CN106047338A - 一种靶向EphrinB2荧光标记分子探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种靶向EphrinB2荧光标记分子探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向EphrinB2荧光标记分子探针及其制备方法和应用。所述的荧光探针是在药物苏尼替尼上连接荧光分子CY5，保留了原功能分子对肿瘤细胞增殖的抑制作用。该探针对EphrinB2靶蛋白具有高选择识别作用，在647±5nm吸收光照射下，可对EphrinB2受体蛋白细胞高效标记，发出红色荧光信号。作为一种靶向工具分子，可与肿瘤细胞直接作用，在靶向识别领域以及分析药物相互作用，研究药物作用机制方面具有重要的应用价值和广阔的应用前景。

Description

一种靶向EphrinB2荧光标记分子探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向EphrinB2荧光标记分子探针及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤的发病率在全世界呈逐年上升的趋势，目前已成为严重威胁人类健康的杀手。抗肿瘤药物研究是当今生命科学中极富挑战性且意义重大的领域。酪氨酸激酶受体(RTK)是一个庞大的家族，在生物体的生命活动中担当着非常重要的作用。Eph是属于目前已知最大的蛋白酪氨酸激酶受体家族(RTKs)亚族，包括Eph受体及其Ephrin配体。EphB4与EphrinB2在信号传递时表现出独特的方式，可互被对方激活，产生“正向信号”和“反向信号”，以EphrinB2激活EphB4等信号通路为正向信号，而EphB4激活EphrinB2为反向信号。EphrinB2可能在VEGF信号通路中扮演一个总调控者的角色，并在血管生长中发挥核心作用。抗肿瘤药物靶向筛选是新药筛选的一个重要方向和领域。目前，寻找靶标开发抗肿瘤药物己成为治疗恶性肿瘤生长和转移的重要手段之一。分子荧光探针广泛用于荧光成像分析，可用于实时在线检测活细胞受体相互作用，小动物活体成像以及生物大分子结构变化过程。
在肿瘤细胞抑制剂的研发中，尚没有对EphrinB2有一定的抑制作用药物。以EphrinB2为靶点，寻找靶向于肿瘤中EphrinB2的药物会成为研发抗肿瘤药物的重要途径之一。但是目前没有靶向于肿瘤EphrinB2的对照化合物和药物，亦没有可用于EphrinB2示踪分析和药物受体相互作用的荧光探针，因此合成制备靶向EphrinB2荧光探针可以广泛应用于靶向识别领域，在药物受体相互作用分析，药物作用机制方面具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向EphrinB2荧光标记分子探针及其制备方法和应用，以解决目前没有可用于EphrinB2示踪分析和药物受体相互作用的荧光探针的问题。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种靶向EphrinB2荧光标记分子探针，其分子式为C55H67FN7O9S2 +，结构式如下：
所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针的制备方法，包括以下步骤：
1)N-乙基乙二胺与苯甲氧羰酰琥珀酰亚胺反应得到中间体1；
2)N-Boc-溴乙胺与中间体1反应得到中间体2；
3)中间体2经脱保护反应得到中间体3；
4)5-氟吲哚-2-酮与2,4-二甲基-5-醛基-1H-吡咯-3-羧酸反应得到中间体4；
5)中间体4与中间体3经缩合反应得到中间体5；
6)中间体5经脱保护反应得到中间体6；
7)中间体6与CY5琥珀酰亚胺酯(CY5-SE)缩合得到目标化合物靶向EphrinB2荧光标记分子探针(记为CY5-SU)；
其中，中间体1的结构式为
中间体2的结构式为
中间体3的结构式为
中间体4的结构式为
中间体5的结构式为
中间体6的结构式为
CY5琥珀酰亚胺酯的结构式为
所述步骤1)的具体步骤为：氮气保护下，在-40℃的温度下，将苯甲氧羰酰琥珀酰亚胺的无水二氯甲烷溶液滴加至N-乙基乙二胺的无水二氯甲烷溶液中进行反应，再升至室温并搅拌反应过夜；反应结束后，将反应液减压浓缩并倒入乙醚和磷酸盐缓冲溶液中，搅拌后对有机相进行洗涤，合并水相并调节其pH值后进行萃取，将萃取的有机相浓缩至干，得到中间体1；
所述步骤2)的具体步骤为：氮气保护下，将N-Boc-溴乙胺加入到含有中间体1、K2CO3以及NaI的无水DMF溶液中，室温下搅拌反应，然后将反应液稀释，分出有机相，有机相经洗涤、干燥后抽滤，滤液减压浓缩至干，残余液经硅胶柱层析分离得到中间体2。
