CN104792760B - 一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，即首先用Tris‑HCl缓冲液将辅酶I配置成不同浓度梯度的辅酶I溶液，检测不同浓度的辅酶I溶液的荧光值，制作辅酶I浓度与荧光值相对应的标准曲线，将由粗乙醛脱氢酶酶液、pH7.0‑9.0，0.1 mol/L Tris‑HCl缓冲液等形成的反应体系控制温度为25‑40℃保持10‑30min后，在激发波长为320nm‑380nm，发射波长为440nm‑480nm下测定反应体系中粗乙醛脱氢酶酶液酶液每分钟的荧光变化值，最后依公式酶活力单位=△荧光值/3来计算乙的醛脱氢酶酶活力单位。该测定方法操作简便，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，属酶工程中酶活检测技术领域。
背景技术
人体由肠道吸收摄入的乙醇，主要在肝脏内代谢。乙醇进入体内后，首先在乙醇脱氢酶(ADH)的作用下使乙醇脱氢转化为乙醛，然后在由乙醛脱氢酶(ALDH)的催化作用下，使乙醛氧化生成乙酸，乙酸通过三羧酸循环(TCA)分解为CO2和水，并释放能量生成ATP。
乙醛是毒性很强的物质，在体内是潜在的致癌物质，能够干扰DNA的合成和修复，对人体组织和器官有高度的致毒，致突变，致癌的作用，乙醛脱氢酶的代谢活性直接影响体内乙醛的代谢，对人体的健康状态产生重大影响。
研究乙醛脱氢酶酶活力的检测方法具有重要意义。现有方法主要包括：紫外分光光度计法、HPLC、GC。其中，紫外分光光度计法最为常见，主要原理是在340nm处检测NADH紫外吸收值变化来反映酶活性，此检测方法灵敏度低，吸光度的变化与实际酶活的对应关系不够理想。而HPLC、GC检测方法的原理是通过检测乙醛或乙酸含量来测定酶活，但检测方法较复杂，实验时间长无法实时监测酶活，同时酶液成分复杂造成杂峰较多，对实验有干扰。
发明内容
本发明的目的之一是为了解决在使用紫外分光光度法检测乙醛脱氢酶酶活时，检测灵敏度较低，而在使用HPLC法时，步骤较复杂、时间较长，且无法实时监测酶活力等技术问题而提供一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，该检测方法具有检测速度快、灵敏度高等优点。
本发明的技术原理
本发明采用荧光分光光度计检测乙醛脱氢酶酶活力，主要依据在于NADH的荧光性质，NADH以320-380nm为激发波长，发射波长为440-480nm左右，荧光物质含量与荧光峰值成正比。采用荧光分光光度计建立NADH的荧光标准曲线，用于计算待测酶液催化反应生成的NADH含量计算酶活性，提高了测定酶活的灵敏度，为检测乙醛脱氢酶酶活提供了一种新的实用方法。
本发明的技术方案
一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，具体包括以下步骤：
(1)、配制0.01-0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，pH7.0-9.5；
(2)、激发波长为320nm-380nm，发射波长为440nm-480nm；
(3)、用pH7.0-9.5、浓度为0.01-0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液配制浓度为5×10-4-0.39×10-5mol/L的辅酶I溶液，并测定其辅酶Ⅰ溶液光值，然后以辅酶Ⅰ溶液荧光值为横坐标、以辅酶Ⅰ浓度为纵坐标，获得辅酶Ⅰ溶液荧光值和辅酶Ⅰ浓度之间的标准曲线；
(4)、取细胞培养液经4℃、5000r/min离心15min，收集所得的细胞中加入为细胞体积3倍的磷酸缓冲液，然后在超声功率150W，超声6s间隔8s，超声总时间28min进行细胞破碎，然后控制温度0-6℃、转速8000-14000r/min离心10-30min，收集上清液作为粗乙醛脱氢酶酶液；
所述的磷酸缓冲液按每升计算，含0.24g KH2PO4，1.44g Na2HPO4,8.0g NaCl，0.2gKCl和余量的水；
或取血液作为粗乙醛脱氢酶酶液；
或组织匀浆液控制温度0-6℃、转速8000-14000r/min离心10-30min，收集的上清液作为粗乙醛脱氢酶酶液；
(5)、将步骤(4)所得的粗乙醛脱氢酶酶液、pH7.0-9.0，0.1mol/L Tris-HCl缓冲液、1×10-3-5×10-3mol/L乙醛水溶液、0.1-0.5mol/LKCl水溶液、5×10-4-1×10-3mol/L NAD+水溶液和0.01-0.05mol/L硫基乙醇水溶液混合，形成的反应体系控制温度为25-40℃保持10-30min后，在激发波长为320nm-380nm，发射波长为440nm-480nm下，测定反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化值；
所述的反应体系，按每3ml计算，其组成及含量如下：
(6)、步骤(3)所得辅酶Ⅰ溶液荧光值x和辅酶Ⅰ浓度y之间标准曲线的线性方程为：
