CN106046199A - 一种壳寡糖季铵盐衍生物及利用它制备的纳米银 - Google Patents

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Abstract

一种壳寡糖季铵盐衍生物及利用它制备的纳米银，首先在壳寡糖上生成壳寡糖希夫碱同时引入酚羟基，然后通过与缩水甘油三甲基氯化铵反应引入季铵盐结构单元，制备得到一种新的壳寡糖季铵盐衍生物，其不但具有壳寡糖抗菌活性部分、季铵盐抗菌活性结构，而且具有抗菌和强还原性基团酚羟基。酚羟基以及季铵盐结构除了具有抗菌活性外，季铵离子的存在能够大大提高壳寡糖希夫碱的水溶性，而且希夫碱中的氮原子及酚羟基可以与纳米银粒子通过配位形成稳定的纳米银体系。利用壳寡糖季铵盐衍生物可在比较温和的条件下还原银氨溶液，生成的纳米银体系在常温下能够稳定存在，并具有较强的抗菌、抗植物病毒活性，抗TMV活性比壳寡糖及壳寡糖季铵盐的活性更强。

Description

一种壳寡糖季铵盐衍生物及利用它制备的纳米银
技术领域
本发明属于纳米银制备技术领域，具体涉及一种壳寡糖季铵盐衍生物及用壳寡糖季铵盐衍生物制备的纳米银。
背景技术
烟草普通花叶病作为一种广泛发生且危害严重的烟草病毒病，可严重地影响烟叶的产质以及工业可用性，在我国的大部分烟区都有发生，已经成为影响我国烟草生产的较为严重的一种病害，因此，如何建立有效的预防体系成为烟叶生产上面临的重大技术难题。
壳聚糖也被称为几丁寡糖，属于天然碱性高分子多糖，具有良好的生物降解性和生物相容性，在食品、生物医学和化工等领域方面有着广泛的应用。近些年来壳聚糖衍生物备受关注。但由于壳聚糖分子水溶性很差，限制了其应用。与壳聚糖相比，壳寡糖水溶性好，其物理性质和化学性质与壳聚糖相比均得到较大的改善。壳寡糖（Oligochitosan）是一种聚合度在3-20且交联度低于5%的低聚糖，它可诱导植物产生防御反应。研究表明，对其适当的化学改性能够大幅度提高其各种生物活性，因此利用其分子结构特点，特别是含有活泼的羟基、氨基引入活性分子骨架成为近几年的热点研领域。已有的化学农药对烟草普通花叶病毒(TMV)有一定的防治效果，但随着化学农药在植物体内残留、积累问题的越来越严重，如何解决这些问题，积极寻找更为有效的防控措施成为最佳的选择。
四级铵盐与无机盐性质相似，易溶于水，不少四级铵盐具有一定的生物活性，有些四级铵盐可用作药物、农药以及化学反应中的相转移催化剂等。例如，矮壮素[(CH3)3NCH2CH2Cl]+Cl-是一种植物生长调节剂，氯化苄基三乙基铵和硫酸氢四丁基铵都是优良的相转移催化剂。在相转移催化反应中，四级铵盐可与水相中的亲核试剂组成离子对，进入有机相，从而加快反应速率，减少副反应并提高收率。作为一种新型抗菌剂，纳米银具有超强的活性、渗透性以及杀菌作用，而且病原菌不会产生耐药性，在消毒杀菌方面的研究和应用得到越来越多的关注。近年来，人们开始探索纳米银在农业上的应用，纳米银农药不仅具有较好的抗菌性，其在抗病毒方面也表现出了较好的作用，因为其安全性比较高，纳米银作为农药应用具有广泛地应用前景。
纳米粒子在形成过程中通常因其疏水性而容易发生聚集，所以为了合成分散性好的金纳米粒子，需要在制备过程中加入稳定剂，如：烷基硫醇或者大分子聚合物、枝状化合物、聚电解质、表面活性剂等。
与其他化学合成的杀菌剂相比，低分子量的壳寡糖的广谱抗菌活性较低；因此拟通过对壳寡糖进行分子修饰，引入可能大幅度提高其活性的季铵离子骨架，使壳寡糖衍生物产生不仅抗真菌、抗病毒，而且抗细菌性病害的多功能生物活性物质。季铵盐类物质是一种高效、低毒的新型杀菌剂，但由于结构中卤离子的存在，利用壳寡糖季铵盐来制备纳米银理论上并不容易，文献报道很少。
发明内容
本发明的目的就在于为解决现有技术的不足而提供一种壳寡糖季铵盐衍生物及利用它制备的纳米银。
本发明的目的是以下述方式实现的：
一种壳寡糖季铵盐衍生物，所述壳寡糖季铵盐衍生物是如下式的化合物；其中R为2-羟基；4-羟基；2,4-二羟基；2-羟基-5-氯；2-羟基-5-溴；2-羟基-5-硝基的一种，10≦n≦20。
如上所述的壳寡糖季铵盐衍生物的制备方法，包括以下步骤：
（1）壳寡糖与羟基苯甲醛衍生物反应，通过壳寡糖上的氨基与羟基苯甲醛衍生物上的醛基发生缩合生成壳寡糖希夫碱衍生物；羟基苯甲醛衍生物为2-羟基苯甲醛、4-羟基苯甲醛、2,4-二羟基苯甲醛、2-羟基-5-氯苯甲醛、2-羟基-5-溴苯甲醛或2-羟基-5-硝基苯甲醛；
（2）壳寡糖希夫碱衍生物与缩水甘油三甲基氯化铵发生开环反应生成壳寡糖季铵盐。
步骤（1）为：壳寡糖与羟基苯甲醛衍生物在冰乙酸催化下，在50-80℃下反应6-10h；壳寡糖氨基与羟基苯甲醛衍生物反应摩尔比为1:(1-2.5)；反应终止后经提纯、干燥得到壳寡糖希夫碱衍生物，即化合物I；步骤（2）为：将化合物I与缩水甘油三甲基氯化铵以1:(1-3)摩尔比反应，反应温度为50-90℃，反应时间为8-16h；反应终止后经提纯、干燥得到壳寡糖季铵盐，即化合物II。
步骤（1）具体为：取1.5-2.5g壳寡糖在10-20mL无水乙醇中浸泡5-20h；然后加入1-2.5倍摩尔量的羟基苯甲醛衍生物，在0.5-3mL冰乙酸催化下，在50-80℃下反应6-10h，冷却后加入20-50mL无水乙醇，静置，弃掉上清液，重复3-5次；减压抽滤，真空干燥；然后以无水乙醇为溶剂，索氏提取10-15h，真空干燥至恒重。
步骤（2）具体为：取1.5-2.5g化合物I，加入10-25mL异丙醇作为溶剂，65-75℃保温0.5-1.5h，取1-3倍摩尔量的缩水甘油三甲基氯化铵加入8-20mL异丙醇，然后将缩水甘油三甲基氯化铵的异丙醇溶液加入化合物I的异丙醇溶液中，反应温度为50-90℃，时间为8-16h；冷却至室温后加入40-80mL无水乙醇静置，弃掉上清液，减压抽滤，无水乙醇洗涤，然后以无水乙醇为溶剂，索氏提取10-15h，真空干燥至恒重。
