CN106146665A - 一种用于制备针对甜菜夜蛾caspase‑5大亚基的抗体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于制备针对甜菜夜蛾caspase‑5大亚基的抗体的方法，包括以下步骤：使用氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽免疫动物后，收集所述动物的血清，然后从所述血清中纯化所述抗体。本发明还涉及由所方法得到的抗体。本发明还涉及用所述抗体检测甜菜夜蛾caspase‑5大亚基的方法。通过使用本发明的方法和抗体，可特异性地检测样品中甜菜夜蛾caspase‑5大亚基，并且为首次检测到昆虫细胞凋亡过程中caspase‑5蛋白的活化，即大小亚基断裂。对研究昆虫caspase基因家族的毒理学意义及以caspase为靶标的新杀虫剂的开发都具有重要意义。

Description

一种用于制备针对甜菜夜蛾caspase-5大亚基的抗体的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别地，涉及一种用于制备针对甜菜夜蛾caspase-5大亚基的抗体的方法。

背景技术

胱天蛋白酶(caspases)是存在于多细胞生物中的一类保守的天冬氨酸专一性半胱氨酸蛋白酶。胱天蛋白酶作为细胞凋亡的中枢效应器，在细胞凋亡的启动及进程中发挥着关键的作用。胱天蛋白酶家族成员通过对凋亡信号的募集、传递和执行，完成胱天蛋白酶成员之间的级联反应，推动细胞凋亡进程。胱天蛋白酶家族根据生理功能分为炎症和凋亡胱天蛋白酶两个亚家族。凋亡胱天蛋白酶又可以分为起始(initiator caspases)和执行胱天蛋白酶(effector caspases)。在细胞凋亡启动时，起始胱天蛋白酶的激活是细胞选择凋亡或生存的一个关键点，使其成为人类增生性和退化性疾病治疗的一个重要靶标。执行胱天蛋白酶进行选择性的有顺序的一系列蛋白切割反应，推进细胞凋亡过程。因此，胱天蛋白酶系作为细胞凋亡的中枢效应器，在细胞凋亡的启动及进程中发挥着关键的作用。

正常情况下，胱天蛋白酶在体内均以无活性的酶原形式存在于胞质溶胶中。胱天蛋白酶酶原分子由一个大亚基(p20)，小亚基(p10)和N端前域组成。胱天蛋白酶酶原的N端前域比较长，并且其中包含募集域(caspase-recruiment domains,CARDs)或死亡效应域(death effector domains，DEDs)。酶原分子激活后，N端前域和大小亚基都被切割分离，分离的大小亚基之间形成异二聚体，两个异二聚体形成一个四聚体，即成熟的胱天蛋白酶。在成熟的胱天蛋白酶中，大亚基处于外周，小亚基处于内部，并且构成四聚体的两个异二聚体各自具有一个活性中心。

本课题组鉴定了甜菜夜蛾caspase-5的编码基因，其全长序列为1659bp，其中5’UTR和3’UTR分别为134bp和160bp，并且甜菜夜蛾caspase-5的5’UTR中第一个碱基是G，据推测有可能是转录起始位点；编码区中开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)长度为1365bp，编码455个氨基酸。在结构上包含一个长的N端前域，其中包含有募集结构域(CARD)；大亚基和小亚基。氨基酸序列比较分析表明，甜菜夜蛾caspase-5氨基酸序列与鳞翅目昆虫斜纹夜蛾，棉铃虫及家蚕caspase-5的同源性为60.72％。

为了研究甜菜夜蛾caspase-5执行其生物学功能过程中的作用机制，必须制备甜菜夜蛾caspase-5抗体，尤其是其大亚基的抗体来特异性地检测甜菜夜蛾caspase-5及其大亚基。

然而，目前本领域中，尚未能制备出甜菜夜蛾caspase-5大亚基的抗体。而且在鳞翅目昆虫中，目前只是有推测的N端以及大小亚基的断裂位点，并没有实际的实验证明。Caspase-5作为起始胱天蛋白酶，通过募集凋亡信号并切割活化执行胱天蛋白酶。而这些功能在昆虫也没有直接的证据证明。甜菜夜蛾caspase-5的蛋白结构抗原性比较弱，并不是随便选取一段肽段就能得到针对甜菜夜蛾caspase-5尤其是其大亚基的抗体。发明人曾试着选取了全长的caspase-5作为免疫原来制作抗体，结果免疫兔子的过程中发现兔子无法耐受，发明人又曾多次选取一些区段的肽段作为抗原来作为抗体，结果也未得需要的抗体。例如，参见图4，发明人选取部分N端前域和大部分大亚基序列(85-346aa)作为免疫原来免疫兔子，所得的血清只能检测到caspase-5全酶，但是检测不到caspase-5大亚基。

