CN106119314A - 一种冰城链霉菌发酵生产米尔贝霉素的培养基和培养方法 - Google Patents

一种冰城链霉菌发酵生产米尔贝霉素的培养基和培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种冰城链霉菌发酵生产米尔贝霉素的培养基和培养方法，本发明确认了冰城链霉菌发酵生产米尔贝霉素的种子培养基、发酵培养基中碳源、氮源和最佳配伍比例。特别是发酵培养基中添加了发酵豆腐渣，培养基中的碳源、氮源含有米尔贝霉素生物合成过程中所需的关键物质，保证了米尔贝霉素的技术效果。利用本发明中提供的培养基配方和发酵控制工艺，能够提高米尔贝霉素发酵单位，降低发酵成本，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现米尔贝霉素稳定、高效的生产。

Description

一种冰城链霉菌发酵生产米尔贝霉素的培养基和培养方法
技术领域
本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种冰城链霉菌发酵生产米尔贝霉素的培养基和培养方法。
背景技术
米尔贝霉素是二十世纪70年代从链霉菌属中分离得到的一类具有广谱抗虫活性的十六元大环内酯结构的天然产物，广泛应用于农业和畜牧业的抗虫药物。
目前，国内米尔贝霉素的发酵生产采用三级发酵模式，该方式存在的主要问题有以下几点：
1 米尔贝霉素发酵水平较低，其发酵水平维持在1g/L左右。
2 国内缺少米尔贝霉素发酵工艺的文献报道。
3 米尔贝霉素发酵成本较高，降低了该产品的市场竞争力。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种发酵工艺简单，有效提高发酵单位，同时最大限度的降低原辅料对发酵单位的影响，降低生产成本，且原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现米尔贝霉素稳定、高效生产的冰城链霉菌发酵生产米尔贝霉素的培养基。
本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产米尔贝霉素的培养方法。
为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种冰城链霉菌发酵生产米尔贝霉素的培养基，其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其中
所述一级种子培养基的组成为：
甜菜糖蜜3～7ml/L、麦芽糖6～10g/L、麦芽糖酶0.001～0.005g/L、配方鱼粉8～12g/L、一浸豆粕粉6～10g/L、玉米浆10-14ml/L、硫酸铵0.5～0.9g/L、轻质碳酸钙1～5g/L；
所述二级种子培养基的组成为：
甜菜糖蜜5～9ml/L、麦芽糖8～12g/L、麦芽糖酶0.002～0.006g/L、配方鱼粉10～14g/L、一浸豆粕粉6～10g/L、玉米浆10-14ml/L、发酵豆腐干渣4-8g/L，硫酸铵0.5～0.9g/L、轻质碳酸钙1～5g/L；
所述发酵培养基的组成为：
甜菜糖蜜8～12ml/L、麦芽糖11～15g/L、麦芽糖酶0.003～0.007g/L、配方鱼粉13～17g/L、一浸豆粕粉9～13g/L、玉米浆12-16ml/L，发酵豆腐干渣6-10g/L、甜菜碱3～7g/L、硫酸铵0.5～0.9g/L、轻质碳酸钙1～5g/L、磷酸二氢钾0.07～0.11g/L、硫酸镁0.02～0.06g/L、硫酸亚铁0.06～0.1g/L、聚醚改性硅油0.5～0.9ml/L。
所述配方鱼粉是指鱼粉中含有5-10%的骨粉。
一种利用上述培养基发酵生产米尔贝霉素的培养方法，其特征在于工艺步骤为：
1） 一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至20～25℃，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的冰城链霉菌母瓶发酵液按照0.1～0.2L/m3的接种量接入一级种子培养基中进行一级种子培养，至菌体浓度25～29%、培养时间35～37h移种；
2） 二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至20～25℃，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度35～40%、培养时间30～34h时移入发酵培养基；
3） 发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至20～25℃，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，至菌体浓度35～40%、化学效价＞1.5g/L时终止发酵。
所述一级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮35～45mg/L、溶磷100～120ug/ml、总糖5～10g/L；
所述二级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮40～50mg/L、溶磷80～100ug/ml、总糖10～15g/L；
