CN105085709A - 一种壳寡糖季铵盐衍生物及利用它制备纳米银的方法 - Google Patents

Abstract

本发明制备得壳寡糖季铵盐衍生物具有抗菌活性部分壳寡糖、抗菌活性部分季铵盐结构、兼有抗菌和强还原性基团酚羟基以及醛基；以此壳寡糖季铵盐衍生物还原银铵溶液可顺利制备纳米银，并使合成的壳寡糖季铵盐纳米银获得高效、抗菌、抗植物病毒等活性，且抗TMV活性比壳寡糖及壳寡糖季铵盐活性更强。

Description

一种壳寡糖季铵盐衍生物及利用它制备纳米银的方法

技术领域

本发明属于纳米银制备技术领域，具体涉及一种壳寡糖季铵盐衍生物及用壳寡糖季铵盐衍生物制备纳米银的方法。

背景技术

甲壳素和壳聚糖(CTS)具有许多天然的优良性质，如吸湿透气性、反应活性、生物相容性、生物可降解性、无抗原性、无致炎性、无有害降解产物、吸附性粘合性、抗菌性和安全性等，从而被广泛应用于纺织工业、生物医学和日用环保等方面。CTS还被誉为人体的“第6生命要素”，有人评论认为甲壳素将成为21世纪的支柱产业之一，曾有科学家预言“21世纪将是甲壳素的世纪”，近几十年来，甲壳素和CTS已成为日、美等国家的热门研究课题。

CTS的结构式如下。

由于甲壳素的CTS的水不溶性，限制了它们的应用范围，而通过降解甲壳素或壳聚糖得到的壳寡糖(其聚合度在20以下)是一类无毒且具有良好的生物降解性和生物相容性的高分子物质，其优越的生物活性功能、良好的成膜特性和较强的抗菌防腐能力，低粘度和良好的水溶性使壳寡糖比壳聚糖展现出更独特的生理活性的功能性质，如抗菌、抗肿瘤、提高植物防御能力等。

壳寡糖作为一种激发子，可有效地诱导植物抗病性，增强植物对病虫害的防御能力，其作为植物免疫激活因子的基础研究始于20世纪60年代。Ayers等于1976年发现细胞壁的寡糖碎片能诱导植物植保素(phytoalexin)合成仁；1985年Albersheim首次提出了寡糖素(oligosaccharins)这个新概念和新领域，每种活性寡聚糖可发出调节特定功能的信息，激活防御反应和调控植物生长，产生具有抗病害的活性物质，抑制病害的形成。

(1)对烟草的诱导抗性

烟草花叶病毒病(TMV)在生产上的危害很大，至今仍缺乏有效的治疗药剂。目前，选择合适的诱抗剂不失为一种有效的防治方法，其广阔的应用前景已引起人们的高度重视。郭红莲等以壳寡糖诱导烟草枯斑三生叶(Nicotianatabacumvar.samsunNN)寄主后，调查了其对病斑的抑制率，同时研究了壳寡糖单独处理和以病毒粒子侵染诱导的病程相关蛋白的差异，结果表明，壳寡糖处理对TMV侵染有保护作用，施用后7d，以浓度为50μg/mL和75μg/mL时其对枯斑的抑制效果为好；通过体外测试发现，壳寡糖对TMV粒子有钝化作用，单独施用壳寡糖可以诱导烟草产生6条耐碱性的PR蛋白，其中1条区别于TMV侵染诱导的PR。Lu等将壳寡糖喷洒于感染烟草花叶病毒(TMV)的烟草叶片上，在接种后24h发现50μg/mL壳寡糖对烟草花叶病毒的抑制率最高，研究结果表明，壳寡糖诱导烟草防御是与N-介导的抗性有关。

(2)对水稻的诱导抗性

稻瘟病和纹枯病是水稻的重要病害，在世界范围内每年造成上亿千克产量损失，高发病时甚至可以造成减产50%。Obara等用固相微萃取技术和GC-MS法分析不同诱导剂释放的挥发物作为诱导剂处理稻瘟病菌。Pyriculariaoryzae将病菌嫁接到水稻叶片上(含有壳寡糖)，发现不同的诱导剂产生的挥发物在定性和定量上有一些差别。Inui等将一系列浓度的壳寡糖放到水稻培养液中，也发现其能够诱导苯丙氨酸解氨酶(PAL)。胡健等结果表明：相对分子质量不同的壳寡糖对供试水稻品种叶片几丁质酶的诱导作用不同，相对分子质量为1500的壳寡糖诱导效果最佳，而相对分子质量为500的壳寡糖诱导效果最差。不同水稻品种对纹枯病的抗性不同，其几丁质酶的诱导能力也不同，无论是苗期还是抽穗期，抗病能力强的水稻品种，几丁质酶的诱导水平也高。宁伟等对30株水稻幼苗发病情况的统计结果显示，经5μg/mL壳寡糖处理的水稻植株抗稻瘟病能力明显增强，病斑级数为2~3级，植株抗病级数为1~2级；而未经壳寡糖处理的植株极大部分病斑为感病病斑，发病级数在4~5级。