y＝0.0686x-3.6621，y的单位为1×10-4mol/L
定义每生成0.0686×10-4mol/L辅酶Ⅰ为一个酶活力单位U；
根据下述的公式计算乙醛脱氢酶酶活力；
酶活力单位(U/mL)＝△荧光值/3；
其中△荧光值为步骤(5)中的反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化值；3mL是反应体系总体积。
本发明的有益效果
本发明的一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，主要依据是NADH具有荧光性质，NADH含量与其荧光值成正比。采用荧光分光光度计建立NADH的荧光标准曲线，用于计算待测酶液催化反应生成的NADH含量，计算酶活性，提高了测定酶活的灵敏度，为检测乙醛脱氢酶酶活提供了一种新的实用方法。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。
本发明的各实施例中所述的辅酶1为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
实施例1
一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，具体包括以下步骤：
(1)、配制0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液，pH8.0，步骤如下：
0.1mol/L Tris-HCl(1000mL):Tris碱12.11g；ddH2O 800mL；HCl 49mL三者混匀充分溶解后,滴加浓盐酸调pH至8.0，定溶至1000mL；
(2)、激发波长为320nm，发射波长为440nm；
(3)、用pH8.0、浓度为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液配制浓度为5×10-4-0.39×10-5mol/L的辅酶I溶液，并测定辅酶Ⅰ溶液荧光值，然后以辅酶Ⅰ溶液荧光值为横坐标、以辅酶Ⅰ浓度为纵坐标，获得辅酶Ⅰ溶液荧光值和辅酶Ⅰ浓度之间的标准曲线；
所述的pH8.0、浓度为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液通过包括如下步骤的方法制备而成：
1.2114gTris碱溶于900ml蒸馏水，加入80.6ml0.01mol/LHCl，调pH至8.0，定容至1000ml；
(4)、取细胞培养液经4℃、5000r/min离心15min，收集所得的细胞中加入为细胞体积3倍的磷酸缓冲液，然后在超声功率150W，超声6s间隔8s，超声总时间28min进行细胞破碎，然后控制温度4℃、转速10000r/min离心20min收集上清液作为粗乙醛脱氢酶酶液；
所述的磷酸缓冲液按每升计算，含0.24g KH2PO4，1.44g Na2HPO4,8.0g NaCl，0.2gKCl和余量的水；
(5)、将步骤(4)所得的粗乙醛脱氢酶酶液、pH8.0、浓度为0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液、0.05mol/L乙醛水溶液、3mol/LKCl水溶液、0.02mol/L NAD+水溶液和1mol/L硫基乙醇水溶液混合，形成的反应体系控制温度为25℃保持20min后，在激发波长为320nm，发射波长为440nm下，在连续5min内，连续测定反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化值；
所述的反应体系，按每3ml计算，其组成及含量如下：
(6)、根据下述的公式计算乙醛脱氢酶酶活力；
步骤(3)所得辅酶Ⅰ溶液荧光值x和辅酶Ⅰ浓度y之间标准曲线的线性方程为：
y＝0.0686x-3.6621，y的单位为1×10-4mol/L；
定义每生成0.0686×10-4mol/L辅酶Ⅰ为一个酶活力单位U；
根据下述的公式计算乙醛脱氢酶酶活力；
酶活力单位(U/mL)＝△荧光值/3＝6.1U/ml；
其中△荧光值为步骤(4)中的反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化值；3mL是反应体系总体积。
对照实施例1
采用紫外分光光度计法对乙醛脱氢酶活性进行检测的方法，具体包括以下步骤：
(1)、配制0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液，pH8.0，步骤如下：
0.1mol/L Tris-HCl(1000mL):Tris碱12.11g；ddH2O 800mL；HCl 49mL三者混匀充分溶解后,滴加浓盐酸调pH至8.0,定溶至1000mL
(2)、取细胞培养液经4℃、5000r/min离心15min，收集所得的细胞中加入为细胞体积3倍的磷酸缓冲液，然后在超声功率150W，超声6s间隔8s，超声总时间28min进行细胞破碎，然后控制温度4℃、转速10000r/min离心20min，收集上清液作为粗乙醛脱氢酶酶液；
