CN106146473B - 一种抗血管新生化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗血管新生的新化合物及其制备方法和用途。本发明化合物具有良好的抗血管新生作用，初步认为该类化合物是通过抑制VEGFR2(即KDR)产生活性的。该类化合物可用于对新生血管、VEGFR2、PDGFR‑β、KIT等蛋白激酶异常所致疾病的治疗，如湿性黄斑变性、恶性肿瘤等。
Figure DDA0001045100860000011

Description

一种抗血管新生化合物
本申请为申请号201410125752.0、申请日2014年3月28日，发明名称“一种抗血管新生化合物”的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种新化合物和用途。
背景技术
血管新生(angiogenesis)，是从已有血管发芽生成新血管的过程。这一过程与血管内皮细胞迁移和增殖相关。血管新生与多种人类重大疾病有关，如恶性肿瘤。目前发现，眼部血管新生性疾病，包括年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病视网膜病变、新生血管性青光眼等，这类疾病的共同特点都在于眼部新生血管的异常增生(金晓，等，抗VEGF药物在眼科疾病中的应用及机制研究进展，中外医疗，2012年)。
其中，黄斑变性主要有干性和湿性两种，湿性黄斑变性(AMD)的特点是，脉络膜的新生血管进入视网膜下以及继而发生的出血、渗出及水肿等病理变化。湿性迅速丧失视力，较干性更为严重。目前，在湿性黄斑变性的治疗方面已有较好的进展。早期的激光烧烁止血被血管内皮因子拮抗剂所代替，但因后者效果不佳，很快被光动力疗法所取代。光动力疗法虽然提高了疗效，但仍不理想。近年又出现了新的血管内皮因子拮抗剂Lucentis(雷珠单抗)，是一种人源性VEGF亚型单克隆抗体片段的重组体，可减少新生血管生成。2006年，该药物被美国FDA批准用于治疗湿性黄斑变性，疗效良好；同时，目前也发现该类抗VEGF药物对糖尿病视网膜病变、新生血管性青光眼有治疗作用。但由于Lucentis为抗体药，价格极高，它还不能在全世界普及。因此，研究疗效良好、价格低廉的小分子新生血管抑制剂药物是当今国际制药界激烈竞争的焦点。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种新化合物，及其制备方法和用途。
本发明提供了如式A所示的化合物及其药学上可接受的盐或前体药物：
Figure BDA0001045100840000011
其中，Z0为O或S；X为C，Y为N；；Z1、Z2分别独立选自N或-CR8；
r7选自氢或C1-C6烷基；r8选自氢或C1-C6烷基；r10选自H、氨基、羟基、巯基、C1-C6烷基或-(CH2)n1NHr1，其中，n1＝1-5，r1为H或C1-3的烷基；
r9选自H、氨基、羟基、巯基、(C-r11r12)nNr13r14、(C-r11r12)nOr15、(C-r11r12)nC(O)Er13、(C-r11r12)nS(O)mr17；或r8和r9与它们所连接的原子一起形成饱和的4-7元杂环或取代杂环，其中，杂环或取代杂环含有1或2个选自N，O或S的杂原子，其取代基为0，1，或2个，分别独立地选自氧代基团，C1-C6烷基，C1-C6卤代烷基，C1-C6烷氧基，C1-C6卤代烷氧基，C1-C6烷酰基、C1-C6烷胺基、C3-C7环烷基、卤素，羟基，氨基，羰基，氨基羰基，C1-C6氨烷基羰基，C1-C4酰基，C1-C6烷氧基羰基，C1-C6磺酰基，氨基磺酰基；
Ar2选自苯基，萘基，单环或二环杂芳基，二环或三环杂环基，其中每个杂芳基或杂环基有1，2，3或4个选自N，O或S的杂原子；所述的苯基，萘基，杂芳基或杂环基团是未取代或取代的苯基，萘基，杂芳基或杂环基团，其取代基为1，2，或3个，分别独立地选自C1-C8烷基，C1-C8卤代烷基，羟基C1-C6烷基，C1-C8烷氧基，C1-C8卤代烷氧基，卤素，羟基，氨基，氨基C-C6烷基，C1-C6烷基氨基，苯基，C3-C7环烷基，螺环的C3-C7环烷基，氨基磺酰基，C1-C6烷基氨基磺酰基；
m为0，1，或2；n为0，1，2，或3；E为空、氧或-Nr18；
r11，r12和r18是相同或不同的，分别独立选自氢或C1-C4烷基；r13，r14，r15，r16和r17独立选自氢，C1-C6烷基，C1-C6酰基，苯基和杂环，或取代的C1-C6烷基，C1-C6酰基，苯基和杂环，其取代基为为0、1或2个，分别独立选自C1-C4烷氧基，C1-C4烷基、卤素、羟基、氨基、C1-C6氨烷基。
进一步地，所述化合物结构式如下：
Figure BDA0001045100840000021
其中，X为C，Y为N；
R1选自H、氨基、羟基或巯基；R2选自H、氨基、羟基、巯基或-(CH2)nNHR8，其中，n＝1-5，R8为H或C1-3的烷基；R3选自H或C1-6烷基；R4、R5、R6分别独立选自H、卤素、C1-6的烷基或卤素取代烷基；R7选自H、C1-6的烷基或卤素；
或者，R2、R3与其相连的碳原子共同构成取代或非取代的含1-2个杂原子的五元或六元环，所述杂原子为N、O或S，其取代基为C1-6的烷基。
进一步地，X、Y不相同；R1选自H或氨基；R2选自H、氨基或-(CH2)nNHR8，其中，n＝1-3，R8为H或C1-2的烷基；R3选自H或C1-2烷基；R4、R5、R6分别独立选自卤素、C1-2的烷基或卤素取代烷基；R7选自H或卤素；
或者，R2、R3与其相连的碳原子共同构成取代或非取代的含1个N的五元或六元环，取代基为C1-3的烷基。
更进一步地，R2选自氨基或-(CH2)nNHR8；或者，R2、R3与其相连的碳原子共同构成取代或非取代的含1个N的五元或六元环，取代基为C1-3的烷基。
进一步，所述化合物结构式如下：
Figure BDA0001045100840000031
化合物为式II时，W1、W2分别独立选自C或杂原子，n＝1或2；R9为H、C1-C4烷基或卤素；R10为卤素；其中，n＝1时，W1、W2不同时为C；优选地，n＝1时，W1、W2同时为杂原子，杂原子优选为N；n＝2时，W1、W2同时为C；
化合物为式III时，W3选自C或杂原子，杂原子优选为N；R10为卤素。
更进一步地，所述卤素为F或Cl。
优选地，所述化合物为：
Figure BDA0001045100840000032
本发明还提供了上述化合物及其药学上可接受的盐或前体药物在制备血管新生抑制剂中的用途。
进一步地，所述血管新生抑制剂为血管内皮生长因子受体2抑制剂。
更进一步地，所述抑制剂是抗眼部血管新生的药物。
进一步地，所述药物是脉络膜新生血管抑制剂。
更进一步地，所述药物是治疗或预防湿性黄斑变性、糖尿病视网膜病变或新生血管性青光眼的药物。
本发明还提供了上述化合物及其药学上可接受的盐或前体药物在制备VEGFR2、PDGFR-β或/和KIT抑制剂类药物中的用途。
本发明还提供了一种药物组合物，它是含有上述化合物及其药学上可接受的盐的眼用制剂。除了本发明提供的上述化合物以外，制剂中还可以包含其他已知具有相似治疗用途的药物。
进一步地，所述眼用制剂为滴眼剂、眼膏剂或眼用注射液。
在本领域中已知的方法可制备本发明化合物的盐。用酸处理，或与合适的阴离子交换剂，与上述化合物可成盐。本发明的化合物的药学上可接受的盐，可以从上述化合物具有碱性氮原子的有机或无机酸加成盐。
优选地，合适的无机酸包括但不限于，氢卤酸，如盐酸，硫酸，或者磷酸。
优选地，合适的有机酸包括，但不限于，羧酸，磷酸，磺酸或氨基羧酸，例如乙酸，丙酸，辛酸，癸酸，十二烷酸，羟基乙酸，乳酸，富马酸，琥珀酸，己二酸，庚二酸，辛二酸，壬二酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸，氨基酸，如谷氨酸或天冬氨酸，马来酸，羟基酸，甲基马来酸，环己烷羧酸，金刚烷羧酸，苯甲酸酸，水杨酸，4氨基水杨酸，邻苯二甲酸，苯乙酸，扁桃酸，肉桂酸，甲烷或乙烷磺酸磺酸，2-羟基乙磺酸，乙烷-1，2-二磺酸，苯磺酸，2-萘磺酸，1，5-萘二磺酸，2-甲基苯磺酸，对甲基苯磺酸，乙基硫酸，十二烷基硫酸的酸，N环己基氨基乙酸，N-甲基-N-乙基-N-丙基-氨基磺酸，或其它有机酸，如抗坏血酸。
另外，它也可以药学上不可接受的盐用于分离或纯化中，例如苦味酸盐或高氯酸盐。但是，用于治疗用途的，只能是药学上可接受的盐或游离化合物，以适用的药物制剂的形式。
本发明所述药学上可接受的前体药物，是指所述化合物经过化学结构修饰后得到的在体内经酶或非酶的转化释放出活性成分而发挥药效的化合物。本发明的一种实施方式中，还包括了同位素标记的上述化合物或其药学上可接受的盐，所述同位素标记化合物是指与本文中所列化合物相同，但是其中的一个或多个原子被另一个原子取代，该原子的原子质量或质量数不同于自然界中常见的原子质量或质量数。可以引入化合物中的同位素包括氢、碳、氮、氧、硫，即2H，3H、13C、14C、15N、17O、18O、35S。含有上述同位素和/或其它原子同位素的化合物及其立体异构体，以及该化合物、立体异构体的可药用的盐均应包含在本发明范围之内。
