CN106075795B - 一种生物法除去漆树漆酚过敏性的方法 - Google Patents

一种生物法除去漆树漆酚过敏性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生物法除去漆树漆酚过敏性的方法，属于天然产物及生物转化领域。以生漆过敏源漆酚为底物的生物转化菌株的筛选及方法，通过底物诱导筛选出高效降解漆酚的灰色链霉菌诱色变种（Streptomyces griseus var.ferrugineus）菌株，对漆酚的转换率达93.38%。该方法操作简便，对漆酚的转化率高，可广泛应用于漆酚过敏去除及无致敏性漆树活性提取物的开发。

Description

一种生物法除去漆树漆酚过敏性的方法
技术领域
本发明涉及一种生物法除去漆树漆酚过敏性的方法，属于天然产物和生物技术领域。
背景技术
漆树科(Anacadiaceae)的漆树(Rhus verniciflua Stokes)韧皮部的分泌物，生漆，又称“土漆”、“国漆”或“大漆”，是漆树中最具有经济价值的产物，在我国已有七千余年的悠久历史[1]。生漆为乳白色胶状液体，一旦接触空气后转为褐色，数小时后表面于涸硬化而生成漆皮。生漆主要应用于涂料行业，具有极高的适用经济价值，因其高光泽，高硬度，耐腐、耐磨、耐酸、耐溶剂、耐热、隔水和绝缘性好、富有光泽等待性，抗化学腐蚀等特性，是军工、工业设备、农业、建设、和家具等的优良涂料，而有“涂料之王”的美誉。
生漆是一种优质的天然涂料，但又具有十分强烈的致敏性。漆酚类物质具有强烈的致敏特征，调查显示在中国约有2亿人对漆酚过敏；而约40%以上人致敏量低于2μg；而有报道显示，少数生漆漆酚过敏体质有急性肾炎的症状；过敏患处肿胀，奇痒难忍，经抓搔后会出现红色小丘斑，严重者皮肤局部呈现水痘大小的水泡。由于生漆中有致敏性物质，施工工过程中，很大一部分人员直接接触或嗅到生漆的气味，均会发生不同程度的过敏反应，致使能够使用生漆的技术人员越来越少，在化学涂料迅速发展的今天，在可供选择而激烈竞争的情况下，生漆产业的发展必然处于劣势。因此生漆过敏反应问题是漆树产业发展中迫切需要解决的一项工作。
生漆作为中国重要的林产品，也是漆树产区的主要经济来源之一。除生漆以外，漆树中还包括漆油、漆蜡和漆树活性物等产品，漆籽油在我国少数民族一直有食用和药用的习惯，可以防止胃病和止血，野漆蜡在日本得到广泛的应用，韩国对漆树活性物进行了大量的研究，其黄酮提取物具有优良的药理活性，抗氧化、抑菌、抑制α-葡糖苷酶、抗诱变、抗血小板聚集作用和抗肿瘤等作用。但是漆树的这些部位也同样具有过敏性问题，韩国当地食品药品监督管理局特别制定了漆树黄酮提取物的质量标准，其中对致敏物漆酚进行了严格限定，提取物中不得含有漆酚。因此致敏物的脱除技术是这些产品能够有效广泛使用的必要条件。利用微生物技术从原料进行固态生物发酵降解致敏物，从而从源头达到去除致敏物的目的，这对中国漆树资源的合理高效开发具有重要的意义。
发明内容
为实现上述目的，发明了一种生物法除去漆树漆酚过敏性的方法，由以下步骤组成：
第一步，斜面培养
将菌株接种到固体斜面培养基上，在28～30℃条件下，静置培养5天，获得斜面菌种；
第二步，制备种子培养液
将第一步中的斜面菌种，在无菌条件下，取5环菌体，转接到液体培养基中，在30～35℃条件下，180rpm摇床培养5-7天，制得种子培养液；
第三步，生物转化
使用第二步中的种子培养液，以体积比4～6%加入0.4～1%的漆酚，接种底物培养基，在30～35℃条件下，180rpm摇床培养1～2天，发酵后的原液，过滤除去菌体，滤液加入体积比1:3～5的乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，合并萃取液，减压浓缩，制备乙酸乙酯萃取物，得到降解物，称取重量，用乙醇定容至10mL容量瓶，然后用紫外检测与薄层检测相结合的方法鉴定转化产物，从中筛选优选菌株；
第四步，生漆漆酚的去除
将第三步的优选菌株，使用第二步中的种子培养液，以体积比4～6%加入0.4～1%的漆酚，接种底物培养基，在28～35℃条件下，180rpm摇床培养2～3天，通过紫外检测发酵液中的漆酚含量，计算可得转化率为63.75～93.38%。