所述的磷酸缓冲液按每升计算，含0.24g KH2PO4，1.44g Na2HPO4,8.0g NaCl，0.2gKCl和余量的水；
(3)、将由pH8.0、浓度为0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液、0.05mol/L乙醛水溶液、3mol/LKCl水溶液、0.02mol/L NAD+水溶液和1mol/L硫基乙醇水溶液组成的反应体系与25℃恒温保持20min后，加入25℃恒温保持20min的步骤(2)所得的粗乙醛脱氢酶酶液，然后在340nm下连续5min内测定反应体系中每分钟的吸光度变化值；
所述的反应体系，按每3ml计算，其组成及含量如下：
(4)、定义在340nm处吸光度值升高0.001为一个酶活力单位U；根据下述的公式计算乙醛脱氢酶酶活力；
酶活力单位(U/ml)＝△吸光度/3＝5.13U/ml；
其中△吸光度为步骤(3)中的反应体系每分钟的吸光度变化值；3mL是反应体系总体积。
对照实施例2
采用HPLC对乙醛脱氢酶活性进行检测的方法，具体包括以下步骤：
(1)、配制0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液，pH8.0，步骤如下：
0.1mol/L Tris-HCl(1000mL):Tris碱12.11g；ddH2O 800mL；HCl 49mL三者混匀充分溶解后,滴加浓盐酸调pH至8.0,定溶至1000mL；
(2)、取细胞培养液经4℃、5000r/min离心15min，收集所得的细胞中加入为细胞体积3倍的磷酸缓冲液，然后在超声功率150W，超声6s间隔8s，超声总时间28min进行细胞破碎，然后控制温度4℃、转速10000r/min离心20min收集上清液作为粗乙醛脱氢酶酶液；
所述的磷酸缓冲液按每升计算，含0.24g KH2PO4，1.44g Na2HPO4,8.0g NaCl，0.2gKCl和余量的水；
(3)、将pH8.0、浓度为0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液、0.05mol/L乙醛水溶液、3mol/LKCl水溶液、0.02mol/L NAD+水溶液和1mol/L硫基乙醇水溶液混合形成的反应体系于25℃恒温保持20min后，加入25℃恒温保持20min的步骤(2)所得的粗乙醛脱氢酶酶液，然后在340nm下连续5min立即加热终止反应，终止后的反应体系作为样品进行HPLC分析其乙酸含量；
所述的反应体系，按每3ml计算，其组成及含量如下：
(4)、HPLC以Symmetry5umC4(4.6mm×150mm)为色谱柱，0.0020mol/L H2SO4为流动相，流速1.0ml/min.利用外标法测定乙酸含量，线性范围0.04-0.4g/L，柱温为室温，样品经0.22um滤膜过滤，仪器稳定平衡后进样10uL，检测波长210nm，乙酸保留时间为3.21min；
根据峰面积对应的标准曲线，得出反应生成乙酸含量，进而计算乙醛脱氢酶酶活力，定义每生成0.001g/L乙酸为一个酶活力单位U；
(5)、分别进样反应1min-5min后终止的反应体系，进样10uL，通过检测在210nm处的峰面积变化，对应标准曲线，计算酶活力为12U。
通过上述实施例1、对照实施例1、对照实施例2进行对比，可以看出：
紫外分光光度计法对乙醛脱氢酶活性进行检测的方法操作比较简单，但灵敏度不高，而且没法计算吸光度值与含量之间确切的数量关系；
HPLC对乙醛脱氢酶活性进行检测的方法步骤繁琐，需要专门的色谱柱以及配套设施，试验成本较高，而且不能实时监控需要进行终止反应，可能会使实验成分发生变化，影响实验结果；
本发明的一种乙醛脱氢酶酶活力的检测方法，解决了现有检测方法繁琐、实验时间过长以及灵敏度低等技术问题，提供一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，该检测方法具有检测速度快、灵敏度高、可以实时监控等优点，由此表明了本发明的一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法具有创造性。
实施例2
一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，具体包括以下步骤：
(1)、配制0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液，pH8.5；
(2)、激发波长为380nm，发射波长为480nm；
(3)、用pH8.5、浓度为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液配制浓度为5×10-4-0.39×10-5mol/L的辅酶Ⅰ溶液，并测定辅酶Ⅰ溶液荧光值，然后以辅酶Ⅰ溶液荧光值为横坐标、以辅酶Ⅰ浓度为纵坐标，获得辅酶Ⅰ溶液荧光值和辅酶I浓度之间的标准曲线；
所述的pH8.5、浓度为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液通过包括如下步骤的方法制备而成：