所述步骤3)的具体步骤为：将Pd/C催化剂加入到中间体2的甲醇溶液中，在室温及常压下进行氢化反应，反应结束后，对反应液进行抽滤，洗涤滤饼，合并滤液并减压浓缩至干，得到中间体3；
所述步骤4)的具体步骤为：将5-氟吲哚-2-酮、2,4-二甲基-5-醛基-1H-吡咯-3-羧酸和四氢吡咯的乙醇溶液加热回流反应，反应结束后冷却至室温，加入盐酸溶液搅拌并抽滤，滤饼洗涤、干燥后得中间体4。
所述步骤5)的具体步骤为：氮气保护下，将中间体4、1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和三乙胺加入到无水DMF中，室温下搅拌反应，然后加入中间体3的无水DMF溶液并继续在室温下反应，反应结束后对反应液进行减压浓缩，残余液经硅胶柱层析分离纯化后得中间体5；
所述步骤6)的具体步骤为：氮气保护下，将中间体5悬浮于无水二氯甲烷中，冰浴下加入三氟乙酸，随后撤去冰浴于室温下搅拌反应，反应结束后将反应液减压浓缩至干，得到中间体6。
所述步骤7)的具体步骤为：氮气保护下，将中间体6、CY5琥珀酰亚胺酯(记为CY5-SE，通过购买得到)和N,N-二异丙基乙胺依次加入到无水DMF中，室温下黑暗避光反应，反应结束后，反应液经C18反相柱分离纯化，收集的产物组分经冷冻干燥后得到目标化合物靶向EphrinB2荧光标记分子探针(记为CY5-SU)。
所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针在筛选靶向EphrinB2的药物方面的应用。
所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针在药物与EphrinB2或EphB4受体相互作用研究以及药物调控EphrinB2/EphB4信号通路分析检测方面的应用。
所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针在动物模型活体成像、实时检测活细胞受体相互作用以及生物大分子结构变化过程方面的应用。
所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针在抑制高表达EphrinB2受体的细胞增殖方面的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明通过分子设计，提供了一种靶向EphrinB2荧光标记分子探针，记为CY5-SU，并分析考察了该探针对肿瘤细胞的直接作用，通过其荧光性能的变化，综合分析了该探针和EphrinB2受体相互作用以及对EphrinB2信号通路调控作用。本发明提供的靶向EphrinB2荧光标记分子探针是在药物苏尼替尼上连接荧光分子CY5，保留了原功能分子对肿瘤细胞增殖的抑制作用。该探针对EphrinB2靶蛋白具有高选择识别作用，在647±5nm吸收光照射下，可对EphrinB2受体蛋白细胞高效标记，发出红色荧光信号。该探针作为一种靶向工具分子，可与肿瘤细胞直接作用，在靶向识别领域以及分析药物相互作用、研究药物作用机制方面具有重要的应用价值和广阔的应用前景。本发明解决了目前没有可用于EphrinB2示踪分析和药物受体相互作用的荧光探针的市场空缺问题，具有重要的应用价值和市场前景。
本发明提供的靶向EphrinB2荧光标记分子探针可以在药物靶向识别和体内及体外药物受体相互作用检测等多方个面进行应用，可以用于筛选靶向EphrinB2的药物，可以用于动物模型活体成像，可以用于药物与EphrinB2或EphB4受体相互作用以及药物调控EphrinB2/EphB4信号通路方面的分析检测，也可以用于实时在线检测活细胞受体相互作用、小动物活体成像以及生物大分子结构变化过程。
本发明经过多次探索，最终确定了靶向EphrinB2荧光标记分子探针的合成路线及其制备方法，该方法的制备过程及后处理过程简单，收率高，总收率能够达到20％。并且该方法在制备靶向EphrinB2荧光标记分子探针的过程中得到的中间体5和中间体6具有靶向EphrinB2作用，能够特异性作用于EphrinB2，可以作为具有新的作用功能的靶向EphrinB2候选药物。
附图说明
图1为靶向EphrinB2荧光标记分子探针(CY5-SU)的合成路线图；
图2为靶向EphrinB2荧光标记分子探针(CY5-SU)的1H NMR图谱；
图3为靶向EphrinB2荧光标记分子探针(CY5-SU)的13C NMR图谱；
图4为靶向EphrinB2荧光标记分子探针(CY5-SU)与EphrinB2受体相互作用的荧光图，其中A为荧光分子CY5与EphrinB2受体相互作用的荧光图，B为探针CY5-SU与EphrinB2受体相互作用的荧光图；