本发明中的关键中间体和化合物进行分离和纯化，所使用的方式是有机化学中常用的分离和纯化方法且所述方法的实例包括过滤、萃取、干燥、旋干和各种类型的色谱。可选择地，可以使中间体不经纯化即进行下一步反应。
在某些实施方式中，本发明的一种或多种化合物可以彼此联合使用。也可选择将本发明的化合物与任何其它的活性试剂结合使用，用于制备调控细胞功能或治疗疾病的药物或药物组合物。如果使用的是一组化合物，则可将这些化合物同时、分别或有序地对受试对象进行。
本发明化合物具有良好的抗血管新生作用，初步认为该类化合物是通过抑制VEGFR2(即KDR)产生活性的。该类化合物可用于对新生血管、VEGFR2等蛋白激酶异常所致疾病的治疗，如湿性黄斑变性、恶性肿瘤等。
附图说明
图1 本发明化合物对斑马鱼血管发育的抑制作用
图2 阴性对照结果图，其中，斑马鱼血管发育正常
图3 药物组结果图，其中，斑马鱼血管发育部位被本发明化合物部分抑制
图4 药物组结果图，其中，斑马鱼血管发育部位被本发明化合物完全抑制
图5 本发明化合物对VEGFR2体外抑制作用
图6 本发明化合物KDR4脉络膜新生血管的抑制作用，其中，A：阴性对照，B：KDR4
图7 本发明化合物V01脉络膜新生血管的抑制作用，其中，A：阴性对照，B：V01
图8 化合物V01的核磁图
图9 化合物V3的质谱图
图10 化合物V4的质谱图
图11 化合物V5的质谱图
图12 化合物V5的核磁图
图13 化合物V6的质谱图
图14 化合物KDR3的质谱图
图15 KDR4化合物质谱图
图16 KDR6的质谱图
图17 KDR6A的质谱图
图18 KDR8的质谱图
图19 KDR8A的核磁图
图20 KDR8A的质谱图
图21 KDR8B的质谱图
图22 化合物V01的剂量效应曲线
图23 化合物V01对小鼠眼部新生血管和出血的影响，A：右眼V01处理，B：左眼PBS对照
具体实施方式
实施例1 本发明中间体的制备
Figure BDA0001045100840000051
步骤如下：
第1步：混和米氏酸(75.3g、0.522mol)和原甲酸三乙酯(92mL，0.55mol)，加热至55℃，维持90分钟，然后冷却到45℃。化合物1(92g、0.5mol)溶于甲醇(200mL)，并加入到反应混合物中反应45分钟，同时保持反应混合物的温度低于50℃，然后在室温下搅拌过夜，薄层色谱(PE/EA＝3：1)监控至反应完成。反应混合物被冷却到0℃，沉淀物过滤，干燥后得到白色固体纯化合物2(155.9g，产量：96％)。
第2步：化合物2(155.9g、0.441mol)在Dowtherm A热导管中(1.1L)被加热到100℃，然后慢慢添加到连接有Dowtherm A热导管的烧瓶中(500mL，预热到210℃)中，同时保持温度高于207℃。反应物在210℃下搅拌反应一个小时，然后冷却到室温。过滤收集的沉淀，用乙醚、丙酮洗后，干燥后得到棕色的固体纯化合物3(67g、产量：61％)。
第3步：在室温下，伴随搅拌并往三氯氧磷P℃l3(35mL)中添加化合物3(10g、0.0398mol)。添加后，反应混合物回流搅拌3个小时，薄层色谱(二氯甲烷DCM/甲醇＝10：1)跟踪反应完成，再将反应混合物注入冰水，碳酸钠碱化调pH＝8，然后以乙酸乙酯萃取，收集有机相，用盐水洗涤，以Na2SO4干燥后，粗产物再由硅胶柱色谱(石油醚PE/乙酸乙酯EA＝20：1，1：1)，得到淡黄色固体纯化合物4(6.0g，产量：56％)。
第4步：将化合物4(10.0g，37mmol)、锌粉(0.36g、5.55mmol)、Zn(CN)2(2.69g、22.9Zn)，dppf(8.82g、15.9mmol)和Pd2(dba)3(7.8g、8.51mmol)混合于DMA(50mL)中，80℃搅拌过夜。薄层色谱(PE/EA＝5：1)跟踪至几乎所有的化合物4被消耗。将反应混合物冷却到室温后倒入水中，过滤，滤液以乙酸乙酯提取，收集有机相，用盐水洗涤，在Na2SO4上干燥浓缩获得粗产物，硅胶柱色谱纯化(PE/EA＝50：1，10：1)获得淡黄色固体纯化合物5(6.0g，产量：62.3％)。
第5步：混合化合物5(6.0g、23.08mmol)、氢氧化钠(10g、250mmol)在乙二醇(70mL)和水(10mL)在回流蒸馏器搅拌3小时。薄层色谱(DCM/甲醇＝10：1)跟踪至反应完成。将反应混合物冷却到室温，加入柠檬酸水溶液并酸化到pH＝4，过滤，沉淀干燥后得到淡黄色固体纯化合物6(6.0g，产量：93.2％)。
第6步：搅拌混和化合物6(6.0g、21.5mmol)于甲醇(100mL)中，在0℃逐滴添加SOCl2(4.7mL，64.5mmol)。添加后，反应混合物在室温下搅拌1个小时，然后加热回流过夜。薄层色谱(DCM/甲醇＝10：1)跟踪至反应完成。将反应混合物蒸发除去大部分溶剂，残留物注入冰水，添加固体碳酸钠调节pH＝8，并用乙酸乙酯提取，收集有机相，用盐水洗涤后，在Na2SO4上干燥，浓缩获得褐黄色固体化合物7(3.9g，产量：61.9％)。
第7步：混和化合物7(3.9g、13.3mmol)和10％Pd/C(1.0g)在甲醇(150mL)中，在室温下H2气中搅拌2小时。薄层色谱(PE/EA＝2：1)跟踪至反应完成。将反应混合物过滤，滤液浓缩后得到棕色的固体化合物8(2.6g，产量：96.3％)。
第8步：搅拌混和化合物8(0.5g、2.46mmol)于甲醇(5mL)中，室温下添加2N NaOH(2.5mL，5mmol。添加后，反应混合物在室温下搅拌夜。薄层色谱(DCM/甲醇＝10：1)指示反应完成。将反应混合物蒸发，残留物用水稀释，并用乙酸乙酯提取，弃去乙酸乙酯层，水相添加柠檬酸水溶液并调节pH＝2，过滤，沉淀干燥后得到纯化合物9(0.4g，产量：86％)。
第9步：混和化合物9(0.4g、2.11mmol)、3-三氟甲基苯胺(375mg，2.32mmol)，HATU(960mg，2.53mmol)和DIPEA(820mg，6.33mmol)在DMF(5mL)室温下于N2中搅拌过夜。薄层色谱(DCM/甲醇＝10：1)显示反应完成。将反应混合物用水稀释后乙酸乙酯提取，收集有机相，用盐水洗涤，在Na2SO4上干燥浓缩后获得粗产物，由硅胶柱色谱纯化后获得黄色的固体纯化合物10(0.4g，产量：57％)。
实施例2 化合物V01(本发明中亦可记为V01)的制备
步骤1：
Figure BDA0001045100840000071
化合物11A(20g、0.15mol)、DMAP(1.9g、15.4mmol)和(BoC)2O(75g，0.34mol)，在四氢呋喃(750mL)中混合，反应混合物在室温搅拌过夜。薄层色谱(PE/EA＝3：1)显示反应完成。将反应混合物浓缩后悬浮于PE/EA(10：1，200mL)，过滤后得到白色固体纯化合物11(50g，100％)。
步骤2：
Figure BDA0001045100840000072
混合化合物10(50mg，0.15mmol)和Cs2CO3(150mg，0.45mmol)于DMSO(1mL)中，在N2中室温搅拌半个小时，然后加入化合物11(60mg)。由此产生的反应混合物搅拌半个小时，用薄层色谱(DCM/甲醇＝10：1)检测至反应完成。将反应混合物加水稀释后，用EA提取，收集有机相，用盐水洗涤，以Na2SO4干燥后，色谱纯化后制备黄色的固体纯化合物12(30mg，32％)。
室温下N2中搅拌混合化合物12(20mg，0.032mmol)和TFA(0.1mL)半个小时。薄层色谱(DCM/甲醇＝10：1)显示至反应完成。将反应混合物由Na2CO3碱化后，用DCM提取，收集有机相，用盐水洗涤，以Na2SO4上干燥，浓缩后获得粗产物，由硅胶柱色谱纯化后获得黄色的固体纯化合物V01(4.5mg，33％)，结构鉴定参见图8。
实施例3 化合物V3(本发明中亦可记为V03)的制备
步骤1：
Figure BDA0001045100840000073
搅拌混和化合物13(5.0g，45mmol)和吡啶(200mL)，65℃下将(Boc)2O(14.7g，67.5mmol)滴加到上述混合物中。添加后，在85℃搅拌反应4小时。薄层色谱(DCM/甲醇＝10：1)跟踪至反应完成后，将反应混合物冷却到0℃，加入浓HCl(100mL)和H2O(50mL)，EA提取后，收集有机相，用NaHCO3水溶液洗涤，以Na2SO4干燥后，得到黄色的油状物，将其悬浮于Et2O，过滤，获得白色固体化合物14(4.3g，产量：45.2％)。
