CN106074590A - 脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物及其制备方法和应用 - Google Patents

脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物及其制备方法和应用。所述的脱氧嘌呤核苷包括脱氧腺苷、脱氧鸟苷；所述其它核苷、碱基包括：脱氧胞苷、胸苷、腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶；本发明的优点在于：脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基均为人体正常核苷，以脱氧嘌呤核苷为主药，以其它核苷、碱基为辅药的组合用于制备治疗胃癌、肺癌、肝癌、结肠癌、食管癌、胰腺癌、乳腺癌、生殖系统肿瘤等多种常见恶性肿瘤的药物，该发明抗肿瘤作用有广谱、低毒、机制全新等特点；组合用药比单一用药毒副作用降低；抗肿瘤作用相乘性增加；同时可延缓肿瘤耐药性的发生。

Description

脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物及其 制备方法和应用
本发明是申请号201410675196.4，申请日：2014年11月24日，发明名称：“脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物及其制备方法和应用”的分案申请。
技术领域
本发明涉及人体正常脱氧腺嘌呤核苷与核苷或碱基组合在制备肿瘤药物中的应用，具体地说是将脱氧腺苷、脱氧鸟苷中的一种或两种与核苷或碱基中的一种或多种组合成药用于治疗肿瘤，最经典的是两种脱氧嘌呤核苷与一种其它核苷或碱基组合制备肿瘤药物。属于肿瘤新药开发领域。
背景技术
核苷（nucleoside）由碱基和五碳糖(核糖或脱氧核糖)连接而成，即嘌呤的N-9或嘧啶的N-1与核糖或脱氧核糖的C-1通过β糖苷键连接而成的化合物，包括核糖核苷和脱氧核糖核苷两类，核糖核苷构成RNA，主要有腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷；脱氧核糖核苷（简称脱氧核苷）构成DNA，主要有脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和胸苷。碱基是组成核苷的重要部分，主要有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。
核糖核苷，由除胸腺嘧啶外的嘌呤或嘧啶与核糖分子共价结合而成的化合物，主要有腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷。腺嘌呤核苷(adenosine)简称腺苷，化学名：9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤，CAS号：58-61-7，分子式：C10H13N5O4，分子量：267.24。鸟嘌呤核苷（Guanosine）简称鸟苷，化学名：9-β-D-呋喃核苷鸟嘌，CAS号：118-00-3，分子式：C10H13N5O5，分子量：283.24。胞嘧啶核苷（Cytidine）简称胞苷，化学名：1-β-D-呋喃核糖基胞嘧啶，CAS号：65-46-3，分子式：C9H13N3O5，分子量243.22。尿嘧啶核苷简称尿苷，化学名：1-β-D-呋喃核糖基尿嘧啶，CAS号：58-96-8，分子式：C9H12N2O6，分子量244.20。
脱氧核糖核苷（deoxynucleoside），是嘌呤碱(腺嘌呤、鸟嘌呤)的N-9或嘧啶碱(胞嘧啶、胸腺嘧啶)的N-1与2-脱氧-D-核糖的C-1通过β糖苷键相连接而成的化合物，体内主要的脱氧核苷有脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸腺嘧啶脱氧核苷（简称胸苷）。脱氧腺苷（deoxyadenosine）即2′-腺嘌呤脱氧核苷，化学名：9-β-D-2′-脱氧呋喃核苷腺嘌呤，是腺嘌呤的N-9与2-脱氧-D-核糖的C-1通过β糖苷键相连所形成的化合物，CAS号：958-09-8，分子式：C10H13N5O3，分子量：251.24。脱氧鸟苷（deoxyguanosine）即2′-鸟嘌呤脱氧核苷，化学名：9-β-2′-呋喃脱氧核苷鸟嘌呤，是鸟嘌呤的N-9与2-脱氧-D-核糖的C-1通过β糖苷键相连接所形成的化合物，CAS号：961-07-9，分子式：C10H13N5O4，分子量：267.24。脱氧胞苷（deoxycytidine）即2'-脱氧胞嘧啶核苷，化学名：1-β-2′-呋喃脱氧核苷胞嘧啶，是胞嘧啶的N-1与2-脱氧-D-核糖的C-1通过β糖苷键相连接所形成的化合物，CAS号：951-77-9，分子式：C9H13N3O4，分子量：227.22。胸腺嘧啶脱氧核苷简称胸苷（Thymidine）即2'-脱氧胸腺嘧啶核苷，或β-胸苷，化学名：9-β-D-呋喃核苷胸腺嘧啶，CAS号：50-89-5，分子式：C10H14N2O5，分子量为242.023。
碱基是核苷或脱氧核苷去除核糖的部分，包括：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。腺嘌呤(adenine)：又称维生素B4，CAS号：73-24-5，分子式：C5H5N5，分子量：135.127；鸟嘌呤（guanine）：CAS号：73-40-5，分子式：C5H5N5O，分子量：151.13；胞嘧啶（Cytosine）：CAS号：71-30-7，分子式：C4H5N3O，分子量111.10；尿嘧啶(Uracil) ：CAS号：66-22-8，分子式：C4H4N2O2，分子量112.09；胸腺嘧啶（Thymine）：CAS号： 65-71-4，分子式：C5H6N2O2，分子量：126.1133。