1.2114gTris碱溶于900ml蒸馏水，加入80.6ml0.01mol/LHCl，调pH至8.5，定容至1000ml；
(4)、取细胞培养液经4℃、5000r/min离心15min，收集所得的细胞中加入为细胞体积3倍的磷酸缓冲液，然后在超声功率150W，超声6s间隔8s，超声总时间28min进行细胞破碎，然后控制温度4℃、转速10000r/min离心20min，收集上清液作为粗乙醛脱氢酶酶液；
所述的磷酸缓冲液按每升计算，含0.24g KH2PO4，1.44g Na2HPO4,8.0gNaCl，0.2gKCl和余量的水；
(5)、将步骤(4)所得的粗乙醛脱氢酶酶液、pH8.5、浓度为0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液、0.05mol/L乙醛水溶液、3mol/LKCl水溶液、0.02mol/L NAD+水溶液和1mol/L硫基乙醇水溶液混合，形成的反应体系控制温度为30℃保持20min后，在激发波长为380nm，发射波长为480nm下，在连续5min内，连续测定反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化值；
所述的反应体系，按每3ml计算，其组成及含量如下：
(6)、步骤(3)所得辅酶Ⅰ溶液荧光值x和辅酶Ⅰ浓度y之间标准曲线的线性方程为：
y＝0.0686x-3.6621，y的单位为1×10-4mol/L；
定义每生成0.0686×10-4mol/L辅酶Ⅰ为一个酶活力单位U；
根据下述的公式计算乙醛脱氢酶酶活力；
酶活力单位(U/mL)＝△荧光值/3＝11.5U/ml；
其中△荧光值为步骤(5)中的反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化值；3mL是反应体系总体积；
实施例3
一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，具体包括以下步骤：
(1)、配制0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液，pH9.0；
(2)、激发波长为340nm，发射波长为460nm；
(3)、用pH9.0、浓度为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液配制浓度为5×10-4-0.39×10-5mol/L的辅酶Ⅰ溶液，并测定辅酶Ⅰ溶液荧光值，然后以辅酶Ⅰ溶液荧光值为横坐标、以辅酶Ⅰ浓度为纵坐标，获得辅酶Ⅰ溶液荧光值和辅酶I浓度之间的标准曲线；
所述的pH8.0、浓度为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液通过包括如下步骤的方法制备而成：
1.2114gTris碱溶于900ml蒸馏水，加入80.6ml0.01mol/LHCl，调pH至9.0，定容至1000ml；
(4)、取细胞培养液经4℃、5000r/min离心15min，收集所得的细胞中加入为细胞体积3倍的磷酸缓冲液，然后在超声功率150W，超声6s间隔8s，超声总时间28min进行细胞破碎，然后控制温度4℃、转速10000r/min离心20min，收集上清液作为粗乙醛脱氢酶酶液；
所述的磷酸缓冲液按每升计算，含0.24g KH2PO4，1.44g Na2HPO4,8.0g NaCl，0.2gKCl和余量的水；
(5)、将步骤(4)所得的粗乙醛脱氢酶酶液、pH9.0、浓度为0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液、0.05mol/L乙醛水溶液、3mol/LKCl水溶液、0.02mol/L NAD+水溶液和1mol/L硫基乙醇水溶液混合，形成的反应体系控制温度为35℃保持20min后，在激发波长为340nm，发射波长为460nm下，在连续5min内，测定反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化值；
所述的反应体系，按每3ml计算，其组成及含量如下：
(6)、步骤(3)所得辅酶Ⅰ溶液荧光值x和辅酶Ⅰ浓度y之间标准曲线的线性方程为：
y＝0.0686x-3.6621，y的单位为1×10-4mol/L；
定义每生成0.0686×10-4mol/L辅酶Ⅰ为一个酶活力单位U；
根据下述的公式计算乙醛脱氢酶酶活力；
酶活力单位(U/mL)＝△荧光值/3＝6.3U/ml；
其中△荧光值为步骤(4)中的反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化值；3mL是反应体系总体积。
综上所述，本发明的一种乙醛脱氢酶酶活力的检测方法，解决了现有检测方法繁琐、实验时间过长以及灵敏度低等技术问题，提供一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，该检测方法具有检测速度快、灵敏度高等优点。