因此，需要一种针对甜菜夜蛾caspase-5大亚基的抗体，以及用于制备该抗体的多肽。

发明内容

为解决以上技术问题，已经进行的多次实验推论，猜测N端前域有可能对caspase-1分子的折叠或加工有影响，部分N端前域的缺失导致所表达的多肽的部分区段尤其是大亚基区段不能正确折叠或加工，因此可能导致所得到的多肽不含大亚基区段的大部分或全部抗原位点。因此，发明人试着选取包括全部N端前域和部分大亚基序列(1-200aa，SEQ IDNO:1)作为免疫原来制备针对甜菜夜蛾caspase-1大亚基的抗体，出人意料的是，由此制备的抗体确实能够识别甜菜夜蛾caspase-1大亚基。

基于此，本发明提供了一种用于制备针对甜菜夜蛾caspase-5大亚基的抗体的方法，包括以下步骤：使用氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽作为抗原免疫动物后，收集所述动物的血清，然后从所述血清中纯化得到所述针对甜菜夜蛾caspase-1大亚基的抗体。

进一步地，所述多肽通过表达序列如SEQ ID NO:2所示的基因得到。

进一步地，所述动物为兔子。

进一步地，所述多肽通过以下方法来得到：将所述基因插入至pET16b质粒载体中，然后将携带所述基因的pET16b载体转入原核表达宿主中进行表达。

进一步地，所述方法包括以下步骤：

1)从甜菜夜蛾组织中提取总RNA，将所述总RNA反转录成cDNA；；

2)以所述cDNA为模板，用SEQ ID NO:3所示的引物-1和SEQ ID NO:4所示的引物-2进行PCR扩增得到序列如SEQ ID NO:2所示的DNA片段；

3)将所述DNA片段插入到质粒pET16b的内切酶位点BamH I和Xho I之间，形成重组质粒，并用所述重组质粒转化表达宿主中，诱导转化有所述重组质粒的表达宿主表达序列如SEQ ID NO:1所示的多肽；

4)用所述多肽作为抗原免疫兔子，并在第一次免疫后第2周和第6周加强免疫，最后一次免疫2周后收集被免疫的兔子的血清，即得到包含针对甜菜夜蛾caspase-5大亚基的抗体的血清；

5)使用亲和层析的方法对所述血清进行纯化，得到所述针对甜菜夜蛾caspase-1大亚基的抗体。

本发明还提供了一种针对甜菜夜蛾caspase-5大亚基的抗体，其由上述方法制备得到。

本发明还提供了一种用于检测甜菜夜蛾caspase-5大亚基的方法，包括使用上述抗体检测样品中是否存在甜菜夜蛾caspase-5大亚基。

进一步地，所述检测通过蛋白免疫印迹、免疫荧光染色或免疫组化染色进行。

经过Western-blot试验，发现该多克隆抗体能够检测到喜树碱及羟基喜树碱诱导的甜菜夜蛾细胞凋亡过程中，caspase-5的活化，即大亚基的形成。本抗体的成功制备以及应用，为首次检测到昆虫细胞凋亡过程中caspase-5蛋白的活化，即大小亚基断裂。对研究昆虫caspase基因家族的毒理学意义及以caspase为靶标的新杀虫剂的开发都具有重要意义。

附图说明

图1为caspase-5基因片段的PCR结果电泳照片；

图2为caspase-5片段的SDS-PAGE电泳照片；

图3为本发明的抗体检测caspase-5全酶和大亚基的蛋白免疫印迹照片；

图4为使用85-346aa的免疫兔子得到的血清进行蛋白免疫印迹照片。。

具体实施方式

以下结合实例和附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.甜菜夜蛾Caspase-5基因片段的克隆和表达

1.1总RNA提取

采用QIAGEN公司RNA提取试剂盒(Mini Kit)与反转录试剂盒(RT Kit)，根据说明书指示操作。

(1)用配制好的0.1％DEPC水浸泡各类枪头与离心管，于37℃下过夜处理，第二天将处理好的用具在121℃高压灭菌30min，室温保存，为RNA提取做好准备；

(2)裂解细胞，释放RNA：将传代3日后的IOZCAS-Spex-II细胞培养液4.5mL置于2mL小管中，若细胞数小于5×10⁶个，取350μL buffer RLT裂解，若细胞数小于1×10⁷个，取600μL buffer RLT裂解，在涡旋器上涡旋30s，加入1体积的70％的乙醇，搅拌混匀；