搅拌混和化合物14(2.4g、11.4mmol)和N，N二甲基苯胺(6.6mL)于DCM(84mL)中，0℃N2中，滴加POCl3(3.2mL，34.2mmol)。添加后，反应混合物在室温下搅拌2小时。薄层色谱(PE/EA＝2：1)跟踪至反应完成后，将反应混合物注入冰水。有机相用盐水洗，在Na2SO4上干燥浓缩后获得粗产物，由硅胶柱色谱纯化，获得白色固体纯化合物15(1.8g，70％)。
在THF(1mL)中搅拌混和化合物15(100mg，0.47mmol)和DMAP(12mg，0.09mmol)，室温下加入(BOC)2O(124mg，0.57mmol)，然后室温下搅拌过夜。薄层色谱(PE/EA＝2：1)表明反应完成后，将反应混合物用水稀释，EA提取，收集有机相，用盐水洗，在Na2SO4上干燥浓缩后获得粗产物，由硅胶柱色谱纯化，获得白色固体纯化合物16(70mg，44.8％)。
室温下，在N2中DMSO(1mL)中搅拌混和化合物10(50mg，0.15mmol)和Cs2CO3(150mg，0.45mmol)半小时，然后加入化合物16(60mg，0.18mmol)，再搅拌半小时。薄层色谱(PE/EA＝2：1)表明反应完成后，将反应混合物用水稀释，EA提取，收集有机相，用盐水洗，在Na2SO4上干燥浓缩后获得粗产物，由硅胶柱色谱纯化，获得黄色固体纯化合物17(50mg，53.3％)。
步骤2：
Figure BDA0001045100840000081
室温下，在N2中DMSO(1mL)中搅拌混和化合物17(50mg，0.08mmol)和TFA(0.2mL)半小时。薄层色谱(DCM/甲醇＝10：1)表明反应完成后，这个反应混合物由Na2CO3碱化后，用DCM提取。有机相是用盐洗，在Na2SO4上干燥浓缩后获得粗产物，由硅胶柱色谱纯化后获得黄色的固体纯化合物V3(15mg，44％)，其结构鉴定数据参见图9。
实施例3化合物V4(本发明中亦可记为V04)的制备
步骤1：
Figure BDA0001045100840000082
搅拌混和化合物18(50g，0.47mol)于DCM(600mL)中，加入TEA(94g，0.93mol)，然后在0℃，N2中，滴加溴乙酸乙酯(94g，0.56mol)。反应混合物在室温下搅拌过夜。薄层色谱(PE/EA＝1：1)表明反应完成后，反应混合物用盐水洗，在Na2SO4上干燥浓缩后获得粗产物，由硅胶柱色谱纯化(用PE/EA＝20：1to10：1to5：1洗脱)，获得黄色油状纯化合物19(46g，51％)。
95℃下，在甲苯(800mL)搅拌混和化合物19(38g，196.65mmol)和TEA(29.9g，295mmol)，逐滴加入4-溴丁酸乙酯(72.9g，373.65mmol).加完后回流加热过夜。薄层色谱(PE/EA＝5：1)表明反应完成后，反应混合物浓缩，由硅胶柱色谱纯化(用PE/EA＝20：1to5：洗脱)，获得黄色油状纯化合物20(32g，yield：53％)。
在甲苯(800mL)中搅拌混和化合物20(32g，104.3mmol)，0℃下，加入t-BuOK(51.2g，456.3mmol)。添加后，反应混合物在室温下反应1小时。薄层色谱(PE/EA＝5：1)表明反应完成后，添加2N HCl调节pH＝6，然后EA提取，收集有机相，用盐水洗，在Na2SO4上干燥浓缩后获得粗产物21(17g，yield：62.5％)，为暗黄色油，可直接用于下一步反应，不需进一步纯化。
MeONa((11g，161.65mmol)溶于甲醇(280mL)，反应混合物被冷却到5℃，再加入乙酸甲脒(3.0g，29.15mmol)。搅拌反应混合物半个小时，再加入化合物21(17g、65.1mmol)。将反应混合物40℃搅拌过夜。薄层色谱(DCM/甲醇＝10：1)表明反应完成后，将反应混合物冷却到室温，蒸发除去大部分的溶剂。残留物水处理和EA提取，有机相用盐水洗，在Na2SO4上干燥浓缩后获得粗产物，由硅胶柱色谱纯化获得淡黄色固体纯化合物22(2.5g，产量：16％)。
在压力为0.5MPa H2中，搅拌过夜混和化合物22(2.5g，10.4mmol)，10％Pd/C(0.5g)和(B℃)2O(2.7g，12.4mmol)于MeOH(40mL)中。薄层色谱(DCM/甲醇＝10：1)表明反应完成后，将反应混合物过滤浓缩得到黄色固体纯化合物23(2.6g，100％)。
在1，2-DCE(64mL)中混和化合物23(1.6g，6.3mmol)，PPh3(3.33g，12.6mmol)和CCl4(2.93g，18.9mmol)，70℃加热1小时。薄层色谱(DCM/甲醇＝10：1)表明反应完成后，将反应混合物浓缩后，由硅胶柱色谱纯化获得淡黄色固体纯化合物24(1.38g，81％)。
室温N2中，在DMSO(2mL)中搅拌混和化合物10(100mg，0.3mmol)和Cs2CO3(300mg，0.9mmol)半个小时，再加入化合物24(97mg，0.36mmol)。反应混合物搅拌混合半小时。薄层色谱(DCM/MeOH＝10：1)表明反应完成后，反应物用水稀释，然后EA提取。有机相用盐水洗，在Na2SO4上干燥浓缩后获得粗产物，将反应混合物浓缩后由硅胶柱色谱纯化获得黄色固体纯化合物25(21mg，12.4％)。
步骤2：
Figure BDA0001045100840000091
室温N2中，中搅拌混和化合物25(21mg，0.037mmol)和TFA(0.2mL)半个小时。薄层色谱(DCM/MeOH＝10：1)表明反应完成。将反应混合物由Na2CO3碱化后，用DCM提取。有机相用盐水洗，在Na2SO4上干燥浓缩后获得粗产物，由硅胶柱色谱纯化后获得黄色的固体纯化合物V4(10mg，57.9％)，其结构鉴定数据参见图10。
实施例4化合物V5(本发明中亦可记为V05)的制备
步骤1：
Figure BDA0001045100840000101
(S)-1-苯基乙胺(10g，8.26mmol)和乙基乙酰丙酸(11.9g，8.26mmol)的1，2-DCE(200mL)溶液中，分批加入NaBH(OAc)3(35g，16.52mmol)。加完后，将反应混合物在室温下搅拌4小时。然后将反应混合物加入NaHCO3水溶液碱化，并以DCM萃取，分离有机相，并用饱和食盐水洗涤，在Na2SO4上干燥，并浓缩得到粗的化合物34(20.5g，收率：100％)，可不经进一步纯化直接用于下一步骤中。
在1，2-DCE(200mL)中搅拌混和化合物34(20.5g，82mmol)和乙醛酸乙酯((33mL，165mmol，50％的甲苯溶液)，NaBH(OAc)3(35g，165mmol)，在室温下搅拌4小时。然后将反应混合物用NaHCO3水溶液碱化，并以DCM萃取。分离有机相并用饱和食盐水洗涤，在Na2SO4干燥并浓缩得到粗的化合物35(26g，100％)，可不经进一步纯化直接用于下一步骤中。
化合物35(26g，78mmol)和t-BuOK(22g，156mmol)在甲苯(600mL)中的混合，搅拌回流过夜。然后将反应混合物用NaHCO3水溶液碱化并以DCM萃取。有机相用盐水洗涤，在Na2SO4干燥并浓缩，得到粗化合物36。
取粗化合物36通过硅胶色谱法(PE/EA＝20：1洗脱)纯化，得到纯的化合物37(3g)。
在乙醇(50mL)中的混合化合物37(3.0g，0.01mol)和甲脒乙酸盐(3.24g，0.03mol)，混合物中溶液中加入NaOEt(2.38g，0.035mol)。搅拌该反应混合物于90℃过夜，然后蒸发以除去大部分的溶剂。残余物用H2O稀释，用2N HCl酸化至pH为6，然后用DCM萃取。有机相用盐水洗涤，在Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过硅胶色谱法纯化，得到纯的化合物38(1.0g，收率：35.8％)，为黄色固体。
将化合物38(1.0g，10.4mmol)，10％的Pd/C(0.1g)和(B℃)2O(2.7g，12.4mmol)混合于MeOH(40mL)中，在压力为0.5兆帕的氢气中搅拌过夜。TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明反应完成。将反应混合物过滤，将滤液浓缩，得到粗产物，将其通过硅胶色谱法纯化，得到纯的化合物39(0.7g，产率：71％)，为黄色固体。
取化合物39(0.7g，6.3mmol)和三苯基膦PPh3(3.33g，12.6mmol)在四氯化碳(10mL)中混合，于80℃过夜搅拌。TLC(DCM/甲醇＝15：1)表明反应完成。将反应混合物浓缩，并将残余物通过硅胶色谱法纯化，得到纯的化合物40(0.4g，53.4％)，为浅黄色油状物。