所述发酵培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮50～60mg/L、溶磷20～30ug/ml、总糖15～20g/L。
所述培养好的冰城链霉菌母瓶发酵液质量要求为：菌体浓度20～30%；镜检无杂菌。
所述一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量：0～5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h～移种：20～40m3/h；搅拌转速60～80r/min。
所述二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～30℃；空气流量40～60m3/h；搅拌转速70～90r/min。
所述发酵培养条件为：
a pH：初始pH，发酵培养基灭菌后pH控制在6～7，发酵过程中pH控制在5～7；
b 温度：采用变温控制工艺，
发酵时间0～70h：培养温度27～28℃，
发酵时间71～200h：培养温度28～29℃，
发酵时间201h～发酵结束：培养温度27～28℃；
c 搅拌转速：采用变频搅拌控制工艺，
发酵时间0～70h：转速控制在80-90r/min，
发酵时间71～200h：转速控制在110-120r/min，
发酵时间201h～发酵结束：转速控制在70-80r/min；
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa；
e 空气流量：
发酵时间0～70h：100～150m3/h，
发酵时间71～200h：200～300m3/h，
发酵时间201h～发酵结束：150～200m3/h；
f 溶氧控制：
发酵前70h内，不控制溶氧，
发酵时间71～200h，溶氧控制在40%以上，
发酵时间201～发酵结束：溶氧控制在30%以上。
所述发酵过程中采用流加法进行补料，补料包括补增效剂、补水、补硫酸铵、补麦芽糖和pH控制，其中
a 补增效剂工艺控制：
在发酵周期分别达到120h，180h补入增效剂；
b补水工艺控制：
发酵前70h不用进行补水，
发酵时间在71～200h，当菌体浓度高于45%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40～45%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度，
发酵时间在201h～发酵结束，当菌体浓度高于40%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在35～40%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度；
c 发酵过程pH控制工艺：
发酵前70h，pH不进行控制，
发酵时间在71～200h，若pH＜6.0，采用流加法加入10～20%的氢氧化钠，调节pH至6～7，若pH＞7，采用流加法加入30%的硫酸溶液，调节pH至6～7，
发酵时间在201～发酵结束，若pH＜6.2，加入10～20%的氢氧化钠，调节pH控至6.2～6.6；若pH＞6.6，加入30%的硫酸溶液，调节pH至6.3～6.6；
d 补入麦芽糖：
发酵前70h，总糖含量不进行控制，
发酵71h至200h：总糖含量＜2g/L时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使总糖的含量控制在3～5g/L，
发酵201h至发酵结束：总糖含量＜0.5g/L时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使总糖的含量控制在0.5～1g/L，
上述麦芽糖溶液中加入麦芽糖酶，其浓度控制在0.001～0.003%；
e 补硫酸铵：
在发酵120h和180h时补入10%的硫酸铵溶液，其用量控制在发酵液体积的0.01～0.03%。
所述增效剂为丝氨酸、谷氨酸和核黄素的水溶液，其各自浓度控制在0.001～0.005%；补料过程中，其用量为发酵液体积的0.01～0.03%。
本发明的技术优势体现在：
1 本发明确认了冰城链霉菌发酵生产米尔贝霉素的种子培养基、发酵培养基中碳源、氮源和最佳配伍比例。特别是发酵培养基中添加了发酵豆腐渣，培养基中的碳源、氮源含有米尔贝霉素生物合成过程中所需的关键物质，保证了米尔贝霉素的技术效果。
2 本发明对种子培养、发酵培养的工艺进行了详细的阐述，确认了米尔贝霉素最佳的发酵工艺和控制参数。通过本发明发酵生产米尔贝霉素，其发酵单位达到1.5g/L以上，同国内技术相比，发酵单位提高了50%以上。
3 本发明适用于规模化发酵生产米尔贝霉素，至少能够满足年产5吨米尔贝霉素的生产需求。
5 培养基中使用麦芽糖代替葡萄糖，避免出现葡萄糖碳化现象。
具体实施方法
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例的菌种选用冰城链霉菌：生产使用的菌种来源为母瓶发酵液。母瓶发酵液质量要求为：菌体浓度20～30%；镜检无杂菌。