(3)对番茄的诱导抗性

Noah等研究了5%或30%乙酰化程度的几丁质、壳寡糖和壳聚糖对番茄Lycopersiconesculentum叶片中水解酶的诱导情况，发现乙酰化程度低的壳寡糖没有诱导作用，而95%乙酰化的壳寡糖是一个有效的抗病诱导剂。何培青等研究了0.3%壳寡糖诱导番茄叶片120h后，其挥发性物质对番茄枯萎病菌Fusariumoxysporum孢子萌发和菌丝生长的影响，采用气相色谱-质谱联用技术，检测诱导后番茄叶中挥发性物质及植保素日齐素质和量的变化。结果表明，经壳寡糖诱导后，番茄叶中挥发性物质对病菌的抑制率较对照组高。番茄叶中挥发性抗真菌物质的总含量为对照组的1.49倍；氧合脂类、萜类及芳香类化合物的含量分别提高了61%、10%和69%，其中(E)-2-乙烯醛的含量增加了64%，水杨酸甲酯的含量增加了38%。

(4)对小麦的诱导抗性

日本京都大学IshiharaAtsushi壳寡糖测试燕麦时，发现其能够诱导燕麦HTT酶的活性，从而诱导其产生抗病能力。刘晓等用壳寡糖和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)以不同方式处理小麦种子，测定其从G1期启动进入S期和G2-M期的胚细胞百分率和小麦黄化苗的生长；结果表明，壳寡糖可促进小麦种子胚细胞周期启动并促进小麦根数目增加，说明壳寡糖对小麦种子的胚细胞分裂有促进作用；壳寡糖预处理小麦种子可解除DON对小麦黄化苗生长及胚细胞启动的抑制作用，表明寡聚糖可提高植物对病原菌毒素的抗耐性，这可能是寡聚糖诱导植物提高抗病性的重要机制之一。Takezawa用小麦培养的细胞来研究Ca₂ ⁺的传递作用和诱导细胞对真菌病原体的抵抗作用。Typhulaishikariensis以衍生的物质来诱导用小麦培养的细胞，结果显示，ccd-1基因密码是一个14kDa的Ca²⁺蛋白质复合物，它具有一个偏酸性的两性分子特征。壳寡糖诱导显示了它能够转换Ca₂ ⁺信号，这能使植物启动自己的防御体系，免受真菌的入侵。

壳寡糖具有多方面生理功能以及抗肿瘤效果。早在1985年，Suzuki等就用甲壳六聚糖对小鼠进行抗肿瘤测试，得到了明显效果；1997年，王中和等又用低分子壳多糖口服液对临床患者进行辅助治疗，发现白细胞、淋巴细胞的总数保持稳定，T淋巴细胞的数量显著上升，也说明了低分子壳多糖的抗肿瘤辅助疗效。因此，它可作为早期肿瘤的治疗药物；其作用机理为乙酰-D糖胺(GlcNA)或D-糖胺(GLcN)残基与巨噬细胞表面受体结合后，激活巨噬细胞释放IL-1，同时引起T细胞表面IL-2受体表达，而这又加速了T细胞成熟而释放IL-2、IL-2与受体结合后，进一步加速T细胞分化成熟为细胞毒性T细胞，从而产生抗肿瘤作用。

壳聚糖具有天然、广谱抗菌活性，壳寡糖为其降解产物，同样也具有抗菌作用。壳寡糖具有广谱抑菌活性并对人畜无毒，开发壳寡糖生物源农药是减少化学农药施用量的有效途径。郑连英等研究推测壳寡糖通过渗透进入病原菌细胞体内，吸附其体内带有阴离子的细胞质，并产生絮凝作用，扰乱细胞正常的生理活动，最终杀灭病菌。施用壳聚糖可直接抑制病菌生长或诱导植物的抗病反应，提高植物的抗病性。经实验室生物活性测定和田间药效试验证明，壳寡糖对番茄早疫病、黄瓜白粉病、棉花黄萎病、大豆病毒病、辣椒病毒病、木瓜病毒病等均有很好的防效。

除了不能与碱性农药混合使用外，壳寡糖是一种良好的生物源农药，具有对环境无污染，能够诱导植物产生抗病性等优点。中国科学院大连化学物理研究所研制的壳寡糖生物农药如已获得国家农业部农药临时登记证，并与相关企业联合，作为抗烟草花叶病的指定药剂，在烟草生产中进行大面积推广，取得了明显的经济和社会效益。