具体实施方式
本发明提供了一种靶向EphrinB2荧光标记分子探针，记为CY5-SU，该探针具有特异性靶向EphrinB2的作用，能够与EphB4竞争性结合EphrinB2以及抑制肿瘤细胞的活性，可以广泛用于药物受体相互作用分析和药物作用机制研究。下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的详细说明。
本发明提供的靶向EphrinB2荧光标记分子探针的合成路线如图1所示，具体包括以下步骤：
(1)中间体1的合成：
氮气保护下，将苯甲氧羰酰琥珀酰亚胺(2.42g,9.71mmol)的-40℃60mL无水二氯甲烷溶液缓慢滴加至-40℃的N-乙基乙二胺(0.88g或1.05mL,10.0mmol)的60mL无水二氯甲烷溶液中，滴毕，维持-40℃继续反应3小时，随后使反应溶液缓慢升至室温并搅拌过夜。将反应液减压浓缩至约20mL，将残余液缓慢倾入200mL的乙醚和300mL的pH～3的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌片刻后，有机相再经100mL的pH～3的100mM磷酸盐缓冲溶液分别洗涤三次，合并水相，用1M的氢氧化钠水溶液调pH值至11，随后由200mL乙酸乙酯分别萃取三次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥后抽滤，滤液减压浓缩至干，得到无色油状的液体，即中间体1(1.56g,72.4％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.32–7.15(m,5H),5.83(br s,1H),5.00(s,2H),3.24–3.06(m,2H),2.63(t,J＝5.7Hz,2H),2.53(q,J＝7.0Hz,2H),0.99(t,J＝7.0Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:156.54,136.58,128.29,128.03,127.89,127.83,66.33,48.57,43.48,40.50,14.8。
(2)中间体2的合成：
氮气保护下，将N-Boc-溴乙胺(101mg,0.45mmol)加入到含有中间体1(100mg,0.45mmol),K2CO3(93.3mg,0.68mmol)以及催化量的NaI(10mg)的1.5mL无水DMF溶液中。室温搅拌12小时后，将反应液用20mL的乙酸乙酯和15mL的水稀释，搅拌片刻后，分出有机相，并先后由15mL的饱和碳酸氢钠水溶液和20mL的食盐水洗涤，然后经无水硫酸钠干燥后抽滤，滤液减压浓缩至干。残余液经硅胶柱层析(10×2cm，洗脱液：石油醚/乙酸乙酯1:1)分离纯化后得到无色油状液体，即中间体2(93mg,56.6％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.36–7.21(m,5H),5.34(br s,1H),5.05(s,2H),4.89(brs,1H),3.24–3.14(m,2H),3.13–3.02(m,2H),2.54–2.39(m,6H),1.36(s,9H),0.93(t,J＝7.0Hz,3H)；
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:156.61,156.19,136.74,128.49,128.16,128.05,79.14,66.61,52.98,52.89,47.47,38.88,38.51,28.43,11.64。
(3)中间体3的合成：
将10.0mg的10％Pd/C加入到中间体2(90.0mg,0.25mmol)的5mL甲醇溶液中，室温常压氢化反应12小时后，反应液经硅藻土抽滤，5mL甲醇洗涤滤饼，合并滤液并减压浓缩至干得无色油状液体，即中间体3(56.3mg,99.0％)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:5.14(br s,1H),3.13–3.02(m,2H),2.90–2.75(m,2H),2.69(t,J＝5.9Hz,2H),2.50–2.40(m,6H),1.36(s,9H),0.93(t,J＝7.1Hz,3H)；
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:156.13,78.92,52.94,47.59,39.42,38.53,28.36,22.18,11.55.
