CN106053646B

CN106053646B - 5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的提取方法及其应用

Info

Publication number: CN106053646B
Application number: CN201610394794.3A
Authority: CN
Inventors: 郭东晓; 林永强; 徐丽华; 焦阳; 崔伟亮
Original assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Current assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Priority date: 2016-06-03
Filing date: 2016-06-03
Publication date: 2018-06-19
Anticipated expiration: 2036-06-03
Also published as: CN106053646A

Abstract

本发明公开了一种5‑O‑[4′‑O‑(β‑D‑吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的提取方法：忍冬藤药材粉碎及提取，大孔吸附树脂柱、凝胶柱、半制备HPLC依次分离纯化。所得对照品¹H‑NMR图谱中未观察到杂质氢信号；经HPLC纯度检查，不同色谱柱和流动相测定结果表明均为一个主色谱峰；以峰面积归一化法测定含量大于98％。本发明方法操作简便，步骤简单；有机溶剂用量少，所有试剂均可回收利用，分离成本低。产品纯度高，可作为对照品使用，用于相关中药材、中成药的活性及质量控制研究。

Description

5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的提取方法及其应用

技术领域

本发明属于中药及天然药物成分提取和纯化技术领域，涉及一种中药忍冬藤中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的提取方法，还涉及提取得到的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的应用。

背景技术

中药忍冬藤为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥茎枝。味甘，性寒，具有清热解毒，疏风通络的功效，用于温病发热，热毒血痢，痈肿疮疡，风湿热痹，关节红肿热痛。其化学成分主要包括有机酸类、三萜类、环烯醚萜类、黄酮类、挥发油类等。

5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸，该化合物结构式如下：

研究发现，该成分为忍冬藤的主要成分之一，其含量甚至超过了药典控制的绿原酸的含量，有必要对其进行质量控制。但由于缺少高纯度的对照品，对5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的研究仅限于定性分析，对该成分的活性、质量控制研究较少。因此，制备5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的对照品，就成为一项迫切的工作。

发明内容

为了解决以上现有技术中无5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸对照品的问题，本申请提供了一种5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的提取方法。

本发明还提供了5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸在作为对照品中的应用。

本发明是通过以下步骤得到的：

本发明所提供的一种5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的制备方法，包括以下步骤：

(1)将忍冬藤药材粉碎，加4～10倍量体积分数为30～70％(优选50～60％)的甲醇或乙醇溶液，超声提取(功率500W，频率40kHZ)2～3次，每次0.5～1小时，合并提取液并滤过，减压回收提取溶剂(水浴加热温度不超过60℃)至干，得到干浸膏a，其中目标成分质量分数约为1％～2％；

(2)取步骤(1)获得的干浸膏a，加1～2倍量水(优选1倍量水)使溶解，以大孔吸附树脂柱进行纯化(柱填料用量为干浸膏重量的1～2倍，优选1.5～2倍)，以水为洗脱溶剂，洗脱3～4个柱体积，收集洗脱液并合并，减压回收溶剂(水浴加热温度不超过60℃)至干得干浸膏b，干浸膏b中目标成分质量分数约为8％～10％；

(3)取步骤(2)获得的干浸膏b，加等量水使溶解，以凝胶柱进行纯化(柱体积为样品水溶液体积的10～20倍，优选10～15倍)，以水为洗脱溶剂，洗脱3～4个柱体积，以30～40分之一柱体积作为一份收集洗脱液。以HPLC进行检测，合并含有目标成分的洗脱液，减压回收溶剂(水浴温度不超过60℃)至干。以凝胶柱反复纯化2～4次，干浸膏中目标成分质量分数可达65～70％；

(4)以半制备HPLC继续纯化，收集含有目标成分的洗脱液，收集液经浓缩干燥即得，以HPLC峰面积归一化法测定，目标成分含量大于98％。

上述步骤(1)中忍冬藤药材选自忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥茎枝。

上述步骤(2)中所述大孔吸附树脂为非极性或弱极性大孔吸附树脂，优选型号为D101或AB-8型大孔吸附树脂。

上述步骤(3)中所述凝胶为葡聚糖凝胶或羟丙基葡聚糖凝胶，优选型号为Sephadex G-25或Sephadex LH-20型凝胶。

上述步骤(3)和(4)中HPLC条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0.1～1％冰醋酸溶液(体积比3～10:97～90)或甲醇-0.1～1％冰醋酸溶液(体积比6～20:94～80)；检测波长为327nm。

得到的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸作为质量控制对照品。

本发明制备的化合物单体成分经HR-ESI-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC、¹H-¹HCOSY等技术鉴定为5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸。¹H-NMR图谱中未观察到杂质氢信号；经HPLC纯度检查，不同色谱柱和流动相测定结果表明均为一个主色谱峰；以峰面积归一化法测定含量大于98％，符合含量测定用中药化学对照品的要求。

有益效果：

1)本发明的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的提取方法，提取率高，得到的产品纯度高，可作为对照品使用，用于相关中药材、中成药的活性及质量控制研究；

2)本发明方法操作简便，步骤简单；有机溶剂用量少，所有试剂均可回收利用，分离成本低。

附图说明

图1为实施例1制备的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的HR-ESI-MS图谱，

图2为实施例1制备的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的¹H-NMR图谱，

图3为实施例1制备的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的¹³C-NMR图谱，

图4为实施例1制备的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的HSQC图谱，

图5为实施例1制备的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的HMBC图谱，

图6为实施例1制备的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的¹H-¹HCOSY图谱，

图7为实施例1制备的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的HPLC条件A纯度检查色谱图，

图8为实施例1制备的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的HPLC条件B纯度检查色谱图，

图9为实施例1制备的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的HPLC条件C纯度检查色谱图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步的说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于具体实施例。

实施例1

一、化合物提取分离

(1)取忍冬藤药材500g，粉碎成粗粉，加8倍量体积分数为50％的甲醇溶液，超声提取(功率500W，频率40kHZ)2次，每次0.5小时，合并提取液并滤过，以旋转蒸发仪回收提取溶剂(水浴加热温度55℃)至干，得干浸膏a；

(2)干浸膏a加等量水使溶解，以D101大孔吸附树脂柱进行纯化(柱填料用量为干浸膏重量的2倍)，以水为洗脱溶剂，洗脱3个柱体积，收集洗脱液并合并，以旋转蒸发仪回收溶剂(水浴加热温度55℃)至干得干浸膏b；

(3)干浸膏b加等量水使溶解，以Sephadex LH-20凝胶柱进行纯化(柱体积为样品水溶液体积的15倍)，以水为洗脱溶剂，洗脱3个柱体积，以40分之一柱体积作为一份收集洗脱液，以HPLC进行检测，合并含有目标成分的洗脱液，以旋转蒸发仪回收溶剂(水浴温度55℃)至干，以Sephadex LH-20凝胶柱反复纯化2次，得到干浸膏c；

(4)干浸膏c加适量水使溶解，微孔滤膜(0.45μm)滤过，经半制备HPLC纯化，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈-0.4％冰醋酸溶液(体积比4:96)，327nm检测，收集含有目标成分的洗脱液，收集液经浓缩干燥后可得5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸(产率0.50％，提取率67.7％)。

二、化合物结构鉴定

白色无定形粉末，易溶于水。HR-ESI-MS图谱(附图1)给出准分子离子峰m/z515.1392[M-H]^-(calcd 515.1406)，确定分子式为C₂₂H₂₈O₁₄，表明该结构含有9个不饱和度。通过¹³C NMR化学位移(附图3)和HSQC图谱(附图4)，确定22个碳信号中包括3个亚甲基(包括1个连氧亚甲基)，13个次甲基(包括8个连氧、5个双键次甲基)，以及6个季碳(包括1个连氧、3个双键、2个羰基季碳)。¹H NMR图谱(附图2)表明结构中存在一个1,3,4位取代的苯环，一个反式取代的双键，多个连氧亚甲基和次甲基，在δ_H 2.0～2.5范围内存在两对亚甲基氢信号。

经与咖啡酸-4-O-β-D-葡萄糖苷[马荣,殷志琦,张聪,叶文才.忍冬藤正丁醇萃取部位的化学成分.中国药科大学学报,2010,41(4):333-336.]和绿原酸[颜朦朦,肖世基,丁立生,周燕.北栽秧花化学成分研究.中草药,2014,45(3):314-317.]的NMR数据对比，发现该结构可以分为三个部分：奎宁酸、咖啡酸和葡萄糖部分。HMBC图谱(附图5)中，奎宁酸部分H-5[δ_H 5.30(dt,J＝9.0,4.2Hz)]与咖啡酸部分酯羰基(δ_C 168.4)相关，表明奎宁酸C-5位与咖啡酸羰基形成酯键。葡萄糖部分端基氢H-1″[δ_H 5.14(d,J＝6.6Hz)]与H-2″(δ_H 3.64m)较大的耦合常数(6.6Hz)表明端基取代部分为β构型。葡萄糖端基氢H-1″与咖啡酸C-4′(δ_C146.7)相关，表明葡萄糖部分与咖啡酸C-4′位相联。综上，该化合物确定为5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸，该成分为首次从忍冬藤中分离得到。

表1. 5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的NMR数据和HMBC相关^a

^a溶剂为D₂O。¹H和¹³C NMR数据分别在600和150MHz条件下测定。δ单位为ppm。J单位为Hz。¹³C裂分情况由HSQC试验推导所得。

三、纯度检查：

溶液的制备精密称取5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸适量，加水使溶解，制成0.1536mg·mL^-1的溶液。

HPLC条件A

色谱柱：Kromasil 100-5C18(250mm×4.6mm,5μm)；柱温：35℃；流动相：乙腈-0.4％冰醋酸(体积比4:96)；流速1.0mL·min^-1；检测波长：327nm。

HPLC条件B

色谱柱：Kromasil 100-5C18(250mm×4.6mm,5μm)；柱温：35℃；流动相：甲醇-0.4％冰醋酸(体积比8:92)；流速1.0mL·min^-1；检测波长：327nm。

HPLC条件C

色谱柱：Thermo Hypersil GOLD(250mm×4.6mm,5μm)；柱温：35℃；流动相：甲醇-0.4％冰醋酸(体积比6:94)；流速1.0mL·min^-1；检测波长：327nm。

精密吸取20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，记录时间为主色谱峰保留时间1倍以上。结果不同色谱柱、流动相条件下，均呈现一个主色谱峰；按照峰面积归一化法计算，5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸含量均大于98％。HPLC条件A～C色谱图分别见附图7～9。

实施例2

(1)取忍冬藤药材1kg，粉碎成粗粉，加5倍量体积分数为60％的乙醇溶液，超声提取(功率500W，频率40kHZ)3次，每次1小时，合并提取液并滤过，以旋转蒸发仪回收提取溶剂(水浴加热温度55℃)至干得干浸膏a；

(2)干浸膏a加等量水使溶解，以AB-8大孔吸附树脂柱进行纯化(柱填料用量为干浸膏重量的1.5倍)，以水为洗脱溶剂，洗脱4个柱体积，收集洗脱液并合并，以旋转蒸发仪回收溶剂(水浴加热温度55℃)至干得干浸膏b；

(3)干浸膏b加等量水使溶解，以Sephadex G-25凝胶柱进行纯化(柱体积为样品水溶液体积的10倍)，以水为洗脱溶剂，洗脱3个柱体积，以30分之一柱体积作为一份收集洗脱液,以HPLC进行检测，合并含有目标成分的洗脱液，以旋转蒸发仪回收溶剂(水浴温度55℃)至干,以Sephadex G-25凝胶柱反复纯化3次，得到干浸膏c；