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，其特征在于具体包括以下步骤：
（1）、配制0.01-0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，pH7.0-9.5；
（2）、激发波长为320nm-380nm，发射波长为440nm-480nm；
（3）、用pH7.0-9.5、浓度为0.01-0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液配制浓度为5×10-4-0.39×10-5 mol/L的辅酶Ⅰ溶液，并测定辅酶Ⅰ溶液荧光值，然后以辅酶Ⅰ溶液荧光值为横坐标、以辅酶Ⅰ浓度为纵坐标，获得辅酶Ⅰ溶液荧光值和辅酶Ⅰ浓度之间的标准曲线；
（4）、取细胞培养液经4℃、5000r/min离心15min，收集所得的细胞中加入为细胞体积3倍的磷酸缓冲液，然后在超声功率150W，超声6s间隔8s，超声总时间28min进行细胞破碎，然后控制温度0-6℃、转速8000-14000r/min离心10-30min，收集上清液作为粗乙醛脱氢酶酶液；
所述的磷酸缓冲液按每升计算，含0.24g KH2PO4，1.44g Na2HPO4, 8.0g NaCl，0.2g KCl和余量的水；
或取血液作为粗乙醛脱氢酶酶液；
或组织匀浆液控制温度0-6℃、转速8000-14000r/min离心10-30min，收集的上清液作为粗乙醛脱氢酶酶液；
（5）、将步骤（4）所得的粗乙醛脱氢酶酶液、pH7.0-9.0，0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液、1×10-3-5×10-3mol/L乙醛水溶液、0.1-0.5 mol/LKCl水溶液、5×10-4-1×10-3 mol/L NAD+水溶液和0.01-0.05mol/L硫基乙醇水溶液混合，形成的反应体系控制温度为25-40℃保持10-30min后，在激发波长为320nm-380nm，发射波长为440nm-480nm下，测定反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化值；
所述的反应体系，按每3ml计算，其组成及含量如下：
pH7.0-9.0，0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液 2.57.ml
1×10-3-5×10-3mol/L乙醛水溶液 0.1ml
0.1-0.5 mol/LKCl水溶液 0.1ml
5×10-4-1×10-3 mol/L NAD+水溶液 0.1ml
0.01-0.05mol/L硫基乙醇水溶液 0.03ml
粗乙醛脱氢酶酶液 0.1ml；
（6）、步骤（3）所得辅酶Ⅰ溶液荧光值x和 辅酶Ⅰ浓度y之间标准曲线的线性方程为：
y=0.0686x-3.6621，y的单位为1×10-4mol/L
定义每生成0.0686×10-4mol/L辅酶Ⅰ为一个酶活力单位U；
根据下述的公式计算乙醛脱氢酶酶活力；
酶活力单位（U/mL）=△荧光值/3；
其中△荧光值为步骤（5）中的反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化值；3mL是反应体系总体积。
2.如权利要求1所述的一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，其特征在于：
步骤（1）中，Tris-HCl缓冲液浓度为0.1mol/L，pH8.0；
步骤（2）中，激发波长为320nmnm，发射波长为440nmnm；
步骤（3）中，用pH7.5、浓度为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液配制浓度为5×10-4-0.39×10-5 mol/L的辅酶I溶液，并测定辅酶Ⅰ溶液荧光值，然后以辅酶Ⅰ溶液荧光值为横坐标、以辅酶Ⅰ浓度为纵坐标，获得辅酶Ⅰ溶液荧光值和辅酶Ⅰ浓度之间的标准曲线；
所述的pH7.5、浓度为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液通过包括如下步骤的方法制备而成：
1.2114gTris碱溶于900ml蒸馏水，加入80.6ml0.01mol/LHCl，调pH至7.5，定容至1000ml；
步骤（4）、取细胞培养液经4℃、5000r/min离心15min，收集所得的细胞中加入为细胞体积3倍的磷酸缓冲液，然后在超声功率150W，超声6s间隔8s，超声总时间28min进行细胞破碎，然后控制温度4℃、转速10000r/min离心20min收集上清液作为粗乙醛脱氢酶酶液；
所述的磷酸缓冲液按每升计算，含0.24g KH2PO4，1.44g Na2HPO4, 8.0g NaCl，0.2g KCl和余量的水；
步骤（5）中，将反应体系控制温度为25℃保持20min后，激发波长为320nm，发射波长为440nm下，在连续5min内，连续测定反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化值；