壳寡糖分子中基于生物源多糖衍生物合成与生物活性研究，发现经修饰后的壳寡糖希夫碱、壳寡糖希夫碱金属配合物、壳寡糖磷酸酯对烟草花叶病的抑制作用均比未修饰的壳寡糖具有更高的活性。

四级铵盐与无机盐性质相似，易溶于水，不少具有一定的生物活性，有些四级铵盐可用作药物、农药以及化学反应中的相转移催化剂等。例如，矮壮素[(CH₃)₃NCH₂CH₂Cl]⁺Cl^-是一种植物生长调节剂，氯化苄基三乙基铵和硫酸氢四丁基铵都是优良的相转移催化剂。在相转移催化反应中，四级铵盐可与水相中的亲核试剂组成离子对，进入有机相，从而加快反应速率，减少副反应并提高收率。

季铵盐一般可以用作：杀菌消毒剂、柔软抗静电剂、絮凝剂、破乳剂、减阻剂、增稠剂、阴离子增效剂等；聚季铵盐可用作絮凝剂和杀菌剂，能够有效的水中菌藻的繁殖和粘泥的产生，聚季铵盐也具有一定的去油、除臭和缓释的作用；聚季铵盐还可以用在纺织印染行业作为柔软剂、调理剂等；同时季铵盐类的产品具有绿色环保、易降解、不含APEO(烷基酚聚氧乙烯醚)、甲醛等危害自然环境和人类健康的物质的特性。季铵盐是未来洗化行业表面活性剂的发展方向，所以开发季铵盐类的各种精细化工产品具有较大的市场潜力和竞争力。

纳米技术是新兴的交叉和边缘学科，已发展成为21世纪最重要的技术之一，将纳米技术应用于农药，必将对农药的研究和开发产生积极的影响。纳米银是一种典型的金属纳米材料，具有较大的比表面积，粒子尺寸较小，其表面原子所占的百分比增加，表面原子数就增多，周围缺少相邻原子，则存在许多不饱和键，表面具有高表面能的不稳定原子。这种结构给各种反应提供了很多的接触吸附位点和反应作用点，通过化学键很容易与外来原子相结合，它们吸附病毒的能力大大提高，与病毒之间相互产生的化学反应能力也快速增强。而且纳米银作为一种新型的抗菌剂，具有强大的抑菌，杀菌作用及广谱的抗菌活性，具有传统无机抗菌剂无法比拟的抗菌效果，无耐药性，安全性高，并且纳米银还具有一定的抗病毒作用，在防治流感、乙肝、艾滋病等方面取得了一定进展。近年来，国内也开始了将纳米银用于抗植物病害的研究，对烟草花叶病毒的研究刚刚开始起步。随着纳米材料和纳米技术获得快速发展，“纳米农药”为新型农药的研究提供新思路和新手段，有望克服传统农药工艺无法解决的难题，如合成工艺复杂、成本高、三废排放严重等，成为发展新型绿色高效农药的契机。

银纳米材料的制备方法很多，物理方法是将原料通过机械粉碎、超声波粉碎、电弧放电等离子体等来制备纳米银粒子的方法。如：Xu等人在-196℃的低温下对银粉进行高能机械球磨，得到了平均粒径约为20nm的银颗粒粉末；Chang等人在NaCl溶液中用激光烧蚀溅射银片，使其破裂，同时不断搅拌防止烧蚀形成的纳米银颗粒团聚，可以制备平均粒径26nm的银颗粒。虽然各种物理方法原理简单，但由于仪器设备的要求高，生产费用昂贵，使其使用受到限制。

化学方法则是制备纳米银材料常用的方法，其中化学还原法是实验室和工业上最常用的方法。用还原剂将银从它的化合物或盐中还原出来，采用的银盐主要是AgNO₃或其配合物，还原剂主要有硼氢化钠、水合肼、甲醛、多元醇、抗坏血酸以及比Ag活泼的金属等，常加入分散剂或保护剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、山梨醇、聚乙烯醇等控制生成物的粒径及形状。目前绿色合成是化学的发展潮流，所以寻求绿色无污染的高分子保护剂是科学工作者所努力的方向。张晟卯等依据离子液体的环境友好的特性，在室温离子液体中合成银纳米微粒，实验中离子液体不仅作为溶剂而且作为修饰剂阻止银纳米微粒的团聚。还有很多制备纳米材料的方法，都可以用来制备银纳米材料；如光化学合成法，Zhou等利用紫外光辐射AgNO₃，在聚乙烯醇的保护下制备出银纳米棒和树枝状纳米晶体；Yin等利用微波合成法，在柠檬酸三钠存在的状态下用甲醛作为还原剂可以制出各粒径分布较窄的纳米银粉。