发酵豆腐干渣来源：宁夏金夏食品有限公司。发酵豆腐渣干为豆腐生产后的残渣的发酵产物。目前，各种食品厂糟渣特别是豆腐渣含有丰富的营养，被处理之后利用具有很大的经济效益。发酵过程中分泌与合成的大量活菌、蛋白质、氨基酸、各种生化酶、促生长因子等营养与激素类物质。
实施例1
一级种子培养：一级种子培养基体积1m3。
甜菜糖蜜3/L、麦芽糖6kg、麦芽糖酶1g、配方鱼粉8kg、一浸豆粕粉6kg、玉米浆10L、硫酸铵0.5kg、轻质碳酸钙1kg。
二级种子培养：二级种子培养基体积5m3。
甜菜糖蜜25L、麦芽糖40kg、麦芽糖酶10g、配方鱼粉50kg、一浸豆粕粉30kg、玉米浆50L、发酵豆腐干渣20kg、硫酸铵2.5kg、轻质碳酸钙5kg。
发酵培养：发酵培养基体积50m3。
甜菜糖蜜400L、麦芽糖550kg、麦芽糖酶0.15kg、配方鱼粉650kg、一浸豆粕粉450kg、玉米浆600L、发酵豆腐干渣300kg、甜菜碱150kg、硫酸铵25kg、轻质碳酸钙50kg、磷酸二氢钾3.5kg、硫酸镁1kg、硫酸亚铁3kg、聚醚改性硅油25L。
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至20℃，并用无菌空气保压。经检测：氨基氮35.2mg/L、溶磷101ug/ml、总糖5.1g/L。然后在火焰保护下，将已经培养好的冰城链霉菌母瓶发酵液按照0.1m3的接种量接入一级种子培养基中进行一级种子培养，一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量：0～5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h～移种：20m3/h；搅拌转速60r/min；至菌体浓度25%、培养时间35h，待移种。
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至20℃，并用无菌空气保压。经检测，氨基氮40.3mg/L、溶磷82ug/ml、总糖10.2g/L。将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～30℃；空气流量40m3/h；搅拌转速70r/min；至菌体浓度35%、培养时间30h时移入发酵培养基。
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至20～25℃，并用无菌空气保压。经检测，氨基氮50.4mg/L、溶磷20.4ug/ml、总糖15g/L。然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为：
a培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6；
b 温度：采用变温控制工艺。
0～70h：培养温度27～28℃；71～200h：培养温度28～29℃；201h～发酵结束：培养温度27～28℃。
c 搅拌转速：采用变频搅拌控制工艺。0～70h：转速控制在80r/min；71～200h：转速控制在110r/min；201h～发酵结束：转速控制在70r/min；
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在5～7；
f 空气流量：0～70h：100m3/h；71～200h：200m3/h，201h～发酵结束：150m3/h；
h 溶氧控制：发酵前70h内，不控制溶氧；71～200h，溶氧控制在40%以上，201～发酵结束：溶氧控制在30%以上。
至菌体浓度35%、化学效价1.6g/L终止发酵。
实施例2
一级种子培养：一级种子培养基体积1m3。
甜菜糖蜜4/L、麦芽糖7kg、麦芽糖酶2g、配方鱼粉9kg、一浸豆粕粉7kg、玉米浆11L、硫酸铵0.6kg、轻质碳酸钙2kg。
二级种子培养：二级种子培养基体积5m3。
甜菜糖蜜30L、麦芽糖45kg、麦芽糖酶15g、配方鱼粉55kg、一浸豆粕粉35kg、玉米浆55L、发酵豆腐干渣25kg，硫酸铵3kg、轻质碳酸钙10kg。
发酵培养：发酵培养基体积50m3。
甜菜糖蜜450L、麦芽糖600kg、麦芽糖酶0.2kg、配方鱼粉700kg、一浸豆粕粉500kg、玉米浆650L，发酵豆腐干渣350kg、甜菜碱200kg、硫酸铵30kg、轻质碳酸钙100kg、磷酸二氢钾4kg、硫酸镁1.5kg、硫酸亚铁3.5kg、聚醚改性硅油30L。
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至21℃，并用无菌空气保压。经检测：氨基氮36.8mg/L、溶磷106.1ug/ml、总糖6.3g/L。然后在火焰保护下，将已经培养好的冰城链霉菌母瓶发酵液按照0.13m3的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养，一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量：0～5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h～移种：25m3/h；搅拌转速65r/min；至菌体浓度26%、培养时间35.5h，待移种。