一种利用如上所述壳寡糖季铵盐衍生物制备纳米银的方法，它是通过壳寡糖季铵盐衍生物溶液与Ag(NH3)2 +溶液反应生成纳米银。
如上所述利用壳寡糖季铵盐衍生物制备纳米银的方法，取壳寡糖季铵盐衍生物溶液与Ag(NH3)2 +溶液混合，混合溶液中壳寡糖季铵盐衍生物与Ag(NH3)2 +摩尔比为：(1-10):(0.1-1)，于25-60℃条件下反应10-60min获得纳米银。
混合溶液中壳寡糖季铵盐衍生物浓度为3.0×10-4-1.0×10-2mol/L，壳寡糖季铵盐衍生物摩尔浓度以壳寡糖季铵盐衍生物基本结构单元计；混合溶液中 Ag(NH3)2 +浓度为3.0×10-5-1.0×10-3mol/L。
一种纳米银，它为采用如上所述方法制备获得。
一般情况下，带有卤离子的季铵盐在碱性条件下遇到Ag离子容易生成沉淀，从而使利用季铵盐制备纳米银很难实现，而且制备的纳米银体系也不稳定；而本发明通过首先在壳寡糖上生成壳寡糖希夫碱同时引入酚羟基，进一步通过与缩水甘油三甲基氯化铵引入季铵盐结构单元，制备得到一种新的壳寡糖季铵盐衍生物，其不但具有壳寡糖抗菌活性部分、季铵盐抗菌活性结构，而且具有抗菌和强还原性基团酚羟基。酚羟基以及季铵盐结构除了具有抗菌活性外，季铵离子的存在能够大大提高壳寡糖希夫碱的水溶性，而且希夫碱中的氮原子及酚羟基可以与纳米银粒子通过配位形成稳定的纳米银体系。利用壳寡糖季铵盐衍生物可在比较温和的条件下还原银氨溶液，生成的纳米银体系在常温下能够稳定存在，并具有较强的抗菌、抗植物病毒等活性，其抗TMV活性比壳寡糖及壳寡糖季铵盐的活性更强。
附图说明
图1是壳寡糖衍生物的紫外分析图；图2是壳寡糖衍生物的红外分析图；
图3a-d是不同浓度的壳寡糖衍生物下的纳米银溶液紫外-可见光谱跟踪图；
图4a-d是不同银氨溶液的加入量下的纳米银溶液紫外-可见光谱跟踪图；
图5a-c是不同反应温度下的纳米银溶液紫外-可见光谱跟踪图；
图6是壳寡糖希夫碱季铵盐衍生物纳米银的TEM图；
图7 是预防效果中珊西烟发病情况；图8是治疗效果中珊西烟发病情况；
图9是药剂处理下叶绿素的含量变化；图10是药剂处理下PPO酶的活性变化；
图11是药剂处理下SOD酶的活性变化；图12是药剂处理下POD酶的活性变化；
图13是药剂处理下CAT酶的活性变化；图14是药剂处理下PAL酶的活性变化；
图15是药剂处理下脯氨酸的含量变化；图16是药剂处理下丙二醛的含量变化；
图17是药剂处理下可溶性蛋白的含量变化。
具体实施方式
实施例1
本发明提供的壳寡糖季铵盐衍生物是如下式的化合物；其中R为2-羟基；4-羟基；2,4-二羟基；2-羟基-5-氯；2-羟基-5-溴；2-羟基-5-硝基的一种， 10≦n≦20。
其制备方法及利用它制备纳米银的方法包括以下步骤：
（1）合成壳寡糖希夫碱：取壳寡糖与羟基苯甲醛衍生物在冰乙酸催化下，通过壳寡糖上的氨基与羟基苯甲醛衍生物上的醛基发生缩合，在50-80℃下反应6-10h；壳寡糖氨基与羟基苯甲醛衍生物反应摩尔比为1:(1-2.5)；反应终止后经提纯、干燥得到壳寡糖希夫碱衍生物，即化合物I；羟基苯甲醛衍生物为：2-羟基苯甲醛、4-羟基苯甲醛、2,4-二羟基苯甲醛、2-羟基-5-氯苯甲醛、2-羟基-5-溴苯甲醛或2-羟基-5-硝基苯甲醛；
（2）与缩水甘油三甲基氯化铵发生开环反应合成壳寡糖季铵盐：将化合物I与缩水甘油三甲基氯化铵以1:(1-3)摩尔比反应，反应温度为50-90℃，反应时间为8-16h；反应终止后经提纯、干燥得到壳寡糖季铵盐，即化合物II；
（3）壳寡糖季铵盐与Ag(NH3)2 +溶液反应生成纳米银：取壳寡糖季铵盐衍生物溶液与Ag(NH3)2 +溶液混合，混合溶液中壳寡糖季铵盐衍生物与Ag(NH3)2 +摩尔比为：(1-10):(0.1-1)，于25-60℃条件下反应10-60min获得纳米银溶液，纳米银溶液粒径为5-10nm。
上述合成壳寡糖季铵盐与纳米银的反应式如下：
实施例2
本发明提供的壳寡糖季铵盐衍生物其制备方法及利用它制备纳米银的方法包括以下步骤：
（1）取1.5-2.5g壳寡糖在10-20mL无水乙醇中浸泡5-20h；然后加入1-2.5倍摩尔量的羟基苯甲醛衍生物，在0.5-3mL冰乙酸催化下，在50-80℃下反应6-10h，冷却后加入20-50mL无水乙醇，静置，弃掉上清液，重复3-5次；减压抽滤，40-50℃条件下真空干燥2-6h；然后以无水乙醇为溶剂，索氏提取10-15h，40-50℃条件下真空干燥至恒重，得到化合物I；
（2）取1.5-2.5g化合物I，加入10-25mL异丙醇作为溶剂，65-75℃保温0.5-1.5h，取1-3倍摩尔量的缩水甘油三甲基氯化铵加入8-20mL异丙醇，然后将缩水甘油三甲基氯化铵的异丙醇溶液加入化合物I的异丙醇溶液中加热反应，温度为50-90℃，时间为8-16h；冷却至室温后加入40-80mL无水乙醇静置，弃掉上清液，减压抽滤，无水乙醇洗涤，然后以无水乙醇为溶剂，索氏提取10-15h，40-50℃条件下真空干燥至恒重；得到化合物II；
（3）取壳寡糖季铵盐（化合物II）与Ag(NH3)2 +溶液混合，反应生成纳米银溶液：混合溶液中壳寡糖季铵盐衍生物浓度为3.0×10-4-0.01 mol/L，Ag(NH3)2 +浓度为3×10-5-1×10- 3mol/L；壳寡糖季铵盐衍生物与Ag(NH3)2 +摩尔比为：(1-10):(0.1-1)，于25-60℃条件下反应10-60min获得纳米银；Ag(NH3)2 +溶液是通过硝酸银溶液、氢氧化钠溶液与氨水溶液反应制备获得；纳米银粒径为5-10nm。
本文中壳寡糖、壳寡糖希夫碱及壳寡糖季铵盐摩尔量、摩尔浓度均以其基本结构单元计算。
实施例3
