CN106085938A - 一种利用重组钝齿棒杆菌高效合成l‑茶氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用重组钝齿棒杆菌高效合成L‑茶氨酸的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明首先验证了枯草芽孢杆菌来源的GGT信号肽可以实现GGT在C.glutamicum体系中分泌表达。同时重组菌C.glutamicum SDNN403/pXMJ19‑tacM‑ggt的胞外酶活约为C.glutamicum SDNN403/pXMJ19‑ggt的2倍，这说明tacM启动子更有利于GGT酶活的合成。采用底物流加策略高产L‑茶氨酸，转化体系包含：终浓度为0.8U/mL的GGT，pH 10，37℃，从0h开始每隔两个小时补加22mmol/L的L‑谷氨酰胺，66mmol/L的乙胺。批次流加在12h时达到最大茶氨酸产量118mmol，转化率为92.8％。本文首次实现B.subtilis来源的γ‑谷氨酰转肽酶基因(ggt)在C.glutamicum SDNN403中分泌表达，通过分批流加底物获得目前报道的利用重组C.glutamicum合成L‑茶氨酸的最高产量。
Description
技术领域
一种利用重组钝齿棒杆菌表达γ-谷氨酰转肽酶蛋白，然后利用该蛋白酶催化L-谷氨酰胺和乙胺生成L-茶氨酸的方法，属于基因工程和酶工程领域。
技术背景
L-茶氨酸，化学名称为N-乙基-γ-L-谷氨酰胺，是一种几乎只存在于茶类植物中的游离氨基酸，决定茶叶的风味和品质。茶氨酸具有多种重要的生理功能：放松减压作用；降血压作用；抑制咖啡因引起的兴奋反应；提高学习能力；抗肿瘤；控制体重等。早在1985年美国食品和药物管理局(FDA)已经认证L-茶氨酸为一般公认安全的物质(GRAS)，在食品中使用沒有特定用量限制。鉴于茶氨酸上述诸多生理功效及其绝对安全性，其作为一种食品组分及饮品添加剂的需求量日益增加。进入21世纪，酶法转化合成以其优越性日益受到青睐，因此研究人员重心也集中于酶法合成L-茶氨酸，可用于合成茶氨酸的酶包括谷氨酰胺合成酶，谷氨酰胺酶和γ-谷氨酰转肽酶。谷氨酰胺合成酶受ATP供应限制，谷氨酰胺酶产物对底物的转化率低，γ-谷氨酰转肽酶脱颖而出。
γ-谷氨酰转肽酶分布广泛，负责催化谷胱甘肽及其类似物的γ-谷氨酰键的断裂，并将生成的γ-谷氨酰基团转移给水(此时即为水解反应)或者其他氨基酸(转肽反应)。利用GGT的转肽功能，选定L-谷氨酰胺和乙胺作为供体和受体时，即可实现酶法生成L-茶氨酸。
酶法催化中生产菌株的选育至关重要。目前γ-谷氨酰转肽酶的表达多选用大肠杆菌体系，江南大学吴敬教授课题组利用大肠杆菌的分泌型质粒实现了GGT蛋白的胞外分泌，该酶催化200mmol/L L-谷氨酰胺和2.2mol/L乙胺可生成156mmol/L茶氨酸，但是该大肠杆菌宿主表达体系仍存在一定的安全隐患。本课题组前期成功在B.subtilis中实现了该蛋白的过量表达，胞外获得可观的蛋白酶含量。上述研究为我们实验提出了要求和思路：生产菌株的绝对安全性和目的蛋白能否在宿主菌中实现胞外分泌。钝齿棒杆菌SDNN403是经过多级诱变筛选获得、适用于多种氨基酸高产的安全菌株，具备高效表达外源蛋白的潜力，目前尚未有利用重组钝齿棒杆菌生产茶氨酸的报导。同时有学者发现B.subtilis的胞外蛋白基因能利用自身的信号肽在芽孢杆菌宿主系统中有效分泌表达，B.subtilis来源的GGT有望在Corynebacterium glutamicum中实现分泌表达。因此本论文选用钝齿棒杆菌做为宿主菌，在克隆枯草芽孢杆菌γ-谷氨酰转肽酶基因时选择性的保留该基因的信号肽片段，研究该信号肽片段是否可在宿主菌中发挥引导分泌功能，以及该重组菌的目的蛋白表达情况及所表达蛋白酶的转化生产能力。