(4)中间体4的合成：
将5-氟吲哚-2-酮(1.51g,10.0mmol)，2,4-二甲基-5-醛基-1H-吡咯-3-羧酸(1.67g,10.0mmol)和四氢吡咯(1.42g,1.66mL,20.0mmol)的120mL乙醇溶液加热回流反应3小时，冷却至室温后，加入36mL的1M盐酸溶液，搅拌片刻后抽滤，先后经20mL乙醇和20mL的石油醚洗涤滤饼，滤饼干燥后得黄色粉末状固体，即中间体4(2.95g,98.2％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:13.78(br s,1H),10.85(br s,1H),7.66(d,J＝11.0Hz,1H),7.64(s,1H),6.86(t,J＝8.0Hz,1H),6.78(dd,J＝8.3,4.5Hz,1H),2.47(s,3H),2.45(s,3H)；
13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:169.60(s),166.00(s),158.27(d,1J(C,F)＝233Hz),140.86(s),134.74(s),133.42(s),127.03(d,3J(C,F)＝9.6Hz),126.09(s),124.66(s),115.65(d,4J(C,F)＝3.1Hz),114.41(s),112.64(d,2J(C,F)＝24.6Hz),110.05(d,3J(C,F)＝8.2Hz),106.11(d,2J(C,F)＝25.4Hz),14.52(s),11.49(s)。
(5)中间体5的合成：
氮气保护下，将中间体4(71.4mg,0.24mmol)，1-羟基苯并三唑(48.2mg,0.36mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(91.2mg,0.48mmol)和三乙胺(48.2mg,66.0μL,0.48mmol)加入到2.5mL的无水DMF中，室温搅拌反应2小时后，将中间体3(55.0mg,0.24mmol)的0.5mL无水DMF溶液加入并继续室温反应24小时，减压浓缩后，残余液经硅胶柱层析(10×2cm，洗脱液：DCM/MeOH 30:1，随后，DCM/MeOH/Et3N 30:1:0.3)分离纯化后得黄色粉末状固体，即中间体5(100mg,81.8％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:13.62(s,1H),10.83(s,1H),7.68(dd,J＝9.4,2.4Hz,1H),7.65(s,1H),7.39(t,J＝5.4Hz,1H),6.91–6.83(m,1H),6.79(dd,J＝8.4,4.6Hz,1H),6.60(t,J＝5.2Hz,1H),3.22(dd,J＝12.2,6.2Hz,2H),2.93(dd,J＝12.5,6.2Hz,2H),2.49–2.39(m,6H),2.38(s,3H),2.36(s,3H),1.29(s,9H),0.91(t,J＝7.0Hz,3H)；
13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:169.60(s),164.65(s),158.26(d,1J(C,F)＝233Hz),155.66(s),136.59(s),134.52(s),130.31(s),127.19(d,3J(C,F)＝9.5Hz),125.82(s),124.91(s),120.81(s),114.56(d,4J(C,F)＝3.0Hz),112.39(d,2J(C,F)＝24.0Hz),110.05(d,3J(C,F)＝8.7Hz),105.91(d,2J(C,F)＝25.6Hz),77.50(s),52.67(s),47.29(s),38.38(s),37.11(s),28.24(s),13.37(s),11.87(s),10.62(s)。
(6)中间体6的合成：
氮气保护下，将中间体5(50mg,97.4μmol)悬浮于2mL的无水二氯甲烷中，冰浴下加入1.0mL三氟乙酸，随后撤去冰浴于室温搅拌反应2小时，反应液减压浓缩至干，并分别经2mL的甲苯和2mL的二氯甲烷减压蒸馏至干得到黄色粉末状固体，即中间体6(49.7mg,100％)。
