플레이 기술을 이용한 물질 간 상호작용 고속분석 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106164344A true CN106164344A (zh) 2016-11-23
CN106164344B CN106164344B (zh) 2018-12-18

Family

ID=53778195

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580018385.7A Active CN106164344B (zh) 2014-02-07 2015-02-06 使用流式细胞仪测定蛋白纳米颗粒分子间相互作用的方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10908163B2 (zh)
EP (1) EP3103900B1 (zh)
JP (1) JP6526029B2 (zh)
KR (1) KR101733609B1 (zh)
CN (1) CN106164344B (zh)
WO (1) WO2015119447A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190101808A (ko) 2018-02-23 2019-09-02 주식회사 페라메드 하이 스루풋 스크리닝 방법

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1156726A (zh) * 1996-12-20 1997-08-13 周红 猪血中提纯杀菌性/通透性增加蛋白的方法
US20060257887A1 (en) * 2004-12-04 2006-11-16 Waldo Geoffrey S Protein -protein interaction detection system using fluorescent protein microdomains
CN1894581A (zh) * 2003-07-09 2007-01-10 森蒂金生物科学公司 检测蛋白－蛋白相互作用的方法
US20080153111A1 (en) * 2005-03-15 2008-06-26 President And Fellows Of Harvard College Method and composition for detecting protein-protein and protein-nucleic acid interactions
CN101230362A (zh) * 2008-02-27 2008-07-30 东南大学 一种改变细胞膜通透性有效生产1,3-丙二醇的方法
US20090105089A1 (en) * 2006-04-19 2009-04-23 Millegen Method for detecting intracytoplasmic protein/protein interactions
US20130052660A1 (en) * 2011-08-26 2013-02-28 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Method for detecting protein-protein interactions in cells

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003294736A (ja) 2002-04-01 2003-10-15 Japan Science & Technology Corp 蛍光蛋白質融合プローブを用いたスクリーニング方法
CN101821622B (zh) 2007-08-17 2015-04-08 韩国科学技术院 分子相互作用的检测方法
EP2073459A1 (en) 2007-12-17 2009-06-24 Alcatel-Lucent Deutschland AG Transmission via a burst or frame switched network with timing preservation of the transmitted client packets
KR101255682B1 (ko) 2010-09-02 2013-04-18 한국생명공학연구원 신규한 ｍｄ-2 결합 폴리펩타이드 및 이의 용도
KR101356787B1 (ko) 2011-07-22 2014-02-06 한국과학기술원 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석 방법 및 키트
KR101519627B1 (ko) 2011-08-26 2015-05-12 한국생명공학연구원 생체 내 단백질 간 상호작용의 분석 방법
WO2013048185A2 (ko) * 2011-09-30 2013-04-04 한국과학기술원 세포 내에서의 빛을 이용한 가역적 단백질 나노클러스터 형성방법
KR101356075B1 (ko) 2012-02-27 2014-02-12 한국과학기술원 인터루킨-6와 결합할 수 있는 신규한 폴리펩타이드

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1156726A (zh) * 1996-12-20 1997-08-13 周红 猪血中提纯杀菌性/通透性增加蛋白的方法
CN1894581A (zh) * 2003-07-09 2007-01-10 森蒂金生物科学公司 检测蛋白－蛋白相互作用的方法
US20060257887A1 (en) * 2004-12-04 2006-11-16 Waldo Geoffrey S Protein -protein interaction detection system using fluorescent protein microdomains
US20080153111A1 (en) * 2005-03-15 2008-06-26 President And Fellows Of Harvard College Method and composition for detecting protein-protein and protein-nucleic acid interactions
US20090105089A1 (en) * 2006-04-19 2009-04-23 Millegen Method for detecting intracytoplasmic protein/protein interactions
CN101230362A (zh) * 2008-02-27 2008-07-30 东南大学 一种改变细胞膜通透性有效生产1,3-丙二醇的方法
US20130052660A1 (en) * 2011-08-26 2013-02-28 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Method for detecting protein-protein interactions in cells

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HANSRUEDI FELIX: ""Permeabilized cells"", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150093619A (ko) 2015-08-18
EP3103900A4 (en) 2017-10-04
EP3103900A1 (en) 2016-12-14
WO2015119447A1 (ko) 2015-08-13
JP2017512055A (ja) 2017-05-18
US20170192009A1 (en) 2017-07-06
JP6526029B2 (ja) 2019-06-05
CN106164344B (zh) 2018-12-18
US10908163B2 (en) 2021-02-02
KR101733609B1 (ko) 2017-05-08
EP3103900B1 (en) 2020-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11078479B2 (en) Polypeptide display libraries and methods of making and using thereof
Aharoni et al. High-throughput screening of enzyme libraries: thiolactonases evolved by fluorescence-activated sorting of single cells in emulsion compartments
Ackerman et al. Highly avid magnetic bead capture: an efficient selection method for de novo protein engineering utilizing yeast surface display
Bessette et al. Rapid isolation of high-affinity protein binding peptides using bacterial display
US11661676B2 (en) Cellular high throughput encapsulation for screening or selection
Dane et al. Isolation of cell specific peptide ligands using fluorescent bacterial display libraries
Jeong et al. A periplasmic fluorescent reporter protein and its application in high-throughput membrane protein topology analysis
JP2001520022A (ja) 生物学的相互作用を調節する新規化合物についてのスクリーニング
CN106164344B (zh) 使用流式细胞仪测定蛋白纳米颗粒分子间相互作用的方法
Jung et al. Binding and enrichment of Escherichia coli spheroplasts expressing inner membrane tethered scFv antibodies on surface immobilized antigens
Beasley et al. Bacterial cytoplasmic display platform Retained Display (ReD) identifies stable human germline antibody frameworks
EP2516702B1 (en) Protein display
WO2021179892A1 (en) Methods of detection of compound, antibody or protein using recombinant endospores or bacteria as sensing element
Li Use of a modified bacteriophage to probe the interactions between peptides and ion channel receptors in mammalian cells
WO2010104596A1 (en) Fluorobodies: intrinsically fluorescent binding ligands
Daugherty Cell Surface Display and Cytometric Screening for Protein Ligand Isolation and Engineering

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant