CN106086135A - 一种宽体金线蛭抗凝血活性肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种宽体金线蛭抗凝血活性肽的制备方法，属于活性肽技术领域。针对目前宽体金线蛭活性肽的制备方法，蛋白水解率较低，活性肽损失较大、操作复杂、不适合工业化大规模生成应用的问题，本发明提供了一种宽体金线蛭抗凝血活性肽的制备方法，本发明通过培育枯草杆菌，提取碱性蛋白酶粗提液，通过盐析、等电点沉淀及共溶剂沉淀，静置后分成三相，取中间相酶蛋白沉淀，分离纯化得高活性碱性蛋白酶，再用其酶解宽体金线蛭分离蛋白液，得宽体金线蛭抗凝血活性肽。本发明制备的宽体金线蛭抗凝血活性肽收率高，抗凝血活性好，操作简单。

Description

一种宽体金线蛭抗凝血活性肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种宽体金线蛭抗凝血活性肽的制备方法，属于活性肽技术领域。
背景技术
传统中医学当中，因宽体金线蛭有抗凝血、抗血栓、降血脂等功效，而被广泛用
于治疗高血压、瘀血肿痛等病症，多年来其具体有效成分仍不清楚。近年来，对其有效活性成分的研究成为一大热点。吕丹等发现，活体宽体金线蛭的水分含量为85.61%，粗蛋白含量为 11.24%，糖类含量为 1.43%，总脂肪含量为 0.95%，灰分含量为 0.77%。除了水分，蛋白质占了该软体动物的大部分组成。江佩芬等对数种蛋白质水蛭进行电泳分析，发现宽体金线蛭和日本医蛭的蛋白条带较接近。汪波等对七种水蛭可溶性蛋白进行 SDS-PAGE 电泳分析，发现七种水蛭的蛋白带既有相同，又有不同之处。宽体金线蛭的蛋白条带数达到条。可以看出，不同品种的水蛭蛋白质相近，但又存在显著性差异。在氨基酸分析上，研究者们得出的结论是，天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸和甘氨酸在宽体金线蛭中占有较高的比例，蛋氨酸、色氨酸比例均较低。宽体金线蛭抗凝抗血栓的功效对内源性及外源性凝血均有抑制效果，该作用可能在抵抗血栓形成、溶解已成血栓中有积极意义。不仅能抑制血栓素B2的形成，而且还能提高血浆中6-酮-前列腺素 F1α 的量，从而促使血管内皮抗凝促纤溶活性物质的释放，增加内皮细胞的抗栓能力。但是，目前宽体金线蛭活性肽的制备方法，蛋白水解率较低，活性肽损失较大、操作复杂、不适合工业化大规模生成应用，因此，对于体金线蛭活性肽的优化研究显得尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题：针对目前宽体金线蛭活性肽的制备方法，蛋白水解率较低，活性肽损失较大、操作复杂、不适合工业化大规模生成应用的问题，本发明提供了一种宽体金线蛭抗凝血活性肽的制备方法，本发明通过培育枯草杆菌，提取碱性蛋白酶粗提液，通过盐析、等电点沉淀及共溶剂沉淀，静置后分成三相，取中间相酶蛋白沉淀，分离纯化得高活性碱性蛋白酶，再用其酶解宽体金线蛭分离蛋白液，得宽体金线蛭抗凝血活性肽。本发明制备的宽体金线蛭抗凝血活性肽收率高，抗凝血活性好，操作简单。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
（1）分别称取4~5g氯化钠，0.1~0.2g磷酸二氢钾，0.01~0.02g七水合硫酸镁，1~2g蛋白胨，5~6g葡萄糖，加入95~100mL去离子水中，以200~300r/min搅拌20~30min，加热至沸腾后，保温20~30min得培养液，按接种量8~10%，将枯草杆菌接种至培养液中，在30~32℃下培养22~24h，量取2~3mL培养液，与1.5~1.6L去离子水混合，分别加入40~42g氯化钠，1.5~1.6g磷酸二氢钾，0.15~0.16g七水合硫酸镁，11~12g牛肉膏，11~12g酵母浸粉，22~24g蔗糖，用质量浓度为1%氢氧化钠溶液调节pH至10.2~10.5，在30~32℃下，以120~130r/min振荡发酵110~120h，将发酵液置于离心机中，以12000r/min离心30~40min，取上清液，得粗酶液；