一磷酸脱氧核糖核苷是构成脱氧核糖核酸DNA的结构片段，脱氧核苷及其衍生物具有良好的生理活性，是基因药物和基因工程研究的重要原料。核苷类抗肿瘤药物是常见的一类抗肿瘤药，仅抗代谢类药物中有嘌呤类31种，其中上市10种，嘧啶类35种，其中上市9种。这些药物是用参与细胞代谢的正常核苷类物质为母体，用一种元素或基团取代正常元素和基团进行结构改造和修饰，从而达到具有抗肿瘤活性的目的。例如：6-羟基嘌呤、5-氟尿嘧啶等。
本发明与前述抗肿瘤药本质区别是：涉及到的各种核苷与碱基均为没有异常取代基的人体正常核苷与碱基。目前人们一般认为正常核苷能够促进肿瘤生长，而不是抑制肿瘤生长。因此，将正常脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备抗肿瘤药物，国内外尚未见相关报道。
发明内容
本发明提供了一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷、碱基组合制备肿瘤药物，将一种或二种脱氧嘌呤苷与包括腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧胞苷、胸苷、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶的一种、两种或多种组合作为治疗肿瘤的药物成分使用；最优选的组合为两种脱氧嘌呤苷与一种其它核苷或碱基的组合，实现以下发明目的：
脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基均为人体正常核苷，以脱氧嘌呤核苷为主药，以其它核苷、碱基为辅药的组合用于制备治疗胃癌、肺癌、肝癌、结肠癌、食管癌、胰腺癌、乳腺癌、生殖系统肿瘤等多种常见恶性肿瘤的药物，治疗效果显著。
为解决以上技术问题，本发明的技术方案为：
一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物，所述药物由脱氧腺苷和脱氧鸟苷与其它核苷中的任一种组合而制成；或由脱氧腺苷和脱氧鸟苷与碱基中的任一种组合而制成。
以下是对上述技术方案的进一步改进：
所述的核苷为鸟苷。
所述的核苷为鸟嘌呤。
所述的核苷为腺苷。
所述脱氧腺苷、鸟苷、脱氧鸟苷摩尔浓度比为1-3：0.5-2：1。
所述脱氧腺苷、鸟苷、脱氧鸟苷摩尔浓度比为1：0.5：1。
所述脱氧腺苷、鸟苷、脱氧鸟苷摩尔浓度比为3：2：1。
所述脱氧腺苷、鸟苷、脱氧鸟苷摩尔浓度比为1：1：1。
所述脱氧腺苷、鸟嘌呤、脱氧鸟苷摩尔浓度比为：1：1：1。
所述脱氧腺苷、鸟嘌呤、脱氧鸟苷摩尔浓度比为：1：0.5：1。
所述脱氧腺苷、腺苷、脱氧鸟苷摩尔浓度比为：1：1：1。
所述脱氧腺苷、腺苷、脱氧鸟苷摩尔浓度比为：1：0.5：1。
所述药物制成注射剂或片剂或缓释剂。
一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物的应用，所述注射剂，其组成为：
脱氧腺苷 14-16g
鸟苷 7.6-8.6g
脱氧鸟苷 15.9-16.9g
注射用大豆油 190-210g
注射用卵磷脂 10-12g
注射用甘油 21-23g
注射用水加至 2000ml。
所述注射剂，其组成为：
脱氧腺苷 15.5g
鸟苷 8.1g
脱氧鸟苷 16.4g
注射用大豆油 200g
注射用卵磷脂 11g
注射用甘油 22g
注射用水加至 2000ml。
所述片剂，其组成为：
脱氧腺苷 7.65-7.85g
鸟苷 3.95-4.15g
脱氧鸟苷 8.1-8.3g
微晶纤维素 7.4-7.6g
淀粉 5.9-6.1g
硬脂酸镁 1.4-1.6g
所述片剂为100片片剂的量。
所述片剂，其组成为：
脱氧腺苷 7.75g
鸟苷 4.05g
脱氧鸟苷 8.2g
微晶纤维素 7.5g
淀粉 6g
硬脂酸镁 1.5g
所述片剂为100片片剂的量。
一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于：所述注射剂的制备包括以下步骤：
a、原料药的配备；
b、油相的制备；
c、水相的制备；
d、初乳的制备；
e、调pH；
f、乳匀、过滤；
j、全检、包装、入库。
所述调pH步骤，调pH至6-8。
所述乳匀、过滤步骤，在100 mPa压力下乳剂匀浆20次，乳液以0.45μm微孔滤膜过滤，将乳剂灌封于清洗好的注射用安瓿中，通氮，熔封，置121℃条件下热压灭菌20 min。
采用所述方法，制得粒径在100～500nm之间的注射用脂肪乳剂。
所述片剂的制备方法，包括以下步骤:
a、原料药的配备；
b、原料分别过筛；
c、混合、过筛；
d、淀粉过筛；
e、加入硬脂酸镁；
f、压片、全检、包装、入库。
所述原料分别过筛：称取脱氧腺苷、鸟苷、脱氧鸟苷、淀粉、硬脂酸镁分别过100目筛，微晶纤维素过60目筛。
所述混合、过筛步骤，将脱氧腺苷、鸟苷、脱氧鸟苷与微晶纤维素以等量递加法混合，再过40目筛充分混匀三次。
所述药物，对不同肿瘤细胞的IC50值：Hela的IC50值为0.6mmol/L，Bel-7402的IC50值为0.9mmol/L；对不同肿瘤细胞作用48h的抑制率：Hela抑制率为88.43% ；7402 抑制率为77.21%；HepG2抑制率为77.45%；SPC抑制率为72.04%。
本发明与现有技术相比，其优点在于：
1、本发明涉及到的所有核苷、碱基均为动物体内的正常物质，是人体正常组织细胞生长繁殖的必须营养物质。人体正常脱氧腺嘌呤核苷与核苷或碱基组合抗肿瘤新药的发现从根本上改变了抗肿瘤新药的研究方向，揭示了肿瘤治疗的新规律；
2、脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合用于制备治疗胃癌、肺癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、生殖系统肿瘤等多种常见恶性肿瘤的药物，抗肿瘤效果明显，具有广谱、低毒的特点；对不同肿瘤细胞的IC50值：Hela的IC50值为0.6mmol/L，Bel-7402的IC50值为0.9mmol/L；对不同肿瘤细胞作用48h的抑制率：Hela抑制率为88.43% ；7402 抑制率为77.21%；HepG2抑制率为77.45%；SPC抑制率为72.04%；
