CN106153748A - 一种检测多肽中n,n-二异丙基碳二亚胺的方法 - Google Patents
一种检测多肽中n,n-二异丙基碳二亚胺的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于药物分析化学领域，公开了一种检测多肽中N,N-二异丙基碳二亚胺的方法。本发明所述检测方法分别用pH≤5的溶液溶解待测多肽样品和N,N-二异丙基碳二亚胺对照品制得供试品溶液和对照品溶液；采用液相色谱与质谱联用的方法检测供试品溶液中N,N-二异丙基碳二亚胺含量。本发明所述检测方法以pH≤5的溶液溶解多肽样品，营造一个酸性环境，使得多肽中的DIC完全转化为其尿素衍生物。本发明所述检测方法操作简单，检测仪器和试剂普通，检测成本低；检测时间短；检测结果准确、明显，易于判断；检测灵敏度高，质谱检测的检测限可以达到0.8ppm，广泛适合于多肽类药物中DIC的检测。
Description
技术领域
本发明属于药物分析化学领域，具体涉及一种检测多肽中碳二亚胺的方法。尤其是涉及一种检测多肽中N,N-二异丙基碳二亚胺的方法。
背景技术
碳二亚胺(Carbodiimide)又称碳化二亚胺，含有N＝C＝N官能团，是一类常用的失水剂。自1955年有了碳二亚胺多肽合成法以后，碳二亚胺在许多化学领域得到了应用。N,N-二异丙基碳二亚胺，英文简称DIC，就是一种常用的缩合剂。如奈西立肽的合成中就使用到了DIC，此外在Atosiban，缩宫素，生长抑素、加压素等多肽的合成中同样使用DIC。然而欧洲药典给出的基因毒性杂质之结构警示一文明确指出DIC具有基因毒性杂质警示结构，是一个潜在的具有基因毒性的杂质，是要严格控制其在药品中的含量的。所以建立一种检测DIC的方法，完善多肽质量控制，对于提升奈西立肽等多肽质量，减少患者用药风险，是非常有必要的。
目前有文献报道建立了一种多糖蛋白疫苗中残留残余碳二亚胺的检测方法。该检测方法是使用液相色谱和质谱连用技术(LC-MS)对1-乙基-3-(2-二甲基氨基-丙基)-碳二亚胺(EDAC)尿素衍生物进行定量分析。还没有见到奈西立肽中残留DIC检测方法建立的文献报道。而多糖蛋白疫苗为多糖和蛋白的结合物，奈西立肽是仅有三十多个氨基酸的多肽，二者之间的物理化学，结构、样品处理方法、合成的工艺均相差甚远。另外多糖蛋白疫苗中的碳二亚胺为1-乙基-3-(2-二甲基氨基-丙基)-碳二亚胺(EDAC)，而奈西立肽中的碳二亚胺为N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)，这两者的结构也有所差别，自然转化的尿素衍生物也会有差别。存在的这些差异使得能够用于检测多糖蛋白疫苗的中碳二亚胺的方法未必适用于检测奈西立肽中的碳二亚胺。
此外，根据上述文献报道的检测方法的方法学验证数据可以看出，该方法仅凭文献报告和主观推测认为多糖蛋白疫苗中残留的碳二亚胺在工艺中已经完全转化为其尿素衍生物。而实际上，样品中仍然会有微量的碳二亚胺没有转化为其尿素衍生物。作为一个潜在的基因毒性杂质，在药物中被允许的限度很低，通常是在几个ppm至数百ppm，这些没有转化的碳二亚胺很可能就超过了规定的限度。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种适用于奈西立肽等多肽中残留碳二亚胺的检测方法，尤其是N,N-二异丙基碳二亚胺的检测方法，用于完善多肽质量控制，提升奈西立肽等多肽质量，减少患者用药风险。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测多肽中N,N-二异丙基碳二亚胺的方法，分别用pH≤5的溶液溶解待测多肽样品和N,N-二异丙基碳二亚胺对照品制得供试品溶液和对照品溶液；采用液相色谱与质谱联用的方法检测供试品溶液中N,N-二异丙基碳二亚胺含量。
本发明所述检测方法以pH≤5的溶液溶解多肽样品，营造一个酸性环境，使得多肽中的DIC完全转化为其尿素衍生物。取对照品溶液及待测多肽样品溶液采用液相色谱与质谱联用的方法进样分析，以外标法计算总的DIU的量，折算获得多肽样品中DIC的含量。
在一些实施方案中，所述pH≤5的溶液为含0.001mol/L～3mol/L盐酸的有机溶剂水溶液。
在一些优选实施方案中，所述pH≤5的溶液中的盐酸浓度为1mol/L。
在一些实施方案中，所述pH≤5的溶液中所述有机溶剂为乙腈或甲醇。
在一些优选实施方案中，所述pH≤5的溶液中所述有机溶剂浓度为30％。
在一些实施方案中，所述多肽为奈西立肽。
在一些实施方案中，所述溶解还包括超声处理后静置的步骤。溶解后超声静置使多肽中的DIC有充足的时间来转化。