（2）称取18~25g硫酸铵置于50~55℃干燥箱干燥至恒重，加入粉碎机粉碎，过200目筛，将过筛后的硫酸铵粉加入100~150mL上述粗酶液，加入150~200mL叔丁醇，在22~25℃下，以300~400r/min搅拌20~30min，静置1~2h，置入离心机，在4000~5000r/min离心10~15min，收集中间沉淀相，加入100~120mL pH为7.5~7.9磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，得高活性碱性蛋白酶液，备用；
（3）称取50~80g新鲜的宽体金线蛭，用去离子水洗涤至洗涤液呈中性，并加入200~320mL去离子水中，混合均匀后打碎匀浆，用质量浓度为1%氢氧化钠溶液调节pH至8.0~8.5，在35~37℃恒温水浴中加热1~2h，以8000~9000r/min离心15~20min，取上清液，用质量浓度为1%盐酸溶液调节pH至4.5~5.0，转入离心机，以8000~9000r/min离心15~20min，取沉淀，加入去离子水至pH为6.8~7.0，旋转蒸发至原溶液体积的40~50%，得宽体金线蛭分离蛋白液；
（4）向上述宽体金线蛭分离蛋白液中，加入50~60mL上述步骤（2）制备的高活性碱性蛋白酶液，用质量浓度为1%氢氧化钠溶液调节pH至8.0~8.5，在50~55℃下，酶解3~4h，置于沸水浴中灭酶10~15min，冷却后置于5000~6000r/min冷冻离心机中，取上清液，减压浓缩后加入冷冻干燥箱中干燥2~3h，得宽体金线蛭抗凝血活性肽。
本发明的应用方法是：将本发明制备的宽体金线蛭抗凝血活性肽添加在治疗血栓性疾病用医药输液中，添加量为50~100mg/mL，抗凝血率提高10~12%，血栓性疾病痊愈率提高5~8%。
本发明的有益技术效果是：
（1）本发明制备的宽体金线蛭抗凝血活性肽收率高，抗凝血活性好，操作简单；
（2）本发明制备过程绿色、安全、环保。
具体实施方式
分别称取4~5g氯化钠，0.1~0.2g磷酸二氢钾，0.01~0.02g七水合硫酸镁，1~2g蛋白胨，5~6g葡萄糖，加入95~100mL去离子水中，以200~300r/min搅拌20~30min，加热至沸腾后，保温20~30min得培养液，按接种量8~10%，将枯草杆菌接种至培养液中，在30~32℃下培养22~24h，量取2~3mL培养液，与1.5~1.6L去离子水混合，分别加入40~42g氯化钠，1.5~1.6g磷酸二氢钾，0.15~0.16g七水合硫酸镁，11~12g牛肉膏，11~12g酵母浸粉，22~24g蔗糖，用质量浓度为1%氢氧化钠溶液调节pH至10.2~10.5，在30~32℃下，以120~130r/min振荡发酵110~120h，将发酵液置于离心机中，以12000r/min离心30~40min，取上清液，得粗酶液；称取18~25g硫酸铵置于50~55℃干燥箱干燥至恒重，加入粉碎机粉碎，过200目筛，将过筛后的硫酸铵粉加入100~150mL上述粗酶液，加入150~200mL叔丁醇，在22~25℃下，以300~400r/min搅拌20~30min，静置1~2h，置入离心机，在4000~5000r/min离心10~15min，收集中间沉淀相，加入100~120mL