所述的反应体系，按每3ml计算，其组成及含量如下：
pH8.0、浓度为0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲液 2.57ml
0.05mol/L乙醛水溶液 0.1ml
3 mol/LKCl水溶液 0.1ml
0.02 mol/L NAD+水溶液 0.1ml
1 mol/L硫基乙醇水溶液 0.03ml
粗乙醛脱氢酶酶液 0.1ml。
3.如权利要求1所述的一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，其特征在于：
步骤（1）中，Tris-HCl缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH8.0；
步骤（2）中，激发波长为380nm，发射波长为480nm；
步骤（3）中用pH7.5、浓度为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液配制浓度为5×10-4-0.39×10-5 mol/L的辅酶I溶液，并测定辅酶Ⅰ溶液荧光值，然后以辅酶Ⅰ溶液荧光值为横坐标、以辅酶Ⅰ浓度为纵坐标，获得辅酶Ⅰ溶液荧光值和辅酶I浓度之间的标准曲线；
步骤（4）中，取细胞培养液经4℃、5000r/min离心15min，收集所得的细胞中加入为细胞体积3倍的磷酸缓冲液，然后在超声功率150W，超声6s间隔8s，超声总时间28min进行细胞破碎，然后控制温度4℃、转速10000r/min离心20min，收集上清液作为粗乙醛脱氢酶酶液；
所述的磷酸缓冲液按每升计算，含0.24g KH2PO4，1.44g Na2HPO4, 8.0g NaCl，0.2g KCl和余量的水；
步骤（5）中，将形成的反应体系控制温度为30℃保持20min后，在激发波长为380nm，发射波长为480nm下，在连续5min内，连续测定反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化值；
所述的反应体系，按每3ml计算，其组成及含量如下：
pH8.0、浓度为0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲液 2.57ml
0.05mol/L乙醛水溶液 0.1ml
3 mol/LKCl水溶液 0.1ml
0.02 mol/L NAD+水溶液 0.1ml
1 mol/L硫基乙醇水溶液 0.03ml
粗乙醛脱氢酶酶液 0.1ml。
4.如权利要求1所述的一种利用荧光分光光度计对乙醛脱氢酶活性进行快速检测的方法，其特征在于：
步骤（1）中， Tris-HCl缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH8.0；
步骤（2）中，激发波长为340nm，发射波长为460nm；
步骤（3）中，用pH7.5、浓度为0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液配制浓度为5×10-4-0.39×10-5 mol/L的辅酶Ⅰ溶液，并测定辅酶Ⅰ溶液荧光值，然后以辅酶Ⅰ溶液荧光值为横坐标、以辅酶Ⅰ浓度为纵坐标，获得辅酶Ⅰ溶液荧光值和辅酶I浓度之间的标准曲线；
步骤（4）中，取细胞培养液经4℃、5000r/min离心15min，收集所得的细胞中加入为细胞体积3倍的磷酸缓冲液，然后在超声功率150W，超声6s间隔8s，超声总时间28min进行细胞破碎，然后控制温度4℃、转速10000r/min离心20min，收集上清液作为粗乙醛脱氢酶酶液；
所述的磷酸缓冲液按每升计算，含0.24g KH2PO4，1.44g Na2HPO4, 8.0g NaCl，0.2g KCl和余量的水；
步骤（5）中，将步骤（4）所得的粗乙醛脱氢酶酶液、浓度为0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲液、0.05mol/L乙醛水溶液、3 mol/LKCl水溶液、0.02 mol/L NAD+ 水溶液和1 mol/L硫基乙醇水溶液混合，形成的反应体系控制温度为35℃保持20min后，在激发波长为340nm，发射波长为460nm下，在连续5min内，连续测定反应体系中粗乙醛脱氢酶每分钟的荧光变化值；
所述的反应体系，按每3ml计算，其组成及含量如下：
pH8.0、浓度为0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲液 2.57ml
0.05mol/L乙醛水溶液 0.1ml
3 mol/LKCl水溶液 0.1ml
0.02 mol/L NAD+ 水溶液 0.1ml
1 mol/L硫基乙醇水溶液 0.03ml
粗乙醛脱氢酶酶液 0.1ml。
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