经过生物降解的低分子量壳寡糖具有广谱的抑菌、抗病毒作用。壳寡糖生物农药对粮食作物、经济作物、蔬菜、水果、花卉等具有提高免疫力、增强抗病虫性、调节生长发育、改善品质、增产增收等功能。氨基寡糖素生物农药已在生产上大量应用，但与其他化学合成农药相比，其活性仍然偏低，因此拟通过对壳寡糖进行分子修饰，引入可能大幅度提高其活性的季铵离子骨架，使壳寡糖衍生物产生不仅抗真菌、抗病毒，而且抗细菌性病害。季铵盐类物质是一种高效、低毒的新型杀菌剂，但由于结构中卤离子的存在，利用壳寡糖季铵盐来制备纳米银理论上并不容易，文献报道很少。

发明内容

本发明的目的就在于为解决现有技术的不足而提供一种壳寡糖季铵盐衍生物及利用壳寡糖季铵盐衍生物制备纳米银的方法。

本发明的目的是以下述技术方案实现的：

一种壳寡糖季铵盐衍生物，所述壳寡糖季铵盐衍生物是如下式的化合物；其中R为CH₃(CH₂)_m，1≦m≦17，X为Cl、Br、I的一种，6≦n≦20。

一种合成上述壳寡糖季铵盐衍生物的方法，通过对羟基苯甲醛与甲醛通过Mannich反应生成叔胺，叔胺与卤代烷生成季铵盐，季铵盐的醛基与壳寡糖上的氨基通过缩合获得壳寡糖季铵盐衍生物。

进一步，它包括以下步骤：

a合成叔胺：取二甲胺水溶液、甲醛溶液与乙醇溶液混合，于40℃~70℃反应30min~120min，然后加入对羟基苯甲醛继续反应5h~15h；反应终止后经提纯、结晶，得到3-二甲氨甲基-4-羟基苯甲醛；二甲胺、甲醛与对羟基苯甲醛的摩尔比为1.0:(1~1.5):(0.18~1.0)；

b合成季铵盐：取叔胺加乙腈溶解，再加入卤代烷RX，于70℃~100℃加热回流6~20h；反应终止后，提纯、干燥得季铵盐；叔胺与卤代烷的摩尔比为(3-5):(5-7)；加入乙腈的摩尔量为叔胺的20-30倍；所述烷基化剂RX中R为CH₃(CH₂)_m，1≦m≦17，X为Cl、Br、I的一种；

c取季铵盐加甲醇溶解，再加冰乙酸，最后加入壳寡糖，季铵盐与壳寡糖单元的摩尔比为(0.8~1.5):(0.8~1.5)；添加甲醇与冰乙酸的体积比为(15-60):(2-10)，甲醇加入摩尔量为季铵盐的100-500倍；于65~70℃加热回流10h~12h；反应停止后，过滤，提纯，在低于50℃下减压干燥得壳寡糖季铵盐衍生物。

所述步骤a中二甲胺水溶液质量分数为39%~45%、甲醛溶液质量分数为36%~40%、乙醇溶液质量分数为50%~100%，其体积比为(10-15):(5-10):(15-100)。

所述步骤a中提取为用乙酸乙酯萃取，提纯为用石油醚重结晶。

所述步骤b中提纯为用乙酸乙酯萃取提纯。

所述步骤C中提纯为用无水乙醇索氏提取15h~25h，过滤得壳寡糖季铵盐衍生物。

一种利用上述壳寡糖季铵盐衍生物制备纳米银的方法，它是通过壳寡糖季铵盐衍生物溶液与Ag(NH₃)₂ ⁺溶液反应生成纳米银。

进一步，它包括以下步骤：壳寡糖季铵盐衍生物溶液与Ag(NH₃)₂ ⁺溶液混合，混合溶液中壳寡糖季铵盐衍生物单元与Ag(NH₃)₂ ⁺摩尔比为：（15~50）：（1~5），于20℃~80℃条件下反应30min~120min获得纳米银。

所述壳寡糖季铵盐衍生物溶液浓度为0.001mol/L~0.010mol/L，壳寡糖季铵盐衍生物溶液摩尔浓度以壳寡糖季铵盐衍生物基本单元计；所述Ag(NH₃)₂ ⁺溶液浓度为0.002mol/L~0.01mol/L。