3、该抗肿瘤药物对正常细胞无细胞毒作用，是该发明的最大优点；
4、脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合抗肿瘤作用相乘性增加，明显增加了成药性；对CT-26荷瘤小鼠的药效学试验，腺嘌呤低剂量组抑瘤率=-25.85%，腺嘌呤高剂量组抑瘤率=51.03%，组合低剂量组抑瘤率=54.01%，组合高剂量组抑瘤率=64.93%；
5、脱氧核苷与其它核苷、碱基组合用药可延缓肿瘤耐药性的发生；体内抑瘤实验小鼠多药耐药基因检测，动物给药16天，常规化疗组多药耐药基因明显上调，化疗出现耐药；采用该组合药物组多药耐药基因表达无明显变化，没有耐药发生。
附图说明：
图1：组合抗肿瘤实验DNMT基因检测中，去除基因组 DNA 反应示意图；
图2：组合抗肿瘤实验DNMT基因检测中，反转录反应示意图；
图3：体内抑瘤实验中小鼠体重的变化示意图；
图4：体内抑瘤实验小鼠多药耐药基因检测中，去除基因组 DNA 反应示意图；
图5：体内抑瘤实验小鼠多药耐药基因检测中，反转录反应示意图。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
在实施例中以下各种物质或其组合分别用数字代号表示，具体如下表：
实施例1
245组合、25组合、2145组合抑瘤实验，具体实验方法如下：
1、细胞的接种
取处于对数生长期的Hela细胞、7402细胞，用胰蛋白酶消化并稀释成(2.0～3.0)×104/mL的活细胞悬液，接种于96孔培养板中的2～10列，每列设6个复孔，每孔100µL，第11列加100µL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，周边填充以100µL PBS，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。
2、加药干预
细胞贴壁后，弃去孔内培养液，按从大到小的顺序依次加入245组合，2、4、5的摩尔比为2:1:2，组合药物的七个浓度梯度(C1～C7)，其总浓度分别为2.0 mmol/L、1.0 mmol/L、0.5mmol/L、0.25 mmol/L、0.125 mmol/L、0.0625 mmol/L、0.03125mmol/L；
25组合，2和5的摩尔比为 1:1；七个浓度梯度(C1～C7)同上；
2145组合，2、1、4、5 的摩尔比为2:1:1:2，七个浓度梯度(C1～C7)同上；
用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液配药并依次倍比稀释至所需浓度，每孔加200µL；
空白对照组、阴性对照组分别加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液200µL，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
3、呈色
培养48h后，观察药物作用下肿瘤细胞形态、数量的变化并拍照，加入5mg/mL的MTT 20µL，继续培养4h后，小心吸弃全部上清液，每孔加入150µL的DMSO，轻微震荡至结晶颗粒完全溶解。
4、比色
用酶标仪以570nm和630nm处测定各孔光密度值(OD)。
5、计算细胞生长抑制率
按下式计算药物对肿瘤细胞的抑制率：抑瘤率(%)=（1-用药组OD570平均值/对照组OD570平均值）×100%。
6、计算IC50
据公式计算：IC50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)] ，重复4次，取平均值；
其中：Xm：设计的最大浓度的对数值；
i：各浓度倍比浓度的对数值；
ΣP：各组生长抑制率之和；
0.5：经验常数。
表1 25组合、245组合和2145种组合对Hela、Bel-7402的IC50(mmol/L)值
由表1可见看出，经过优选后的245组合优于25组合和2145种组合（说明：IC50数值越小抗肿瘤作用越强）。
实施例2
任三种核苷组合体外抑瘤的析因设计实验，具体实验方法如下：
1、细胞的接种
见实施例1中“细胞的接种”步骤
2、加药干预
细胞贴壁后，弃去孔内培养液，从前往后依次加入浓度均为3.7mmol/L的1(腺苷)、2(脱氧腺苷)、3(腺嘌呤)、4(鸟苷)、5(脱氧鸟苷)、6(鸟嘌呤)六个药物以及这六个药物摩尔比为1:1:1的组合（123、124、125、126、134、135、136、145、146、156、234、235、236、245、246、256、345、346、356、456）；
用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液配药至所需浓度，每孔加200µL；
空白对照组、阴性对照组分别加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液200µL，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
3、呈色
培养48h后，观察药物作用下肿瘤细胞形态、数量的变化并拍照，加入5mg/mL的MTT 20µL，继续培养4h后，小心吸弃全部上清液，每孔加入150µL的DMSO，轻微震荡至结晶颗粒完全溶解。
4、比色
用酶标仪以570nm和630nm处测定各孔光密度值(OD)。
5、计算细胞生长抑制率
按下式计算药物对肿瘤细胞的抑制率：抑瘤率(%)=（1-用药组OD570平均值/对照组OD570平均值）×100%。
6、实验结果：
应用MTT法测定六种药物对Hela细胞、7402细胞、HepG2细胞及SPC细胞的抑瘤实验，具体见表2：
表2 六种药物及其组合对不同肿瘤细胞作用48h的抑制率（%）
由表2可以看出：
1、药物组合的抑瘤作用比药物单独的抑瘤作用更显著；