本专利第四步中的优选菌株为野油菜黄单细胞Xanthomonas campestris，NOCICC10258、灰色链霉菌锈色变种Streptomyces griseus var. ferrugineus，NOCICC23624、雅致小克银汉霉Cunninghamella elegans，NO CICC40250、华根霉Rhizopus chinensis，NO CICC3091和季也蒙假丝酵母季也蒙变种Candida guilliermondii var. guilliermondii，NO CICC1274中的一种。
本专利第一步中的斜面培养基配方为，野油菜黄单细胞：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0；灰色链霉菌锈色变种：马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，自然pH；雅致小克银汉霉：马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，pH自然；华根霉：5°C麦芽汁1.0L，琼脂15.0g,自然pH；季也蒙假丝酵母季也蒙变种：5°C麦芽汁1.0L，琼脂15.0g，自然pH。
本专利第二步中的液体培养基的配方为，野油菜黄单细胞：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0；灰色链霉菌锈色变种：马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g， pH自然；雅致小克银汉霉：马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g， pH自然；华根霉：5°C麦芽汁1.0L，自然pH；季也蒙假丝酵母季也蒙变种：5°C麦芽汁1.0L，自然pH。
本专利第三步中的紫外检测条件为：样品量2mL置于25的容量瓶内，加入10mL的体积比为1:1的1.6%三乙醇胺乙醇溶液和0.1%三氯化铁乙醇溶液，用无水乙醇稀释至刻度，放置15min，在625nm处测定吸光度。
本专利第三步中的薄层检测的条件为：展开剂为石油醚:乙酸乙酯=7.5:2.5，显色剂：碘蒸气。
本专利还可以用于无致敏性漆树活性提取物的制备，将第二步的种子培养液加入到漆树叶、籽、皮、木和枝的粉末原料中，种子培养液的添加量为5%～12%，在28～35℃条件下，发酵4～5天，期间10h小时搅拌一次。发酵结束后，将发酵后的原料与30%～100%甲醇水溶液或乙醇水溶液按质量体积比1:15-30 g/mL提取1-4次，提取温度60-80℃，提取时间1-3h，提取后，过滤，合并滤液，真空浓缩得到漆树活性提取物，通过HPLC和GC-MS检测，检测不到漆酚。
本专利漆酚检测的HPLC条件为：150×2.0 mm，5 μm 的Agilent ZORBAX C-18柱，流速为0.3 mL/ min，流动相为体积比8经2的甲醇与水溶液，紫外检测器检测波长为210nm，进样量为5 μL。
本发明的有益效果：
本发明所提供一种生物法除去漆树漆酚过敏性的方法，还具有以下特点：
（1）使用生漆过敏源漆酚为底物进行菌株生物转化，有效解决了生漆的致敏性问题；
（2）将获得的菌株应用于漆树叶、木、枝、皮、籽等活性提取物的预处理，可以获得高效低毒的漆树活性提取物；
（3）本发明工艺操作简单，易实施。
具体实施方式
以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。
实施例1
第一步，斜面培养
将野油菜黄单细胞Xanthomonas campestris接种到固体斜面培养基上，固体培养基为：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0；在28～30℃条件下，静置培养5天，获得斜面菌种；
第二步，制备种子培养液
将第一步中的斜面菌种，在无菌条件下，取5环菌体，转接到液体培养基中，液体培养基为：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0；在30～35℃条件下，180rpm摇床培养5-7天，制得野油菜黄单细胞Xanthomonas campestris种子培养液；
第三步，生物转化
使用第二步中的种子培养液，以体积比4-6%加入0.4-1%的漆酚，接种底物培养基，在30～35℃条件下，180rpm摇床培养1-2天，发酵后的原液，过滤除去菌体，滤液加入体积比1:3-5的乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，合并萃取液，减压浓缩，制备乙酸乙酯萃取物，得到降解物，称取重量，用乙醇定容至10mL容量瓶，然后用紫外检测与薄层检测相结合的方法鉴定转化产物。