在氮气下，化合物10(150mg，0.45mmol)和Cs2CO3(440mg，1.35mmol)于DMSO(2ml)中混合，在室温下搅拌半小时，然后加入化合物40(153mg，0.54mmol)。将所得的反应混合物搅拌半小时，TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明反应完成。将反应混合物用水稀释并用EA萃取。有机相用盐水洗涤，在Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过制备的TLC纯化，得到纯的化合物41(60mg，23％)，为黄色固体。
步骤2：
Figure BDA0001045100840000111
取化合物41(60mg，0.104mmol)和TFA(0.3mL)的混合物在氮气下，室温搅拌半小时。TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明反应完成。将反应混合物NaHCO3水溶液碱化并以DCM萃取。有机相用盐水洗涤，在Na2SO4上干燥浓缩，得到粗产物，将其通过制备的TLC纯化，得到纯化合物V5(20mg，40.3％)，为黄色固体，其结构鉴定数据参见图11、12。
实施例5化合物V6(本发明中亦可记为V06)的制备
步骤1：
Figure BDA0001045100840000112
配备有机械搅拌器和氯化钙管的3L的烧瓶中，装入化合物26(100g，0.716mol)和乙醇(1.0L)。将该混合物搅拌20分钟，然后滴加三乙胺(72.5g，0.716mol)。将所得的混合物搅拌10分钟，然后，加入丙烯酸乙酯(61.6g，0.716mol)。将反应混合物在室温下搅拌17小时。(BOC)2O(234.5g，1.08mol)在室温下逐滴加入。滴加结束后，将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物浓缩以除去大部分EtOH中。将残余物溶解在水(3L)中，并用Et2O(1L×3)萃取。合并的有机相用氯化铵(500L×3)水溶液和盐水(500L×3)洗涤，无水Na2SO4干燥，并浓缩得到粗的化合物28(300g，92％)，为黄色油状物，其用于下一步骤而无需额外的纯化。
钠(27.6g，0.765mol)加入无水乙醇(1.5L)中。当固体钠完全消失，将化合物28(300g，1.04mol)加入热溶液中。反应混合物回流过夜。薄层色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝4：1)表明起始原料完全被消耗。将反应混合物蒸发，将残余物溶解在水(1L)中，然后柠檬酸水溶液酸化至pH为6。然后将混合物用EtOAc(1升×3)萃取。将萃取液合并，并用盐水(1L×3)洗涤，在Na2SO4干燥并蒸发，得到化合物29(169g，63.4％)，为棕色油状物。该粗产物无需进一步纯化用于下一步骤。
甲醇钠(2.6g，48.58mmol)溶解于MeOH(50mL)中，并将该溶液冷却至5℃。加入醋酸甲脒(3.0g，29.15mmol)，将反应混合物搅拌半小时。再加入化合物29(5.0g，19.43mmol)，将反应混合物搅拌回流过夜。TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明反应完成。将反应混合物冷却至室温，并蒸发以除去大部分溶剂。将残余物用水处理并用EA萃取。有机相用盐水洗涤，在Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过硅胶色谱法纯化，得到纯的化合物30(680mg，收率：14.7％)，为浅黄色固体。
在0℃氮气下，三氯氧磷(P℃l3，174mg，1.26mmol)加入到搅拌混合有化合物30(100mg，0.42mmol)和N，N-二甲基苯胺(0.28mL)的DCM(4mL)中，加完后，将反应混合物倾入冰水中，通过加入固体碳酸钠碱化，然后用DCM萃取。有机相用盐水洗涤，在Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过制备TLC纯化，得到纯的化合物31(60mg，55.6％)，为白色固体。
在氮气下，化合物10(50mg，0.15mmol)和Cs2CO3(150mg，0.45mmol)混合于DMSO(1mL)中，混合物在室温下搅拌半小时，然后加入化合物31(46mg，0.18mmol)。将所得的反应混合物搅拌半小时，TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明反应完成。将反应混合物用水稀释并用EA萃取。有机相用盐水洗涤，在Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过制备的TLC纯化，得到纯的化合物32(13mg，15.7％)，为黄色固体。
步骤2：
Figure BDA0001045100840000121
氮气下，化合物32(13mg，0.038mmol)和TFA(0.1mL)的混合物室温下搅拌半小时。TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明反应完成。将反应用混合物用Na2CO3水溶液碱化和DCM萃取。有机相用盐水洗涤，在Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过制备TLC纯化，得到纯的化合物，V6(6mg，收率：56.3％)，为黄色固体，其结构鉴定数据参见图13。
实施例6 KDR3的制备方法
Figure BDA0001045100840000131
第1步：将化合物1(1.4克，0.01mmol)，4-(苄氧基甲基)-6-氯嘧啶(4.7克，0.02)和K2CO3(4.2克，0.03摩尔)在DMF(50mL)中混合，在100℃、N2下搅拌为5小时。TLC(PE/EA＝4：1)表明反应完成。将反应混合物冷却至室温并用水稀释，用EA萃取。收集有机相，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过柱层析纯化，得到纯的化合物2(3.0克，产率：90％)，为黄色固体。
步骤2：在N2气氛下，化合物2(1.2克，3.56毫摩尔)，水合肼(0.36克，7.12毫摩尔)和Raney Ni(0.2g)的THF(20mL)中的混合物回流搅拌1小时。TLC(PE/EA＝2：1)表明反应完成。将反应混合物过滤，过滤浓缩，得到粗产物，将其通过柱层析纯化，得到纯的化合物3(0.8克，产率：73％)，为黄色固体。
步骤3：在0℃在氮气下，将TCDI(0.78克，4.4mmol)和化合物3(0.9克，2.93mmol)在干燥的DCM(10mL)中缓慢混合。加完后，将反应混合物在室温下搅拌半小时。TLC(PE/EA＝1：1)表明反应混合物中完成。将反应混合物浓缩，得到粗产物，将其用闪蒸色谱法纯化，得到粗化合物4(1.0克，产率：100％)，为灰白色固体。
步骤4：将化合物4(1.1克，3.15毫摩尔)，4-甲基-5-(三氟甲基)苯1，2-二胺(0.6克，3.15毫摩尔)和碳二亚胺(1.2克，6.30毫摩尔)的THF(50毫升)在氮气下，回流下搅拌2小时。TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明，反应混合物中完成。与EA稀释该反应混合物，并过滤沉淀物。将滤液蒸发，得到粗产物，将其用柱色谱法(PE/EA＝10：1至4：1)纯化，得到纯的化合物5(0.8克，产率：50％)，为棕色油状物。
步骤5：化合物5(0.7克，1.38毫摩尔)和TFA(15ml)中的混合物于60℃过夜搅拌。将反应混合物升温至70℃，并在此温度下搅拌1小时。TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明，反应混合物中完成。将反应混合物冷却至室温并倾入冰水中，用2N的NaOH碱化至pH为10，然后用EA萃取。有机相用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩，得到化合物6的粗产物(0.4g，收率：70％)，为黄色油状物，其不经进一步纯化直接用于下一个步骤。
步骤6：在搅拌着的化合物6(60mg，每日0.1445mmol)的DCM(5ml)中，加入TEA(30毫克，0.289mmol)和MSCL(25毫克，0.2168mmol)在0℃氮气保护下。滴加结束后，反应结束。将该混合物用DCM稀释，用盐水洗涤，在Na2SO4干燥并浓缩，得到化合物7的粗产物，它不经进一步纯化直接用于下一步骤中。
第7步：化合物7(60毫克，0.12毫摩尔)和MeNH2(0.6毫升，1.2毫摩尔，在MeOH中的2N)的无水THF(5ml)中的混合物于室温过夜搅拌。TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明，反应混合物中完成。将反应混合物浓缩并纯化残余物，TLC纯化三次，得到纯KDR3(6毫克，产率：12％)，为白色固体，其结构鉴定数据参见图14。