在一些优选实施方案中，所述超声处理后时间为1min。
在一些优选实施方案中，所述静置时间为2小时。
在本发明所述检测方法中，所述液相色谱与质谱联用的方法可以按照现有技术中的常规方法操作。
在一些实施方案中，所述液相色谱与质谱联用的方法中色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相A为水，流动相B为乙腈。
在一些实施方案中，所述液相色谱与质谱联用的方法中色谱柱为氧化硅柱，流动相A为乙腈，流动相B为1％的甲酸。
进一步的，在一些实施方案中，所述液相色谱与质谱联用的方法中梯度洗脱程序为
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 90 | 10 |
| 10 | 50 | 50 |
| 11 | 90 | 90 |
| 20 | 90 | 10 |
在一些实施方案中，所述液相色谱与质谱联用的方法中检测波长为210nm。
在一些实施方案中，所述液相色谱与质谱联用的方法中离子流提取范围为144-146Da。
在一些实施方案中，所述液相色谱与质谱联用的方法中色谱柱柱温为20℃～40℃之间，液相流速为0.8ml/min～1.2ml/min，进质谱的流速为0.2ml/min～0.4ml/min，液相检测器为紫外检测器，质谱检测器为ESI源离子阱质谱仪，离子源温度为200℃，离子传输管温度320℃，鞘气流30au，喷雾电压3KV，辅气0au，偏转电压80V，正离子模式。
在某一具体实施例中，所述检测方法为取待测多肽样品20mg，精密称定，精密加入2mL含30％乙腈的1mol/L的盐酸溶液溶解待测多肽样品，超声处理1min，再室温静置2小时，用30％的乙腈溶液稀释、定容至刻度，摇匀作为供试品溶液；另取N,N-二异丙基碳二亚胺40mg，置50mL的量瓶中，加含30％乙腈的1mol/L的盐酸溶液20mL溶解样品，超声处理1min，再室温静置2小时，用含30％乙腈的1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀。精密取量上述溶液1mL置100mL量瓶中，用含30％乙腈的1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，作为对照品储备溶液。精密取量对照品储备液1.0mL置10mL量瓶中，用30％的乙腈溶液稀释至刻度，作为对照品溶液；采用液相色谱与质谱联用的方法，色谱柱为Agilent Eclipse C183.5μm 4.6×100mm，柱温25℃，液相流速为1.0mL/min，调节分流器的分流比使得进质谱的流速0.3mL/min，液相检测器为紫外检测器，检测波长为210nm，质谱检测器为ESI源离子阱质谱仪(Thermo LTQXL)，离子源温度为200℃，离子传输管温度320℃，鞘气流30au，喷雾电压3KV，辅气0au，偏转电压80V，正离子模式，离子流提取范围144-146Da，流动相A为水，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序为
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 90 | 10 |
| 10 | 50 | 50 |
| 11 | 90 | 90 |
| 20 | 90 | 10 |
精密量取上述供试品溶液与对照品溶液各10μL注入液相色谱仪，按外标法以离子流峰面积或液相峰面积进行计算，求出DIC的含量。
在本发明所述检测方法中，所述液相色谱与质谱联用的方法包括但不限于上述检测方法。
本发明实施例中分别对本发明所述检测方法进行检测限、系统适应性、定量限、线性、分析重复性、回收率进行检测。结果显示本发明所述方法检测限溶液的液相色谱峰的信噪比为5.32，大于3，质谱的离子流峰高明显高于基线，信噪比必定大于3。表明本发明所述方法所述对照溶液浓度的10％处可以有效检测，相当83ppm。
本发明所述方法系统适应性结果显示液相峰面积RSD为0.53％，小于20％，质谱离子流峰面积RSD为2.76％，小于20％，表明本发明所述检测方法系统适应性很好。
本发明所述方法定量限溶液连续进样6针，液相色谱图的信噪比均大于3，峰面积的RSD为0.66％，小于20.0％。质谱的离子流峰明显高于基线，信噪比必定大于10，且离子流峰面积的RSD为1.10％，小于20.0％。表明对照溶液浓度的30％处可以定量分析，相当于249ppm。