紫外检测条件为：样品量2mL置于25的容量瓶内，加入10mL的体积比为1:1的1.6%三乙醇胺乙醇溶液和0.1%三氯化铁乙醇溶液，用无水乙醇稀释至刻度，放置15min，在625nm处测定吸光度。标准曲线：准确称取饱和漆酚0.1g,加入蒸馏水溶解并定容到25ml容量瓶中，稀释至刻度，得到0.8mg/ml的标准品溶液。分别移取0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8和1ml的0.8mg/ml的标准溶液至25ml的容量瓶中，分别加入三乙醇胺-三氯化铁10ml,用蒸馏水定容至刻度，放置15min后，在625nm波长处测吸光度。按照以上方法绘制漆酚测定的标准曲线，经线性回归分析，得到漆酚标准曲线的线性方程为y=0.1983x-0.0015（R2=0.994），表明两变量线性相关性较好。
薄层检测的条件为：展开剂为石油醚:乙酸乙酯=7.5:2.5，显色剂：碘蒸气。
根据计算漆酚的转化率为：78.01%，由薄层检测可知，漆酚结构发生变化，表现为斑点向上移动，极性明显变弱，判定漆酚转化变为极性较小的化合物。
实施例2
第一步，斜面培养
将灰色链霉菌锈色变种Streptomyces griseus var. ferrugineus接种到固体斜面培养基上，斜面培养基为：马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，自然pH；在28～30℃条件下，静置培养5天，获得斜面菌种；
第二步，制备种子培养液
将第一步中的斜面菌种，在无菌条件下，取5环菌体，转接到液体培养基中，液体培养基为马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g， pH自然；在30～35℃条件下，180rpm摇床培养5-7天，制得灰色链霉菌锈色变种Streptomyces griseus var. ferrugineus种子培养液；
第三步，生物转化
使用第二步中的种子培养液，以体积比4-6%加入0.4-1%的漆酚，接种底物培养基，在30～35℃条件下，180rpm摇床培养1-2天，发酵后的原液，过滤除去菌体，滤液加入体积比1:3-5的乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，合并萃取液，减压浓缩，制备乙酸乙酯萃取物，得到降解物，称取重量，用乙醇定容至10mL容量瓶，然后用紫外检测与薄层检测相结合的方法鉴定转化产物。根据计算漆酚的转化率为：93.38%，由薄层检测可知，漆酚结构发生变化，表现为斑点向上移动，极性明显变弱，判定漆酚转化变为极性较小的化合物。
实施例3
第一步，斜面培养
将雅致小克银汉霉Cunninghamella elegans菌株接种到固体斜面培养基上，斜面培养基为：马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，pH自然；在28～30℃条件下，静置培养5天，获得斜面菌种；
第二步，制备种子培养液
将第一步中的斜面菌种，在无菌条件下，取5环菌体，转接到液体培养基中，液体培养基为：马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，pH自然；在30～35℃条件下，180rpm摇床培养5-7天，制得雅致小克银汉霉Cunninghamella elegans种子培养液；
第三步，生物转化
使用第二步中的种子培养液，以体积比4-6%加入0.4-1%的漆酚，接种底物培养基，在30～35℃条件下，180rpm摇床培养1-2天，发酵后的原液，过滤除去菌体，滤液加入体积比1:3-5的乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，合并萃取液，减压浓缩，制备乙酸乙酯萃取物，得到降解物，称取重量，用乙醇定容至10mL容量瓶，然后用紫外检测与薄层检测相结合的方法鉴定转化产物。根据计算漆酚的转化率为：67.27%，由薄层检测可知，漆酚结构发生变化，表现为斑点向下移动，极性明显变强，判定漆酚转化变为极性较大的化合物。