(4)干浸膏c加适量水使溶解，微孔滤膜(0.45μm)滤过，经半制备HPLC纯化，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为甲醇-0.4％冰醋酸溶液(体积比8:92)，327nm检测，收集含有目标成分的洗脱液，收集液经浓缩干燥后可得5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸(产率0.47％，提取率63.6％，经峰面积归一化法检测，含量大于98％)。

实施例3

(1)取忍冬藤药材1.5kg，粉碎成粗粉，加5倍量体积分数为50％的乙醇溶液，超声提取(功率500W，频率40kHZ)3次，每次1小时，合并提取液并滤过，以旋转蒸发仪回收提取溶剂(水浴加热温度58℃)至干得干浸膏a；

(2)干浸膏a加等量水使溶解，以D101大孔吸附树脂柱进行纯化(柱填料用量为干浸膏重量的1.5倍)，以水为洗脱溶剂，洗脱4个柱体积，收集洗脱液并合并，以旋转蒸发仪回收溶剂(水浴加热温度58℃)至干得干浸膏b；

(3)干浸膏b加等量水使溶解，以Sephadex LH-20凝胶柱进行纯化(柱体积为样品水溶液体积的10倍)，以水为洗脱溶剂，洗脱3个柱体积，以30分之一柱体积作为一份收集洗脱液，以HPLC进行检测，合并含有目标成分的洗脱液，以旋转蒸发仪回收溶剂(水浴温度58℃)至干，以Sephadex LH-20凝胶柱反复纯化4次，得到干浸膏c；

(4)干浸膏c加适量水使溶解，微孔滤膜(0.45μm)滤过，经半制备HPLC纯化，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈-0.4％冰醋酸溶液(体积比3:97)，327nm检测，收集含有目标成分的洗脱液，收集液经浓缩干燥后可得5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸(产率0.45％，提取率60.9％，经峰面积归一化法检测，含量大于98％)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸的提取方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将忍冬藤药材粉碎，加4～10倍质量体积分数为30～70％的甲醇或乙醇溶液，超声功率500W，频率40kHz提取2～3次，每次0.5～1小时，合并提取液并滤过，减压回收提取溶剂至干，得到干浸膏a；

(2)取干浸膏a，加1～2倍质量的水溶解，以大孔吸附树脂柱进行纯化，柱填料用量为干浸膏重量的1～2倍，以水为洗脱溶剂，洗脱3～4个柱体积，收集洗脱液并合并，减压回收溶剂至干，得到干浸膏b；大孔吸附树脂型号为D101或AB-8型大孔吸附树脂；

(3)取干浸膏b，加等质量水使溶解得水溶液，以凝胶柱进行纯化，柱体积为水溶液体积的10～20倍，以水为洗脱溶剂，洗脱3～4个柱体积，以30～40分之一柱体积作为一份收集洗脱液，以HPLC进行检测，合并含有目标成分的洗脱液，减压回收溶剂至干，以凝胶柱反复纯化2～4次，得干浸膏c；凝胶柱中凝胶型号为Sephadex G-25或Sephadex LH-20型凝胶；

(4)以半制备HPLC继续纯化，收集含有目标成分的洗脱液，收集液经浓缩干燥即得，5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸含量大于98％；

步骤(3)和(4)中HPLC条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-0.1～1％冰醋酸溶液，两者体积比为(3～10):(97～90)，或流动相为甲醇-0.1～1％冰醋酸溶液，两者体积比(6～20):(94～80)；检测波长为327nm。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤(2)中大孔吸附树脂为非极性或弱极性大孔吸附树脂。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤(3)中凝胶为葡聚糖凝胶或羟丙基葡聚糖凝胶。

4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤(1)、(2)、(3)中减压回收溶剂操作中使用水浴加热，加热温度不超过60℃。

5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤(1)干浸膏a中目标成分质量分数为1％～2％，步骤(2)干浸膏b中目标成分质量分数为8％～10％，步骤(3)干浸膏c中目标成分质量分数65％～70％。

6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤(4)中干浸膏c加水溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，再经过半制备HPLC纯化。

7.一种权利要求1-6中任一项所述的提取方法得到的5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸作为质量控制对照品的应用。