CN106138121B - 牛奶子提取物及其制备方法和应用、包括其的皮肤外用剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛奶子提取物及其制备方法和应用、包括其的皮肤外用剂。牛奶子提取物的制备方法采用方式一或方式二进行：方式一为：将粉碎后的牛奶子与50～90％的乙醇混合均匀，在10～50℃下提取0.5～2.5小时，固液分离得滤液，对滤液进行减压旋蒸以脱除乙醇，即得牛奶子粗提物；牛奶子与乙醇的质量体积比为(1：5)～(1：30)g/mL。方式二为：将方式一得到的牛奶子粗提物用去离子水溶解后，上样到大孔树脂填充柱，依次用去离子水、10～50％的乙醇、50～80％的乙醇和80～100％的乙醇洗脱，分别收集洗脱液，并脱除溶剂即可。本发明提供的牛奶子提取物具有较好的美白、抗老化和抗氧化的功效。
Description
技术领域
本发明公开了一种牛奶子提取物及其制备方法和应用、包括其的皮肤外用剂。
背景技术
1956年Harman提出了自由基衰老学说[Harman,D.Aging:A theory based onfree radical and radiation chemistry.J.Gerontol.1956,11:289-300.]，认为过多的自由基是造成生物老化的重要原因。根据这一理论，体内过量的活性氧自由基与不饱和脂肪酸作用产生丙二醛等物质，丙二醛将与细胞膜上的蛋白质等作用生产褐色素，沉淀于皮肤便成为各种色斑。过量的自由基还能使皮肤内的胶原纤维、弹性纤维发生交联和变性、变脆、失去弹性，当皮肤水分不足时，容易使弹性纤维断裂，出现暗纹、细纹、皱纹等皮肤老化现象。此外，环境中的离子辐射以及诸如空气污染与化学物质等的环境污染物，也会使生物体内不断的产生自由基。例如环境中的紫外线会使皮肤真皮中的纤维母细胞及线粒体受到刺激，进而释放出超氧阴离子，而过量的超氧阴离子则会转换成其它破坏性更强的自由基。虽然人体内具有能够维持氧化与抗氧化之间平衡状态的抗氧化防御系统，用以减缓活性氧及自由基的产生，但若是长期过度的曝晒在阳光下，则人体内大量产生的自由基会导致皮肤的抗氧化防御能力降低，造成皮肤的伤害，例如光老化、表皮皱纹、皮肤免疫力失调等。抗氧化剂是具有捕捉自由基能力的物质，可以清除皮肤中的活性自由基，减轻自由基引起的皮肤氧化应激损伤，从而改善由氧化应激等造成的皮肤老化。目前已知有维生素E、维生素C等生物体内的清除自由基型抗氧化剂，另外也报道了植物来源的抗氧化剂如莲花、梅果提取物等(专利文献CN201110158540含有莲花提取物和乌梅提取物作为有效成分而具有抗氧化活性的皮肤外用剂组合物)。
关于皮肤黑色素的形成，目前研究表明主要是由于黑素细胞内的生物化学反应引起，即酪氨酸在作为催化剂的酪氨酸酶的作用下，生成多巴醌，再通过酶的催化作用或非酶的氧化作用形成黑色素。关于抑制上述黑色素生成的美白活性物，通常以抑制酪氨酸酶活性为主要靶点。来源于植物提取物的酪氨酸酶抑制剂作为潜在的美白活性物，同时又具有安全性和对皮肤低刺激性的预期，目前已有各种开发的报道(专利文献CN201310411195白蔹提取物美白功效的检测方法；CN201310382406白木香果皮提取物在制备美白化妆品中的应用)。
皮肤胶原约占干燥皮肤重量的75％，是皮肤细胞外基质的重要组成成分，起着皮肤结构的支撑体功能，并提供皮肤的抗拉和弹力等重要功能。正常皮肤中胶原的生成和分解在生物调节作用下处于平衡状态，随着年龄增长，以及紫外线辐射等环境因素引起生物调节功能减弱，胶原的分解作用大于生成作用时，皮肤中胶原含量的下降，皮肤相应出现弹力减少、皱纹产生等皮肤老化现象。而通过合适的植物提取物调节胶原蛋白的生成，或者适当增加可以产生的胶原蛋白的成纤维细胞的数量，就可以期待会对皮肤老化的现象有所改善，目前已有报道红杉新芽、越桔新芽等来自植物提取物的抑制皮肤老化成分具有类似的改善皮肤老化机理(专利文献CN200980106591.8含有植物的新芽提取物的用于抑制皮肤老化的组合物)。