一般情况下带有卤离子的季铵盐与Ag离子混合易产生沉淀，从而使用季铵盐制备纳米银很难完成，而本发明制备得壳寡糖季铵盐衍生物具有抗菌活性部分壳寡糖、抗菌活性部分季铵盐结构、兼有抗菌和强还原性基团酚羟基以及醛基；以此壳寡糖季铵盐衍生物还原银铵溶液可顺利制备纳米银，并使合成的壳寡糖季铵盐纳米银获得高效、抗菌、抗植物病毒等活性，且抗TMV活性比壳寡糖及壳寡糖季铵盐活性更强。

附图说明

图1是本实施例2制备的季铵盐红外光谱图；

图2是本实施例2制备的季铵盐UV-Vis吸收光谱图；

图3是壳寡糖、季铵盐及壳寡糖季铵盐衍生物的红外光谱对照图；

图4是壳寡糖、季铵盐及壳寡糖季铵盐衍生物的红外光谱对照图；

图5是不同的席夫碱溶液制备的纳米银UV-Vis吸收光谱图；

图6是不同量的银氨溶液制备的纳米银UV-Vis吸收光谱图；

图7是不同浓度的席夫碱溶液制备的纳米银UV-Vis吸收光谱图；

图8是不同反应时间制备的纳米银UV-Vis吸收光谱图；

图9是C₄席夫碱溶液作还原剂制备纳米银的扫描电镜图；

图10是C₆席夫碱溶液作还原剂制备纳米银的扫描电镜图；

图11是不同供试样品下叶绿素随接种时间的含量变化图；

图12是不同供试样品下SOD随接种时间的活性变化图；

图13是不同供试样品下CAT随接种时间的活性变化图；

图14是不同供试样品下POD随接种时间的活性变化图；

图15是不同供试样品下PAL随接种时间的活性变化图；

图16是不同供试样品下脯氨酸随接种时间的活性变化图。

具体实施方式

实施例1

本发明提供的壳寡糖季铵盐衍生物是如下式的化合物；其中R为R为CH₃(CH₂)_m，1≦m≦17，X为Cl、Br、I的一种;6≦n≦20。

其制备方法及利用它制备纳米银的方法包括以下步骤：

(1)合成叔胺：取二甲胺水溶液、甲醛溶液与乙醇溶液混合，于40℃~70℃反应30min~120min，然后加入对羟基苯甲醛继续反应5~15h；反应终止后经乙酸乙酯萃取、石油醚提纯，得到3-二甲氨甲基-4-羟基苯甲醛；二甲胺、甲醛与对羟基苯甲醛的摩尔比为1.0:(1~1.5):(0.18~1.0)；所述二甲胺水溶液质量分数为39%~45%、甲醛溶液质量分数为36%~40%、乙醇溶液质量分数为50%~100%，其体积比为(10~15):(5~10):(15~100)。其反应式为：

(2)合成季铵盐：取叔胺加乙腈溶解，再加入卤代烷RX，在氮气氛围下，于70℃~100℃加热回流6h~20h；反应终止后，乙酸乙酯萃取提纯、干燥得季铵盐；叔胺与卤代烷的摩尔比为(3-5):(5-7)；加入乙腈的摩尔量为叔胺的20-30倍；所述卤代物RX中R为CH₃(CH₂)_m，1≦m≦17，X为Cl、Br、I的一种；其反应式为：

(3)合成壳寡糖季铵盐衍生物：取季铵盐加甲醇溶解，再加冰乙酸，最后加入壳寡糖，季铵盐与壳寡糖单元的摩尔比为(0.8~1.5):(0.8~1.5)；添加甲醇与冰乙酸的体积比为(15~60):(2~10)，甲醇加入摩尔量为季铵盐的100~500倍；于65℃~70℃加热回流10h~12h；反应停止后，过滤，用无水乙醇索氏提取15h~25h，过滤，在低于50℃下减压干燥得壳寡糖季铵盐衍生物；其反应式为：

(4)合成纳米银：取浓度为0.001~0.010mol/L壳寡糖季铵盐衍生物溶液与浓度为0.002~0.01mol/L的Ag(NH₃)₂ ⁺溶液混合，混合溶液中壳寡糖季铵盐衍生物单元与Ag(NH₃)₂ ⁺摩尔比为：(15~50):(1~5)，于20℃~80℃条件下反应30min~120min获得纳米银；所述Ag(NH₃)₂ ⁺溶液是通过硝酸银溶液、氢氧化钠溶液与氨水溶液反应制备获得。