实施例7 KDR4化合物制备
Figure BDA0001045100840000141
第一步：将化合物1(1.0克，4.5毫摩尔)在ACN(20毫升)中混合2-氯-5-硝基吡啶2-氯-5-硝基吡啶(0.8克，5毫摩尔)和碳酸铯(3.3克，10毫摩尔)，在室温下搅拌过夜。TLC(PE/EA＝1：1)表明反应混合物中完成。将反应混合物用水稀释，用EA萃取。有机相用盐水洗涤，在Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过快速色谱纯化，得到纯的化合物2(0.4克，收率：24.5％)，为黄色固体。
第二步：向化合物2(0.3克，0.83毫摩尔)的THF(5mL)中的搅拌混合物中加入阮内镍(0.1克)，然后加热至回流。H2N-NH2 H2O(1.66毫摩尔)的THF(5mL)中的溶液逐滴加入。将所得的反应混合物搅拌10分钟。TLC(DCM/甲醇＝15：1)表明，反应混合物中完成。将反应混合物过滤，过滤浓缩，得到粗产物，将其通过快速色谱纯化，得到纯的化合物3(0.16克，产率：50％)，为黄色固体。
第三步：在化合物3(0.16克，0.483mmol)的搅拌溶液中，在0℃氮气保护下，在DCM(10mL)中加入TCDI(95mg，0.531mmol)。滴加结束后，将反应混合物在室温下搅拌。过夜。TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明，反应混合物中完成。将反应混合物浓缩，得到粗产物，将其通过快速色谱纯化，得到纯的化合物4(50毫克，产率：28％)为灰白色固体。
第四步：将化合物4(50毫克，0.134mmol)，4-甲基-5-(三氟甲基)-苯-1，2-二胺(25.5mg，0.134毫摩尔)和EDCI(51米克，0.268毫摩尔)在无水THF(10mL)中，氮气下回流搅拌1小时。TLC(DCM/MEOH＝15：1)表明，反应混合物中完成。稀释反应混合物，用EA和过滤沉淀物，得到粗产物，将其由预TLC纯化，得到纯的化合物5(40毫克，收率：56％)，为白色固体。
第五步：化合物5(20毫克，0.038毫摩尔)和三氟乙酸(0.2毫升)的混合物，在室温下搅拌半小时。TLC(DCM/甲醇＝5：1)表明反应混合物中完成。将反应混合物蒸发以除去TFA，将残余物溶解在THF中，由固体K2CO3碱化，过滤并浓缩滤液，得到纯化合物KDR4(10毫克，产率：62.5％)，为白色固体，其结构鉴定数据参见图15。
实施例10 KDR6化合物制备
Figure BDA0001045100840000151
第一步：7-甲氧基喹啉-4-醇(10.0克，57.1mmol)溶解在50ml三氯氧磷，然后将反应混合物在120℃加热3小时。然后将混合物冷却至室温，并倒入冰水(50毫升)。用EtOAc萃取该混合物(100mLx 3)，将有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并浓缩，得到粗产物，将其用闪式色谱法(与PE/EA＝30：1洗脱)纯化，得到的产物(8.5克，收率：76.9％)，为白色固体。
第二步：4-氯-7-甲氧基喹啉(5.5G，28.4mmol)，锌(276.9mg，4.26mmol)，Zn(CN)2(2.07克，17.6mmol)，DPPF(6.65克，12.21mmol)，PD2(DBA)3(5.98克，6.53mmol)溶解在100mL的DMAc中，将混合物用氩气覆盖并加热在160℃过夜，然后将混合物冷却至室温，并通过硅藻土过滤，将滤液用H2O处理，然后用EA萃取将有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，并在真空下浓缩。通过闪式色谱法(与PE/EA＝10：1洗脱)纯化，得到产物7-甲氧基喹啉-4-甲腈(4.38克，收率：83.7％)，为棕色固体。
第三步：7-甲氧基喹啉-4-甲腈(4.38克，23.78mmol)溶解在30mL的H2O中，加入氢氧化钠(2.38克，59.45mmol)。然后将混合物加热至100℃过夜。将反应混合物冷却至室温，并用EA萃取，以除去杂质。将水相酸化，通过加入6N盐酸至pH为2。将黄色的沉淀物通过过滤收集并干燥，得到2.5g的7-甲氧基喹啉-4-羧酸，产率52％，为棕色固体。
第四步：7-甲氧基喹啉-4-羧酸(2.0克，9.84mmol)和DIPEA(3.82克，29.52mmol)溶解在DMF中。然后将反应混合物冷却至0℃，加入HATU(4.49克，11.81mmol)和3-(三氟甲基)苯胺(1.74克，10.82mmol)。该混合物用氩气覆盖，然后在室温下搅拌过夜。该混合物用水稀释并用EtOAc(3×50毫升)萃取。洗涤有机层，用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，并在真空下浓缩，得到粗产物，将其通过快速色谱纯化，与PE/EA＝1：1洗脱，得到产物(2.5g，收率：79.6％)为浅黄色固体。
第五步：7-甲氧基-N-(3-(三氟甲基)苯基)喹啉-4-甲酰胺(0.6克，1.733mmol)于DCM(50毫升)溶液中，10℃氮气下逐滴加入BBr3(1.73mL，6.93毫摩尔。加完后，将反应混合物在室温下搅拌100小时。TLC(DCM/甲醇＝15：1)表明反应完成。将反应混合物倾入冰-水中并用DCM萃取。洗涤有机层，用盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩的产物，为棕色固体(0.5克，产率：87％)，将其用于下一步，无需进一步纯化。
第六步：将7-羟基-N-(3-(三氟甲基)苯基)喹啉-4-甲酰胺(50毫克，0.151mmol)，叔丁基(6-氯嘧啶-4-基)甲基(甲基)氨基甲酸叔丁酯(46.6mg，0.181mmol)和K2CO3(41.7mg，0.302mmol)在DMSO(2ml)溶液中混合，在90℃搅拌过夜。TLC(PE/EA＝1：2)表明反应完成。将反应混合物用水稀释并用EA萃取。洗涤有机层，用盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩，粗品，这是通过预-TLC纯化，得到纯的产物(25毫克，产率：30％)，为白色固体。
第七步：叔丁基甲基((6-(4-(3-(三氟甲基)苯基氨基甲酰基)喹啉-7-基氧基)嘧啶-4-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(25毫克，0.045mmol)和TFA(0.25毫升)的混合物，在0℃下搅拌半小时。TLC(DCM/甲醇＝5：1)表明反应完成。蒸发TFA，并将残余物通过水溶液碱化。Na2CO3和用DCM萃取。洗涤有机相，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过预-TLC纯化，得到纯的化合物06(7毫克，收率：21％)，为白色固体，其结构鉴定数据参见图16。
实施例11 KDR6A化合物制备
Figure BDA0001045100840000161
第一步：7-甲氧基喹啉-4-醇(10.0克，57.1mmol)溶解在50ml三氯氧磷，然后将反应混合物在120℃加热3小时。然后将混合物冷却至室温，并倒入冰水(50毫升)。用EtOAc萃取该混合物(100mLx 3)，将有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并浓缩，得到粗产物，将其用闪式色谱法(与PE/EA＝30：1洗脱)纯化，得到的产物(8.5克，收率：76.9％)，为白色固体。
第二步：4-氯-7-甲氧基喹啉(5.5G，28.4mmol)，锌(276.9mg，4.26mmol)，锌(CN)2(2.07克，17.6mmol)，DPPF(6.65克，12.21mmol)，PD2(DBA)3(5.98克，6.53mmol)溶解在100mL的DMAc中，将混合物用氩气覆盖并加热在160℃过夜，然后将混合物冷却至室温，并通过硅藻土过滤，将滤液用H2O处理，然后用EA萃取将有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，并在真空下浓缩。通过闪式色谱法(与PE/EA＝10：1洗脱)纯化，得到产物7-甲氧基喹啉-4-甲腈(4.38克，收率：83.7％)，为棕色固体。
第三步：7-甲氧基喹啉-4-甲腈(4.38克，23.78mmol)溶解在30mL的H2O中，加入氢氧化钠(2.38克，59.45mmol)。然后将混合物加热至100℃过夜。将反应混合物冷却至室温，并用EA萃取，以除去杂质。将水相酸化，通过加入6N盐酸至pH为2。将黄色的沉淀物通过过滤收集并干燥，得到2.5g的7-甲氧基喹啉-4-羧酸，产率52％，为棕色固体。