牛奶子(Elaeagnus umbellata Thunb.)是胡颓子科(Elaeagnaceae)胡颓子属(Elaeagnus Linn.)植物牛奶子的果实。作为胡颓子属的植物，可以列举牛奶子(Elaeagnusumbellata Thunb.)，银果牛奶子(Elaeagnus magna Rehder)，长叶胡颓子(Elaeagnusbockii Diels)，巫山牛奶子(Elaeagnus wushanensis C.Y.Chang)，南川牛奶子(Elaeagnus nanchuanensis C.Y.Chang)等[中国植物志第52(2)卷]。
牛奶子又名剪子果、甜枣(河南)，麦粒子(山东)，牛奶子是落叶直立灌木，高1-4米，具长1-4厘米的刺；果实几球形或卵圆形，长5-7毫米，幼时绿色，被银白色或有时全被褐色鳞片，成熟时红色；果梗直立，粗壮，长4-10毫米。花期4-5月，果期7-8月。产于华北、华东、西南各省区和陕西、甘肃、青海、宁夏、辽宁、湖北。生长于海拔20-3000米的向阳的林缘、灌丛中，荒坡上和沟边。果实可生食，制果酒、果酱等；果实、根和叶亦可入药。牛奶子果实含有葡萄糖，果糖，蔗糖，抗坏血酸，去氢抗坏血酸，有机酸，缔合鞣质。牛奶子果实中还含有芦丁(Rutin)和槲皮素(Quercetin)。目前未有专利披露牛奶子的美白、抗老化和抗氧化活性功效。
发明内容
本发明创新性地发现了牛奶子的美白、抗氧化和抗老化新用途，而提供了一种牛奶子提取物及其制备方法和应用、包括其的皮肤外用剂。本发明提供的牛奶子提取物具有较好的美白、抗老化和抗氧化的功效。
本发明的目的之一在于，提供一种牛奶子提取物的制备方法，其采用方式一或方式二进行：
所述的方式一包括如下步骤：将粉碎后的牛奶子与体积浓度为50～90％的乙醇混合均匀，在10～50℃下提取0.5～2.5小时，固液分离得滤液，对滤液进行减压旋蒸以脱除乙醇，即得牛奶子粗提物；其中，所述牛奶子与所述乙醇的质量体积比为(1：5)～(1：30)g/mL；
所述的方式二包括如下步骤：将方式一得到的牛奶子粗提物用去离子水溶解后，上样到大孔树脂填充柱，依次用去离子水、溶剂Ⅰ、溶剂Ⅱ和溶剂Ⅲ洗脱，分别收集洗脱液，并脱除溶剂后，相应地得到水洗脱部位、溶剂洗脱部位A、溶剂洗脱部位B和溶剂洗脱部位C；所述溶剂Ⅰ、所述溶剂Ⅱ和所述溶剂Ⅲ分别为体积浓度为10～50％的乙醇、体积浓度为50～80％的乙醇和体积浓度为80～100％的乙醇。
其中，所述的牛奶子(Elaeagnus umbellata Thunb.)为胡颓子科(Elaeagnaceae)胡颓子属(Elaeagnus Linn.)植物。所述的牛奶子一般是指牛奶子的果实。
方式一中，所述的提取为本领域常规操作，较佳地为超声提取。所述的超声提取较佳地在室温下进行。所述的室温为本领域常规，一般为20～35℃。所述的超声提取的时间较佳地为2小时。
方式一中，所述牛奶子与所述乙醇的质量体积比较佳地为(1:20)g/mL。
方式一中，所述的乙醇的体积浓度较佳地为70％。
方式一中，所述的固液分离的方法为本领域常规，较佳地为过滤、压滤或离心。
方式一中，所述的减压旋蒸的操作条件为本领域常规条件。
方式二中，所述的大孔树脂填充柱为本领域常规的大孔树脂填充柱，较佳地为D101、AB-8或ADS-8树脂填充柱，更佳地为AB-8树脂填充柱。