2、在这20个组合中以脱氧腺苷-鸟苷-脱氧鸟苷组合（245组合）的抑瘤作用最显著，对Hela细胞、7402细胞、HepG2细胞及SPC细胞的抑瘤作用分别达到88.4%、74.3%、77.5%、72.0%。
实验结论：
1、同样浓度条件下组合抗肿瘤作用强于单体；
2、脱氧腺苷-鸟苷-脱氧鸟苷组合抗肿瘤作用最强；抗肿瘤作用次之的是脱氧腺苷-脱氧鸟苷-鸟嘌呤、腺苷-脱氧腺苷-脱氧鸟苷。
实施例3
脱氧腺苷-鸟苷-脱氧鸟苷（245）组合浓度配比的正交实验设计，具体实验步骤如下：
1、细胞的接种
取处于对数生长期的Hela细胞、7402细胞，用胰蛋白酶消化并稀释成(2.0～3.0)×104/mL的活细胞悬液，接种于96孔培养板中的2～10列，每列设6个复孔，每孔100µL，第11列加100µL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，周边填充以100µL PBS，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。
2、加药干预
细胞贴壁后，弃去孔内培养液，加药方案如下：2(脱氧腺苷)、4(鸟苷)、5(脱氧鸟苷)浓度均为3mmol/L，设计得到的9组分别为：2(脱氧腺苷)、4(鸟苷)、5(脱氧鸟苷)加入的摩尔比分别为：（1）1:1:1；（2）2:1:2；（3）3.25:1:3.25；（4）1:2:2；（5）1:1:1.46（6）3:2:1；（7）1:3.25: 3.25；（8）2:3:1；（9）1.55:1.55:1；
具体加药的步骤：
（1）2、4、5分别加入的体积为67μL、67μL、67μL；
（2）2、4、5分别加入的体积为80.4μL、40.2μL、80.4μL；
（3）2、4、5分别加入的体积为87.1μL、26.8μL、87.1μL；
（4）2、4、5分别加入的体积为40.2μL、80.4μL、80.4μL；
（5）2、4、5分别加入的体积为58.1μL、58.1μL、84.8μL；
（6）2、4、5分别加入的体积为100.5μL、67μL、33.5μL；
（7）2、4、5分别加入的体积为26.8μL、87.1μL、87.1μL；
（8）2、4、5分别加入的体积为67μL、100.5μL、33.5μL；
（9）2、4、5分别加入的体积为75.9μL、75.9μL、49.2μL；
用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液配药至所需浓度，每孔总量为200µL；
空白对照组、阴性对照组分别加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液200µL，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
3、呈色
培养48h后，观察药物作用下肿瘤细胞形态、数量的变化并拍照，加入5mg/mL的MTT 20µL，继续培养4h后，小心吸弃全部上清液，每孔加入150µL的DMSO，轻微震荡至结晶颗粒完全溶解。
4、比色
用酶标仪以570nm和630nm处测定各孔光密度值(OD)。
5、计算细胞生长抑制率
按下式计算药物对肿瘤细胞的抑制率：抑瘤率(%)=（1-用药组OD570平均值/对照组OD570平均值）×100%。
实验结果见表3：
表3 245配比组合对不同肿瘤细胞作用48h的抑瘤率（%）
由表3可看出：
1、脱氧腺苷-鸟苷-脱氧鸟苷摩尔浓度比为2:1:2时抗肿瘤作用最好，次之是脱氧腺苷-鸟苷-脱氧鸟苷3:2:1，再次脱氧腺苷-鸟苷-脱氧鸟苷1:1:1。
实验结论：
应用MTT法测定药物对Hela细胞、7402细胞抑瘤实验得到：2、4、5号药物配比为2：1：2时抑瘤作用最显著。
实施例4：
脱氧腺苷-鸟苷-脱氧鸟苷组合体外代谢实验，具体实验方法如下：
1、细胞的接种
取处于对数生长期的Hela细胞、7402细胞，用胰蛋白酶消化并稀释成(1.0～2.0)×105/mL的活细胞悬液，接种于6孔培养板中，每孔2.5mL。置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。
2、加药干预
细胞贴壁后，弃去孔内培养液，每个细胞依次加入摩尔浓度均为3.7mmol/L 的2(脱氧腺苷)、4(鸟苷)、5(脱氧鸟苷) 以及245组合配比为摩尔比 2:1:2，每孔2.5mL，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
3、检测
分别于培养24h、48h后，取细胞上清液，0.22μm滤器过滤，高效液相检测。
4、检测条件：
设备：美国戴安公司U3000高效液仪
液相条件
色谱柱：C18AQ，250×4.6mm×5μm
柱温：30℃
流动相：水（磷酸调PH为6.6）：甲醇=90:10
流速：1ml/min
波长：254nm。
具体实验结果见表4、表5：
表4 脱氧腺苷-鸟苷-脱氧鸟苷组合在Hela中的代谢情况（HPLC峰下面积）
表5脱氧腺苷-鸟苷-脱氧鸟苷组合在Bel-7402中的代谢情况（HPLC峰下面积）
由表4、表5中可见：核苷组合经24、48小时与肿瘤细胞培养，培养基内浓度基本稳定。
实验提示：体外实验数据是组合成分所致。另外，提示制备肿瘤新药有可行性。
实施例5：
脱氧腺苷-鸟苷-脱氧鸟苷组合制剂注射用脂肪乳剂及其制备方法：
脱氧腺苷-鸟苷-脱氧鸟苷组合制剂注射用脂肪乳剂，其组成为：
脱氧腺苷 15.5g
鸟苷 8.1g
脱氧鸟苷 16.4g
注射用大豆油 200g
注射用卵磷脂 11g
注射用甘油 22g
注射用水加至 2000ml
脱氧腺苷-鸟苷-脱氧鸟苷组合制剂注射用脂肪乳剂的制备方法，包括以下步骤：
a、原料药的配备
按照下述比例配备各种原料药：
脱氧腺苷 15.5g
鸟苷 8.1g
脱氧鸟苷 16.4g
注射用大豆油 200g
注射用卵磷脂 11g
注射用甘油 22g
b、油相的制备
将处方量注射用大豆油投入到容器中，搅拌均匀，制成油相；
c、水相的制备
将处方量脱氧腺苷、鸟苷、脱氧鸟苷、注射用卵磷脂、注射用甘油及适量注射用水加入到容器中，搅拌均匀，制成水相；