本实施例中壳寡糖季铵盐衍生物、它的制备方法及利用它制备纳米银的方法如下所述：
（1）取2g壳寡糖（M单元=161）于100mL圆底烧瓶中，加入15mL无水乙醇在磁力搅拌条件下浸泡20h，使其溶胀；然后加入水杨醛（即R为2-OH，M=122）2.27g（壳寡糖氨基：水杨醛=1mol:1.5mol），在2mL冰乙酸催化下，磁力搅拌下于50℃反应10h，回流管上加干燥管；反应停止后，待烧瓶稍冷，加入40mL无水乙醇静置使其沉淀，弃去上清液，再加入同体积无水乙醇，如此反复5次后减压抽滤， 50℃条件下真空干燥12h，然后以无水乙醇为溶剂，索氏提取15h，50℃条件下真空干燥至恒重，得到化合物I；实验过程中冰乙酸作为合成壳寡糖席夫碱的催化剂，结果表明水杨醛能够很好的与壳寡糖连接，但是由于加入醛的量是糖量的二倍，加之有冰乙酸的存在，产物将会有一部分溶解于反应体系中，如果反应后直接进行抽滤会不容易抽干且产品在干燥过程中很容易发黑。在抽滤前先用足量无水乙醇洗涤数次，可对上述问题有较好的解决；
（2）取2g壳寡糖水杨醛希夫碱（M=265，0.00755moL）即化合物I，加入100mL三口烧瓶中，再加入20mL异丙醇搅拌分散均匀后成浆状，升温至70℃保温1h，称取缩水甘油三甲基氯化铵4.54g(0.02265moL)，壳寡糖席夫碱:季铵盐=1mol:3mol)，立即加入10mL异丙醇溶液，然后将缩水甘油三甲基氯化铵的异丙醇溶液加入烧瓶，加热回流，回流温度为85℃，时间为8.5h；冷却至室温后加入40mL无水乙醇静置，弃掉上清液，减压抽滤，用40mL无水乙醇洗涤，重复洗涤5次，抽滤，得粉末状粗产物，粗产品用无水乙醇在索氏提取器中抽提15h，45℃条件真空干燥，待恒重后取出研磨得土黄色粉末，即化合物II；季铵化后的壳寡糖衍生物水溶性较之壳寡糖希夫碱有了很大的提高，这就为在水相中大量制备纳米银提供了先决条件；
（3）壳寡糖季铵盐（化合物II）与Ag(NH3)2 +溶液反应生成纳米银：取14.5mL浓度为1mg/mL（M=416，壳寡糖氨基摩尔浓度为0.0024moL/L）的壳寡糖季铵盐衍生物溶液与0.5mL浓度为0.0040moL/L的 Ag(NH3)2 +溶液混合，混合溶液中壳寡糖季铵盐衍生物与Ag(NH3)2 +摩尔比为：17.4:1，于45℃条件下反应30min获得纳米银；Ag(NH3)2 +溶液是通过硝酸银溶液、氢氧化钠溶液与氨水溶液反应制备获得；纳米银粒径为5-10nm。
试验例
一、壳寡糖季铵盐结构表征
1、紫外光谱分析
分别取实施例3中的壳寡糖、壳寡糖希夫碱、壳寡糖季铵盐，于410nm左右进行紫外光谱分析，结果如图1所示。
从图1可以看出，壳寡糖席夫碱的紫外光谱扫描曲线与壳寡糖原料的紫外扫描曲线完全不同，这是由于壳寡糖与水杨醛发生加成反应后的紫外吸收峰与原料壳寡糖相比有了改变。这进一步证实了壳寡糖与水杨醛发生了化学反应。壳寡糖席夫碱经GTMAc改性后，紫外吸收光谱曲线与原料壳寡糖及壳寡糖席夫碱有明显区别，这可以说明壳寡糖席夫碱已经与GTMAc发生了反应。当壳寡糖席夫碱经GTMAc改性后，结构中的苯环吸收峰发生了明显的红移，可能是由于季铵基团的加入破坏了酚羟基与糖链上羟基之间的氢键所致。
、红外光谱分析
取纯净的实施例3中的壳寡糖、壳寡糖希夫碱、壳寡糖季铵盐约2 mg，干燥的KBr约200mg，置于玛瑙研钵中，混合均匀，研成粉末。取适量混合物转移至压片磨具中，加压成透明或半透明薄片，置于红外分光光度计中检测，测试范围4000~400 cm-1，结果如图2所示。
壳寡糖及其衍生物的红外图谱如图2所示，壳寡糖及其衍生物在3440 cm-1 (羟基的伸缩振动)、2920 cm-1（亚甲基的C-H伸缩振动）和l660cm-1（酰胺的C=O伸缩振动）处均有吸收峰，这说明在壳寡糖及其衍生物中均有-OH、C-HN- C=O这些化学键的存在。壳寡糖席夫碱中新出现了1638 cm-1的C=N伸缩振动峰和1615,1454 cm-1苯环的骨架振动吸收峰；而从壳寡糖席夫碱季铵盐衍生物的红外图谱中除了看到1638 cm-1的C=N伸缩振动峰和1615,1512，1454 cm-1苯环的骨架振动吸收峰外，还可以看到2920,2847 cm-1以及1324 cm-1甲基的伸缩振动和弯曲振动峰。这是由于壳聚糖经过季铵化改性后，分子中引入了CH3和的CH2而引起的结构变化。
二、纳米银合成条件探讨及结构表征
1、不同浓度的壳寡糖季铵盐衍生物对纳米银合成的影响
分别称取实施例3制备的0.015g、0.045g、0.075g、0.105g壳寡糖水杨醛季铵盐衍生物放入四只玻璃管中，加入14.5mL纯净水配制成1mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、7mg/mL的壳寡糖季铵盐衍生物溶液，超声震荡15min，45℃水浴加热搅拌30min后，加入0.5mL银氨溶液（0.0040mol/L）；继续加热并定时对其取样进行紫外检测，观察410nm左右纳米银吸收峰的变化情况；对颜色变化情况拍照记录，结果如图3a-d所示。
随着银氨溶液加入壳寡糖席夫碱季铵盐衍生物溶液变浑浊并且呈现乳白色，随着反应的进行A、B两个处理溶液逐渐变澄清，C、D两处理的颜色逐渐变深。观察图3可发现7mg/mL的季铵盐纳米银特征吸收峰(410nm)明显低于其他三个处理，四个处理均放置一定时间后可发现C、D两处理产生少量沉淀，溶液呈少许浑浊状态。A、B依然澄清,从UV图中可以看出A、B的最高纳米银特征吸收峰(410nm)基本相同，从经济角度来说可优选浓度为1mg/mL的壳寡糖席夫碱季铵盐衍生物。
2、银氨溶液的加入量对纳米银合成的影响