本发明所述方法液相线性回归的结果来看，从定量限到对照品限度的2倍选取7个浓度点进行回归，液相检测结果的相关系数R2＝0.9999，大于0.990，截距峰面积比为3.93％，小于10％，线性关系良好。质谱检测结果的相关系数R2＝0.9906，大于0.990，截距峰面积比为1.56％，小于10％，线性关系良好。
本发明所述方法分析重复性溶液液相峰面积和质谱离子流峰面积的RSD均小于20.0％，表明本发明所述检测方法的分析重复性良好。
本发明所述方法液相和质谱各浓度水平的平均回收率为90.76％，质谱的平均回收率为106.99％，均在80.0％～120.0％，平均回收率的RSD分别为4.66％和8.80％，均小于20.0％，表明本发明所述检测方法的准确度良好。
本发明所述检测多肽中N,N-二异丙基碳二亚胺的方法分别用pH≤5的溶液溶解待测多肽样品和N,N-二异丙基碳二亚胺对照品制得供试品溶液和对照品溶液；采用液相色谱与质谱联用的方法检测供试品溶液中N,N-二异丙基碳二亚胺含量。本发明所述检测方法以pH≤5的溶液溶解多肽样品，营造一个酸性环境，使得多肽中的DIC完全转化为其尿素衍生物。取对照品溶液及待测多肽样品溶液采用液相色谱与质谱联用的方法进样分析，以外标法计算总的DIU的量，折算获得多肽样品中DIC的含量。本发明所述检测方法操作简单，检测仪器和试剂普通，检测成本低；检测时间短，20分钟就能完成样品分析，而且检测结果准确明显，易于判断；DIU质谱离子化效果好，检测灵敏度高，质谱检测的检测限可以达到0.8ppm，广泛适合于多肽类药物中DIC的检测。
附图说明
图1示实施例5液相色谱图；
图2示实施例5质谱图；
图3示实施例6液相线性曲线图；
图4示实施例6质谱线性曲线图；
图5示实施例7空白液相图谱；
图6示实施例7空白质谱图谱；
图7示实施例7奈西立肽液相图谱；
图8示实施例7奈西立肽质谱图谱。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种检测多肽中N,N-二异丙基碳二亚胺的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品和方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品和方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。其中，电子天平购自METTLER TOLEDO公司，XS205型；液相色谱仪购自Agilent公司，1260型；质谱仪购自Thermo公司，LTQ型；乙腈购自Merker公司，色谱纯；DIC对照品购自AlORICH公司，批号SHBC2555V，含量99.0％。说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中：
| 缩写及英文 | 含义 |
| EDAC | 1-乙基-3-(2-二甲基氨基-丙基)-碳二亚胺 |
| DIC | N,N-二异丙基碳二亚胺 |
| EDAU | 1-乙基-3-(2-二甲基氨基-丙基)-碳二亚胺的尿素衍生物 |
| DIU | N,N-二异丙基碳二亚胺的尿素衍生物 |
| LOQ | 定量限 |
| LOD | 检测限 |
实施例1：溶液的配制
含30％乙腈的1mol/L的盐酸溶液：取盐酸120mL加水780mL、乙腈360mL混匀即得；
30％的乙腈溶液：取乙腈300mL加水700mL，混匀。
流动相A：水。
流动相B：乙腈
供试品溶液：取供试品约20mg，精密称定，置20mL容量瓶中，精密加入2mL含30％乙腈的1mol/L的盐酸溶液溶解样品，超声处理1min，在室温静置2小时，用30％的乙腈溶液稀释、定容至刻度，摇匀。平行配制2份。
对照品储备液：取DIC对照品40mg置50mL的量瓶中，加含30％乙腈的1mol/L的盐酸溶液20mL溶解样品，超声处理1min，在室温静置2小时，用含30％乙腈的1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀。精密取量上述溶液1mL置100mL量瓶中，用含30％乙腈的1mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，作为对照品储备溶液。
对照品溶液：精密取量对照品储备液1.0mL置10mL量瓶中，用30％的乙腈溶液稀释至刻度，作为对照品溶液。
检测限溶液：精密取量对照品储备液0.1mL置10mL量瓶中，用30％的乙腈溶液稀释至刻度。
定量限溶液：精密取量对照品储备液0.3mL置10mL量瓶中，用30％的乙腈溶液稀释至刻度。
50％线性溶液：精密取量对照品储备液0.5mL置10mL量瓶中，用30％的乙腈溶液稀释至刻度。