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至21℃，并用无菌空气保压。经检测，氨基氮43.7mg/L、溶磷85.4ug/ml、总糖11.7g/L。将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～30℃；空气流量45m3/h；搅拌转速75r/min；至菌体浓度36%、培养时间31h时移入发酵培养基。
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至21℃，并用无菌空气保压。经检测，氨基氮53.0mg/L、溶磷22.9ug/ml、总糖16.4g/L。然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为：
a培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6.3；
b 温度：采用变温控制工艺。
0～70h：培养温度27～28℃；71～200h：培养温度28～29℃；201h～发酵结束：培养温度27～28℃。
c 搅拌转速：采用变频搅拌控制工艺。0～70h：转速控制在82r/min；71～200h：转速控制在113r/min；201h～发酵结束：转速控制在72r/min；
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在5～7；
f 空气流量：0～70h：110m3/h；71～200h：215m3/h，201h～发酵结束：160m3/h；
h 溶氧控制：发酵前70h内，不控制溶氧；71～200h，溶氧控制在40%以上，201～发酵结束：溶氧控制在30%以上。
至菌体浓度36%、化学效价1.7g/L终止发酵。
实施例3
一级种子培养：一级种子培养基体积1m3。
甜菜糖蜜5/L、麦芽糖8kg、麦芽糖酶3g、配方鱼粉10kg、一浸豆粕粉8kg、玉米浆12L、硫酸铵0.7kg、轻质碳酸钙3kg；
二级种子培养：二级种子培养基体积5m3。
甜菜糖蜜35L、麦芽糖50kg、麦芽糖酶20g、配方鱼粉60kg、一浸豆粕粉40kg、玉米浆60L、发酵豆腐干渣30kg，硫酸铵3.5kg、轻质碳酸钙15kg；
发酵培养：发酵培养基体积50m3。
甜菜糖蜜500L、麦芽糖650kg、麦芽糖酶0.25kg、配方鱼粉750kg、一浸豆粕粉550kg、玉米浆700L、发酵豆腐干渣400kg、甜菜碱250kg、硫酸铵35kg、轻质碳酸钙150kg、磷酸二氢钾4.5kg、硫酸镁2kg、硫酸亚铁4kg、聚醚改性硅油35L。
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至22℃，并用无菌空气保压。经检测：氨基氮39.4mg/L、溶磷110.5ug/ml、总糖7.5g/L。然后在火焰保护下，将已经培养好的冰城链霉菌母瓶发酵液按照0.15m3的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养，一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量：0～5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h～移种：30m3/h；搅拌转速70r/min；至菌体浓度27%、培养时间36h，待移种。
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至22℃，并用无菌空气保压。经检测，氨基氮45.3mg/L、溶磷89.9ug/ml、总糖12.6g/L。将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～30℃；空气流量50m3/h；搅拌转速80r/min；至菌体浓度37%、培养时间32h时移入发酵培养基。
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至22℃，并用无菌空气保压。经检测，氨基氮55.2mg/L、溶磷25.4ug/ml、总糖17.8g/L。然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为：
a培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6.5；
b 温度：采用变温控制工艺。
0～70h：培养温度27～28℃；71～200h：培养温度28～29℃；201h～发酵结束：培养温度27～28℃。
c 搅拌转速：采用变频搅拌控制工艺。0～70h：转速控制在85r/min；71～200h：转速控制在115r/min；201h～发酵结束：转速控制在75r/min；
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在5～7；
f 空气流量：0～70h：120m3/h；71～200h：250m3/h，201h～发酵结束：175m3/h；
h 溶氧控制：发酵前70h内，不控制溶氧；71～200h，溶氧控制在40%以上，201～发酵结束：溶氧控制在30%以上。
至菌体浓度36%、化学效价1.8g/L终止发酵。
实施例4
一级种子培养：一级种子培养基体积1m3。