本实验利用pXMJ19质粒，实现了B.subtilis 168来源的γ-glutamyltranspeptidase基因在C.crenatum SDNN403的表达。同时发现GGT蛋白的信号肽片段可以在钝齿棒杆菌中被识别，从而引导该目的蛋白分泌到胞外，该分泌作用使得酶活提高4倍，这就为钝齿棒杆菌中外源蛋白的分泌提供一条可选用的信号肽序列。
利用该胞外蛋白酶液转化L-谷氨酰胺和乙胺生成茶氨酸，并对受体、供体的添加比例及最适添加酶量进行了优化，在上述基础上在12h的转化进程中流加双底物，获得最大的茶氨酸产量118mmol/L，转化率为92.8％。这是目前报道的利用重组C.glutamicum合成L-茶氨 酸的最高产量。
发明内容
本发明的目的在于提供一株重组钝齿棒杆菌用于酶法催化合成茶氨酸，同时验证γ-谷氨酰转肽酶蛋白的信号肽序列在宿主菌中的引导分泌作用，以期实现目的蛋白的分泌表达。随后将该重组菌的胞外蛋白酶用于转化L-茶氨酸，并对茶氨酸的转化条件进行优化。为钝齿棒杆菌作为宿主表达外源蛋白及茶氨酸的生产均提供了有益的指导。
本发明所述的重组菌是在研究室保藏的钝齿棒杆菌的表达B.subtilis JNA(保藏号CCTCC M209309；专利申请公布号CN 101864381 A)来源的γ-glutamyltranspeptidase蛋白得到的，该钝齿棒杆菌是本实验室通过传统诱变育种手段得到的一株钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum SDNN403(保藏编号CGMCC0890，专利号为：ZL 03112896.3)。
本发明的技术方案：
1.重组质粒pXMJ19-tacM的构建
Nco I F 5’-CATGCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTT-3’(Nco I F)
tacM-R 5’-CCGCTCACAATTCCACACATGGTACCACACGATGATTAAT T-3’
Nde I R 5’-GGAATTCCATATGTTCGGGTTATGTGGCCCCCGTG-3’(Nde I)
tacM-F 5’-ATATTCTGAA ATGAGCTGTT GACAATTAAT CATCGTGTGG TACCAT-3’
以pXMJ19载体为模板，选用PrimerSTAR HS高保真酶，利用两对引物Nde I R、TacM-F和Nco I F、tacM-R分别扩增出tac-lacIq-Nde I片段和Nco I-oripUC-tac片段，基因片段大小分别约为2700bp和2100bp，其中两片段重叠部分序列为ATTAATCATCGTGTGGTACCAT(下划线部分为tac启动子所发生突变的部位及其突变后的序列)。胶回收上述两个DNA片段，准备进行下一轮PCR。PCR体系包含dNTP、Pfu酶及其buffer，再加入上述两PCR产物使其互为模板及引物(总量设置为1μL，可根据PCR产物浓度调整其用量比例)，较低的退火温度下(50-55℃)延伸3-5个循环后，向体系中加入两端引物NCO1F，Nde1R，扩增出启动子突变的NCO1-tacM-Nde1片段，片段加A尾巴处理后连接到pMD18-T载体上转化大肠杆菌。提取得到的重组T载体酶切处理后连接至相同酶切处理收集到的pXMJ19的小片段上(约1788bp)，连接产物转化大肠杆菌，提取质粒单双酶切验证，验证成功后即为改造成功的pXMJ19-tacM载体。
2.ggt基因的克隆及表达载体pXMJ19-ggt、pXMJ19-tacM-ggt，pXMJ19-△spggt的构建
根据NCBI公布的枯草芽孢杆菌的全基因组核酸序列中ggt的基因序列设计引物，并在上游和下游引物的5'端分别加上Bam H I、Eco R1酶切位点(加下划线)。
ggt-F 5’-CGC GGATCC AAAGGAGGGAAATCATGAAAAGAA CGTGGAACGT CT-3’
ggt-F15’-CGCGGATCCAAAGGAGGGAAATCATGAAAAAACCGCCCAAAAGCTACGA-3’