称取四份0.015 g实施例3制备的壳寡糖季铵盐放入四只玻璃管中，加入14.5 mL纯净水超声震荡15 min，45℃水浴加热搅拌30min后，分别加入0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL浓度为0.0040 mol/L银氨溶液；继续加热并定时对其取样进行紫外检测，观察410 nm左右纳米银吸收峰的变化情况，结果如图4a-d所示。
由图4a-d可知随着银氨溶液体积的增加，纳米银的特征吸收峰(410 nm)增高；随着加热时间的延长，吸收峰出现先增高再逐渐下降的趋势，其中以20 min时峰值达到最高。随银氨溶液体积的增加，溶液透明度降低，且放置后可观察到B、C、D溶液均出现不同程度的浑浊并产生沉淀，且浑浊度逐渐增加，故优先选择0.5 mL 0.0040mol/L的银氨溶液。
3、不同温度对纳米银合成的影响
取14.5mL实施例3制备的壳寡糖季铵盐，浓度为1.0 mg/mL,加入0.5mL银氨溶液（0.0040 mol/L）的配比分别跟踪了35℃、45℃、55℃条件下壳寡糖季铵盐衍生物制备纳米银溶液的情况，结果如图5a-c所示。
由图5a-c可以看出经过改性后的产品在较低的温度下就可以反应，但是在35℃条件下所得溶液透明度明显没有其他两个处理好；所得纳米银溶液稳定性也不如另外两处理，放置一段时间后有沉淀产生。故根据反应时间、反应温度及溶液稳定情况可选择55℃为最适温度。
根据以上所述在55℃下10ml 1mg/ml 壳寡糖席夫碱季铵盐衍生物加入0.5ml0.0040mol/L银氨溶液反应能得到最好的纳米银溶液。
4、纳米银粒子形貌观察
将稀释后的壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液滴加在透射电子显微镜覆有碳膜的铜网网格上，室温条件下真空干燥 30 min，待溶剂挥发后可观察纳米银粒子的形貌。其中加速电压为 200 kV，结果如图6所示。
图6表示的是 0.5mL 浓度为4.0×10-3 mol/L的Ag(NH3) 2 +与14.5mL 浓度为1 mg/mL壳寡糖希夫碱季铵盐衍生物在55℃条件下反应制得的壳寡糖希夫碱季铵盐衍生物纳米银溶液的透射电镜图。由透射电镜图可以看出，所得到的纳米银微粒为规则的球形，且分散性好、颗粒分布均匀，粒径为 5～10nm。壳寡糖衍生物糖链缠绕在纳米银粒子的表面，对纳米银形成了保护作用，同时糖链上所含的大量羟基、季铵离子以及羰基等亲水基团，可促使纳米微粒具有较好的亲水性能在水溶液中稳定存在，从而形成红色透明的溶液。
实验利用 UV、IR、TEM对壳寡糖季铵盐衍生物以及其纳米银溶液进行了结构表征。利用壳寡糖衍生物季铵盐作为还原剂和稳定剂制得了稳定的纳米银溶液，实验得出：经过季铵化改性后的壳寡糖衍生物季铵盐优选在45℃-55℃的条件下制得纳米银溶液，反应条件温和，反应速度快。壳寡糖衍生物季铵盐的浓度在3.0×10-4-0.01 mol/L之间和银氨溶液浓度在3.0×10-5-1.0×10-3 mol/L之间可以生成稳定的纳米银溶液。壳寡糖衍生物季铵盐在制备纳米银的反应中既作为还原剂又作为保证纳米银粒子稳定存在的稳定剂，从而使制得的纳米银溶液更稳定。通过透射电镜（TEM）观察银纳米粒子的形貌，并结合紫外-可见光谱(UV)的结果，印证了纳米银溶液的基本光学特征。
三、纳米银溶液的抗TMV药效实验
1、枯斑抑制筛选试验
试验采用枯斑寄主半叶法进行筛选。TMV病毒汁液的质量浓度为3.33 µg/mL, 采用常规汁液摩擦的方法进行接种。
预防试验：首先选取长势一致、具有4~5片真叶的盆栽珊西烟进行喷药，然后在24h后用半叶法摩擦接种TMV，以另一半烟叶喷清水24 h后接种TMV作为对照，每个药剂处理重复3次，观察烟株发病情况，计算枯斑抑制率。
治疗试验：首先选取长势一致、具有4~5片真叶的盆栽珊西烟，选取一半叶接种TMV， 12 h后喷药；另一半叶接种TMV ，12 h后喷清水作为对照，每个药剂处理重复3次，观察烟株发病情况，计算枯斑抑制率。
对不同浓度的壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液抗烟草花叶病毒的枯斑抑制效果进行统计分析，结果如表1所示，半叶法接种后喷施3.3×10-5mol/L（以Ag计）的壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液对枯斑的预防效果抑制率高达86.36%，分别比宁南霉素和壳寡糖高出23.50%、29.69%；不同浓度的壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液的枯斑抑制率均高于壳寡糖季铵盐衍生物的枯斑抑制率；壳寡糖对枯斑的抑制效果最差，其枯斑抑制率为56.67%，比市售药剂宁南霉素低6.19%。从治疗效果来看，喷施3.3×10-5mol/L的壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液对枯斑的抑制率可达到48.53%，分别比宁南霉素和壳寡糖处理高出23.12%、20.26%；8.25×10-6mol/L的壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液对枯斑的抑制效果最差，为23.18%；3M、6M壳寡糖季铵盐衍生物处理下枯斑抑制率均高于壳寡糖处理和宁南霉素处理。由此可知，接种过TMV的珊西烟喷施3.3×10-5mol/L的壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液枯斑抑制效果较好，可选择该浓度纳米银溶液在普通烟K326上做进一步的研究；图7为预防效果珊西烟发病情况，左：喷施3.3×10-5mol/L的壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液后接种TMV；右：喷施清水后接种TMV；图8为治疗效果中珊西烟发病情况，左：接种TMV后喷施3.3×10- 5mol/L的壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液；右：接种TMV后喷施清水。