本文中壳寡糖及壳寡糖季铵盐摩尔量、摩尔浓度及质量体积均以其基本单元计算。

实施例2

本实施例中壳寡糖季铵盐衍生物、它的制备方法及利用它制备纳米银的方法如下所述：

(1)叔胺的合成：

取40%的二甲胺水溶液12.8mL(0.10mol)，37%的甲醛溶液7.8mL(0.12mol)，无水乙醇15mL于100mL圆底烧瓶中放于60℃水浴中搅拌反应30min，然后加入2.44g(0.02mol)对羟基苯甲醛反应，利用高效液相色谱仪进行反应跟踪，反应12h后液相显示新物质可以占到95%。停止反应后于60℃减压旋蒸，至不再蒸出液体，用150mL乙酸乙酯萃取3~4次至乙酸乙酯层澄清，加无水硫酸钠干燥，然后于旋蒸仪中旋蒸乙酸乙酯至无旋蒸液滴下停止旋蒸，此时剩余液体为黄褐色油状物；加入石油醚有黄色固体析出，过滤得到叔胺粗品。用石油醚重结晶，并加入活性炭脱色，热过滤所得到的滤液冷却得到白色固体。用石油醚洗涤晶体，干燥，称重，产量为2.53g，产率为70.7%，熔点为78~80℃。

（2）季铵盐的合成

取步骤(1)中制得的叔胺0.723g(0.004mol)，于100mL三颈瓶中，加5mL乙腈溶解，再加0.006mol的CH₃CH₂Br，连接上氮气保护装置，磁力搅拌80℃下加热回流5h~8h，回流管上加干燥管。停止反应后，在反应瓶中加大量乙酸乙酯，出现白色固体粉末，减压抽滤，用乙酸乙酯洗涤2~3次，放在真空干燥箱中干燥，称重得固体质量1.13g，产率为98%。

（3）壳寡糖季铵盐衍生物的合成

先加步骤(2)中制得的季铵盐于0.003mol于100mL三颈瓶中，用15mL甲醇溶解，再加2mL冰乙酸，最后加0.483g(0.003mol，以壳寡糖基本单元计)的壳寡糖，加上冷凝装置，回流管上加干燥管，同时连接氮气保护装置。在磁力搅拌下加热回流10h。反应停止后，减压抽滤，所得固体用无水乙醇索氏提取20h，减压抽滤得土黄色固体粉末，即为壳寡糖季铵盐衍生物，所得质量为0.3790g，产率为29.4%。所用壳寡糖相对分子量为1000~3200，脱乙酰度≥90%。

（4）纳米银的合成

取单元浓度为1mg/mL（单元摩尔浓度为0.0023mol/L）步骤(3)中制得的壳寡糖季铵盐衍生物溶液15mL与0.5mL浓度为0.0042mol/L的Ag(NH₃)₂ ⁺溶液混合，于60℃条件下反应30min获得纳米银；所述Ag(NH₃)₂ ⁺溶液是通过硝酸银溶液、氢氧化钠溶液与氨水溶液按常规方法制备获得。

实施例3-16中壳寡糖季铵盐及各步骤工艺参数见表1-2，其他同实施例2。

表1实施例3-9中壳寡糖季铵盐及各步骤工艺参数

表2实施例10-16中壳寡糖季铵盐及各步骤工艺参数

试验例

1、结构表征

(1)季铵盐结构表征

取本发明实施例2获得的季铵盐约2mg，干燥的KBr约200mg，置于玛瑙研钵中，混合均匀，研成粉末。取适量混合物转移至压片模具中，加压成透明或半透明薄片，置于红外分光光度计中检测，测试范围4000~400cm^-1。图1是本发明实施例2获得的季铵盐红外光谱图，图中:3424cm^-1为OH伸缩振动吸收峰，3189cm^-1为芳环H的特征吸收峰，1658cm^-1为C=O伸缩振动峰，1600cm^-1、1544cm^-1、1509cm^-1为芳环的骨架振动峰，1452cm^-1为CH₃的不对称弯曲振动峰，1400cm^-1为C-N的伸缩振动峰。图2是本发明实施例2获得的季铵盐紫外光谱图，其中:328nm有紫外吸收，可能为醛基受苯环π--π*跃迁影响发生红移，202nm，239nm有紫外吸收可能是苯环受醛基n—π*跃迁影响发生红移，而壳寡糖仅在265nm处显示未脱乙酰基的π-π*跃迁吸收。

（2）壳寡糖季铵盐衍生物结构表征

图3是壳寡糖、季铵盐及壳寡糖季铵盐衍生物的红外光谱对照图，其中季铵盐、壳寡糖季铵盐为本发明实施例2制得。分析:将衍生物与季铵盐和壳寡糖两种原料作比较，可发现在衍生物中在1639cm^-1出现C=N双键的特征吸收峰，在1608cm^-1、1457cm^-1出现苯环特征骨架振动峰，而壳寡糖1622处的N-H弯曲振动峰消失，则可以说明季铵盐通过C=N双键连接到壳寡糖上。图4是壳寡糖、季铵盐及壳寡糖季铵盐衍生物的紫外光谱对照图，其中季铵盐、壳寡糖季铵盐为本发明实施例2制得。分析:将衍生物与壳寡糖、季铵盐两种原料比较:壳寡糖在265nm处有吸收，而衍生物在此处吸收减弱，壳寡糖部分结构以发生变化；与季铵盐相比，壳寡糖的C₂-季铵盐衍生物在194nm、328nm和378nm处有明显的取代苯环特征吸收。结构中引入苯环，较之原料季铵盐明显红移且强度降低。紫外光谱和红外光谱证明壳寡糖季铵盐衍生物的生成。