ggt-R 5’-CCGGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTACGTTTTAAATTAATGCCG-3’
F1：切除ggt基因自身信号肽(84bp)剩余片段，验证该信号肽的功能。
提取B.subtilis 168的基因组作为模板，以ggt-F(F1)/ggt-R引物进行PCR扩增，获得目的基因片段ggt、△sp ggt。PCR总反应体系为50μL，包含1ng的质粒模板，200μmol/LdNTP，20μmol/L引物和1μL的Ex Taq DNA聚合酶。程序设定为95℃预变性5min；循环扩增程序为95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸105sec(根据实际情况，时间设定为1kb/min)，35个循环；72℃延伸10min。PCR反应产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离，目的条带切割后，用胶回收试剂盒(Takara)回收，回收的基因片段与pMD18-T连接，转化E.coli JM109，经过氨苄青霉素抗性平板筛选，挑取阳性转化子。提取质粒酶切验证，重组质粒命名为T-ggt，T-△sp ggt，DNA测序由上海生工生物有限公司完成。经测序验证正确的重组质粒T-ggt，T-△sp ggt，用Bam H I和Eco R I双酶切后连接到经过相同酶切处理的pXMJ19和pXMJ19-tacM上，构建表达载体pXMJ19-ggt、pXMJ19-tacM-ggt、pXMJ19-△sp ggt。3GGT在钝齿棒杆菌SDNN403中的表达
将构建好的表达载体pXMJ19-ggt、pXMJ19-tacM-ggt、pXMJ19-△spggt电转化法转化至C.glutamicum SDNN403感受态中，在氯霉素抗性平板上筛选阳性重组子，提取质粒进行酶切验证，验证正确即为构建成功的重组菌C.glutamicum SDNN403/pXMJ19-ggt、C.glutamicum SDNN403/pXMJ19-tacM-ggt、C.glutamicum SDNN403/pXMJ19-△sp ggt。上述菌株分别接种至含有10μg/mL氯霉素的LBG液体培养基中30℃培养过夜，次日以10％的接种量转接至25mL的钝齿发酵培养基中培养，添加IPTG终浓度为0.8mM进行诱导表达，完整培养周期为96h。培养结束后8000rpm离心20min，收集上清液即为胞外酶液，4℃保存。细胞沉淀用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤3次，重悬浮于该缓冲液中，超声波破碎仪破碎细胞。10000rpm离心30min去除沉淀细胞碎片，上清即为胞内蛋白液，置于4℃保存。均用于后续GGT的酶活测定。
4GGT酶活力的测定
GGT转肽酶活的测定原理是利用酶的转肽功能，催化底物γ-L-谷氨酰对硝基苯胺(γ-GpNA)的γ-谷氨酰基团转移到受体双甘二肽，随之生成的对硝基苯胺在410nm处有特殊吸收，通过测定该反应生成的对硝基苯胺的浓度来衡量GGT酶活力。
1mL反应体系中包含：50mmol/L硼酸-NaOH缓冲液(pH 10.0)，2.5mmol/Lγ-GpNA，60mmol/L双甘二肽，20μL适当稀释的酶液。37℃反应10min后，添加125μL浓度为3.5mol/L的醋酸终止反应。以不添加双甘二肽受体的反应液作为对照，其他处理均和实验组相同，410nm处测定吸光度差值。酶活单位定义为：1min内经由转肽反应催化生成1μmol对硝基苯胺(p-Nitrophenylamine)所需酶量即为一个酶活单位(U)。
5L-茶氨酸的酶法生产
L-茶氨酸的转化体系：供体L-谷氨酰胺，受体乙胺，GGT蛋白酶；反应条件为pH 10，37℃下反应一定时间，添加10％的TCA终止反应。