(3)转柱富集RNA：将细胞裂解液转到RNeasy mini柱中，于10,000×g转速下离心15s，弃去流动相，RNA被固定于膜上；

(4)加入700μL buffer RWL到RNeasy mini柱中，于10,000×g转速下离心15s，弃去流动相；

(5)加入500μL buffer RPE到RNeasy mini柱中，于10,000×g转速下离心15s，弃去流动相；

(6)加入500μL buffer RPE到RNeasy mini柱中，于10,000×g转速下离心2min，弃去流动相，然后继续空管全速离心1min抽去过多液体；

(7)将RNeasy mini柱转移到1.5mL离心管中，垂直于微膜加入20μL无RNAase的灭菌DEPC水，于10,000×g转速下离心1min，所收集到的流体即RNA原液，同时取2μL原液于1.0％琼脂糖凝胶中电泳中检测RNA完整性，最终将原液保存于-80℃中，为转录工作做准备。

1.2采用QIAGEN公司反转录试剂盒(RT Kit)，根据说明书指示操作，反转录出cDNA。

1.3目的片段的扩增

以上述cDNA为模板，用引物-1：atcggatccATGCAGAGAGAACACAGAGAAGC(SEQ ID NO:3)和引物-2：agcctcgagttaGTACGTGAAGTCGAGCAAGAT(SEQ ID N0：4)进行PCR扩增反应，扩增体系如下：

PCR仪按照如下程序进行：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火温度30s，72℃延伸30s，共进行30个循环，最后72℃延伸10min后终止反应。

如图1所示，扩增后得到扩增甜菜夜蛾Caspase-5基因中1-600nt的片段(SEQ IDN0：2)，并且两端带有BamH I和Xho I酶切位点。

通过琼脂糖电泳和DNA纯化提取试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)纯化扩增得到的DNA片段。

1.4目的片段插入质粒PET16b多克隆位点

BamH I和Xho I酶切条件不同，有必要单独分开连接，因此其各自酶的反应体系如下：

质粒pET16b和目标序列在30℃条件下进行BamH I单酶切1小时，酶切后的DNA还要经过如下步骤沉淀分离：加入2μL 3M CH₃COONa(pH5.2)和2倍原体积的冰冷无水乙醇，均匀混合后在-20℃下静置30min，然后在10,000rpm转速下离心5min回收沉淀，用70％乙醇清洗沉淀，离心后干燥获得单酶切后的DNA片段，用于下一步单酶切。酶切体系如下：

BamH I酶切体系

XhoI酶切体系

BamH I酶切后的质粒pET16b和目标序列在37℃条件下进行Xho I单酶切1小时，酶切后的产物要经1％琼脂糖凝胶电泳，检测是否发生完整酶切，然后经2％琼脂糖凝胶电泳分离纯化。

将分别酶切后的质粒和目的片段在T4DNA连接酶的作用下连接，4℃静置过夜，形成重组质粒，连接反应体系如下：

连接产物用于转化DH5α感受态细胞，37℃培养过夜，经蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，小量制备质粒，用PCR扩增，限制性酶切和测序鉴定正确后，将得到重组质粒用于接下来的操作。

1.5甜菜夜蛾caspase-5蛋白的1-200aa片段(SEQ ID NO:1)的表达和纯化

通过以下方法表达该多肽片段：

1)用重组质粒转化表达宿主BL21(DE3)，通过酶切检测正确后将携带重组质粒的BL21(DE3)接种至液体培养基中，37℃过夜培养过夜；

2)将上述培养得到的菌液按照1:50的比例转接入20mL新鲜的氨苄抗性LB培养基中，37℃振荡培养至对数中期；

3)加入终浓度为0.1mM的IPTG(设置1管对照，不加入IPTG)诱导表达，于室温继续振荡培养；

4)分别于诱导后1hr和3hr收集1mL菌液，12000rpm离心1min收集菌体沉淀；

5)用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳分析表达结果。

SDS-PAGE电泳结果(图2)显示，得到了40KD左右的目标多肽，然后进行大体系表达。收集经诱导的菌体后，超声破碎菌体，并过镍柱纯化，得到纯化的目标多肽。

2.针对甜菜夜蛾caspase-5大亚基的抗体的制备

通过免疫兔子来得到针对甜菜夜蛾caspase-5大亚基的抗体，方法如下：

1)取1mg各组免疫原溶解在500μl PBS缓冲中，与等量弗氏完全佐剂彻底混合，乳化可以在用多聚乙烯管连接的两个一次性注射器之间进行，当乳化完成时，一滴乳化液在水面上呈现球形；