2、纳米银溶液诱导K326烟株对TMV侵染的抗性
选用长势一致，7~8片真叶的盆栽K326烟株进行药效试验。在喷施药剂24h后，摩擦接种TMV，试验处理设有：处理1（喷施稀释260倍的宁南霉素后接种TMV，T1），处理2（喷施3.3×10-5 mol/L的实施例3制备的壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液后接种TMV，T2），处理3（喷施1mg/mL的壳寡糖后接种TMV，T3）, 接种对照（喷施清水后接种TMV，CK0），健康对照（只喷施清水不接种CK1）。在接种后1d、4d、7d、10d、13d和16d分别取样装入锡箔纸，做标记，放置于-80℃冰箱中保存。每个处理设置3个重复。
采用Gooding（Gooding G V Jr,Hebert T T. A simple technique forpurification of tobacco mosaic virus in large quantities．PhytopathologicalNotes,1967,57:1285） 等人的方法进行烟草花叶病毒的提纯。采用乙醇提取法（李虎林,白青竹, 姬文秀, 等. 不同类型烟草叶片叶绿素和类胡萝卜素含量比较分析[J]. 延边大学农学学报, 2008, 30(3): 153-156）测定叶绿素的含量；参照氮蓝四唑（NBT）显色的方法（刘炳辉, 董晓颖, 李志军, 等. 硬肉桃果实成熟前后几种与果实软化相关的生理指标的变化[J]. 植物生理学通讯, 2008, 44(5): 887-890）测定超氧物歧化酶（SOD）的含量；参照Chen Y F的方法（Chen Y F, Zhan Y, Zhao X M, et al. Functions ofoligochitosan induced resistance and pathogenesis related protein lcinase intobacco mosaic virus proteins in tobacco [J]. Plant Physiology &Biochemistry, 2009, 47: 724-731）测定过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的含量，略有修改；参照李靖等的方法（李靖, 利容千, 袁文静. 黄瓜感染霜霉病菌叶片中一些酶活性的变化[J]. 植物病理学报, 1991, 21(4): 277-283）测定多酚氧化酶（PPO）的活性；采用考马斯亮蓝G-250染料结合法（张龙翔, 张廷芳, 李令嫒. 生化实验方法和技术(第二版)[M]. 北京: 高等教育出版社, 1997: 312-313）测定可溶性蛋白含量；参照赵世杰（赵世杰, 许长成, 邹琦, 等. 植物组织中丙二醛测定方法的改进[J].植物生理学通讯, 1991, 30(3): 207–210）的方法测定丙二醛的含量；游离脯氨酸的测定参照邹琦（邹琦. 植物生理生化实验指导[M]. 北京: 中国农业出版社, 1995）的方法。
2.1药剂处理下叶绿素含量的动态变化
本试验对不同浓度药剂处理下烟叶中叶绿素含量的动态变化进行了研究，结果如图9所示。结果表明，T1处理下，叶片中叶绿素含量在接种后第4天达到最大值，之后骤然下降；T2处理下，叶片中叶绿素含量在整个试验过程中升降平缓，表现为降-升-降-升-降的趋势；T3处理下，叶片中叶绿素含量升降较明显，在接种后第7天达到最大值，其升降趋势与T2处理相同，T3处理下的叶片中叶绿素含量整体上明显处于最低值；CK0处理下，叶片中叶绿素含量表现为降-升-降的趋势，叶绿素含量升降明显，在接种后第10天达到最大值之后降幅较明显；CK1处理下，叶片中叶绿素含量表现为升-降-升的趋势，叶绿素含量升降较平缓，叶绿素含量整体上略高于T2处理。由此可见，喷施壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液可有效的降低被烟草花叶病毒侵染后烟草叶片中叶绿素含量下降的幅度。
2.2各个药剂处理下防御酶活性的动态变化
（1）药剂处理下PPO酶活性的变化
测定了药剂处理下叶片中PPO酶活性变化，结果如图10所示，T1处理下，叶片中PPO酶活性在接种后整体几乎呈现直线增加的趋势；T2处理下，叶片中PPO酶活性在接种后1-4天有不明显的下降，之后骤然上升到第10天之后缓慢上升，T2处理下PPO酶活性表现为单峰曲线；T3处理下，叶片中PPO酶活性在接种后1-4天缓慢上升，4-7天有稍明显的下降，7-10天骤然上升，10-13天明显下降之后缓慢上升；CK0处理下，叶片中PPO酶活性在接种后表现为升-降-升，且升降较缓和，CK0处理下的叶片中PPO酶活性相较于其他处理最低；CK1处理下，叶片中PPO酶活性在接种后整体表现为上升的趋势，上升幅度较明显；与健康对照CK1相比，T2处理下叶片中PPO酶活性较好。由此可见，喷施壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液可有效的提高烟叶中PPO酶活性。
（2）药剂处理下SOD酶活性的变化