方式二中，所述的溶剂Ⅰ较佳地为体积浓度为30％的乙醇。所述溶剂Ⅱ较佳地为体积浓度为70％的乙醇。所述溶剂Ⅲ较佳地为体积浓度为95％的乙醇。
方式二中，所述的脱除溶剂的方法为本领域常规，较佳地为减压旋蒸。
本发明的目的之二在于，提供一种由上述制备方法制得的牛奶子提取物。所述的牛奶子提取物包括方式一制得的牛奶子粗提物、方式二制得的水洗脱部位、溶剂洗脱部位A、溶剂洗脱部位B和溶剂洗脱部位C中的一种或多种。
所述的牛奶子提取物较佳地为溶剂洗脱部位B。
本发明的目的之三在于，提供上述牛奶子提取物在制备皮肤外用剂时作为美白活性成分、抗老化活性成分和抗氧化活性成分中的一种或多种的应用。
本发明中，所述牛奶子提取物较佳地作为美白活性成分和/或抗老化活性成分应用于所述皮肤外用剂中。
本发明中，所述的皮肤外用剂包括本领域常规的具备疾病治疗用途的药物，或者不具备疾病治疗用途的化妆品。
本发明的目的之四在于，提供一种包括上述牛奶子提取物的皮肤外用剂。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供的牛奶子提取物具有较好的美白、抗老化和抗氧化的功效。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
本实施例制备了牛奶子粗提物，具体制备方法如下：称取20.0g牛奶子，粉碎后，加入400mL 70％v/v乙醇，室温(25℃)超声提取2小时，固液分离后，将滤液减压旋蒸脱除溶剂后，得到1.9g牛奶子粗提物。
实施例2
将实施例1制备的牛奶子粗提物，用去离子水完全溶解后，上样到AB-8树脂填充柱，依次用去离子水、30％乙醇、70％乙醇和95％乙醇洗脱，分别收集洗脱液，脱除溶剂后，分别得到牛奶子提取物水洗脱部位、30％乙醇洗脱部位、70％乙醇洗脱部位和95％乙醇洗脱部位。
效果实施例1
本效果实施例考察的是牛奶子提取物的抗氧化活性。按照实施例1和实施例2制备的牛奶子提取物，测定其清除DPPH自由基能力。测定步骤为：将牛奶子提取物分别用去离子水配制成水溶液，移取2mL于10mL具塞试管中，加人2mL DPPH乙醇溶液(2×10-4mol/L)，充分混匀，室温静置，30min后用分光光度计测定517nm波长的吸光度A517；同时测定2mL提取物溶液与2mL乙醇混合后的吸光度A0，2mL水与2mL DPPH乙醇溶液混合后的吸光度C以及2mL水与2mL乙醇溶液混合后的吸光度C0。平行测定三次，取平均值，根据以下公式计算自由基清除率，清除率越大，说明提取物的抗氧化能力越强。
自由基清除率(％)＝[1-(A517-A0)/(C-C0)]×100％。
表1 DPPH法自由基清除活性的测定结果
由于样品浓度为0.1mg/mL时无法看出牛奶子粗提物与30％乙醇洗脱部位、70％乙醇洗脱部位、95％乙醇洗脱部位的自由基清除率有何差别，表1中进一步补充了样品浓度为0.01mg/mL的数据。
由表1可见，牛奶子提取物具有很强的清除自由基的能力，经大孔吸附树脂分离后得到的牛奶子70％乙醇洗脱部位清除自由基的活性最强，进一步的实验数据表明其IC50为0.007mg/mL。
效果实施例2
本效果实施例考察的是牛奶子提取物中的总黄酮含量。按照实施例2制备牛奶子提取物，按照中华人民共和国药典(2010版)方法，以芦丁为标准品，测定牛奶子提取物中总黄酮含量。测定步骤为：1)标准曲线制作：精密量取对照品溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL，分别置25mL量瓶中，各加30％乙醇至6.0mL，加5％亚硝酸钠溶液1mL。混匀，放置6分钟，再加10％硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6分钟。