pH为7.5~7.9磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，得高活性碱性蛋白酶液；称取50~80g新鲜的宽体金线蛭，用去离子水洗涤至洗涤液呈中性，并加入200~320mL去离子水中，混合均匀后打碎匀浆，用质量浓度为1%氢氧化钠溶液调节pH至8.0~8.5，在35~37℃恒温水浴中加热1~2h，以8000~9000r/min离心15~20min，取上清液，用质量浓度为1%盐酸溶液调节pH至4.5~5.0，转入离心机，以8000~9000r/min离心15~20min，取沉淀，加入去离子水至pH为6.8~7.0，旋转蒸发至原溶液体积的40~50%，得宽体金线蛭分离蛋白液；向上述宽体金线蛭分离蛋白液中，加入50~60mL上述制备的高活性碱性蛋白酶液，用质量浓度为1%氢氧化钠溶液调节pH至8.0~8.5，在50~55℃下，酶解3~4h，置于沸水浴中灭酶10~15min，冷却后置于5000~6000r/min冷冻离心机中，取上清液，减压浓缩后加入冷冻干燥箱中干燥2~3h，得宽体金线蛭抗凝血活性肽。
实例1
分别称取4g氯化钠，0.1g磷酸二氢钾，0.01g七水合硫酸镁，1g蛋白胨，5g葡萄糖，加入95mL去离子水中，以200r/min搅拌20min，加热至沸腾后，保温20min得培养液，按接种量8%，将枯草杆菌接种至培养液中，在30℃下培养22h，量取2mL培养液，与1.5L去离子水混合，分别加入40g氯化钠，1.5g磷酸二氢钾，0.15g七水合硫酸镁，11g牛肉膏，11g酵母浸粉，22g蔗糖，用质量浓度为1%氢氧化钠溶液调节pH至10.2，在30℃下，以120r/min振荡发酵110h，将发酵液置于离心机中，以12000r/min离心30min，取上清液，得粗酶液；称取18g硫酸铵置于50℃干燥箱干燥至恒重，加入粉碎机粉碎，过200目筛，将过筛后的硫酸铵粉加入100mL上述粗酶液，加入150mL叔丁醇，在22℃下，以300r/min搅拌20min，静置1h，置入离心机，在4000r/min离心10min，收集中间沉淀相，加入100mL pH为7.5磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，得高活性碱性蛋白酶液；称取50g新鲜的宽体金线蛭，用去离子水洗涤至洗涤液呈中性，并加入200mL去离子水中，混合均匀后打碎匀浆，用质量浓度为1%氢氧化钠溶液调节pH至8.0，在35℃恒温水浴中加热1h，以8000r/min离心15min，取上清液，用质量浓度为1%盐酸溶液调节pH至5.0，转入离心机，以8000r/min离心15min，取沉淀，加入去离子水至pH为6.8，旋转蒸发至原溶液体积的40%，得宽体金线蛭分离蛋白液；向上述宽体金线蛭分离蛋白液中，加入50mL上述制备的高活性碱性蛋白酶液，用质量浓度为1%氢氧化钠溶液调节pH至8.0，在50℃下，酶解3h，置于沸水浴中灭酶10min，冷却后置于5000r/min冷冻离心机中，取上清液，减压浓缩后加入冷冻干燥箱中干燥2h，得宽体金线蛭抗凝血活性肽。
本发明的应用方法是：将本发明制备的宽体金线蛭抗凝血活性肽添加在治疗血栓性疾病用医药输液中，添加量为50mg/mL，抗凝血率提高10%，血栓性疾病痊愈率提高5%。
实例2