结果如图11所示，T1处理下，叶片中SOD酶活性在接种后在第7天达到最大值，表现为升-降的单峰曲线；T2处理下，叶片中SOD酶活性在接种后在第7天达到最大值，整体上呈现倒“U”型的动态变化；T3处理下，叶片中SOD酶活性在接种后的曲线变化同T2处理，不同的是T3处理下的叶片中SOD酶活性在接种10天后骤然下降；CK0处理下，叶片中SOD酶活性的曲线变化同T2处理；CK1处理下，叶片中SOD酶活性在第7天达到最大值后有细微的下降。与健康对照CK1相比，T2处理下叶片SOD酶活性与其较接近。由此可见，喷施壳寡糖季铵盐纳米银溶液可有效的提高烟叶中SOD酶活性。
（3）药剂处理下POD酶活性的变化
对药剂处理后的叶片中POD酶活性变化进行了测定，结果如图12所示，T1处理下，叶片中POD酶活性在接种后表现为缓慢上升-明显上升-缓慢上升-明显下降-缓慢下降，并在第10天达到最大值；T2处理下，叶片中POD酶活性在第10天达到最大值，表现为倒“V”型的动态变化；T3处理下，叶片中POD酶活性在接种后表现为缓慢上升-明显上升-缓慢上升—缓慢上升-明显下降；在第13天达到最大值；CK0处理下，叶片中POD酶活性曲线变化同T1处理；CK1处理下，叶片中POD酶活性也在第10天达到最大值，表现为明显上升-较明显下降-缓慢下降的趋势；与健康对照CK1相比，T2处理下叶片SOD酶活性与其它三个处理相比酶活性较高。由此可见，喷施壳寡糖季铵盐纳米银溶液可有效的提高烟叶中POD酶活性。
（4）药剂处理下CAT酶活性的变化
测定了药剂处理后的叶片中CAT酶活性变化，结果如图13所示，T1处理下，叶片中CAT酶活性表现为缓慢下降-较明显下降-较明显上升-较明显下降-缓慢上升的趋势；T2处理下，叶片中CAT酶活性在第4天达到最大值，表现为缓慢上升-较明显下降-缓慢下降-的趋势；T3处理下，叶片中CAT酶活性在接种后表现为较明显下降-较明显上升-直线下降的趋势，CAT酶活性整体上较低；CK0处理下，叶片中CAT酶活性整体上几乎表现为直线下降的趋势；CK1处理下，叶片中CAT酶活性在接种后第7天达到最大值，表现为明显上升-明显下降的倒“V”型动态变化；与健康对照CK1相比，T2处理下的CAT酶活性是除CK1外酶活性最高的。由此可见，喷施壳寡糖季铵盐纳米银溶液可有效的提高烟叶中CAT酶活性。
（5）药剂处理下PAL酶活性的变化
如图14所示，T1处理下，叶片中PAL酶活性在接种后第4天达到最大值，整体上表现为缓慢上升-较明显下降-细微上升-较明显下降的趋势；T2处理下， PAL酶活性在接种后表现为缓慢下降-较明显下降-较明显上升-较明显下降的趋势；T3处理下，PAL酶活性在接种后第4天达到最大值，整体上表现为较明显上升-明显下降-较明显上升-明显下降-缓慢下降的趋势；CK0处理下，叶片中PAL酶活性在接种后表现为明显下降-缓慢上升-较明显上升-稍微下降-明显下降的趋势；CK1处理下，叶片中PAL酶活性接种后整体呈现较缓慢的下降趋势与健康对照CK1相比，T2处理下的PAL酶活性是除CK1外酶活性整体变化较缓和较高的。由此可见，喷施壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液可有效的提高烟叶中PAL酶活性。
2.3药剂处理下脯氨酸含量的动态变化
结果如图15所示，T1处理下，叶片中脯氨酸含量在接种后第7天达到最大值，脯氨酸含量在试验过程中表现为明显上升-较明显下降-缓慢上升的趋势；T2处理下，脯氨酸含量在接种后第7天达到最大值，整体表现为较明显上升-明显上升-较明显下降-明显下降-明显上升的趋势；T3处理下，脯氨酸含量同样在接种后第7天达到最大值，表现为缓慢上升-明显上升-明显下降-较明显上升-明显上升的趋势；CK0处理下，脯氨酸含量表现为缓慢上升-明显上升-明显下降-缓慢下降的趋势，在第7天达到最大值；CK1处理下，脯氨酸含量在第10天达到最大值，表现为较明显上升-明显上升-缓慢上升-较明显下降-较明显上升的趋势；与健康对照CK1、接种对照CK0相比，T2处理下烟叶中脯氨酸含量是除CK1外整体含量较高的处理。由此可见，壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液可有效的提高烟叶中脯氨酸的含量。
2.4药剂处理下丙二醛含量的动态变化
结果如图16所示，T1处理下，叶片中丙二醛含量在接种后第10天达到最大值，丙二醛的含量在整个试验过程中表现为明显下降-明显上升-缓慢下降的趋势；T2处理下，叶片中丙二醛含量在接种后整体表现为较明显下降-明显上升-较明显下降的趋势；T3处理下，叶片中丙二醛含量同样在接种后第13天达到最大值，表现为明显下降-明显上升-较明显下降的变化趋势；CK0处理下，叶片中丙二醛含量表现为明显下降-明显上升-较明显下降的趋势，在第13天达到最大值；CK1处理下，叶片中丙二醛含量表现为明显下降-缓慢上升-缓慢下降的变化趋势；与健康对照CK1、接种对照CK0相比，T2处理下烟叶中丙二醛含量是除CK1外整体含量相对较低的处理。由此可见，喷施壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液可有效的降低烟叶中丙二醛的含量。
2.5药剂处理下可溶性蛋白含量的动态变化
结果如图17所示，T1处理下，叶片中可溶性蛋白含量在接种后第16天达到最大值，可溶性蛋白的含量在整个试验过程中表现为上升-下降-上升的变化趋势；T2处理下，叶片中可溶性蛋白含量在接种后整体变化趋势与T1处理相似；T3处理下，可溶性蛋白含量在接种后第16天达到最大值，表现为明显升-降-升的变化趋势；CK0处理下，可溶性蛋白含量表现为较明显下降-明显上升-较明显下降-较明显上升的变化趋势，在第16天达到最大值；CK1处理下，可溶性蛋白含量表现为明显上升-缓慢下降-缓慢上升的变化趋势；与健康对照CK1、接种对照CK0相比，T2处理下烟叶中可溶性蛋白含量是除CK1外整体含量相对较高的处理。由此可见，喷施壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液可有效的降低烟叶中可溶性蛋白的含量。