6L-茶氨酸含量的测定方法
采用高效液相色谱(HPLC)来测定L-茶氨酸的含量。反应液离心，经0.24μm滤膜过滤后上样。
OPA柱前自动衍生。HPLC条件：Angilent 1260；色谱柱：Hypersil ODS C18(4.0mm×125mm)。流动相A，流动相B；流动相梯度程序：保留时间为0、27.5、31.5、34、35、40min时，A/B分别为92:8、40:60、0:100、0:100、92:8、92:8；流速：1.0mL/min；检测器：紫外检测器；检测波长：338nm；柱温：40℃。本发明的有益效果：通过基因工程手段扩增本实验已有的具有γ-谷氨酰转肽酶活力的枯草芽孢杆菌的该酶基因，借助本实验室已有的成熟的枯草表达体系，实现了γ-谷氨酰转肽酶基因在模式菌株B.subtilis 168中的过量表达。将该菌株以1％接种量接种于50mL的优化培养基中，60h后离心收集上清，按标准方法测定酶活，结果显示酶活为原始菌株的20倍。将上清酶液纯化后用于茶氨酸转化，以80mM L-谷氨酰胺为供体，640mM乙胺作为受体，GGT添加量为0.6units/ml，在pH 10温度37℃条件下反应5小时,L-茶氨酸生成量为68.7mM，相应的转化率为86％。
本发明的有益成果：本实验实现了B.subtilis 168来源的γ-glutamyltranspeptidase基因在C.glutamicum SDNN403的表达。C.glutamicum SDNN403是一株适合于氨基酸生产的安全菌株，其细胞培养可以达到的高密度水平也使其具备作为宿主菌表达外源蛋白的潜能，因此该表达系统不但可以满足工业生产的安全性，而且可以满足工业生产的强度。同时发现GGT蛋白的信号肽片段可以在钝齿棒杆菌中被识别，从而引导该目的蛋白分泌到胞外，该分泌作用使得酶活提高4倍，这就为钝齿棒杆菌中外源蛋白的分泌提供一条可选用的信号肽序列。
利用该胞外蛋白酶液转化L-谷氨酰胺和乙胺生成茶氨酸，并对受体、供体的添加比例及最适添加酶量进行了优化，在上述基础上在12h的转化进程中流加双底物，获得最大的茶氨酸产量118mmol/L，转化率为92.8％。这是目前报道的利用重组C.glutamicum合成L-茶氨酸的最高产量。
附图说明
无
具体实施方法
下面结合实施例，对本发明进一步说明。
实施例1：γ-谷氨酰转肽酶基因的克隆及其表达载体的构建
以pXMJ19载体为模板，选用PrimerSTAR HS高保真酶，利用两对引物Nde I R、TacM-F和Nco I F、tacM-R分别扩增出tac-lacIq-Nde I片段和Nco I-oripUC-tac片段，基因片段大小分别约为2700bp和2100bp，其中两片段重叠部分序列为ATTAATCATCGTGTGGTACCAT(下划线部分为tac启动子所发生突变的部位及其突变后的序列)。胶回收上述两个DNA片段，准备进行下一轮PCR。PCR体系包含dNTP、Pfu酶及其buffer，再加入上述两PCR产物使其互为模板及引物(总量设置为1μL，可根据PCR产物浓度调整其用量比例)，较低的退火温度下(50-55℃)延伸3-5个循环后，向体系中加入两端引物NCO1F，Nde1R，扩增出启动子突变的NCO1-tacM-Nde1片段，片段加A尾巴处理后连接到pMD18-T载体上转化大肠杆菌。提取得到的重组T载体酶切处理后连接至相同酶切处理收集到的pXMJ19的小片段上(约1788bp)，获得pXMJ19-tacM载体。
提取B.subtilis 168的基因组为模板，ggt-F1、ggt-F/ggt-R为引物进行PCR扩增，扩增出目的基因片段△sp ggt(切除信号肽的片段基因，大小为1680bp)和ggt(完整基因，大小为1764bp)。PCR产物连接T载体，转化至E.coli JM109感受态，获得的T连载体分别经Bam H I和Eco R I双酶切验证：pMD18-T-△sp ggt质粒酶切得到△sp ggt基因片段，大小为1698 bp(其中包含18bp His编码序列)及线性化的pMD18-T质粒，大小为2692 bp；pMD18-T-ggt得到大小为1782bp的ggt基因片段(亦包含His编码序列)以线性化的pMD18-T质粒，理论值和实际值相符。