实施例4
第一步，斜面培养
将华根霉Rhizopus chinensis菌株接种到固体斜面培养基上，斜面培养基为：5°C麦芽汁1.0L，琼脂15.0g，自然pH；在28～30℃条件下，静置培养5天，获得斜面菌种；
第二步，制备种子培养液
将第一步中的斜面菌种，在无菌条件下，取5环菌体，转接到液体培养基中，液体培养基为：5°C麦芽汁1.0L，自然pH；在30～35℃条件下，180rpm摇床培养5-7天，制得华根霉Rhizopus chinensis种子培养液；
第三步，生物转化
使用第二步中的种子培养液，以体积比4-6%加入0.4-1%的漆酚，接种底物培养基，在30～35℃条件下，180rpm摇床培养1-2天，发酵后的原液，过滤除去菌体，滤液加入体积比1:3-5的乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，合并萃取液，减压浓缩，制备乙酸乙酯萃取物，得到降解物，称取重量，用乙醇定容至10mL容量瓶，然后用紫外检测与薄层检测相结合的方法鉴定转化产物。根据计算漆酚的转化率为：68.27%，由薄层检测可知，漆酚结构发生变化，表现为斑点向下移动，极性明显变强，判定漆酚转化变为极性较大的化合物。
实施例5
第一步，斜面培养
将季也蒙假丝酵母季也蒙变种Candida guilliermondii var. guilliermondii菌株接种到固体斜面培养基上，斜面培养基为：5°C麦芽汁1.0L，琼脂15.0g，自然pH；在28～30℃条件下，静置培养5天，获得斜面菌种；
第二步，制备种子培养液
将第一步中的斜面菌种，在无菌条件下，取5环菌体，转接到液体培养基中，液体培养基为：5°C麦芽汁1.0L，自然pH； 在30～35℃条件下，180rpm摇床培养5-7天，制得季也蒙假丝酵母季也蒙变种Candida guilliermondii var. guilliermondii种子培养液；
第三步，生物转化
使用第二步中的种子培养液，以体积比4-6%加入0.4-1%的漆酚，接种底物培养基，在30～35℃条件下，180rpm摇床培养1-2天，发酵后的原液，过滤除去菌体，滤液加入体积比1:3-5的乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，合并萃取液，减压浓缩，制备乙酸乙酯萃取物，得到降解物，称取重量，用乙醇定容至10mL容量瓶，然后用紫外检测与薄层检测相结合的方法鉴定转化产物。根据计算漆酚的转化率为：64.75%，由薄层检测可知，漆酚结构发生变化，表现为斑点向上移动，极性明显变弱，判定漆酚转化变为极性较小的化合物。
实施例6
将野油菜黄单细胞Xanthomonas campestris，灰色链霉菌锈色变种Streptomyces griseus var. ferrugineus，雅致小克银汉霉Cunninghamella elegans，华根霉Rhizopus chinensis和季也蒙假丝酵母季也蒙变种Candida guilliermondii var. guilliermondii中的一种菌种的种子培养液加入到漆树叶、籽、皮、木和枝的粉末原料中，种子培养液的添加量为5%～12%，在28～35℃条件下，发酵4～5天，期间10h小时搅拌一次。发酵结束后，将发酵后的原料与30%～100%甲醇水溶液或乙醇水溶液按质量体积比1:15-30 g/mL提取1-4次，提取温度60-80℃，提取时间1-3 h，提取后，过滤，合并滤液，真空浓缩得到漆树活性提取物，通过HPLC和GC-MS检测，检测不到漆酚。
HPLC条件为：150×2.0 mm，5 μm 的Agilent ZORBAX C-18柱，流速为0.3 mL/min，流动相为体积比8经2的甲醇与水溶液，紫外检测器检测波长为210 nm，进样量为5 μL。

Claims (8)

1.一种生物法除去漆树漆酚过敏性的方法，由以下步骤组成：
第一步，斜面培养
将菌株接种到固体斜面培养基上，在28～30℃条件下，静置培养5天，获得斜面菌种；
第二步，制备种子培养液
将第一步中的斜面菌种，在无菌条件下，取5环菌体，转接到液体培养基中，在30～35℃条件下，180rpm摇床培养5-7天，制得种子培养液；
第三步，生物转化