3、大田条件下壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液对烟草TMV的防治及烟叶品质的影响
3.1试验地点
试验田设在河南省许昌市襄城县王洛镇，供试品种为中烟100，所选取的试验田为连续三年以上种植烟草，TMV常年发生较明显。试验地的地势平坦、灌溉方便、通风向阳、肥力中等，许昌襄县王洛镇试验田土壤基本情况为（氯离子27.936 mg/kg，速效钾97.339 mg/kg，速效磷23.392 mg/kg，pH 6.49，有机质17.233 g/Kg，碱解氮76.542 mg/kg）在4月中下旬移栽，株行距为120 cm×55 cm，采用随机区组试验设计，每个处理重复3次，试验田的四周设置保护行。其它管理措施与大田管理一致。
3.2病情分级标准和结果调查
烟草花叶病的分级标准（GB/T23222—2008）如下：
3.3试验设计
在河南许昌襄县选取烟田进行试验，试验设4个处理，分别为T1：质量浓度为1000 µg/mL的壳寡糖溶液；T2：稀释260倍的宁南霉素水剂；T3：摩尔浓度为3.3×10-5mol/L（以Ag计）的实施例3制备的壳寡糖季铵盐纳米银溶液；CK：清水（对照）。在大田条件下进行，所选大田烟株生长健壮，长势均匀一致，自然发病。试验分为预防试验和治疗试验。
大田预防试验：烟株移栽后15天选择没有发病的烟田进行药剂的喷施，连续施药四次，每次间隔十天左右。
大田治疗试验：于2015年5月20号、5月30号、6月09号、6月19号进行喷药。5月20号对试验田进行普查，发现有零星TMV烟株，5月28号达到发病高峰。
喷药后每10天对试验田进行普查，根据TMV的分级标准进行记录。挂牌随机选取几株感染TMV、具有代表性的烟株，以中部烟叶作为研究对象，进行取样，对其烤后样进行测定。
3.4大田条件下纳米银溶液对烤后烟草品质的影响
烤烟常规化学成分的测定；中性香味物质的提取采用水蒸气蒸馏-二氯甲烷溶剂同时蒸馏萃取法，利用内标法进行定量，由GC/MS的测定结果以及NIST02库检索进行定性。
3.5统计分析方法
采用SPSS19.0对数据进行差异性分析，并利用Excel 2007、Origin7.5对数据进行统计分析并作图。
3.6许昌襄县大田条件下药剂处理对烟草普通花叶病的防效研究
（1） 药剂对烟草花叶病毒的预防效果
如表3所示，由发病率来看，与清水对照相比，各个处理对感病烟株均达到了较好的抑制作用，不同处理下各个小区的平均病情指数分别为11.23、11.10、10.85和17.44，且各个药剂处理下的平均病情指数分别比对照的平均病情指数下降了35.61%、36.35%和37.79%，不同药剂各个时期的病情指数均明显低于对照，以T3处理为最低。由药剂对烟草普通花叶病的预防效果可以看出，在不同的调查时期下各处理对烟株的平均防治效果分别为：39.90%、41.15%和43.46%，T1、T2和T3处理下达到的最大防效分别为47.37%、48.40%和53.01%，总的来说，T3处理即壳寡糖季铵盐衍生物纳米银效果最好。
（2）药剂对烟草花叶病毒的治疗效果
各个药剂处理对大田烟株的治疗效果如表4所示，由发病率来看，各个处理对感病烟株均达到了一定的抑制作用，以T3处理下的抑制作用最好；不同药剂处理下各个小区的平均病情指数（15.12、13.26和11.97）分别比清水对照的平均病情指数（18.20）下降了16.92%、27.14%和34.23%，不同药剂处理下各个时期的病情指数均低于清水对照，以T3处理下的最为明显；由药剂对烟草普通花叶病的治疗效果可以看出，在不同的调查时期下各个药剂处理对烟株的平均防治效果分别为：25.32%、32.27%和37.58%，且T1、T2和T3处理下达到的最大防效分别为29.24%、37.75%和40.31%，总的来说，T3处理即3.3×10-5 mol/L（以Ag计）壳寡糖季铵盐衍生物纳米银处理的效果较好。
（3） 药剂对烟叶常规化学成分的影响
各个药剂处理下烤后烟叶常规化学成分如表5所示，不同药剂处理下烤烟总糖含量较优质烤烟的标准来说偏高，但低于对照处理，相对来说，以T3处理下总糖含量较接近于工业要求的总糖含量的范围，为26.71%；T1和T3处理下烟叶还原糖处于适宜范围，且T3处理下烟叶还原糖最低，T2和CK处理下烟叶还原糖含量较高，T2处理下烟叶还原糖低于对照处理；各个处理下烟叶蛋白质、钾、氯、烟碱和总氮均符合卷烟企业的要求，其中以T3处理下指标的含量较接近于工业的要求，这可能因为3.3×10-5 mol/L（以Ag计）壳寡糖季铵盐衍生物纳米银处理下感病烟株的病情状况得到了有效缓解，从而使烟叶的品质得到改善。
（4）药剂对烟叶中性致香物质的影响
虽然不同药剂处理下烤烟中性致香物质的种类相同，但其含量却存在着较明显的差别（见表6）。由表6可以看出，与其他各个处理相比，T3处理下除了类胡萝卜素降解产物中的芳樟醇、美拉德反应产物中的糠醇含量稍低于T2处理以及类胡萝卜素降解产物中3-羟基-β-二氢大马酮、巨豆三烯酮1含量低于T1处理，其他大多数香味物质含量均为最高。
由表7可知，T3处理下类西柏烷类降解产物、类胡萝卜素降解产物、芳香族氨基酸降解产物、叶绿素降解产物和美拉德反应产物含量均高于其他三个处理，T2处理除了类西柏烷类降解产物含量低于T1处理，其他致香成分均高于T1处理，且对照处理下的含量均为最低，各个处理下烤烟中性致香成分的总量分别为733.05、926.69、1023.18和695.62 µg.g-1。
、结果分析