分别称取4.5g氯化钠，0.15g磷酸二氢钾，0.015g七水合硫酸镁，1.5g蛋白胨，5.5g葡萄糖，加入98mL去离子水中，以250r/min搅拌25min，加热至沸腾后，保温25min得培养液，按接种量9%，将枯草杆菌接种至培养液中，在31℃下培养23h，量取2.5mL培养液，与1.55L去离子水混合，分别加入41g氯化钠，1.55g磷酸二氢钾，0.15g七水合硫酸镁，11.5g牛肉膏，11.5g酵母浸粉，23g蔗糖，用质量浓度为1%氢氧化钠溶液调节pH至10.3，在31℃下，以125r/min振荡发酵115h，将发酵液置于离心机中，以12000r/min离心35min，取上清液，得粗酶液；称取20g硫酸铵置于52℃干燥箱干燥至恒重，加入粉碎机粉碎，过200目筛，将过筛后的硫酸铵粉加入120mL上述粗酶液，加入180mL叔丁醇，在23℃下，以350r/min搅拌25min，静置1.5h，置入离心机，在4500r/min离心12min，收集中间沉淀相，加入110mL pH为7.8磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，得高活性碱性蛋白酶液；称取70g新鲜的宽体金线蛭，用去离子水洗涤至洗涤液呈中性，并加入280mL去离子水中，混合均匀后打碎匀浆，用质量浓度为1%氢氧化钠溶液调节pH至8.2，在35~37℃恒温水浴中加热1.5h，以8500r/min离心18min，取上清液，用质量浓度为1%盐酸溶液调节pH至4.8，转入离心机，以8500r/min离心18min，取沉淀，加入去离子水至pH为6.9，旋转蒸发至原溶液体积的45%，得宽体金线蛭分离蛋白液；向上述宽体金线蛭分离蛋白液中，加入55mL上述制备的高活性碱性蛋白酶液，用质量浓度为1%氢氧化钠溶液调节pH至8.2，在52℃下，酶解3.5h，置于沸水浴中灭酶12min，冷却后置于5500r/min冷冻离心机中，取上清液，减压浓缩后加入冷冻干燥箱中干燥2.5h，得宽体金线蛭抗凝血活性肽。
本发明的应用方法是：将本发明制备的宽体金线蛭抗凝血活性肽添加在治疗血栓性疾病用医药输液中，添加量为80mg/mL，抗凝血率提高11%，血栓性疾病痊愈率提高7%。
实例3
分别称取5g氯化钠，0.2g磷酸二氢钾，0.02g七水合硫酸镁，2g蛋白胨，6g葡萄糖，加入100mL去离子水中，以300r/min搅拌30min，加热至沸腾后，保温30min得培养液，按接种量10%，将枯草杆菌接种至培养液中，在32℃下培养24h，量取3mL培养液，与1.6L去离子水混合，分别加入42g氯化钠，1.6g磷酸二氢钾，0.16g七水合硫酸镁，12g牛肉膏，12g酵母浸粉，24g蔗糖，用质量浓度为1%氢氧化钠溶液调节pH至10.5，在32℃下，以130r/min振荡发酵120h，将发酵液置于离心机中，以12000r/min离心40min，取上清液，得粗酶液；称取25g硫酸铵置于55℃干燥箱干燥至恒重，加入粉碎机粉碎，过200目筛，将过筛后的硫酸铵粉加入150mL上述粗酶液，加入200mL叔丁醇，在25℃下，以400r/min搅拌30min，静置2h，置入离心机，在5000r/min离心15min，收集中间沉淀相，加入120mL pH为7.9磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，得高活性碱性蛋白酶液；称取80g新鲜的宽体金线蛭，用去离子水洗涤至洗涤液呈中性，并加入320mL去离子水中，混合均匀后打碎匀浆，用质量浓度为1%氢氧化钠溶液调节pH至8.5，在37℃恒温水浴中加热2h，以9000r/min离心20min，取上清液，用质量浓度为1%盐酸溶液调节pH至4.5，转入离心机，以9000r/min离心20min，取沉淀，加入去离子水至pH为7.0，旋转蒸发至原溶液体积的50%，得宽体金线蛭分离蛋白液；向上述宽体金线蛭分离蛋白液中，加入60mL上述制备的高活性碱性蛋白酶液，用质量浓度为1%氢氧化钠溶液调节pH至8.5，在55℃下，酶解4h，置于沸水浴中灭酶15min，冷却后置于6000r/min冷冻离心机中，取上清液，减压浓缩后加入冷冻干燥箱中干燥3h，得宽体金线蛭抗凝血活性肽。