（3）纳米银结构表征

①不同种类壳寡糖季铵盐衍生物对生成纳米银的影响

取X为Br、R分别为CH₃CH₂、CH₃(CH₂)₂CH₂、CH₃(CH₂)₄CH₂、CH₃(CH₂)₈CH₂的席夫碱(即壳寡糖季铵盐衍生物)溶液15mL，浓度均为1mg/mL，浓度0.0042mol/LAg(NH₃)₂ ⁺溶液0.5mL混合，50℃反应，经紫外扫描跟踪，考察不同种类希夫碱生成纳米银的情况；席夫碱制备步骤同实施例2。四种溶液反应30min后都得到红棕色透明的溶液，随着R中C原子的数目增加，颜色逐渐加深。其吸收曲线显示在410~425nm范围有吸收，说明四种壳寡糖季铵盐希夫碱均能还原银铵溶液生成银纳米粒子，如图5所示。图中:四种纳米银溶液稀释10倍后紫外扫描显示，其吸收曲线显示在425nm处有最大紫外吸收，说明四种壳寡糖季铵盐均可以还原银氨溶液生成银纳米溶液，壳寡糖季铵盐不仅作为银纳米的还原剂，也是银纳米粒子的稳定剂。

②不同加入量Ag(NH ₃ ) ₂ ⁺ 溶液对生成纳米银的影响

以X为Br、R为CH₃(CH₂)₂CH₂的席夫碱为例，取15mL浓度为1mg/mL的席夫碱溶液，分别加入0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL的Ag(NH₃)₂ ⁺溶液，其浓度0.0042mol/L，于80℃下反应，考察不同量的Ag(NH₃)₂ ⁺溶液对生成纳米银的影响，席夫碱制备步骤同实施例2。溶液反应30min后均生成红棕色的溶液，其颜色随着Ag(NH₃)₂ ⁺溶液的加入量的增加而加深，经紫外扫描跟踪，其吸收曲线显示在410~425nm范围有吸收，说明有银纳米粒子生成，图6为纳米银溶液稀释10倍后扫描的紫外可见吸收光谱，如图所示，其吸收曲线在425nm处有最大紫外吸收，说明有银纳米粒子生成，当加入的Ag(NH₃)₂ ⁺溶液的量在0.1~2.5mL范围内时，随着加入Ag(NH₃)₂ ⁺溶液的量的增加，吸光度逐渐增大，当加入Ag(NH₃)₂ ⁺溶液的量超过3mL时，会导致纳米银团聚，溶液中有沉淀生成。

③不同浓度的希夫碱对生成纳米银的影响

以X为Br、R为CH₃(CH₂)₂CH₂的席夫碱为例，分别配制15mL浓度为1、2、3、4mg/mL的席夫碱溶液，席夫碱制备步骤同实施例2，加入0.5mL的Ag(NH₃)₂ ⁺溶液，其浓度0.0042mol/L，于80℃下反应，溶液在反应30min后变为红棕色，随着席夫碱溶液浓度的升高，其红棕色颜色逐渐减弱，图7为稀释10倍后纳米银扫描的紫外可见吸收光谱，其吸收曲线显示410~425nm处有紫外吸收，说明有银纳米粒子生成。当C₄季铵盐希夫碱溶液浓度在1~3mg/mL范围内时，随着席夫碱浓度的增大，吸光度逐渐降低，当C₄季铵盐席夫碱溶液浓度超过4mg/mL(包括4mg/mL)时，加入Ag(NH₃)₂ ⁺溶液会立即产生沉淀。

④不同反应时间对生成纳米银的影响

以X为Br、R为CH₃(CH₂)₄CH₂的席夫碱为例，席夫碱制备步骤同实施例2。配制4份15mL浓度为1mg/mL的席夫碱溶液，分别加入0.5mL的Ag(NH₃)₂ ⁺溶液，其浓度0.0042mol/L，于60℃下反应，反应时间分别为30、60、90、120min，反应结束后溶液颜色均为红棕色，随着反应时间的延长，颜色逐渐加深，图8为稀释10倍后纳米银溶液的紫外可见吸收光谱图，其吸收曲线在410~425nm范围有吸收，说明有银纳米粒子生成，随着加热时间的延长，吸光度逐渐增大。