d、初乳的制备
将步骤b得到的油相在搅拌下加入步骤c得到的水相中，高速剪切制成初乳；
e、调pH
调pH至6-8；
f、乳匀、过滤
100 mPa压力下乳剂匀浆20次，乳液以0.45μm微孔滤膜过滤，将乳剂灌封于清洗好的注射用安瓿中，通氮，熔封，置121℃条件下热压灭菌20 min，得到粒径在100～500nm之间的注射用脂肪乳剂；
j、全检、包装、入库。
本产品制备工艺先进可行，载药量较大，同时还具有缓释、靶向、为机体提供能量等作用。
实施例6：
脱氧腺苷-鸟苷-脱氧鸟苷组合制剂片剂及其制备方法：
脱氧腺苷-鸟苷-脱氧鸟苷组合制剂片剂，其组成为：
脱氧腺苷 7.75g
鸟苷 4.05g
脱氧鸟苷 8.2g
微晶纤维素 7.5g
淀粉 6g
硬脂酸镁 1.5g
制成 100片
脱氧腺苷-鸟苷-脱氧鸟苷组合制剂片剂制备方法，包括以下步骤:
a、原料药的配备：
按照下述比例配备各种原料药：
脱氧腺苷 7.75g
鸟苷 4.05g
脱氧鸟苷 8.2g
微晶纤维素 7.5g
淀粉 6g
硬脂酸镁 1.5g
b、原料分别过筛：
称取处方量脱氧腺苷、鸟苷、脱氧鸟苷、淀粉、硬脂酸镁分别过100目筛，微晶纤维素过60目筛备用；
c、混合、过筛：
将脱氧腺苷、鸟苷、脱氧鸟苷与微晶纤维素以等量递加法混合，再过40目筛充分混匀三次；
d、淀粉过筛
将淀粉与步骤c中物料过40目筛充分混匀三次；
e、加入硬脂酸镁
将上述物料加处方量硬脂酸镁混合均匀，过20目筛；
f、压片、全检、包装、入库。
说明：
1、以上具体剂量为中位数，可以有上下50-100%的浮动；
2、药物的辅料（大豆油、纤维素、淀粉等）可以根据实际情况和要求调整。
实施例7
组合抗肿瘤实验DNMT基因检测：
一、实验材料
1、试剂
RNAiso提取试剂盒；氯仿；异丙醇；DEPC水；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNAEraser（Perfect Real Time）；SYBR® Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）。
2、仪器：
定量PCR仪（eppendorf公司）；SW-CJ-2F型净化工作台（苏州净化设备有限公司）； AnkeTGL-16B离心机（上海安亭科学仪器厂）；恒温金属浴（杭州博日科技有限公司）；NV3000Micro-Spectrophotometer（vastech）；移液器（范围100-1000ml，10-100ml，0.5-10ml）（eppendorf公司）。
二、引物序列
管家基因（GAPDH）引物序列
H-GAPDH-F：5'-TGGGTGTGAACCATGAGAAGT-3' 57.4
H-GAPDH-R：5'-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3' 57.9
目的基因引物序列
H-DNMT1-F: 5'-CCCTGAGCCCTACCGAATTG-3' 57.7
H-DNMT1-R: 5'-GTAGCTCGCTGGAGTGGACTTG-3' 59.9
三、样品处理
1、细胞的解冻与培养
从液氮罐中取出人宫颈癌Hela细胞、人肝癌7402细胞株，37℃水浴锅迅速解冻。约1min后冻存管内液体完全溶解，再放入超净工作台内，用吸管吸出细胞悬液，注入培养瓶内并加10倍RPMI-1640培养液（含10%胎牛血清、青霉素100U/mL和链霉素100µg/mL），置于37℃、5%CO2培养箱中培养，次日换一次培养液，细胞呈单层贴壁生长，每2～3天传代1次。
2、加药干预
（1）细胞的接种
取处于对数生长期的Hela细胞、7402细胞，用胰蛋白酶消化并稀释成(4.0～6.0)×104/mL的活细胞悬液，接种于25cm2的培养瓶中，每瓶5 mL，每个细胞2瓶。置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。
（2）加药干预
细胞贴壁后，弃去瓶内培养液，Hela细胞、7402细胞分为三组，一组加245组合2mmol/L，10 mL，一组加245组合1mmol/L，10 mL，另一组加含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液10mL。用药时间48h。
四、RNA抽提
1、裂解并收集细胞
（1）倒出培养液，用1*PBS清洗一次。
（2）每瓶细胞中加入1mL的RNAiso Plus，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落。
（3）将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。
（4）室温静置5min。
2、向上述的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖，用手剧烈震荡15s（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。待溶液充分乳化（无分相现象）后，再室温静置5min。
3、12000g 4℃离心15min。
4、从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白质层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。
5、向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10min。
6、12000g 4℃离心10min。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。
7、 RNA沉淀的清洗