第四步：7-甲氧基喹啉-4-羧酸(406mg，2毫摩尔)和DIPEA(775mg，6毫摩尔)溶解在DMF(5mL)中。将反应混合物冷却至5℃，然后加入HATU(912mg，2.4mmol)和4-氟-3-(三氟甲基)苯胺(394mg，2.2毫摩尔)。该混合物在环境温度下用氩气和覆盖，过夜。TLC(PE/EA＝1：2)表明反应完成。将反应混合物用水稀释并用EA萃取。洗涤有机层，用盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，并浓缩，粗产物，将其由CCTO纯化，得到纯的产物(220毫克，收率：30％)，为棕色固体。
第五步：在N-(4-氟-3-(三氟甲基)苯基)-7-甲氧基喹啉-4-甲酰胺(0.2克，0.549mmol)的DCM(10ml)溶液中，0℃下N2气氛下搅拌加入4N BBr3(0.68毫升，2.75mmol)的DCM溶液。加完后，将反应混合物在室温下搅拌为20小时。然后将反应混合物在-30℃搅拌4小时。TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明起始原料依然。将反应混合物倾入冰-水中并用DCM萃取。将有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并浓缩，得到粗产物，将其由预TLC纯化，得到的原料(120毫克)和纯的产物N-(4-氟-3-(三氟甲基基)苯基)-7-羟基喹啉-4-甲酰胺(60毫克，78％)，为白色固体。
第六步：将N-(4-氟-3-(三氟甲基)苯基)-7-羟基喹啉-4-甲酰胺(30毫克，0.086mmol)，叔丁基(6-氯嘧啶-4-基)甲基(甲基)氨基甲酸叔丁酯(26.5mg，0.103mmol)和K2CO3(23.8mg，0.172mmol)在DMF(1mL)中，50℃下搅拌15小时。TLC(DCM/甲醇＝10：1)表明反应完成。将反应混合物用水稀释。并提取EA。将有机层用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过预-TLC纯化，得到纯的产物(6-(4-(4-氟-3-(三氟甲基叔丁基)苯基氨基甲酰基)喹啉-7-基氧基)嘧啶-4-基)甲基(甲基)氨基甲酸叔丁酯(20毫克，收率：41％)，为黄色固体。
第七步：甲叔丁酯的混合物(6-(4-(4-氟-3-(三氟甲基)苯基氨基甲酰基)喹啉-7-基氧基)嘧啶-4-基)甲基(甲基)氨基甲酸叔丁酯(20毫克，0.035mmol)和三氟乙酸(0.3毫升)在室温下搅拌一小时。TLC(DCM/MEOH＝5：1)表明反应完成。蒸发TFA，并将残余物由Na2CO3碱化并用DCM萃取。洗涤有机相，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过预-TLC纯化，得到纯的化合物06A(5毫克，收率：30％)，为黄色固体，其结构鉴定数据参见图17。
实施例12 KDR8化合物制备
Figure BDA0001045100840000171
第1步：草酸二乙酯(70毫升)的混合物加热到120℃，加入化合物1(50克，0.4mol)，并将混合物加热到180℃的，维持5分钟。将混合物冷藏过夜，过滤收集白色沉淀物，干燥，从而得到白色粉末状的化合物2(75.0克，收率：59.11％)。
步骤2：将化合物2(25克，0.11摩尔)溶解在沸腾的二甲苯(1L)中，缓慢地加入P2S5(9.5克，0.0385摩尔)，回流，直到反应完成(约5小时)，再继续回流。酰胺TLC(PE/EA＝5/1)表明该反应完成后，将反应混合物冷却，并用1N NaOH萃取，水相用盐酸酸化，收集黄色沉淀物，然后将其溶解在EtOAc中，用H2O洗涤，用Na2SO4干燥，并浓缩，得到的化合物3(19克，收率：70.9％)为一种红色油状物。
步骤3：化合物3(30克，0.142摩尔溶于1N氢氧化钠(500mL)中，用铁氰化钾(135克，0.416mol，在340ml水中)氧化，通过缓慢加入硫代酰胺到铁氰化物溶液来进行，使温度保持低于10℃。在1小时后，TLC(DCM/MeOH中＝3/1)表明反应完全。将反应混合物在与水中稀释，酸化(由2N的HCl至pH为6)，然后过滤，得到的化合物4(15g，收率：50.48％)。
步骤4：化合物4(1克，4.34毫摩尔)在DMF(20mL)中搅拌溶解，加入1-methyl-5-(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-3-amine(0.717g，4.35mmol)，随后加入在室温氮气中加入HATU(2.47g，6.5mmol)和DIEA(1.12g，8.6mmol)。在相同的的温度下下搅拌过夜后，TLC(PE/EA＝2/1)表明该反应完成。该反应混合物被倾入水中，并用EtOAc萃取。洗涤将有机的相，用盐水洗涤，在Na2SO4上干燥并浓缩，得到粗的的产品，由硅胶色谱法(PE/EA洗脱＝20/1-5/1)进行纯化，，得到纯的化合物5(900毫克，收率：75.5％)。
步骤5：-10℃氮气中，在化合物5(0.4g，1.12mmol)的DCM(10mL)溶液中，加入BBr3(10mL，4N in DCM)。4小时后，TLC(PE/EA＝1/1)表明反应完成了。然后反应中加入冰，过滤除去未溶解的材料。分离滤液，用DCM萃取。将有机相用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩，得到粗的的产品，这进行纯化，由TLC得到纯的化合物6的化合物(100mg，收率：26.02％)。
步骤6：化合物6的溶液(50mg，0.146mmol)的DMF(10mL)溶液中加入K2CO3(70mg，0.500mmol)和tert-butyl(6-chloropyrimidin-4-yl)methyl(methyl)carbamate(41.41mg，0.161mmol)。将反应混合物在50℃氮气下搅拌过夜。TLC(PE/EA＝1/1)表明反应完成。将反应混合物用水洗涤，用EA萃取。有机相用盐洗涤4次，用Na2SO4干燥并浓缩，得到粗的的产品，由TLC纯化得到纯化合物7(40mg，收率：48.59％)。
第7步：化合物7(40mg，0.071mmol)和TFA(0.4mL)在氮气下室温混合，搅拌半小时。TLC(DCM/甲醇＝10/1)表明反应完成。将反应混合物蒸发以除去TFA。将残余物碱化，用Na2CO3碱化至pH9，然后用DCM萃取。将有机相用盐水洗涤，硫酸钠干燥，浓缩，得到粗产物，将其通过TLC纯化，得到纯的化合物8(20mg，收率：44％)。其结构鉴定数据参见图18。
实施例13 KDR8A化合物制备
Figure BDA0001045100840000191
第1步：草酸二乙酯(70毫升)加热到120℃，加入化合物1(50克，0.4mol)，并将混合物加热到180℃，加热时间为：5分钟。冷却后，混合物在冰箱中过夜，加入50毫升水，然后形成白色沉淀物。收集该固体，干燥，得到白色粉末状的化合物的2(75.0克，收率：59.11％)。
步骤2：将化合物2(25克，0.11摩尔)溶解在沸腾的二甲苯(1L)中，缓慢加入P2S5(9.5克，0.0385摩尔)，回流，直到反应完成(约5小时)，再继续回流。TLC(PE/EA＝5/1)表示反应完成后，将反应混合物冷却，并用1N NaOH萃取，水相用盐酸酸化，收集黄色沉淀物，然后将其溶解在EtOAc中，用H2O洗涤，用Na2SO4干燥，并浓缩，得到的化合物3(19克，收率：70.9％)，为红色油状物。
步骤3：粗化合物3(30g，0.142mol)溶解在1N氢氧化钠(500mL)中，用铁氰化钾(135克，0.416mol，在340ml水中)氧化，通过缓慢加入硫代酰胺到铁氰化物溶液来进行，使温度保持低于10℃。在1小时后，TLC(DCM/MeOH中＝3/1)表明反应完全。将反应混合物在水中稀释，由2N的HCl调节至pH为6，然后过滤，得到的化合物4(15g，收率：50.48％)
步骤4：化合物4(1克，4.78毫摩尔)在DMF(40毫升)溶液中加入3-(三氟甲基)苯胺，随后加入HATU(2.73克，7.17毫摩尔)和DIEA(1.24克，9.56毫摩尔)，在室温氮气下搅拌。在相同的温度下搅拌过夜后TLC(PE/EA＝2/1)表明反应完成后，将反应混合物倾入水中，并用EtOAc萃取。洗涤有机相，用盐水洗涤，在Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过硅胶色谱(与PE/EA＝20/1-5/1洗脱)纯化，得到纯的化合物5(1.68克，收率：99.0％)。