1H NMR(CD3OD)δ:13.12(s,1H),6.89(s,1H),6.82(dd,J＝8.8,1.9Hz,1H),6.50–6.35(m,2H),3.56–3.46(m,2H),3.45–3.36(m,2H),3.31–3.13(m,6H),2.09(s,3H),2.06(s,3H),1.16(t,J＝7.0Hz,3H)；
13C NMR(100MHz,CD3OD)δ:171.19(s),169.65(s),160.22(d,J＝236.4Hz),138.94(s),135.68(s),131.27(s),128.34(d,J＝9.1Hz),127.47(s),124.49(s),118.70(s),117.07(d,J＝3.3Hz),113.64(d,J＝24.3Hz),111.04(d,J＝8.1Hz),106.09(d,J＝25.6Hz),54.38(s),50.60(s),36.14(s),35.20(s),13.79(s),11.00(s),9.13(s)。
(7)荧光探针CY5-SU的合成：
氮气保护下，将中间体6(20mg,39.0μmol)，CY5-SE(29.4mg,39.0μmol)和N,N-二异丙基乙胺(20.2mg或25.8μL,156.0μmol)依次加入到1.5mL的无水DMF中，室温黑暗避光反应24小时，反应液经C18反相柱(250×10mm)分离纯化，分离条件：0～45min下，经梯度1％→65％乙腈的0.1％TFA水溶液为流动相，吸收波长260nm，流速3.5mL/min，收集33.7min吸收峰，收集液经冷冻干燥后得到紫色粉末状固体，即为靶向EphrinB2荧光标记分子探针CY5-SU(25.0mg,60.9％)，其1H和13C谱见图2和图3。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:13.75(s,1H),10.91(s,1H),9.43(br s,1H),8.32(t,J＝12.0Hz,2H),8.15(t,J＝5.1Hz,1H),7.84(s,3H),7.75(dd,J＝9.3,2.3Hz,1H),7.71(s,1H),7.66(d,J＝8.1Hz,2H),7.30(t,J＝8.4Hz,2H),6.96–6.88(m,1H),6.87–6.82(m,1H),6.54(t,J＝12.2Hz,1H),6.26(t,J＝12.6Hz,2H),4.46–4.26(m,4H),4.18–4.00(m,4H),3.68–3.50(m,2H),3.44–3.34(m,2H),3.23–3.12(m,2H),2.46(s,3H),2.44(s,3H),2.08(t,J＝6.4Hz,2H),1.73–1.59(m,14H),1.55–1.45(m,2H),1.34–1.17(m,9H)；
13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:173.18(s),172.84(s),172.71(s),172.05(s),169.58(s),165.85(s),158.26(d,J＝234.4Hz),154.49(s),154.22(s),144.99(s),144.66(s),142.27(s),141.62(s),140.74(s),140.56(s),137.14(s),134.64(s),130.41(s),127.06(d,J＝9.5Hz),126.16(s),125.91(s),124.83(s),120.00(s),119.95(s),119.36(s),115.17(d,J＝3.1Hz),112.59(d,J＝23.4Hz),110.22(s),110.09(d,J＝10.5Hz),106.07(d,J＝25.3Hz),103.48(s),103.44(s),103.31(s),103.28(s),51.51(s),51.34(s),48.98(s),48.87(s),47.79(s),45.78(s),34.88(s),34.19(s),33.64(s),27.10(s),26.97(s),26.67(s),25.62(s),24.59(s),21.10(s),18.07(s),16.73(s),13.60(s),12.13(s),10.75(s),8.55(s)。
下面对本发明制得的靶向EphrinB2荧光标记分子探针CY5-SU对EphrinB2受体靶向性和荧光可视化检测的实验过程及实验结果进行说明。