小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％室温乙醇1mL（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12000g 4℃离心5min后小心弃去乙醇（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）。
8、RNA的溶解
室温干燥沉淀2～5min（不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解），加入适量的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后用NV3000Micro-Spectrophotometer检测并于-80℃保存。
9、RNA检测结果
五、反转录
1、去除基因组 DNA 反应
如图1，按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2 的量配制 Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA 样品。
2、反转录反应
如图2，反应液配制请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2 的量配制Master Mix，然后再分装10 μl到每个反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应。
六、荧光定量PCR检测
1、实验样本
将cDNA样品稀释10倍作为模板上机检测。
2、PCR反应步骤
（1）配制反应混合液
（2）PCR循环条件
（3）仪器的操作
完成上述步骤后，把加好样品的8联管放在定量PCR仪（eppendorf公司）中进行反应。
七、相对定量结果
DNMT1基因相对定量结果
实验证明：核苷组合通过上调DNMT1，使肿瘤基因处于高甲基化状态，从而抑制肿瘤基因表达，从而抑制肿瘤生长。
实施例8
组合对CT-26荷瘤小鼠的药效学研究
1．实验材料
瘤株系统名称：CT26.WT 中文名称：小鼠结肠癌细胞
实验动物BALB/c小鼠 72只 雌雄各半，6周龄
2．供试品、对照品的配制及其给药方法
（1）供试品的配制
供试品在无菌环境下给药当天配制，配制后供试品标签标识，腺嘌呤低剂量组（AL）采用蓝色标签、腺嘌呤高剂量组（AH）、组合低剂量组（ZL）、组合高剂量组（ZH）采用红色标签，同时在标签上填写供试品编号、配制日期、配制浓度及配制人等信息。配制方法按下表进行。
表6、药物配置方法简表
注意事项：供试品煮沸溶解后，需冷却至室温（大约25℃）后定容、过滤、高压，室温保存；供试品配制后及每日给药结束后遮光冷藏保存。
（2）阳性对照品的配制
取1支5氟尿嘧啶注射液，用生理盐水混匀，5-FU注射液的最终浓度为7.5mg/ml，供试品配制后及每日给药结束后遮光冷藏保存。
（3）给药途径：均采用腹腔给药
（4）给药剂量：药物低剂量组：500mg/kg/d；药物高剂量组：1000 mg/kg/d；阳性对照组：15mg/kg/d
（5）给药频率及周期
给药组和生理盐水组每天上、下午各给药1次，阳性对照组每日一次。各组均连续给药14天。
3、实验方法
（1）细胞复苏、培养
常规复苏小鼠结肠癌CT-26细胞株，培养至细胞处于倍数增长期备用。
（2）分组、建立荷瘤鼠模型
按体重大小将所有小鼠随机分为6个组，腺嘌呤低剂量组，腺嘌呤高剂量组，组合低剂量组，组合高剂量组，生理盐水组以及阳性对照组，每组12只。将收集生长状态良好的细胞调整细胞浓度为5×106个/ml，用注射器植入小鼠右侧腋部皮下组织内，每只0.2 ml。
（3）动物给药
各组均采用腹腔给药，给药组上、下午各给药1次，生理盐水组给予等体积氯化钠注射液。阳性对照组给予5氟尿嘧啶，生理盐水组和阳性对照组每日晚上给药1次。各组均连续给药14天。
4、指标的观察
（1）肿瘤观察：试验结束时，处死动物并解剖，在解剖时观察肿瘤的情况。
（2）肿瘤测量：将肿瘤组织完整取出后，擦干血迹，称重。
（3）计算抑瘤率
抑瘤率=（1－实验组瘤重/对照组瘤重）×100%
5、数据处理
（1）采用相对肿瘤增值率T/C （%）作为试验评价指标
肿瘤体积（TV）的计算公式：
V=1/2×a×b2，
其中a、b分别表示瘤体的长和宽；
相对肿瘤体积（RTV）的计算公式：RTV=Vt/V0，
其中V0为分笼给药时（即d0）测量所得肿瘤体积，
Vt为每一次测量时的肿瘤体积；
相对肿瘤增值率T/C（%）的计算公式：T/C%=TRTV/CRTV×100%
其中：TRTV代表治疗组RTV，
CRTV代表阴性对照组RTV；
原则上，评价标准为：T/C（%）＞40%为无效；T/C（%）≤40%，并经统计学处理P＜0.05为有效。
（2）供试品的疗效作用以瘤重抑制率作为评价指标
瘤重抑制率的计算公式：瘤重抑制率%=（1－T/C）×100%。
（3）对小鼠瘤重数据用EXCEL软件计算出均值、标准偏差，在报告中以（均值±SD）表示；进行配对T-检验（供试品组与对照组进行比较）。
6．实验结果
（1）肿瘤观察
5-Fu组，腺嘌呤高剂量组和组合高剂量组均出现肿瘤较小，包膜完整，与周围组织分界明显。生理盐水组肿瘤较大，部分肿瘤组织有坏死，与周围组织有粘连。
（2）肿瘤重量
表7 各组用药后的瘤重
5-FU组、高剂量组给药第13天时，1只小鼠出现死亡。
（3）抑瘤率
腺嘌呤低剂量组抑瘤率=-25.85%
腺嘌呤高剂量组抑瘤率=51.03%
组合低剂量组抑瘤率=54.01%
组合高剂量组抑瘤率=64.93%
体内抑瘤实验证明：总浓度相同时，“组合”肿瘤抑制明显增强；此时，单药浓度分别下降3/5和4/5；就单药而言体外抑瘤作用明显增加。
实施例9：体内抑瘤实验小鼠生活状态对照
1、实验材料、药品配制及其给药方法、实验方法、指标的观察、数据处理等，同实施例8。
2、观察指标
（1）动物的体重。
所有动物在荷瘤之前称重，每次给药之前均称重。
（2）动物进食饮水情况。
观察并记录动物进食及饮水情况。
（3）动物一般状态。
观察实验动物精神、活动状态等。
3、实验结果
（1）体重的变化
