CN106092987A - 一种测定乙醇脱氢酶活力的方法 - Google Patents

一种测定乙醇脱氢酶活力的方法 Download PDF

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魏晓聪
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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
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Abstract

本发明提供了一种测定乙醇脱氢酶酶活力的方法，包括一个配置缓冲体系的步骤，所述的缓冲体系为甘氨酸‑氢氧化钠缓冲液；一个配置一定浓度的酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液，并测定其荧光值，选取线性范围的步骤；一个制备酶液的步骤，将培养好的细胞离心收集菌体，加磷酸盐缓冲液制成菌悬液，经超声细胞粉碎仪破碎后离心收集上清液，上清液即为待测酶液；将酶液与反应体系分别在30‑37℃，温育3‑5min，混合后，在3‑5min内，以320nm‑380nm，激发波长和440nm‑480nm发射波长下，测定测反应体系中每分钟的荧光变化值，计算酶活力，酶活力单位（U/ml）=△荧光值/分钟。本发明提高了酶活测定的灵敏度。

Description

一种测定乙醇脱氢酶活力的方法
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及一种酶活性检测技术，具体来说是一种测定乙醇脱氢酶活力的方法。
背景技术
乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase, ADH) 是催化乙醇（酒精）脱氢生成乙醛的酶。乙醇进入体内后，其最主要的代谢途径是ADH-乙醇氧化体系。ADH-乙醇氧化体系还包括乙醛脱氢酶，它进一步将催化乙醛下脱氢生成乙酸。乙酸再进入三羧酸循环代谢后释放出能量，生成二氧化碳和水。
乙醇对肝脏、肾脏、胃肠道、神经系统、血液循环系统都有一定的毒性。研究还表明一些口腔癌、咽癌、喉癌、结肠癌也与乙醇摄入过多酒精有密切关系。
研究乙醇脱氢酶对于阐述乙醇对人体危害以研究乙醇与相关疾病之间的关系有重要作用。乙醇脱氢酶酶活力的检测是乙醇脱氢酶研究关键的技术之一。现有方法有：紫外分光光度计法、高效液相色谱法、气相色谱。其中，紫外分光光度计法最为常见，此检测方法灵敏度低，而高效液相色谱法、气相色谱检测方法操作过于繁琐，检测时间长，无法实时监测酶活。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种测定乙醇脱氢酶活力的方法，所述的这种测定乙醇脱氢酶活力的方法要解决现有技术中的测定乙醇脱氢酶活力的方法操作过于繁琐、检测时间长、无法实时监测酶活的技术问题。
本发明提供了一种测定乙醇脱氢酶酶活力的方法，包括以下步骤：
1)一个配置缓冲体系的步骤，所述的缓冲体系为0.01 mol/L -0.2 mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH7.5-9.0；
2)一个配置一定浓度的酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液，并测定其荧光值，选取线性范围的步骤，所述的酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液的浓度为1×10-4-8×10-5 mol/L，线性范围为1×10-4—2×10-5mol/L，激发波长320nm-380nm，发射波长440nm-480nm；
3)一个制备酶液的步骤，将培养好的细胞离心收集菌体，加磷酸盐缓冲液制成菌悬液，经超声细胞粉碎仪破碎后离心收集上清液，上清液即为待测酶液；
4)将酶液与反应体系分别在30-37℃，温育3-5min，反应体系包括甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、乙醇、酰胺腺嘌呤二核苷酸和酶液，混合后，在3-5min内，以320nm-380nm，激发波长和440nm-480nm发射波长下，测定测反应体系中每分钟的荧光变化值，计算酶活力，酶活力单位（U/ml）=△荧光值/分钟。
进一步的，在步骤（3）中，细胞离心条件为3000-6000r/min，温度0-8℃，离心10-25min，超声细胞破碎条件为150-450W，间隔时间为6-10s，超声时间4-8s，离心条件为10000-14000r/min，温度0-6℃，离心10-25min。
进一步的，在步骤（4）中，反应体系为2-6ml，包括：0.05 mol/L 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH7.5-9.0），1×10-1-5×10-3mol/L乙醇，5×10-4-1×10-3mol/L 酰胺腺嘌呤二核苷酸，酶液0.1-0.3ml。
酶活力单位定义：每分钟反应体系的荧光值变化1个单位为一个酶活力单位（U）。
本发明采用荧光分光光度计检测乙醇脱氢酶酶活力。根据酶测定体系中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸具有发射波长440-480nm的荧光特性，并且荧光强度与其浓度成正比关系，来检测酶的活性。先建立烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度与的荧光值的工作曲线，再由反应体系中酰胺腺嘌呤二核苷酸浓量变化计算酶活性。该方法显著提高了酶活测定的灵敏度，为检测乙醇脱氢酶提供了一种新的实用方法。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明通过建立烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度与荧光值的工作曲线，再由反应体系中酰胺腺嘌呤二核苷酸含量变化计算酶活性。显著提高了酶活测定的灵敏度，为检测乙醇脱氢酶提供了一种新的实用方法。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围
实施例1
一种测定乙醇脱氢酶活力的方法，包括如下步骤：
1）配置从1×10-4—8×10-5 mol/L浓度梯度的酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液。测定其荧光值。
2）取细菌细胞，在4℃、5000r/min离心15min，去上清沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，洗涤2-3次，去上清，沉淀用0.01mol/L，pH8.0磷酸缓冲液制成菌悬液，料液比为1︰3-5。
3）待测酶液：将菌悬液在冰浴条件下超声破碎，超声功率250W，超声6s间隔8s，超声总时间28min。以4℃、10000r/min离心20min，收集上清，作为待测酶液使用。
4）酶活测定：配置浓度为0.05 mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH8.5。
酶测定反应体系体积3ml，包括：0.05 mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液2.7ml，0.1mol/L，乙醇0.1ml，0.02mol/L 酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1ml，酶液0.1ml。将酶液与反应体系在25℃条件下分别温育20min后。
5）将酶液与反应体系混合，在5min内，测定每分钟在460nm处的荧光值，发射波长为340nm。通过荧光值的变化与对应工作曲线的数据，计算酶活力为7.52U/ml。
实施例2
一种测定乙醇脱氢酶活力的方法，包括如下步骤：
1）配置从1×10-4—8×10-5 mol/L浓度梯度的酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液。测定其荧光值。
2）取细菌细胞，在4℃、5000r/min离心15min，去上清沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，洗涤2-3次，去上清，沉淀用0.01mol/L，pH8.0磷酸缓冲液制成菌悬液，料液比为1︰3-5。
3）待测酶液：将菌悬液在冰浴条件下超声破碎，超声功率250W，超声6s间隔8s，超声总时间28min。以4℃、10000r/min离心20min，收集上清，作为待测酶液使用。
4）酶活测定：配置浓度为0.05 mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH8.5。
酶测定反应体系体积3ml，包括：0.05 mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液2.7ml，0.1mol/L，乙醇0.1ml，0.02mol/L 酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1ml，酶液0.1ml。将酶液与反应体系在30℃条件下分别温育20min后。
5）将酶液与反应体系混合，在5min内，测定每分钟在460nm处的荧光值，发射波长为340nm，通过荧光值的变化与对应工作曲线的数据，计算酶活力为7.83U/ml。
实施例3
一种测定乙醇脱氢酶活力的方法，包括如下步骤：
1）配置从1×10-4—8×10-5 mol/L浓度梯度的酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液。测定其荧光值。
2）取细菌细胞，在4℃、5000r/min离心15min，去上清沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，洗涤2-3次，去上清，沉淀用0.01mol/L，pH8.0磷酸缓冲液制成菌悬液，料液比为1︰3-5。
3）待测酶液：将菌悬液在冰浴条件下超声破碎，超声功率250W，超声6s间隔8s，超声总时间28min。以4℃、10000r/min离心20min，收集上清，作为待测酶液使用。
4）酶活测定：配置浓度为0.05 mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH8.5。
酶测定反应体系体积3ml，包括：0.05 mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液2.7ml，0.1mol/L，乙醇0.1ml，0.02mol/L 酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1ml，酶液0.1ml。将酶液与反应体系在35℃条件下分别温育20min后。
5）将酶液与反应体系混合，在5min内，测定每分钟在460nm处的荧光值，通过荧光值的变化与对应工作曲线的数据，计算酶活力为12.6U/ml。
实施例4
一种测定乙醇脱氢酶活力的方法，包括如下步骤：
1）配置从1×10-4—8×10-5 mol/L浓度梯度的酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液。测定其荧光值，选取线性范围为1×10-4—2×10-5mol/L。
2）取细菌细胞，在4℃、5000r/min离心15min，去上清沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，洗涤2-3次，去上清，沉淀用0.01mol/L，pH8.0磷酸缓冲液制成菌悬液，料液比为1︰3-5。
3）待测酶液：将菌悬液在冰浴条件下超声破碎，超声功率250W，超声6s间隔8s，超声总时间28min。以4℃、10000r/min离心20min，收集上清，作为待测酶液使用。
4）酶活测定：配置浓度为0.05 mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH8.5。
酶测定反应体系体积3ml，包括：0.05 mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液2.7ml，0.1mol/L，乙醇0.1ml，0.02mol/L 酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1ml，待测酶液0.1ml。将酶液与反应体系在40℃条件下分别温育20min后。
5）将酶液与反应体系混合，在5min内，测定每分钟在460nm处的荧光值，发射波长为340nm.通过荧光值的变化与对应工作曲线的数据，计算酶活力为7.1U/ml。