(1)荧光探针CY5-SU与EphrinB2受体的相互作用
将对数生长期的高表达EphrinB2受体的EphrinB2/HEK293细胞，用0.25％胰蛋白酶溶液消化得到细胞悬液，细胞计数后，接种于Gass bottom microwell disks中，细胞悬液体积为150μL/disk。每组设3个平行孔，于37℃，5％CO2培养箱培养24h。待细胞贴壁后，吸弃孔内培养基，PBS缓冲溶液洗3次，加入25uM的CY5和CY5-SU，于37℃恒温培养箱共孵育1h,2h,4h。PBS缓冲液洗3次，同时加入2.5uM Hoechst33258染色液，染色20min，荧光显微镜拍照。结果如图4所示，其中图4A表明CY5和EphrinB2/HEK293细胞没有结合，仅能观察到高表达EphrinB2/HEK293细胞的绿色荧光，而从图4B中可以看出CY5-SU能够明显的结合于EphrinB2/HEK293，呈现红色的荧光。说明CY5-SU能够与EphrinB2/HEK293细胞膜受体EphrinB2结合。
(2)CY5-SU对EphrinB2受体亲和作用分析
将对数生长期的高表达EphrinB2受体的EphrinB2/HEK293细胞，用0.25％胰蛋白酶溶液消化得到细胞悬液EphrinB2/HEK293，制备EphrinB2/HEK293细胞膜Seoul固定相，同时制备HEK293细胞膜色谱固定相。然后制备EphrinB2/HEK293，HEK293细胞膜色谱柱：将静置过夜的细胞膜固定相悬液涡旋混匀，转移至10mL eppendorf管中，4℃条件下2000rpm离心10min，弃上清，沉淀加入约5mL生理盐水涡旋混匀，重复上述操作2次，去除未包裹在硅胶上的细胞膜，向沉淀中加入约5mL生理盐水涡旋混匀，将其倒入事先冲洗过的装柱机中，流动相为水，流速为2.0mL/min，装柱时压力不超过10MPa，装柱时间5min，将装填好的细胞膜色谱柱装入液相色谱仪中使用，或置于生理盐水中4℃冰箱保存备用。色谱条件：EphrinB2/HEK293、HEK293细胞膜色谱柱(10×2.0mm I.D.5μm)；流动相：5mmol/L磷酸盐缓冲溶液(PH＝7.4)；柱温：37℃；流速：0.2mL/min；检测器：SPD-M20A二极管阵列检测器；进样5μL。分析前先进行系统平衡，再进样分析。实验结果表明CY5-SU与HEK293细胞膜色谱柱中的保留相比，能够在EphrinB2/HEK292细胞膜色谱柱中有更好的保留特性，说明CY5-SU与EphrinB2具有更好的亲和性。
(3)CY5-SU对EphrinB2/HEK292细胞生长抑制作用
将对数生长期的肝癌细胞SMMC7721，knockdown EphrinB2的肝癌细胞SMMC7721，EphrinB2/HEK29，HEK293细胞，用0.25％胰蛋白酶溶液消化后，接种于96孔板中(4×104个/孔)，细胞悬液体积为180μL/孔。每组设5个平行孔，于37℃，5％CO2培养箱中培养。24h细胞贴壁后，实验组加入CY5-SU 20μL/孔，阴性对照组加入无血清培养基20μL/孔，作用48h。200μL移液枪小心吸弃孔板内培养基，加入200μL 0.5mg/mL MTT/孔，37℃孵育4h。吸弃孔板内液体，加入DMSO 150μL/孔，将孔板置于脱色摇床上充分振荡15min，用酶联免疫检测仪于490nm波长下测定各孔吸光度值，计算细胞活力。实验结果表明，相比较EK293细胞，CY5-SU对高表达EphrinB2受体的EphrinB2/HEK29细胞活性具有较好的抑制作用；同时对于肝癌细胞SMMC7721，CY5-SU呈现出较好的抑制作用，同时CY5-SU对knockdown EphrinB2的肝癌细胞SMMC7721抑制作用明显低于野生型SMMC7721。
以上实验说明本发明制得的靶向EphrinB2荧光标记分子探针CY5-SU能够靶向于EphrinB2受体，具有较好的抑制肿瘤细胞增殖的作用。因此本发明制得的靶向EphrinB2荧光标记分子探针在靶向识别领域以及分析药物相互作用、研究药物作用机制方面具有重要的应用价值和广阔的应用前景。

Claims (10)

1.一种靶向EphrinB2荧光标记分子探针，其特征在于：其分子式为C55H67FN7O9S2 +，结构式如下：
2.权利要求1所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)N-乙基乙二胺与苯甲氧羰酰琥珀酰亚胺反应得到中间体1；