T连载体上切下来目的基因片段，连接经相同酶切处理的pXMJ19和pXMJ19-tacM载体，转化至E.coli BL21感受态中，得到重组表达载体pXMJ19-△sp ggt、pXMJ19-ggt、pXMJ19-tacM，单、双酶切验证。表明外源基因△sp ggt、ggt已经正确连接到表达载体pXMJ19和pXMJ19-tacM。
实施例2：C.glutamicum SDNN403重组菌的构建及GGT蛋白表达情况分析
将重组质粒pXMJ19-△sp ggt、pXMJ19-ggt、pXMJ19-tacM转化至C.glutamicumSDNN403感受态，质粒验证筛选得到阳性重组子C.glutamicum SDNN403/pXMJ19-△sp ggt，C.glutamicum SDNN403/pXMJ19-ggt，C.glutamicum SDNN403/pXMJ19-tacM-ggt。将其接种于基础培养基中，30℃条件下培养过夜，次日以10％的接种量转接至高产精氨酸培养基中培养，对数中期添加IPTG至终浓度为0.8mM进行诱导表达，培养96h。培养结束后离收集上清液即为胞外酶液，4℃保存。细胞沉淀破碎后亦留作后续分析。实验结果显示：重组菌C.glutamicum SDNN403/pXMJ19-△sp ggt只观察到胞内蛋白条带，C.glutamicumSDNN403/pXMJ19-ggt和C.glutamicum SDNN403/pXMJ19-tacM-ggt胞内、外均观察到明显条带。可得出结论：(1)GGT蛋白是由两个亚基构成的二聚体，大小分别为42KD，22KD；(2)是在GGT蛋白信号肽的引导下，蛋白在C.glutamicum SDNN403中实现分泌。该现象与有关报道称在芽孢杆菌宿主系统中,革兰氏阳性菌的胞外蛋白基因一般都能利用自身的启动子和信号肽有效分泌表达一致。
实施例3：重组菌株GGT酶活力测定
重组菌C.glutamicum SDNN403/pXMJ19-△sp ggt、C.glutamicum SDNN403/pXMJ19-ggt和C.glutamicum SDNN403/pXMJ19-tacM-ggt在精氨酸高产培养基中培养结束后，分别测定胞内破碎上清液及发酵上清中GGT的酶活力，结果如表1所示。因胞内、胞外的蛋白含量不具备可比性，故此处只考虑绝对酶活单位。重组菌C.glutamicum SDNN403/pXMJ19-△sp ggt中只检测到胞内GGT酶活0.99U/mL。重组菌C.glutamicum SDNN403/pXMJ19-ggt中胞内外均检测到酶活，分别为0.27U/mL，4.69U/mL，C.glutamicum SDNN403/pXMJ19-tacM-ggt中胞内外均检测到酶活，分别为0.32U/mL，10.31U/mL。从该酶活数据可以看出(表1)，重组菌C.glutamicum SDNN403/pXMJ19-ggt和C.glutamicum SDNN403/pXMJ19-tacM-ggt中，胞外酶活水平为胞内水平的接近20倍，说明此时蛋白绝大多数都分泌到了胞外。同时重组菌C.glutamicum SDNN403/pXMJ19-tacM-ggt的胞外酶活约为C.glutamicumSDNN403/pXMJ19-ggt的2倍。这说明tacM启动子更有利于GGT酶活的合成。
表1 重组菌GGT酶活测定
实施例4：乙胺浓度对GGT合成茶氨酸的影响