加氢氧化钠试液10mL，再加30％乙醇至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，用紫外-可见分光光度法，在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。2)取一定量样品置于25mL容量瓶中，其它按照标准曲线制备步骤，自“加亚硝酸钠溶液1mL”起，依法测定吸光度，同时取供试品溶液3mL，除不加氢氧化钠试液外，其余同上操作，作为空白，计算牛奶子提取物中总黄酮含量(以芦丁计)。
表2 牛奶子提取物的总黄酮含量
效果实施例3
本效果实施例考察的是牛奶子提取物的抗老化活性。分别按照实施例1和实施例2制备的牛奶子提取物，溶于去离子水，配制成水溶液，用于测定弹性蛋白酶抑制活性。测定方法按照文献(Am.J.Pharmacol.Toxicol.,2009,4,127-129)方法进行，测定步骤为：在96孔板中加入10μL样品溶液和130μL含有1.015mM反应底物Succ-Ala-Ala-Ala-p-硝基酰替苯胺的0.1M Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)，在25℃下温育5分钟，加入15μL弹性蛋白酶溶液(0.5U/mL)，继续在25℃下温育30min，然后用酶标仪测定410nm波长的吸光度A410。用去离子水替换样品水溶液，作为参比溶液同样测定吸光度，结果见表3。
弹性蛋白酶活性抑制率计算公式为：抑制率(％)＝(A0-(A410-B))/A0×100％，其中A0是参比溶液的吸光度，A410是样品溶液的吸光度，B是样品空白溶液的吸光度。
表3 弹性蛋白酶活性抑制的测定结果
由表3可知，在本发明中使用的牛奶子提取物均具有抑制弹性蛋白酶作用，其中牛奶子70％乙醇部位抑制弹性蛋白酶作用最强，可以将牛奶子提取物配合在外用剂中，作为防止肌肤老化、维持年轻健康的肌肤状态的抗老化剂使用。
效果实施例4
本效果实施例考察的是牛奶子提取物对于酪氨酸酶的抑制活性。分别按照实施例1和实施例2制备的牛奶子提取物，溶于去离子水，配制成水溶液，用于测定酪氨酸酶抑制活性。测定步骤为：磷酸盐缓冲溶液(pH6.8，30mM)70μL、1.66mM酪氨酸溶液80μL、样品溶液80μL混合均匀，在37℃恒温水槽中温育5分钟，加入酪氨酸酶溶液(125U/mL)10μL，在37℃恒温10min后，用酶标仪测定475nm波长的吸光度A475。用去离子水替换样品水溶液，作为参比溶液同样测定吸光度，结果见表4。
酪氨酸酶活性抑制率计算公式为：抑制率(％)＝(A0-(A475-B))/A0×100％，其中A0是参比溶液的吸光度，A475是样品溶液的吸光度，B是样品空白水溶液的吸光度。
表4 酪氨酸酶抑制活性的测定结果
由表4可知，在本发明中使用的各牛奶子提取物都具有酪氨酸酶活性抑制作用。其中，牛奶子70％乙醇部位抑制酪氨酸酶作用较强，可以将牛奶子提取物配合在外用剂中，作为防止肌肤色素沉着的美白活性物使用。
实施例3
本实施例的牛奶子粗提物的提取步骤和工艺条件均同实施例1，不同之处在于：提取溶剂为浓度为50％的乙醇，超声提取温度为10℃，超声提取时间为0.5小时，牛奶子与乙醇的质量体积比为(1：5)g/mL。经检测，该牛奶子粗提物具有很强清除自由基的能力，具有抑制弹性蛋白酶作用以及酪氨酸酶活性抑制作用。
实施例4
本实施例的牛奶子粗提物的提取步骤和工艺条件均同实施例1，不同之处在于：提取溶剂为浓度为90％的乙醇，超声提取温度为50℃，超声提取时间为2.5小时，牛奶子与乙醇的质量体积比为(1：30)g/mL。经检测，该牛奶子粗提物具有很强清除自由基的能力，具有抑制弹性蛋白酶作用以及酪氨酸酶活性抑制作用。