本发明的应用方法是：将本发明制备的宽体金线蛭抗凝血活性肽添加在治疗血栓性疾病用医药输液中，添加量为100mg/mL，抗凝血率提高12%，血栓性疾病痊愈率提高8%。

Claims (1)

1.一种宽体金线蛭抗凝血活性肽的制备方法，其特征在于具体制备步骤为：
（1）分别称取4~5g氯化钠，0.1~0.2g磷酸二氢钾，0.01~0.02g七水合硫酸镁，1~2g蛋白胨，5~6g葡萄糖，加入95~100mL去离子水中，以200~300r/min搅拌20~30min，加热至沸腾后，保温20~30min得培养液，按接种量8~10%，将枯草杆菌接种至培养液中，在30~32℃下培养22~24h，量取2~3mL培养液，与1.5~1.6L去离子水混合，分别加入40~42g氯化钠，1.5~1.6g磷酸二氢钾，0.15~0.16g七水合硫酸镁，11~12g牛肉膏，11~12g酵母浸粉，22~24g蔗糖，用质量浓度为1%氢氧化钠溶液调节pH至10.2~10.5，在30~32℃下，以120~130r/min振荡发酵110~120h，将发酵液置于离心机中，以12000r/min离心30~40min，取上清液，得粗酶液；
（2）称取18~25g硫酸铵置于50~55℃干燥箱干燥至恒重，加入粉碎机粉碎，过200目筛，将过筛后的硫酸铵粉加入100~150mL上述粗酶液，加入150~200mL叔丁醇，在22~25℃下，以300~400r/min搅拌20~30min，静置1~2h，置入离心机，在4000~5000r/min离心10~15min，收集中间沉淀相，加入100~120mL pH为7.5~7.9磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，得高活性碱性蛋白酶液，备用；
（3）称取50~80g新鲜的宽体金线蛭，用去离子水洗涤至洗涤液呈中性，并加入200~320mL去离子水中，混合均匀后打碎匀浆，用质量浓度为1%氢氧化钠溶液调节pH至8.0~8.5，在35~37℃恒温水浴中加热1~2h，以8000~9000r/min离心15~20min，取上清液，用质量浓度为1%盐酸溶液调节pH至4.5~5.0，转入离心机，以8000~9000r/min离心15~20min，取沉淀，加入去离子水至pH为6.8~7.0，旋转蒸发至原溶液体积的40~50%，得宽体金线蛭分离蛋白液；
（4）向上述宽体金线蛭分离蛋白液中，加入50~60mL上述步骤（2）制备的高活性碱性蛋白酶液，用质量浓度为1%氢氧化钠溶液调节pH至8.0~8.5，在50~55℃下，酶解3~4h，置于沸水浴中灭酶10~15min，冷却后置于5000~6000r/min冷冻离心机中，取上清液，减压浓缩后加入冷冻干燥箱中干燥2~3h，得宽体金线蛭抗凝血活性肽。
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CN117534731A (zh) * 2021-09-24 2024-02-09 江西康之康中药科技有限公司 一种抗凝血肽及其在抗凝血产品上的应用
CN117586352A (zh) * 2024-01-19 2024-02-23 南京华盖制药有限公司 一种基于宽体金线蛭唾液腺的抗菌多肽aph220及其应用

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CN117586352B (zh) * 2024-01-19 2024-04-16 南京华盖制药有限公司 一种基于宽体金线蛭唾液腺的抗菌多肽aph220及其应用

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