在用药第5天，5-Fu组动物开始出现体重增长变慢，第8天体重出现下降。腺嘌呤高剂量组动物第10天出现体重下降，组合高剂量组在用药第10天出现体重的下降。其余各组动物均呈现体重的升高。用药结束时各组动物体重比较，5-Fu组、腺嘌呤高剂量组，组合高剂量组，较对照组均有明显下降（P<0.05），其余各组较对照组比较，体重无明显变化，如图3所示。
（2）进食、饮水情况
在用药第3天，5-Fu组动物进食开始减少，饮水量在第6天，开始出现减少。腺嘌呤高剂量组和组合高剂量组在第8天均出现进食及饮水量减少。其余各组在第12天开始，进食量开始增多。
（3）动物一般状态
在用药第8天，5-Fu组动物开始出现活动减少，毛发粗糙，消瘦。腺嘌呤高剂量组和组合高剂量组在第10天，出现活动减少，消瘦。其余各组动物无异常。说明“组合”的综合毒性低于5-Fu和腺嘌呤单药。
实施例10：
体内抑瘤实验小鼠多药耐药基因检测：
一、小鼠荷瘤模型的建立及加药干预
1、细胞复苏、培养
常规复苏小鼠结肠癌CT-26细胞株，培养至细胞处于倍数增长期备用。
2、分组、建立荷瘤鼠模型
按体重大小将所有小鼠随机分为3个组，药物组合组，生理盐水组以及阳性对照组，每组8只。将收集生长状态良好的细胞调整细胞浓度为5×106个/ml，用注射器植入小鼠右侧腋部皮下组织内，每只0.2 ml。
3、动物给药
各组均采用腹腔给药，药物组合组给药剂量为1000mg/kg/d，上、下午各给药1次。生理盐水组给予等体积氯化钠注射液，每日晚上给药1次。阳性对照组给予顺铂3mg/kg，每周1次；环磷酰胺和5氟尿嘧啶各3mg/kg，每天一次。各组均连续给药16天。
4、冻存肿瘤组织
用药结束后，取出肿瘤组织，并迅速放入液氮冷冻。
二、RNA抽提
1、将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研柞研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状(无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量)。
2、然后向研钵中加入适量的RNAiso Plus，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研柞继续研磨至裂解液呈透明状。
3、将匀浆液转移至离心管中，室温静置5分钟。
4、12,000 g 4℃离心5分钟。
5、小心吸取上清液，移入新的离心管中(切勿吸取沉淀)。
6、向上述的匀上清液中加入氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖，用手剧烈震荡15s（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。待溶液充分乳化（无分相现象）后，再室温静置5min。
7、12000g 4℃离心15min。
8、从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白质层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。
9、向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10min。
10、12000g 4℃离心10min。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。
11、 RNA沉淀的清洗
小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％室温乙醇1mL（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12000g 4℃离心5min后小心弃去乙醇（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）。
12、RNA的溶解
室温干燥沉淀2～5min（不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解），加入适量的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后用NV3000Micro-Spectrophotometer检测并于-80℃保存。
三、反转录
1、去除基因组 DNA 反应
如图4，按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2 的量配制 Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA 样品。
2、反转录反应
反应液配制请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2 的量配制Master Mix，然后再分装10 μl到每个反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应。
四、荧光定量PCR检测
1、实验样本
将cDNA样品稀释10倍作为模板上机检测。
2、PCR反应步骤
（1）配制反应混合液
（2）PCR循环条件
（3）仪器的操作
完成上述步骤后，把加好样品的8联管放在定量PCR仪（eppendorf公司）中进行反应。
五、MDR1相对定量结果
实验证明：动物给药16天，常规化疗组多药耐药基因明显上调，化疗出现耐药；“组合”组多药耐药基因表达无明显变化，没有耐药发生。

Claims (22)

1.一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物，其特征在于：所述药物由脱氧腺苷和脱氧鸟苷与其它核苷中的任一种组合而制成。
2.如权利要求1所述的一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物，其特征在于：所述的核苷为鸟苷。