甜菜糖蜜6/L、麦芽糖9kg、麦芽糖酶4g、配方鱼粉11kg、一浸豆粕粉9kg、玉米浆13L、硫酸铵0.8kg、轻质碳酸钙4kg；
二级种子培养：二级种子培养基体积5m3。
甜菜糖蜜40L、麦芽糖55kg、麦芽糖酶25g、配方鱼粉65kg、一浸豆粕粉45kg、玉米浆65L、发酵豆腐干渣35kg，硫酸铵4kg、轻质碳酸钙20kg；
发酵培养：发酵培养基体积50m3。
甜菜糖蜜550L、麦芽糖700kg、麦芽糖酶0.3kg、配方鱼粉800kg、一浸豆粕粉600kg、玉米浆750L，发酵豆腐干渣450kg、甜菜碱300kg、硫酸铵40kg、轻质碳酸钙200kg、磷酸二氢钾5kg、硫酸镁2.5kg、硫酸亚铁4.5kg、聚醚改性硅油40L。
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至23℃，并用无菌空气保压。经检测：氨基氮43.1mg/L、溶磷114.8ug/ml、总糖8.6g/L。然后在火焰保护下，将已经培养好的冰城链霉菌母瓶发酵液按照0.17m3的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养，一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量：0～5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h～移种：35m3/h；搅拌转速75r/min；至菌体浓度28%、培养时间36.5h，待移种。
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至23℃，并用无菌空气保压。经检测，氨基氮48.2mg/L、溶磷94.4ug/ml、总糖13.9g/L。将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～30℃；空气流量55m3/h；搅拌转速85r/min；至菌体浓度38%、培养时间33h时移入发酵培养基。
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至23℃，并用无菌空气保压。经检测，氨基氮57.6mg/L、溶磷27.9ug/ml、总糖18.8g/L。然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为：
a培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6.7；
b 温度：采用变温控制工艺。
0～70h：培养温度27～28℃；71～200h：培养温度28～29℃；201h～发酵结束：培养温度27～28℃。
c 搅拌转速：采用变频搅拌控制工艺。0～70h：转速控制在87r/min；71～200h：转速控制在117r/min；201h～发酵结束：转速控制在78r/min；
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在5～7；
f 空气流量：0～70h：135m3/h；71～200h：275m3/h，201h～发酵结束：185m3/h；
h 溶氧控制：发酵前70h内，不控制溶氧；71～200h，溶氧控制在40%以上，201～发酵结束：溶氧控制在30%以上。
至菌体浓度38%、化学效价1.7g/L终止发酵。
实施例5
一级种子培养：一级种子培养基体积1m3。
甜菜糖蜜7/L、麦芽糖10kg、麦芽糖酶5g、配方鱼粉12kg、一浸豆粕粉10kg、玉米浆14L、硫酸铵0.9kg、轻质碳酸钙5kg；
二级种子培养：二级种子培养基体积5m3。
甜菜糖蜜45L、麦芽糖60kg、麦芽糖酶30g、配方鱼粉70kg、一浸豆粕粉50kg、玉米浆70L、发酵豆腐干渣40kg，硫酸铵4.5kg、轻质碳酸钙25kg；
发酵培养：发酵培养基体积50m3。
甜菜糖蜜600L、麦芽糖750kg、麦芽糖酶0.35kg、配方鱼粉850kg、一浸豆粕粉650kg、玉米浆800L，发酵豆腐干渣500kg、甜菜碱350kg、硫酸铵45kg、轻质碳酸钙250kg、磷酸二氢钾5.5kg、硫酸镁3kg、硫酸亚铁5kg、聚醚改性硅油45L。
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至25℃，并用无菌空气保压。经检测：氨基氮45mg/L、溶磷119.6ug/ml、总糖9.8g/L。然后在火焰保护下，将已经培养好的冰城链霉菌母瓶发酵液按照0.2m3的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养，一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量：0～5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h～移种：40m3/h；搅拌转速80r/min；至菌体浓度30%、培养时间37h，待移种。
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至25℃，并用无菌空气保压。经检测，氨基氮50mg/L、溶磷99.6ug/ml、总糖15g/L。将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～30℃；空气流量60m3/h；搅拌转速90r/min；至菌体浓度40%、培养时间34h时移入发酵培养基。