使用第二步中的种子培养液，以体积比4～6%加入0.4～1%的漆酚，接种底物培养基，在30～35℃条件下，180rpm摇床培养1～2天，发酵后的原液，过滤除去菌体，滤液加入体积比1:3～5的乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，合并萃取液，减压浓缩，制备乙酸乙酯萃取物，得到降解物，称取重量，用乙醇定容至10mL容量瓶，然后用紫外检测与薄层检测相结合的方法鉴定转化产物，从中筛选菌株，菌株为野油菜黄单细胞Xanthomonas campestris，NOCICC10258、灰色链霉菌锈色变种Streptomyces griseus var. ferrugineus，NOCICC23624、雅致小克银汉霉Cunninghamella elegans，NO CICC40250、华根霉Rhizopus chinensis，NO CICC3091和季也蒙假丝酵母季也蒙变种Candida guilliermondii var. guilliermondii，NO CICC1274中的一种；
第四步，生漆漆酚的去除
将第三步的菌株，使用第二步中的种子培养液，以体积比4～6%加入0.4～1%的漆酚，接种底物培养基，在28～35℃条件下，180rpm摇床培养2～3天，通过紫外检测发酵液中的漆酚含量，计算可得转化率为64.75～93.38%。
2.根据权利要求1所述一种生物法除去漆树漆酚过敏性的方法，其特征在于第一步中的斜面培养基配方为，（1）野油菜黄单细胞：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0；（2）灰色链霉菌锈色变种：马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，自然pH；（3）雅致小克银汉霉：马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，pH自然；（4）华根霉：5°C麦芽汁1.0L，琼脂15.0g,自然pH；（5）季也蒙假丝酵母季也蒙变种：5°C麦芽汁1.0L，琼脂15.0g，自然pH。
3.根据权利要求1所述一种生物法除去漆树漆酚过敏性的方法，其特征在于第二步中的液体培养基的配方为，（1）野油菜黄单细胞：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0；（2）灰色链霉菌锈色变种：马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g， pH自然；（3）雅致小克银汉霉：马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g， pH自然；（4）华根霉：5°C麦芽汁1.0L，自然pH；（5）季也蒙假丝酵母季也蒙变种：5°C麦芽汁1.0L，自然pH。
4.根据权利要求1所述一种生物法除去漆树漆酚过敏性的方法，其特征在于第三步中的紫外检测条件为：样品量2mL置于25的容量瓶内，加入10mL的体积比为1:1的1.6%三乙醇胺乙醇溶液和0.1%三氯化铁乙醇溶液，用无水乙醇稀释至刻度，放置15min，在625nm处测定吸光度。
5.根据权利要求1所述一种生物法除去漆树漆酚过敏性的方法，其特征在于第三步中的薄层检测的条件为：展开剂为石油醚:乙酸乙酯=7.5:2.5，显色剂：碘蒸气。
6.根据权利要求1所述一种生物法除去漆树漆酚过敏性的方法，其特征在于第三步菌株可应用于无致敏性漆树活性提取物的制备，将第二步的种子培养液加入到漆树叶、籽、皮、木和枝的粉末原料中，种子培养液的添加量为5%～12%，在28～35℃条件下，发酵4～5天，期间10h小时搅拌一次。
7.根据权利要求6所述一种生物法除去漆树漆酚过敏性的方法，其特征在于发酵结束后，将发酵后的原料与30%～100%甲醇水溶液或乙醇水溶液按质量体积比1:15-30 g/mL提取1-4次，提取温度60-80℃，提取时间1-3 h，提取后，过滤，合并滤液，真空浓缩得到漆树活性提取物，通过HPLC和GC-MS检测，检测不到漆酚。
8.根据权利要求7所述一种生物法除去漆树漆酚过敏性的方法，其特征在于HPLC条件为：150×2.0 mm，5 μm 的Agilent ZORBAX C-18柱，流速为0.3 mL/ min，流动相为体积比8:2的甲醇与水溶液，紫外检测器检测波长为210 nm，进样量为5 μL。
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