步骤5：-10℃在氮气下，化合物5(0.1克，0.283毫摩尔)的DCM(10mL)溶液中加入4NBBr3(0.5mL)。4小时后，TLC(PE/EA的＝1/1)表明反应完成后，加入冰，然后过滤以除去所述未溶解的材料。滤液用DCM萃取。用盐水洗涤有机相，用Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物，将其通TLC纯化，得到纯的化合物6(64mg，收率：66.65％)。
步骤6：化合物6(64毫克，0.189毫摩尔)DMF(10毫升)溶液中，加入K2CO3(78毫克，0.567毫摩尔)和叔丁基(6-氯嘧啶-4-基)甲基(甲基)氨基甲酸叔丁酯(tert-butyl(6-chloropyrimidin-4-yl)methyl(methyl)carbamate，53毫克，0.208毫摩尔)。将反应混合物在氮气下50℃搅拌过夜，TLC(PE/EA＝1/1)表明反应完成。将反应混合物用水洗涤，EA萃取。洗涤有机相，用盐水洗涤四次，用Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过预-TLC纯化，得到纯的化合物7(20mg，收率：19.68％)。
第7步：化合物7(20毫克，0.035毫摩尔)和TFA(0.2mL)的混合物，在氮气下室温搅拌半小时。TLC(DCM/MeOH中＝10/1)表明反应完成。将反应混合物蒸发除去TFA。将残余物由sNa2CO3调节pH为9，然后用DCM萃取。洗涤有机相，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过预-TLC纯化，得到纯的化合物KDR08A(12mg，收率：73.07％)，其结构鉴定数据参见图19、22。
实施例14 KDR8B化合物制备
Figure BDA0001045100840000201
第1步：草酸二乙酯(70毫升)的混合物加热到120℃，加入化合物1(50克，0.4mol)，并将混合物加热到180℃，维持5分钟。将混合物后冷藏过夜，形成白色沉淀物。收集该固体被通过过滤中，并干燥，从而得到为白色粉末状的化合物的2(75.0克，收率：59.11％)。
步骤2：将化合物2(25克，0.11摩尔)溶解在沸腾的二甲苯(1L)中，缓慢地加入P2S5(9.5克，0.0385摩尔)，回流，直到将反应物完成(约5小时).TLC(PE/EA＝5/1)表明反应完成。该反应混合物冷却，并用1N NaOH的萃取，水相用盐酸酸化，收集黄色沉淀物，然后将其溶解在EtOAc中，用H2O洗涤，用Na2SO4干燥，并浓缩，得到的化合物3(19克，收率：70.9％)为红色油状物。
步骤3：化合物3(30克，0.142mol)溶解在1N氢氧化钠(500毫升)中，用铁氰化钾(135克，0.416mol，在340ml水中)氧化，通过缓慢加入硫代酰胺到铁氰化物溶液来进行，使温度保持低于10℃。在1小时后，TLC(DCM/MeOH中＝3/1)表明反应完成。将反应混合物在水中稀释，酸化(由2N HCl至pH为6，)，然后过滤，得到的化合物4(15g，收率：50.48％)。
步骤4：化合物4(1克，4.78毫摩尔)的DMF(20mL)溶液中，室温氮气下，搅拌加入4-氟-3-(三氟甲基)苯胺盐酸盐(4-fluoro-3-(trifluoromethyl)aniline Hydrochloride，1.24克，5.74毫摩尔)，随后加入HATU(2.73克，7.17毫摩尔)和DIEA(1.85克，14.34毫摩尔)。在相同的的温度下搅拌过夜后，TLC(PE/EA＝2/1)表明反应完成。将反应混合物倾入水中，并用EtOAc萃取。用盐水洗涤有机相，在Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过硅胶色谱(与
Figure BDA0001045100840000203
Figure BDA0001045100840000202
洗脱)纯化，得到纯的化合物5(1.3克，收率：73.4％)。
步骤5：化合物5(0.5克，1.35毫摩尔)DCM(10mL)溶液中，在-10℃氮气下，加入4NBBr3(2.5mL)，反应4小时后，TLC(PE/EA的＝1/1)表明反应完成。反应中加入冰，然后过滤以除去未溶解的的材料。分离滤液，用DCM萃取。盐水洗涤有机相，用Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过预-TLC纯化，得到纯的化合物6(250mg，收率：51.97％)。
步骤6：化合物6(70毫克，0.196毫摩尔)的DMF(10mL)溶液中，加入K2CO3(81.46毫克，0.589毫摩尔)和叔丁基(6-氯嘧啶-4-基)甲基(甲基)氨基甲酸叔丁酯(tert-butyl(6-chloropyrimidin-4-yl)methyl(methyl)carbamate，55.70毫克，0.216毫摩尔)，将反应混合物在50℃氮气下搅拌过夜。TLC(PE/EA＝1/1)表明反应完成。将反应混合物用水洗涤，与EA萃取。洗涤有机相，用盐水洗涤4次，在Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过TLC纯化，得到纯的化合物7(40毫克，39.51％)。
第7步：化合物7(38毫克，0.071毫摩尔)和TFA(0.4毫升)的混合物，在氮气室温下搅拌半小时。TLC(DCM/MeOH中＝10/1)表明反应完成。将反应混合物蒸发除去TFA。将残余物由Na2CO3调节至pH为9，然后用DCM萃取。洗涤有机相，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过TLC纯化，得到纯的化合物KDR8B(15毫克，47.75％)，其结构鉴定数据参见图21。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。
试验例1 斑马鱼血管发育抑制试验
斑马鱼(Danio rerio)为鲤科(Cyprinidae)短担尼鱼属(Danio)的一种硬骨鱼。其基因与人类基因的相似度高达85％，雌鱼一次可产卵200～300枚，其受精和胚胎发育过程均在体外进行，24小时内就可发育成形，且胚胎通体透明，便于观察体内器官组织的变化。诸多特点使其成为了是国际标准化组织认可的5种鱼类实验动物之一。目前，斑马鱼在人类疾病研究中得到广泛应用，用于心血管系统方面的研究尤为多。
实验方法：该实验使用通常作为筛查化合物对血管形成作用影响的斑马鱼为动物模型。将出生后的斑马鱼胚胎经挑选后，放于培养皿中并置于培养箱中抚育3-5天，本发明化合物在斑马鱼出生后按不同浓度(1μM，10μM，30μM，100μM)直接加入培养液中。24小时后检查脊椎血管的发育情况并用荧光显微镜照相。130B为帕唑帕尼(Pazopanib)，作为阳性对照，DMSO作为阴性对照。
试验结果参见图1-4、表1a，1b。
表1a：KDR系列小分子对FLK-1转基因斑马鱼血管发育的抑制作用
浓度(uM) KDR3 KDR4 KDR6 KDR8 KDR8A
1 0％ 0％ 0％ 0％ 0％
10 0％ 0％ 0％ 0％ 0％
30 0％ 10％ 0％ 0％ 0％
100 50％ 100％ 10％ 5％ 10％
表1b KDR系列小分子对FLK-1转基因斑马鱼血管发育的抑制作用
Figure BDA0001045100840000221
AI：血管抑制率
由图1-4可知，本发明化合物KDR4及V01-v6均能抑制斑马鱼血管发育，尤其是V01，v3，v6，其药效活性显著。
由表1b可知，化合物DKR4的活性明显优于KDR3、KDR6、KDR8和KDR8A，化合物V01，V03的活性明显优于KDR4。
试验例2 本发明化合物的药效实验
1.对VEGFR2体外抑制试验
检测本发明化合物抑制VEGFR2激酶磷酸化的实验方法如下：
1)将培养至P3-P5 HUVEC细胞转移至6孔板，每孔约2*105细胞
2)待细胞生长至70-80％，加入候选小分子抑制剂(10nM，100nM or 1μM)，孵育30min
3)加入VEGF 50ng/ml进行刺激，持续10min
4)加入非变性裂解液终止反应、收集细胞裂解液、进行蛋白定量
5)SDS-PAGE电泳，转膜，将膜切下后用5％脱脂奶配制的TTBS缓冲液(Tris-buffered saline/0.01％Tween 20)封闭2小时
6)洗膜，用抗磷酸化VEGFR2抗体(1：1000稀释)4℃封闭过夜
7)第2天洗膜后用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗与膜共孵育1小时
8)洗膜后用化学发光试剂盒(Millipore)显色，照相。
试验结果参见图5。
由图5可知，本发明化合物KDR4及V01、V3均能抑制VEGFR2，其中，化合物V01、V3效果较KDR4更好。
试验例3 本发明化合物对脉络膜新生血管的抑制作用