Claims (3)

1.一种测定乙醇脱氢酶酶活力的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）一个配置缓冲体系的步骤，所述的缓冲体系为0.01 mol/L -0.2 mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH7.5-9.0；
2）一个配置一定浓度的酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液，并测定其荧光值，选取线性范围的步骤，所述的酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液的浓度为1×10-4-8×10-5 mol/L，线性范围为1×10-4—2×10-5mol/L，激发波长320nm-380nm，发射波长440nm-480nm；
3）一个制备酶液的步骤，将培养好的细胞离心收集菌体，加磷酸盐缓冲液制成菌悬液，经超声细胞粉碎仪破碎后离心收集上清液，上清液即为待测酶液；
4）将酶液与反应体系分别在30-37℃，温育3-5min，反应体系包括甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、乙醇、酰胺腺嘌呤二核苷酸和酶液，混合后，在3-5min内，以320nm-380nm，激发波长和440nm-480nm发射波长下，测定测反应体系中每分钟的荧光变化值，计算酶活力，酶活力单位（U/ml）=△荧光值/分钟。
2.如权利要求1所述的一种测定乙醇脱氢酶酶活力的方法，其特征在于：在步骤（3）中，细胞离心条件为3000-6000r/min，温度0-8℃，离心10-25min，超声细胞破碎条件为150-350W，间隔时间为6-10s，超声时间4-8s，离心条件为10000-14000r/min，温度0-6℃，离心10-25min。
3.如权利要求1所述的一种测定乙醇脱氢酶酶活力的方法，其特征在于：在步骤（4）中，反应体系为2-6ml，包括：0.05 mol/L 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH7.5-9.0），1×10-1-5×10-3mol/L乙醇，5×10-4-1×10-3mol/L 酰胺腺嘌呤二核苷酸，酶液0.05-0.3ml。
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