75％线性溶液：精密取量对照品储备液0.75mL置10mL量瓶中，用30％的乙腈溶液稀释至刻度。
100％线性溶液：对照品溶液。
125％线性溶液：精密取量对照品储备液1.25mL置10mL量瓶中，用30％的乙腈溶液稀释至刻度。
150％线性溶液：精密取量对照品储备液1.5mL置10mL量瓶中，用30％的乙腈溶液稀释至刻度。
200％线性溶液：精密取量对照品储备液2.0mL置10mL量瓶中，用30％的乙腈溶液稀释至刻度。
50％准确度溶液：取供试品约20mg，精密称定，置20mL容量瓶中，精密加入2mL含30％乙腈的1mol/L的盐酸溶液溶解样品，超声处理1min，在室温静置2小时，精密加入1.0mL对照品储备液，用30％的乙腈溶液稀释、定容至刻度，摇匀。平行配制3份。
100％准确度溶液：取供试品约20mg，精密称定，置20mL容量瓶中，精密加入2mL含30％乙腈的1mol/L的盐酸溶液溶解样品，超声处理1min，在室温静置2小时，精密加入2.0mL对照品储备液，用30％的乙腈溶液稀释、定容至刻度，摇匀。平行配制6份。
150％准确度容溶液：取供试品约20mg，精密称定，置20mL容量瓶中，精密加入2mL含30％乙腈的1mol/L的盐酸溶液溶解样品，超声处理1min，在室温静置2小时，精密加入3.0mL对照品储备液，用30％的乙腈溶液稀释、定容至刻度，摇匀。平行配制3份。
分析重复性溶液：配制同100％准确度溶液，平行配制6份。
实施例2、检测条件
1、液相条件
色谱柱：Agilent Eclipse C183.5μm 4.6×100mm，色谱柱编号：RD-152；紫外检测波长：210nm；柱温：25℃；液相流速：1.0ml/min；调节分流比，使得进质谱的流速0.3ml/min；进样量：10μL；流动相A：水；流动相B：乙腈；梯度洗脱程序如下：
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 90 | 10 |
| 10 | 50 | 50 |
| 11 | 90 | 90 |
| 20 | 90 | 10 |
2、质谱条件
质谱仪检测器：Thermo LTQXL；离子模式：正离子模式；离子流数据采集范围：144-146Da；离子源温度:200℃；离子传输管温度:320℃；鞘气流：30au；辅气流：0au；喷雾电压:3KV；偏转电压:80KV。
实施例3、系统适应性
取对照品溶液连续进样6针，液相峰面积和离子流峰面积的RSD均不得过20.0％，质谱离子流的面积RSD不得大于20.0％。检测结果如表1和表2。
表1 6针对照品进样结果(液相)
表2 6针对照品进样结果(质谱)
由表1和表2结果可见液相峰面积RSD为0.53％，小于20％，质谱离子流峰面积RSD为2.76％，小于20％，表明本发明所述检测方法系统适应性很好。
实施例4、定量限
取定量限溶液连续进样6针，液相色谱峰和离子流峰的信噪比不得小于3，液相峰面积和离子流峰面积的RSD均不得过20.0％，检测结果如表3和表4。
表3 连续6针液相分析结果
表4 连续6针质谱分析结果
由表3和表4结果可见，定量限溶液连续进样6针，液相色谱图的信噪比均大于3，峰面积的RSD为0.66％，小于20.0％。质谱的离子流峰明显高于基线，信噪比必定大于10，且离子流峰面积的RSD为1.10％，小于20.0％。表明对照溶液浓度的30％处可以定量分析，相当于249ppm。
实施例5、检出限
取检出限溶液进样1针，液相色谱峰和离子流峰的信噪比不得小于3，检测结果如图1、表5和图2。
表5 液相色谱结果
| 出峰时间 | 峰面积 | 峰面积％ | 峰高 | 峰高％ | S/N |
| 4.827 | 12492 | 100.00 | 2746 | 100.00 | 5.32 |
| 总和 | 12492.000 | 100.000 | 2746.000 | 100.000 |
由上述结果可见，本发明所述方法检测限溶液的液相色谱峰的信噪比为5.32，大于3，质谱的离子流峰高明显高于基线，信噪比必定大于3。表明本发明所述检测法所述对照溶液浓度的10％处可以有效检测，相当83ppm。
实施例6、线性
取分别进样1针，根据液相色谱图的峰面积和离子流峰面积绘制的线性曲线的线性相关系数R方不得小于0.990，不同浓度水平的RSD不得大于10.0％，线性曲线Y轴截距的绝对值与100％浓度水平的比值(截距峰面积比)不得过10.0％。检测结果如表6、表7、图3和图4。
表6 各浓度线性溶液液相检测结果
表7 各浓度线性溶液质谱检测结果