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至23℃，并用无菌空气保压。经检测，氨基氮60mg/L、溶磷30ug/ml、总糖19.9g/L。然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为：
a培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6.9；
b 温度：采用变温控制工艺。
0～70h：培养温度27～28℃；71～200h：培养温度28～29℃；201h～发酵结束：培养温度27～28℃。
c 搅拌转速：采用变频搅拌控制工艺。0～70h：转速控制在90r/min；71～200h：转速控制在120r/min；201h～发酵结束：转速控制在80r/min；
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在5～7；
f 空气流量：0～70h：150m3/h；71～200h：300m3/h，201h～发酵结束：200m3/h；
h 溶氧控制：发酵前70h内，不控制溶氧；71～200h，溶氧控制在40%以上，201～发酵结束：溶氧控制在30%以上。
至菌体浓度40%、化学效价1.7g/L终止发酵。
上述实施例1-5的发酵过程中，根据检测情况，采用流加法进行补料，补料包括补增效剂、补水、补硫酸铵、补麦芽糖和pH控制，其中
a 补增效剂工艺控制：
在发酵周期分别达到120h，180h补入增效剂；
b补水工艺控制：
发酵前70h不用进行补水，
发酵时间在71～200h，当菌体浓度高于45%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40～45%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度，
发酵时间在201h～发酵结束，当菌体浓度高于40%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在35～40%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度；
c 发酵过程pH控制工艺：
发酵前70h，pH不进行控制，
发酵时间在71～200h，若pH＜6.0，采用流加法加入10～20%的氢氧化钠，调节pH至6～7，若pH＞7，采用流加法加入30%的硫酸溶液，调节pH至6～7，
发酵时间在201～发酵结束，若pH＜6.2，加入10～20%的氢氧化钠，调节pH控至6.2～6.6；若pH＞6.6，加入30%的硫酸溶液，调节pH至6.3～6.6；
d 补入麦芽糖：
发酵前70h，总糖含量不进行控制，
发酵71h至200h：总糖含量＜2g/L时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使总糖的含量控制在3～5g/L，
发酵201h至发酵结束：总糖含量＜0.5g/L时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使总糖的含量控制在0.5～1g/L，
上述麦芽糖溶液中加入麦芽糖酶，其浓度控制在0.001～0.003%；
e 补硫酸铵：
在发酵120h和180h时补入10%的硫酸铵溶液，其用量控制在发酵液体积的0.01～0.03%。
所述增效剂为丝氨酸、谷氨酸和核黄素的水溶液，其各自浓度控制在0.001～0.005%；补料过程中，其用量为发酵液体积的0.01～0.03%。
对比实施例（培养工艺及控制参数依据实施例3）
一级种子培养：一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成：玉米淀粉13kg、葡萄糖13kg、黄豆饼粉13kg、玉米浆14L、蛋白胨9kg、硫酸铵0.7kg、轻质碳酸钙3kg。灭菌后一级种子培养基的质量：氨基氮26mg/L、溶磷76ug/ml、总糖3.7mg/L。一级种子培养结束，菌体浓度18%、pH值6.4、培养时间36h。
二级种子培养：二级种子培养基体积5m3。
二级种子培养基组成：玉米淀粉65kg、葡萄糖60kg、黄豆饼粉65kg、玉米浆85L、蛋白胨50kg、硫酸铵2kg、轻质碳酸钙15kg。灭菌后的二级种子培养基的质量：氨基氮31mg/L、溶磷59ug/ml、总糖4.2g/L。将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度30%、pH值6.4、培养时间32h时移入发酵培养基。
发酵培养：发酵培养基体积50m3。
发酵培养基组成：玉米淀粉1000kg、葡萄糖1200kg、黄豆饼粉900kg、蛋白胨600kg、玉米浆700L、硫酸铵30kg、轻质碳酸钙300kg、磷酸二氢钾15kg、硫酸镁2.5kg、硫酸亚铁18kg、聚醚改性硅油50L。
先将发酵培养基灭菌，冷却至25℃，并用无菌空气保压，灭菌后发酵培养基的质量为：氨基氮42mg/100ml、溶磷16ug/ml、总糖11.2g/L。发酵过程中，按照补料工艺要求进行补料，不补入增效剂。发酵结束，菌体浓度34%、化学效价0.9g/L。