3.如权利要求1所述的一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物，其特征在于：所述的核苷为腺苷。
4.如权利要求2所述的一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物，其特征在于：所述脱氧腺苷、鸟苷、脱氧鸟苷摩尔浓度比为1-3：0.5-2：1。
5.如权利要求2所述的一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物，其特征在于：所述脱氧腺苷、鸟苷、脱氧鸟苷摩尔浓度比为1：0.5：1。
6.如权利要求2所述的一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物，其特征在于：所述脱氧腺苷、鸟苷、脱氧鸟苷摩尔浓度比为3：2：1。
7.如权利要求2所述的一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物，其特征在于：所述脱氧腺苷、鸟苷、脱氧鸟苷摩尔浓度比为1：1：1。
8.如权利要求3所述的一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物，其特征在于：所述脱氧腺苷、腺苷、脱氧鸟苷摩尔浓度比为：1：1：1。
9.如权利要求3所述的一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物，其特征在于：所述脱氧腺苷、腺苷、脱氧鸟苷摩尔浓度比为：1：0.5：1。
10.如权利要求1所述的一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物的应用，其特征在于：所述药物制成注射剂或片剂或缓释剂。
11.如权利要求10所述的一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物的应用，其特征在于：所述注射剂，其组成为：
脱氧腺苷 14-16g
鸟苷 7.6-8.6g
脱氧鸟苷 15.9-16.9g
注射用大豆油 190-210g
注射用卵磷脂 10-12g
注射用甘油 21-23g
注射用水加至 2000ml。
12.如权利要求10所述的一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物的应用，其特征在于：所述注射剂，其组成为：
脱氧腺苷 15.5g
鸟苷 8.1g
脱氧鸟苷 16.4g
注射用大豆油 200g
注射用卵磷脂 11g
注射用甘油 22g
注射用水加至 2000ml。
13.如权利要求10所述的一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物的应用，其特征在于：所述片剂，其组成为：
脱氧腺苷 7.65-7.85g
鸟苷 3.95-4.15g
脱氧鸟苷 8.1-8.3g
微晶纤维素 7.4-7.6g
淀粉 5.9-6.1g
硬脂酸镁 1.4-1.6g
所述片剂为100片片剂的量。
14.如权利要求10所述的一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物的应用，其特征在于：所述片剂，其组成为：
脱氧腺苷 7.75g
鸟苷 4.05g
脱氧鸟苷 8.2g
微晶纤维素 7.5g
淀粉 6g
硬脂酸镁 1.5g
所述片剂为100片片剂的量。
15.如权利要求10所述的一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于：所述注射剂的制备包括以下步骤：
a、原料药的配备；
b、油相的制备；
c、水相的制备；
d、初乳的制备；
e、调pH；
f、乳匀、过滤；
j、全检、包装、入库。
16.如权利要求15所述的一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于：所述调pH步骤，调pH至6-8。
17.如权利要求15所述的一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于：所述乳匀、过滤步骤，在100 mPa压力下乳剂匀浆20次，乳液以0.45μm微孔滤膜过滤，将乳剂灌封于清洗好的注射用安瓿中，通氮，熔封，置121℃条件下热压灭菌20 min。
18.如权利要求15所述的一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于：采用所述方法，制得粒径在100～500nm之间的注射用脂肪乳剂。
19.如权利要求10所述的一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于：所述片剂的制备方法，包括以下步骤:
a、原料药的配备；
b、原料分别过筛；
c、混合、过筛；
d、淀粉过筛；
e、加入硬脂酸镁；
f、压片、全检、包装、入库。
20.如权利要求19所述的一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于：所述原料分别过筛：称取脱氧腺苷、鸟苷、脱氧鸟苷、淀粉、硬脂酸镁分别过100目筛，微晶纤维素过60目筛。
21.如权利要求19所述的一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于：所述混合、过筛步骤，将脱氧腺苷、鸟苷、脱氧鸟苷与微晶纤维素以等量递加法混合，再过40目筛充分混匀三次。
22.如权利要求1所述的一种脱氧嘌呤核苷与其它核苷或碱基组合制备的抗肿瘤药物，其特征在于：所述药物，对不同肿瘤细胞的IC50值：Hela的IC50值为0.6mmol/L，Bel-7402的IC50值为0.9mmol/L；对不同肿瘤细胞作用48h的抑制率：Hela抑制率为88.43% ；7402 抑制率为77.21%；HepG2抑制率为77.45%；SPC抑制率为72.04%。
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