本研究得出烟草在感染花叶病后喷施壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液可有效的缓解叶绿素的下降幅度，这可能是因为药剂处理后使得一些分解叶绿素的酶活性降低或者使叶绿素酯含量升高，也可能是因为药剂的使用缓解了病毒侵染烟株体内的分解叶绿素酶活性的升高速度，进而缓解叶绿素含量的下降速度。
烟草在感染花叶病后喷施壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液可有效的提高防御酶（SOD、POD、CAT、PPO、PAL等）的活性，可提高对活性氧的清除能力，从而提高烟叶的抗病性感染TMV的烟草喷施药剂后可促进脯氨酸的有效积累，尤其以喷施3.3×10-5mol/L（以Ag计）的壳寡糖季铵盐纳米银溶液效果最好；喷施3.3×10-5 mol/L（以Ag计）的壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液可较好的缓解被TMV侵染烟株体内丙二醛的积累，而可溶性蛋白的含量在植物体内得到了积累。
在许昌襄县的试验结果表明，喷施药剂后，与壳寡糖和市售药剂宁南霉素相比，无论是从病情指数来看，还是从预防和治疗效果来说，壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液对大田感染烟草普通花叶病的烟株具有较好的诱导抗病效果，其最大防治效果分别达到53.01%、40.31%。这些均与已报道的相比得到了显著提高，这可能与壳寡糖自身的诱导抗病性、季铵盐的抗病性或者纳米银的诱导抗病性以及三者的协同作用有关。
经壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液处理的试验田烟株的烟叶品质均得到了较好的改善，且明显优于壳寡糖和宁南霉素处理，烤烟的品质可通过常规化学成分以及中性致香物质来体现。试验得出，各个处理与对照相比烟叶常规化学成分和中性致香物质均有较明显的差异，其中以壳寡糖季铵盐衍生物纳米银溶液效果较好。
本发明实施例4-21中各步骤参数见表8-9，其他同实施例2；实施例22-39中各步骤参数见表10-12，其他同实施例3；其中R中：A为2-羟基；B为4-羟基；C为2,4-二羟基；D为2-羟基-5-氯；E为2-羟基-5-溴；F为2-羟基-5-硝基。

Claims (9)

1.一种壳寡糖季铵盐衍生物，其特征在于：所述壳寡糖季铵盐衍生物是如下式的化合物；
其中R为2-羟基；4-羟基；2,4-二羟基；2-羟基-5-氯；2-羟基-5-溴；2-羟基-5-硝基的一种，10≦n≦20。
2.如权利要求1所述的壳寡糖季铵盐衍生物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）壳寡糖与羟基苯甲醛衍生物反应，通过壳寡糖上的氨基与羟基苯甲醛衍生物上的醛基发生缩合生成壳寡糖希夫碱衍生物；羟基苯甲醛衍生物为2-羟基苯甲醛、4-羟基苯甲醛、2,4-二羟基苯甲醛、2-羟基-5-氯苯甲醛、2-羟基-5-溴苯甲醛或2-羟基-5-硝基苯甲醛；
（2）壳寡糖希夫碱衍生物与缩水甘油三甲基氯化铵发生开环反应生成壳寡糖季铵盐。
3.如权利要求2所述的壳寡糖季铵盐衍生物的制备方法，其特征在于步骤（1）为：壳寡糖与羟基苯甲醛衍生物在冰乙酸催化下，在50-80℃下反应6-10h；壳寡糖氨基与羟基苯甲醛衍生物反应摩尔比为1:(1-2.5)；反应终止后经提纯、干燥得到壳寡糖希夫碱衍生物，即化合物I；步骤（2）为：将化合物I与缩水甘油三甲基氯化铵以1:(1-3)摩尔比反应，反应温度为50-90℃，反应时间为8-16h；反应终止后经提纯、干燥得到壳寡糖季铵盐，即化合物II。
4.如权利要求3所述的壳寡糖季铵盐衍生物的制备方法，其特征在于步骤（1）具体为：取1.5-2.5g壳寡糖在10-20mL无水乙醇中浸泡5-20h；然后加入1-2.5倍摩尔量的羟基苯甲醛衍生物，在0.5-3mL冰乙酸催化下，在50-80℃下反应6-10h，冷却后加入20-50mL无水乙醇，静置，弃掉上清液，重复3-5次；减压抽滤，真空干燥；然后以无水乙醇为溶剂，索氏提取10-15h，真空干燥至恒重。
5.如权利要求3所述的壳寡糖季铵盐衍生物的制备方法，其特征在于步骤（2）具体为：取1.5-2.5g化合物I，加入10-25mL异丙醇作为溶剂，65-75℃保温0.5-1.5h，取1-3倍摩尔量的缩水甘油三甲基氯化铵加入8-20mL异丙醇，然后将缩水甘油三甲基氯化铵的异丙醇溶液加入化合物I的异丙醇溶液中，反应温度为50-90℃，时间为8-16h；冷却至室温后加入40-80mL无水乙醇静置，弃掉上清液，减压抽滤，无水乙醇洗涤，然后以无水乙醇为溶剂，索氏提取10-15h，真空干燥至恒重。
6.一种利用如权利要求1所述壳寡糖季铵盐衍生物制备纳米银的方法，其特征在于它是通过壳寡糖季铵盐衍生物溶液与Ag(NH3)2 +溶液反应生成纳米银。
7.如权利要求6所述利用壳寡糖季铵盐衍生物制备纳米银的方法，其特征在于取壳寡糖季铵盐衍生物溶液与Ag(NH3)2 +溶液混合，混合溶液中壳寡糖季铵盐衍生物与Ag(NH3)2 +摩尔比为：(1-10):(0.1-1)，于25-60℃条件下反应10-60min获得纳米银。
8.如权利要求7所述利用壳寡糖季铵盐衍生物制备纳米银的方法，其特征在于混合溶液中壳寡糖季铵盐衍生物浓度为3.0×10-4-1.0×10-2mol/L，壳寡糖季铵盐衍生物摩尔浓度以壳寡糖季铵盐衍生物基本结构单元计；混合溶液中 Ag(NH3)2 +浓度为3.0×10-5-1.0×10-3mol/L。
9.一种纳米银，其特征在于：它为采用如权利要求6-8任一项所述方法制备获得。
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