实施例5
本实施例的牛奶子提取物的提取步骤和工艺条件均同实施例2，不同之处在于：溶剂Ⅰ、溶剂Ⅱ和溶剂Ⅲ分别为体积浓度为10％的乙醇、体积浓度为50％的乙醇和体积浓度为80％的乙醇。经检测，该些牛奶子提取物具有很强清除自由基的能力，具有抑制弹性蛋白酶作用以及酪氨酸酶活性抑制作用。
实施例6
本实施例的牛奶子提取物的提取步骤和工艺条件均同实施例2，不同之处在于：溶剂Ⅰ、溶剂Ⅱ和溶剂Ⅲ分别为体积浓度为50％的乙醇、体积浓度为80％的乙醇和体积浓度为100％的乙醇。经检测，该些牛奶子提取物具有很强清除自由基的能力，具有抑制弹性蛋白酶作用以及酪氨酸酶活性抑制作用。
Claims (8)
1.一种牛奶子提取物的制备方法，其特征在于，其采用方式一或方式二进行：
所述的方式一包括如下步骤：将粉碎后的牛奶子与体积浓度为70%的乙醇混合均匀，在10~50℃下提取0.5~2.5小时，固液分离得滤液，对滤液进行减压旋蒸以脱除乙醇，即得牛奶子粗提物；其中，所述牛奶子与所述乙醇的质量体积比为（1：5）~（1：30）g/mL；
所述的方式二包括如下步骤：将方式一得到的牛奶子粗提物用去离子水溶解后，上样到大孔树脂填充柱，依次用去离子水、溶剂Ⅰ、溶剂Ⅱ和溶剂Ⅲ洗脱，分别收集洗脱液，并脱除溶剂后，相应地得到水洗脱部位、溶剂洗脱部位A、溶剂洗脱部位B和溶剂洗脱部位C；所述溶剂Ⅰ、所述溶剂Ⅱ和所述溶剂Ⅲ分别为体积浓度为30%的乙醇、体积浓度为70%的乙醇和体积浓度为95%的乙醇，所述的牛奶子提取物为溶剂洗脱部位B。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，方式一中，所述的提取为超声提取；所述牛奶子与所述乙醇的质量体积比为（1:20）g/mL；所述的固液分离的方法为过滤、压滤或离心。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，方式一中，所述的超声提取在室温下进行；所述的室温为20~35℃；所述的超声提取的时间为2小时。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，方式二中，所述的大孔树脂填充柱为D101、AB-8或ADS-8树脂填充柱。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，方式二中，所述的脱除溶剂的方法为减压旋蒸。
6.一种如权利要求1~5中任一项所述的制备方法制得的牛奶子提取物。
7.一种如权利要求6所述的牛奶子提取物作为酪氨酸酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、抗氧化活性成分或抗老化活性成分在制备皮肤外用剂中的应用。
8.一种包括如权利要求6所述的牛奶子提取物的皮肤外用剂。
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| Free radical scavenging activity,phytochemical composition and nutrient analysis if Elaeagnus umbellate berry;Khanzadi Fatima Khattak;《Journal of Medicinal Plants Sesearch》;20121010;第6卷(第39期);第5196-5203页，尤其是第5197页右栏Extraction，第5199页右栏第2-3段，第5200页图2，第5201页图3，左栏第1段 * |
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