2)选择6只13周龄雄性新西兰大白兔，免疫前采血0.5mL作为样本对照，首次免疫混合弗氏完全佐剂(1:1,v/v)，在0.5mL弗氏完全佐剂中加入0.5mL抗原溶液，用2mL注射器抽拉该乳化液，排除注射器中的气泡；

3)每只兔子的免疫体积为1mL。免疫方式为后颈部皮下注射。免疫后第2周和第6周用不完全弗氏佐剂(IFA)进行加强免疫，免疫剂量相同，最后一次免疫2周后收集血，37℃1hr,然后3500rpm收集血清，收集血清，分装并-80℃保存。对最后一次血清进行蛋白免疫印迹检测。

得到的血清可通过蛋白-Sepharose 4B亲和层析进行纯化。

3.样品中甜菜夜蛾caspase-5全酶及其大亚基的检测

使用蛋白免疫印迹的方法来检测样品中甜菜夜蛾caspase-5全酶及其大亚基，方法如下：

1)SDS-PAGE电泳：取10μl蛋白样品(0.01ng/孔)与2×SDS上样缓冲液，沸水煮样品5min，将样品小心注入12％SDS-PAGE凝胶上样孔，80伏电压跑浓缩胶，待溴酚蓝进入分离胶后将电压调为100伏；

2)转膜：待溴酚蓝跑到凝胶底部时，结束电泳，按照滤纸、胶、硝酸纤维素膜、滤纸的顺序放到夹子上(注意之间不要存在气泡，膜靠近正极)，80mA恒流转膜60min，用丽春红染色看蛋白转移效果；

3)封闭：封闭液(含5％脱脂奶粉的TBST)室温轻摇封闭3h。

4)一抗结合：用封闭液按一定比例稀释一抗，将膜和稀释后的抗体封闭在封口膜中，4℃过夜，TBST振荡洗膜5次，每次3min；

5)二抗结合：用封闭液按一定比例稀释二抗(辣根过氧化物酶偶联的IgG)，室温轻摇1h，TBST振荡洗膜5次，每次3min；

6)显影：将化学发光底物涂在膜上显色4min，压片、曝光、显影、定影。

结果(图3)显示，该抗体可特异地检测出甜菜夜蛾caspase-5全酶及其大亚基。图中第2和7泳道为未处理的样品，免疫印迹大小为约52kDa，第3和8泳道为DMSO分别处理24小时和48小时的阴性对照样品，免疫印迹大小为约52kDa，与甜菜夜蛾Caspase-5蛋白的理论分子量大小一致，第4、5、9、10泳道为分别用喜树碱和羟基喜树碱处理24小时和48小时的样品，检测到Caspase-5断裂形成大亚基，约36kDa(箭头标示)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于制备针对甜菜夜蛾caspase-2大亚基的抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：使用氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽作为抗原免疫动物后，收集所述动物的血清，然后从所述血清中纯化得到针对甜菜夜蛾caspase-1大亚基的所述抗体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽通过表达序列如SEQ ID NO:2所示的基因得到。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物为兔子。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多肽通过以下方法来得到：将所述基因插入至pET16b质粒载体中，然后将携带所述基因的pET16载体转入原核表达宿主中进行表达。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)从甜菜夜蛾组织中提取总RNA，将所述总RNA反转录成cDNA；；

2)以所述cDNA为模板，用SEQ ID NO:3所示的引物-1和SEQ ID NO:4所示的引物-2进行PCR扩增得到序列如SEQ ID NO:2所示的DNA片段；

3)将所述DNA片段插入到质粒pET16b的内切酶位点BamH I和Xho I之间，形成重组质粒，并用所述重组质粒转化表达宿主中，诱导转化有所述重组质粒的表达宿主表达序列如SEQ ID NO:1所示的多肽；

4)用所述多肽作为抗原免疫兔子，并在第一次免疫后第2周和第6周加强免疫，最后一次免疫2周后收集被免疫的兔子的血清，即得到包含针对甜菜夜蛾caspase-5大亚基的抗体的血清；

5)使用亲和层析的方法对所述血清进行纯化，得到所述针对甜菜夜蛾caspase-1大亚基的抗体。

6.一种针对甜菜夜蛾caspase-5大亚基的抗体，其特征在于，由权利要求1-5中任一项所述方法制备得到。

7.一种用于检测甜菜夜蛾caspase-5大亚基的方法，其特征在于，使用权利要求6所述的抗体检测样品中是否存在甜菜夜蛾caspase-5大亚基。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述检测通过蛋白免疫印迹、免疫荧光染色或免疫组化染色进行。