从上述液相线性回归的结果来看，从定量限到对照品限度的2倍选取7个浓度点进行回归，液相检测结果的相关系数R2＝0.9999，大于0.990，截距峰面积比为3.93％，小于10％，线性关系良好。质谱检测结果的相关系数R2＝0.9906，大于0.990，截距峰面积比为1.56％，小于10％，线性关系良好。
实施例7、分析重复性
取2份供试品溶液和6份分析重复性溶液各进1针。液相色谱峰和质谱离子流峰面积的RSD均不得过20.0％。检测结果见表8-11和图5-8。
表8 液相供试品检测结果
| 奈西立肽质量mg | 稀释倍数 | 奈西立肽浓度mg/ml | DIC峰面积 |
| 22.68 | 20 | 1.134 | 0 |
| 22.68 | 20 | 1.134 | 0 |
| 20.18 | 20 | 1.009 | 0 |
| 20.18 | 20 | 1.009 | 0 |
表9 质谱供试品检测结果
图5和图6空白图谱表明空白溶液对于检测没有任何干扰，而图7和图8奈西立肽图谱结果显示，奈西立肽中DIC的总含量为0.00％。
表10 液相分析重复性结果
表11 质谱分析重复性结果
上述分析重复性结果显示，分析重复性溶液液相峰面积和质谱离子流峰面积的RSD均小于20.0％，表明本发明所述检测方法的分析重复性良好。
实施例8、回收率
取各浓度水平下的所有准确度溶液各进样1针，液相和质谱各浓度水平的平均回收率在80.0％～120.0％，回收率的RSD不得大于20.0％。
表12 9针样品加标准的回收的液相分析结果
表13 9针样品加标准的回收质谱分析结果
由表12和13的结果可见，液相和质谱各浓度水平的平均回收率为90.76，质谱的平均回收率为106.99％，均在80.0％～120.0％，平均回收率的RSD分别为4.66％和8.80％，均小于20.0％，表明本发明所述检测方法的准确度良好。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种检测多肽中N,N-二异丙基碳二亚胺的方法，分别用pH≤5的溶液溶解待测多肽样品和N,N-二异丙基碳二亚胺对照品制得供试品溶液和对照品溶液；采用液相色谱与质谱联用的方法检测供试品溶液中N,N-二异丙基碳二亚胺含量。
2.根据权利要求1所述的方法，所述pH≤5的溶液为含0.001mol/L～3mol/L盐酸的有机溶剂水溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，所述有机溶剂为乙腈或甲醇，所述有机溶剂浓度为30％。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，所述多肽为奈西立肽。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，所述溶解还包括超声处理后静置的步骤，所述超声处理后时间为1min，所述静置时间为2小时。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，所述液相色谱与质谱联用的方法中色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相A为水，流动相B为乙腈。
7.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，所述液相色谱与质谱联用的方法中色谱柱为氧化硅柱，流动相A为乙腈，流动相B为1％的甲酸。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的方法，所述液相色谱与质谱联用的方法中梯度洗脱程序为
。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的方法，所述液相色谱与质谱联用的方法中检测波长为210nm，离子流提取范围为144-146Da。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的方法，所述液相色谱与质谱联用的方法中色谱柱柱温为20℃～40℃之间，液相流速为0.8ml/min～1.2ml/min，进质谱的流速为0.2ml/min～0.4ml/min，液相检测器为紫外检测器，质谱检测器为ESI源离子阱质谱仪，离子源温度为200℃，离子传输管温度320℃，鞘气流30au，喷雾电压3KV，辅气0au，偏转电压80V，正离子模式。
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2015
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