2)N-Boc-溴乙胺与中间体1反应得到中间体2；
3)中间体2经脱保护反应得到中间体3；
4)5-氟吲哚-2-酮与2,4-二甲基-5-醛基-1H-吡咯-3-羧酸反应得到中间体4；
5)中间体4与中间体3经缩合反应得到中间体5；
6)中间体5经脱保护反应得到中间体6；
7)中间体6与CY5琥珀酰亚胺酯缩合得到目标化合物靶向EphrinB2荧光标记分子探针；
其中，中间体1的结构式为
中间体2的结构式为
中间体3的结构式为
中间体4的结构式为
中间体5的结构式为
中间体6的结构式为
CY5琥珀酰亚胺酯的结构式为
3.根据权利要求2所述的所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针的制备方法，其特征在于：所述步骤1)的具体步骤为：氮气保护下，在-40℃的温度下，将苯甲氧羰酰琥珀酰亚胺的无水二氯甲烷溶液滴加至N-乙基乙二胺的无水二氯甲烷溶液中进行反应，再升至室温并搅拌反应过夜；反应结束后，将反应液减压浓缩并倒入乙醚和磷酸盐缓冲溶液中，搅拌后对有机相进行洗涤，合并水相并调节其pH值后进行萃取，将萃取的有机相浓缩至干，得到中间体1；
所述步骤2)的具体步骤为：氮气保护下，将N-Boc-溴乙胺加入到含有中间体1、K2CO3以及NaI的无水DMF溶液中，室温下搅拌反应，然后将反应液稀释，分出有机相，有机相经洗涤、干燥后抽滤，滤液减压浓缩至干，残余液经硅胶柱层析分离得到中间体2。
4.根据权利要求2所述的所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针的制备方法，其特征在于：所述步骤3)的具体步骤为：将Pd/C催化剂加入到中间体2的甲醇溶液中，在室温及常压下进行氢化反应，反应结束后，对反应液进行抽滤，洗涤滤饼，合并滤液并减压浓缩至干，得到中间体3；
所述步骤4)的具体步骤为：将5-氟吲哚-2-酮、2,4-二甲基-5-醛基-1H-吡咯-3-羧酸和四氢吡咯的乙醇溶液加热回流反应，反应结束后冷却至室温，加入盐酸溶液搅拌并抽滤，滤饼洗涤、干燥后得中间体4。
5.根据权利要求2所述的所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针的制备方法，其特征在于：所述步骤5)的具体步骤为：氮气保护下，将中间体4、1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和三乙胺加入到无水DMF中，室温下搅拌反应，然后加入中间体3的无水DMF溶液并继续在室温下反应，反应结束后对反应液进行减压浓缩，残余液经硅胶柱层析分离纯化后得中间体5；
所述步骤6)的具体步骤为：氮气保护下，将中间体5悬浮于无水二氯甲烷中，冰浴下加入三氟乙酸，随后撤去冰浴于室温下搅拌反应，反应结束后将反应液减压浓缩至干，得到中间体6。
6.根据权利要求2所述的所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针的制备方法，其特征在于：所述步骤7)的具体步骤为：氮气保护下，将中间体6、CY5琥珀酰亚胺酯和N,N-二异丙基乙胺依次加入到无水DMF中，室温下黑暗避光反应，反应结束后，反应液经C18反相柱分离纯化，收集的产物组分经冷冻干燥后得到目标化合物靶向EphrinB2荧光标记分子探针。
7.权利要求1所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针在筛选靶向EphrinB2的药物方面的应用。
8.权利要求1所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针在药物与EphrinB2或EphB4受体相互作用研究以及药物调控EphrinB2/EphB4信号通路分析检测方面的应用。
9.权利要求1所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针在动物模型活体成像、实时检测活细胞受体相互作用以及生物大分子结构变化过程方面的应用。
10.权利要求1所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针在抑制高表达EphrinB2受体的细胞增殖方面的应用。
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