Claims (10)

1.一种冰城链霉菌发酵生产米尔贝霉素的培养基，其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其中
所述一级种子培养基的组成为：
甜菜糖蜜3～7ml/L、麦芽糖6～10g/L、麦芽糖酶0.001～0.005g/L、配方鱼粉8～12g/L、一浸豆粕粉6～10g/L、玉米浆10-14ml/L、硫酸铵0.5～0.9g/L、轻质碳酸钙1～5g/L；
所述二级种子培养基的组成为：
甜菜糖蜜5～9ml/L、麦芽糖8～12g/L、麦芽糖酶0.002～0.006g/L、配方鱼粉10～14g/L、一浸豆粕粉6～10g/L、玉米浆10-14ml/L、发酵豆腐干渣4-8g/L，硫酸铵0.5～0.9g/L、轻质碳酸钙1～5g/L；
所述发酵培养基的组成为：
甜菜糖蜜8～12ml/L、麦芽糖11～15g/L、麦芽糖酶0.003～0.007g/L、配方鱼粉13～17g/L、一浸豆粕粉9～13g/L、玉米浆12-16ml/L，发酵豆腐干渣6-10g/L、甜菜碱3～7g/L、硫酸铵0.5～0.9g/L、轻质碳酸钙1～5g/L、磷酸二氢钾0.07～0.11g/L、硫酸镁0.02～0.06g/L、硫酸亚铁0.06～0.1g/L、聚醚改性硅油0.5～0.9ml/L。
2.按照权利要求1所述的培养基，其特征在于所述配方鱼粉是指鱼粉中含有5-10%的骨粉。
3.一种利用权利要求1或2所述的培养基发酵生产米尔贝霉素的培养方法，其特征在于工艺步骤为：
1） 一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至20～25℃，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的冰城链霉菌母瓶发酵液按照0.1～0.2L/m3的接种量接入一级种子培养基中进行一级种子培养，至菌体浓度25～29%、培养时间35～37h移种；
2） 二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至20～25℃，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度35～40%、培养时间30～34h时移入发酵培养基；
3） 发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至20～25℃，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，至菌体浓度35～40%、化学效价＞1.5g/L时终止发酵。
4.按照权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述一级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮35～45mg/L、溶磷100～120ug/ml、总糖5～10g/L；
所述二级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮40～50mg/L、溶磷80～100ug/ml、总糖10～15g/L；
所述发酵培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮50～60mg/L、溶磷20～30ug/ml、总糖15～20g/L。
5.按照权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述培养好的冰城链霉菌母瓶发酵液质量要求为：菌体浓度20～30%；镜检无杂菌。
6.按照权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量：0～5h，采用空气搅拌代替机械搅拌；6h～移种：20～40m3/h；搅拌转速60～80r/min。
7.按照权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～30℃；空气流量40～60m3/h；搅拌转速70～90r/min。
8.按照权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述发酵培养条件为：
a pH：初始pH，发酵培养基灭菌后pH控制在6～7，发酵过程中pH控制在5～7；
b 温度：采用变温控制工艺，
发酵时间0～70h：培养温度27～28℃，
发酵时间71～200h：培养温度28～29℃，
发酵时间201h～发酵结束：培养温度27～28℃；
c 搅拌转速：采用变频搅拌控制工艺，
发酵时间0～70h：转速控制在80-90r/min，
发酵时间71～200h：转速控制在110-120r/min，
发酵时间201h～发酵结束：转速控制在70-80r/min；
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa；
e 空气流量：
发酵时间0～70h：100～150m3/h，
发酵时间71～200h：200～300m3/h，
发酵时间201h～发酵结束：150～200m3/h；