几乎所有GGT蛋白酶催化生产L-茶氨酸的最适条件均为温度37℃，pH 10.0，而供体L-谷氨酰胺和乙胺用量间比例及酶的添加量多有不同，因此主要研究这两个变量对GGT合成茶氨酸的影响。在该转肽酶的催化过程中，除了主转肽反应生成目的产物L-茶氨酸外，还存在多种副反应甚至多级反应，其中以水解副反应生成L-谷氨酸和自转肽反应生成L-谷氨酰-谷氨酰胺为主。催化过程中谷氨酰胺或作为底物残留，或被酶催化生成产物；酶催化产物又可分为主产物L-茶氨酸和副产物；三者(谷氨酰胺残留，L-茶氨酸，副产物)总物质量之和理论上应和初始谷氨酰胺添加量相等。因此在底物L-谷氨酰胺添加量固定的情况下，前两者之和(谷氨酰胺残留量，主产物L-茶氨酸)越大，第三者(副产物)越小，反之亦然，因此我们可以通过检测底物残留量和茶氨酸生成量判断副产物总体水平。过程中要保证受体量大于供体，因此从乙胺用量从40mmol/L到120mmol/L，保证反应体系的其他条件：22mmol/L的L-谷氨酰胺，pH 10，37℃，反应时间5h不变。实验结果可知：乙胺浓度较低时，酶对L-谷氨酰胺的利用率处于较高水平(底物残留少)，但是L-茶氨酸和L-谷氨酰胺残留量之和小，说明此时副产物生成多，水分子的竞争优势使得水解副产物L-谷氨酸含量应在实验组中处于最高水平。随着乙胺含量的增加，66mmol/L时获得最高的茶氨酸产量和转化率。乙胺浓度再增加时，谷氨酰胺残留开始显著增加。因为受体乙胺的竞争优势，副产物的量并未增加。由此推测，高浓度的乙胺对酶存在抑制作用。
实施例5：酶添加量对GGT合成茶氨酸的影响
酶的添加量对反应具有重要影响，但同样由于多种副反应的存在，单纯的提高酶量可能会催生更多的副产物的生成。因此研究酶的最适添加量，选用优化得到的乙胺浓度60mmol/L，其他条件如上保持不变。酶量较少(0.02U/mL)时，酶对底物的利用率有限，底物L-谷氨酰胺残留量多，产物L-茶氨酸量和副产物量均较少。随着酶量的增加，对底物的利用率逐渐增强，而L-谷氨酰胺残留量和L-茶氨酸生成量之和却在逐渐减少，说明此时副产物的生成量呈增加趋势。酶最适添加量为0.06U/mL，此时茶氨酸产量、转化率均最高。
实施例6：双底物流加的批次转化方法高产L-茶氨酸
在上面条件优化过程中可以看出，反应过程中必须严格控制供体、受体比例及酶的添加量。高浓度的乙胺并不利于酶的转化生产，供体谷氨酰胺又存在溶解度的限制，因此可以通过同时流加两个底物的补料策略来实现放大转化体系。将一个较长时间的过程分成若干个阶 段，降低一次性加入L-谷氨酰胺和乙胺的量，不仅有助于L-谷氨酰胺的溶解，同时可以更好的控制碱性乙胺所引起的pH变化问题。考虑到酶的稳定性及产物、底物抑制效应的存在，适当扩大酶的添加量(3倍)。初始转化体系体积为40mL，包含22mmol/L的L-谷氨酰胺，66mmol/L的乙胺，终浓度为0.8U/mL的GGT；转化条件pH 10，37℃；每隔两个小时补加22mmol/L的L-谷氨酰胺，66mmol/L的乙胺；补料前取样，补料后调节pH，茶氨酸产量不再增加时停止反应。在反应进行到12h时获得最大的茶氨酸产量118mmol/L，转化率为92.8％。该L-茶氨酸产量及底物转化率相较一次性加入具有明显优势。
Claims (3)
1.一种高效分泌合成γ-谷氨酰转肽酶的重组钝齿棒杆菌，其特征是：将SEQ ID NO:1所示ggt基因克隆至pXMJ19-tacM载体上并转化至钝齿棒杆菌中获得。
2.将权利要求1重组钝齿棒杆菌生产的γ-谷氨酰转肽酶用于茶氨酸的生产，其特征在于:反应体系为：适量的L-谷氨酰胺，适量的乙胺，适量的γ-谷氨酰转肽酶酶液，pH 10，反应温度37℃，每隔两个小时补加15-30mmol/L的L-谷氨酰胺，50-70mmol/L的乙胺；补料前取样，补料后调节pH至10，茶氨酸产量不再增加时停止反应。
3.权利要求2所述反应体系中，L-谷氨酰胺添加量优选22mmol/L，乙胺添加量优选66mmol/L，γ-谷氨酰转肽酶添加量优选0.8U/mL。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20161109 |