小鼠为c57/BL，采用激光诱导的脉络膜新生血管(ChoroidalNeovascularization，CNV)动物模型进行实验。此模型目前也是应用最广的一种被用来研究药物对CNV形成影响的动物模型。采用532激光在C57/bl6小鼠(每个视网膜4个激光点)行激光视网膜光凝来诱导的CNV形成。激光实施后立即进行注射：一只小鼠右眼注射浓度150uM的KDR4，另一只小鼠右眼注射浓度1uM的V01，两小鼠左眼注射均注射与药物相同体积的PBS作为对照。注射后5天将动物处死并获取眼球。去除眼前节、玻璃体和视网膜后，制作脉络膜铺片并行Isolectin染色。采用Zeiss荧光显微镜系统进行拍照和CNV面积的测量。结果见图6、图7。
根据图6可知，化合物KDR4(150uM)、V01(1uM)均能显著抑制脉络膜新生血管形成，可有效治疗或缓解湿性黄斑变性。
试验例4 本发明化合物对激酶的影响
蛋白激酶(protein kinases)又称蛋白质磷酸化酶(protein phosphakinase)。一类催化蛋白质磷酸化反应的酶。它能把腺苷三磷酸(ATP)上的γ-磷酸转移到蛋白质分子的氨基酸残基上某些丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的羟基上，从而改变蛋白质、酶的构象和活性。蛋白质的磷酸化是多种信号传导途径的重要环节，细胞内大部分重要的生命活过程都离不开蛋白质磷酸化。
蛋白激酶分为5类：蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶、蛋白酪氨酸激酶、蛋白组氨酸激酶、蛋白色氨酸激酶和蛋白天冬氨酰基/谷氨酰基激酶。蛋白激酶在细胞过程的调节和维持起到了重要作用，在许多疾病状态中都观察到了激酶活性异常，所述疾病状态包括：恶性肿瘤，免疫性疾病、心血管疾病、糖尿病、感染性疾病、关节炎和其它免疫紊乱、神经系统如老年性痴呆症，阿默海茨症AD等，现已发现与超过400种人类疾病与蛋白激酶相关。
其中，VEGFR(血管内皮细胞生长因子受体)家族成员为受体酪氨酸激酶，如VEGFR1、VEGFR2等，该类受体在恶性肿瘤的生长、转移中以及血管增生性疾病(如黄斑变性、肿瘤)等疾病的发展过程中有重要影响。
PDGFR(血小板衍生生长因子受体)家族成员为受体酪氨酸激酶，如PDGFRα和PDGFRβ以及集落刺激因子1受体、干细胞生长因子受体KIT等，目前也发现该类激酶与肿瘤的发生、发展有密切联系。如PDGFR的异常表达已在黑色素瘤、脑膜瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、前列腺癌、肺癌和胰腺癌中有发现，KIT的异常活化则是许多肿瘤发生、发展的直接诱因。
1)抑制剂量效应研究
化合物V01溶解于100％DMSO中，稀释为3组系列浓度，DMSO在最后测试中均保持1％。测试最高浓度为50uM。用非选择性蛋白激酶的活性抑制剂星形孢菌素(Staurosporine)作为参照，最高浓度为1uM。结果见表3、图22。
表2
目标 供应商 [酶]，nM [ATP]，μM 孵育时间，hr
KDR Invitrogen 0.25 80 3
表3对KDR的抑制活性
化合物 IC50(μM) 95％置信率 Hill
Staurosporine 0.00942 0.00121 1.002392
V01 0.0207 0.00287 1.007953
2)抑制特异性研究
对化合物VO1，测试了22种激酶活性抑制试验，测试浓度为5mM，重复两次，在ATPKm测试。V01首先溶于100％DMSO中，溶解浓度为最终测试浓度的100倍，所有最终测试时的DMSO都为1％。非选择性蛋白激酶的活性抑制剂星形孢菌素(Staurosporine)作为对照，测试时用最大浓度10mM.
具体试验方法及试剂如下表所示：
表4
激酶 测试平台 供应商 激酶浓度(nM) ATP浓度(μM) 反应时间(hr)
AKT2 Caliper MSA INVITROGEN 2 130 3
AURORA-B Caliper MSA CARNA 0.05 10 3
BRAF Caliper MSA UPSTATE 1.44 35 3
CDK2 Caliper MSA UPSTATE 0.2 50 3
CHEK1 Caliper MSA CARNA 0.5 50 3
DMPK Caliper MSA INVITROGEN 0.5 10 10
EGFR Caliper MSA BPS 0.5 3 3
FGFR2 Caliper MSA CARNA 0.06 75 3
GSK-3-β Caliper MSA UPSTATE 0.5 10 3
JAK2 Caliper MSA INVITROGEN 0.8 12 3
KDR(即VEGFR2) Caliper MSA INVITROGEN 0.25 80 3
KIT Caliper MSA INVITROGEN 2 400 6
MAPK3 Caliper MSA INVITROGEN 1.2 50 3
MEK1 Caliper MSA UPSTATE 3.1 35 3
MET Caliper MSA INVITROGEN 1.5 45 3
P38-α Caliper MSA AMPHORA 2.5 130 3
PDGFR-β Caliper MSA UPSTATE 0.2 30 3
PI3KA ADP-Glo INVITROGEN 1.25 50 3
PKC-α Caliper MSA INVITROGEN 0.03 20 3
ROCK1 Caliper MSA CARNA 3 5 3
SRC Caliper MSA INVITROGEN 1 25 3
SYK Caliper MSA BPS 1.5 30 3
V01对激酶两次试验平均抑制率如下表：
表5
Figure BDA0001045100840000251
从试验结果可知，V01对蛋白激酶KDR的抑制率高达100％，对其他两种与肿瘤相关的蛋白激酶也有一定抑制作用，其中，PDGFR-β抑制率为52.7％，KIT抑制率为68％，但V01对其余蛋白激酶抑制活性绝大部分小于5％。由此可见，和现有研发的小分子激酶抑制剂相比，本发明化合物对KDR具有高特异性和高效率的抑制作用，且对PDGFR-β和KIT这两种与肿瘤有密切关联的蛋白激酶也有一定的抑制作用，这就表明化合物V01对KDR、PDGFR-β和KIT这三种蛋白激酶异常活化相关的各种肿瘤及老年湿性黄斑变性等疾病均有潜在治疗活性。
3)新生血管抑制的研究
共测试了5只鼠.在眼角膜中央，用75％硝酸银溶液和25％硝酸钾棒诱导化学烧伤造模。化学烧伤之后立即在右眼结膜下注射0.2ml化合物V01，然后每天滴0.2ml化合物V012次。7天后眼角膜拍照比较。
由图23所示，化合物V01能显著减少了新生血管和出血。
综上所述，本发明化合物具有良好的抗血管新生作用，初步认为该类化合物是通过抑制VEGFR2(即KDR)产生活性的。该类化合物可用于对新生血管、VEGFR2、PDGFR-β、KIT等蛋白激酶异常所致疾病的治疗，如湿性黄斑变性、恶性肿瘤等。

Claims (10)

1.式Ⅱ所示的化合物及其药学上可接受的盐，：
Figure FDA0002221279200000011
R9为H、C1-C4烷基或卤素；R10为卤素；n＝1时，W1、W2同时为杂原子，杂原子为N；n＝2时，W1、W2同时为C。
2.根据权利要求1所述的化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于：所述卤素为F或Cl。
3.根据权利要求1或2所述的化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于：所述化合物为：
Figure FDA0002221279200000012
4.权利要求1-3任意一项所述化合物及其药学上可接受的盐在制备血管新生抑制剂类药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述血管新生抑制剂为血管内皮生长因子受体2抑制剂。
6.根据权利要求4或5所述的用途，其特征在于：所述抑制剂是抗眼部血管新生的药物。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述药物是脉络膜新生血管抑制剂。
8.根据权利要求6或7所述的用途，其特征在于：所述药物是治疗或预防湿性黄斑变性、糖尿病视网膜病变或新生血管性青光眼的药物。
9.权利要求1-3任意一项所述化合物及其药学上可接受的盐在制备VEGFR2、PDGFR-β或/和KIT抑制剂类药物中的用途。
10.一种药物组合物，其特征在于：它是含有权利要求1-3任意一项所述化合物及其药学上可接受的盐的眼用制剂。
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