f 溶氧控制：
发酵前70h内，不控制溶氧，
发酵时间71～200h，溶氧控制在40%以上，
发酵时间201～发酵结束：溶氧控制在30%以上。
9.按照权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述发酵过程中采用流加法进行补料，补料包括补增效剂、补水、补硫酸铵、补麦芽糖和pH控制，其中
a 补增效剂工艺控制：
在发酵周期分别达到120h，180h补入增效剂；
b补水工艺控制：
发酵前70h不用进行补水，
发酵时间在71～200h，当菌体浓度高于45%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40～45%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度，
发酵时间在201h～发酵结束，当菌体浓度高于40%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在35～40%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度；
c 发酵过程pH控制工艺：
发酵前70h，pH不进行控制，
发酵时间在71～200h，若pH＜6.0，采用流加法加入10～20%的氢氧化钠，调节pH至6～7，若pH＞7，采用流加法加入30%的硫酸溶液，调节pH至6～7，
发酵时间在201～发酵结束，若pH＜6.2，加入10～20%的氢氧化钠，调节pH控至6.2～6.6；若pH＞6.6，加入30%的硫酸溶液，调节pH至6.3～6.6；
d 补入麦芽糖：
发酵前70h，总糖含量不进行控制，
发酵71h至200h：总糖含量＜2g/L时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使总糖的含量控制在3～5g/L，
发酵201h至发酵结束：总糖含量＜0.5g/L时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使总糖的含量控制在0.5～1g/L，
上述麦芽糖溶液中加入麦芽糖酶，其浓度控制在0.001～0.003%；
e 补硫酸铵：
在发酵120h和180h时补入10%的硫酸铵溶液，其用量控制在发酵液体积的0.01～0.03%。
10.按照权利要求9所述的培养方法，其特征在于所述增效剂为丝氨酸、谷氨酸和核黄素的水溶液，其各自浓度控制在0.001～0.005%；补料过程中，其用量为发酵液体积的0.01～0.03%。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107236771A (zh) * 2017-07-25 2017-10-10 宁夏泰瑞制药股份有限公司 利用地中海拟无枝酸菌发酵生产利福霉素的培养基和培养方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101100651A (zh) * 2007-05-28 2008-01-09 东北农业大学 链霉菌属菌株及其应用方法
CN103468625A (zh) * 2013-09-10 2013-12-25 东北农业大学 一种冰城链霉菌的基因阻断突变菌及其制备方法和应用
CN104480174A (zh) * 2014-12-26 2015-04-01 宁夏泰瑞制药股份有限公司 一种维吉尼链霉菌发酵生产维吉尼亚霉素的培养基及补料方法
CN105087711A (zh) * 2014-10-20 2015-11-25 杭州辰西生物科技有限公司 一种链霉菌发酵生产米尔贝霉素用发酵培养基及发酵培养方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101100651A (zh) * 2007-05-28 2008-01-09 东北农业大学 链霉菌属菌株及其应用方法
CN103468625A (zh) * 2013-09-10 2013-12-25 东北农业大学 一种冰城链霉菌的基因阻断突变菌及其制备方法和应用
CN105087711A (zh) * 2014-10-20 2015-11-25 杭州辰西生物科技有限公司 一种链霉菌发酵生产米尔贝霉素用发酵培养基及发酵培养方法
CN104480174A (zh) * 2014-12-26 2015-04-01 宁夏泰瑞制药股份有限公司 一种维吉尼链霉菌发酵生产维吉尼亚霉素的培养基及补料方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘慧主编: "《现代食品微生物学 第二版》", 31 May 2011, 中国轻工业出版社 *
匡春兰等: "米尔贝霉素产生菌种子培养工艺及移种标准的研究", 《发酵科技通讯》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107236771A (zh) * 2017-07-25 2017-10-10 宁夏泰瑞制药股份有限公司 利用地中海拟无枝酸菌发酵生产利福霉素的培养基和培养方法

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