⑤壳寡糖季铵盐衍生物制备纳米银的透射电子显微镜(TEM)

以X为Br、R为CH₃(CH₂)₆CH₂的席夫碱为例，席夫碱制备步骤同实施例2。取15mL浓度为1mg/mL的席夫碱溶液，加入0.2mLAg(NH₃)₂ ⁺溶液(其中[Ag(NH₃)₂ ⁺]=0.0042mol/L)，在60℃下反应30min，所制备的纳米银溶液透射电子显微镜(TEM)如图9。

以X为Br、R为CH₃(CH₂)₄CH₂的席夫碱为例，席夫碱制备步骤同实施例2。取15mL浓度为1mg/mL的席夫碱溶液，加入0.2mLAg(NH₃)₂ ⁺溶液(其中[Ag(NH₃)₂ ⁺]=0.0042mol/L)，在50℃下反应30min，所制备的纳米银溶液透射电子显微镜(TEM)如图10。

实验采用FEITECNALG2型透射电子显微镜(荷兰FEI公司)对纳米银溶液的形貌进行表征，加速电压为200KV。测试前取几滴稀释后的纳米银溶液滴加于覆有碳膜的铜网网格上，然后将铜网置于室温下的真空环境中干燥30min，待溶剂挥发后用透射电镜观察纳米银粒子的形貌。

图9和图10透射电镜照片显示，所制备的纳米银溶液粒径大小在10nm左右，呈一定分布。在纳米范围内分布的纳米银溶液，只要不发生团聚，对应就有显著的紫外可见吸收。由于所用还原剂的不同，得到的纳米银粒子呈现不同的分布。

2、壳寡糖季铵盐纳米银溶液抗烟草花叶病毒活性试验

采用枯斑寄主半叶法对供试药剂进行筛选。采用常规汁液摩擦接种法。(1)选取长势一致、4~5片真叶的盆栽珊西烟喷药24h后半叶接种TMV，以半叶法喷清水24h后接种TMV为对照，每个处理重复3次，观察发病情况，计算枯斑抑制率。(2)选取长势一致、4~5片真叶的盆栽珊西烟采用常规汁液摩擦接种法接种12h后喷药，以接种后喷洒清水为对照，每个处理重复3次，观察发病情况，计算枯斑抑制率。供试药剂、预防效果及治疗效果如表3所示。

抑制率=(清水处理枯斑数-喷药处理枯斑数)/清水处理枯斑数

表3供试药剂在珊西烟上对TMV的抑制效果

表1中壳寡糖C₄季铵盐席夫碱X为Br，C₄指R为CH₃(CH₂)₄CH₂，壳寡糖C₄季铵盐纳米银为壳寡糖C₄季铵盐席夫碱制备获得，制备步骤同实施例2。如表1所示，从预防效果来看，在1mg/mL基础上稀释60倍的壳寡糖C₄季铵盐纳米银溶液的枯斑抑制率高达86.95%，比市售药剂宁南霉素高出24.09%；壳寡糖C₄季铵盐纳米银溶液1mg/mL预防效果最差，枯斑抑制率为61.03%；其余药剂预防效果依次为:稀释20倍的壳寡糖C₄季铵盐纳米银溶液＞宁南霉素稀释260倍＞稀释100倍的壳寡糖C₄季铵盐纳米银溶液＞壳寡糖C₄季铵盐纳米银1mg/mL＞壳寡糖＞壳寡糖C₄季铵盐500μg/mL。从治疗效果来看，稀释100倍的壳寡糖C₄季铵盐纳米银治疗效果最好，为44.23%，其次为稀释60倍的壳寡糖C₄季铵盐纳米银，最差的依然是壳寡糖C₄季铵盐纳米银1mg/mL，但是从表1中可以看出，不同浓度的壳寡糖C₄季铵盐纳米银溶液均比宁南霉素治疗效果好。

选用长势一致，7~8片真叶的盆栽K326进行药效试验。在喷施药剂24h后，采用常规汁液摩擦接种法接种TMV，试验设有：处理1(喷施清水后接种TMV，CK0)，处理2(喷施稀释260倍的宁南霉素后接种TMV，CK1)，处理3(喷施在1mg/mL的基础上稀释60倍的C₄席夫碱季铵盐纳米银溶液后接种TMV，T1)，处理4(喷施1mg/mL壳寡糖后接种TMV，T2)，处理5(喷施1mg/mL壳寡糖席夫碱后接种TMV，T3)。壳寡糖C4季铵盐席夫碱X为Br，C₄指R为CH₃(CH₂)₄CH₂，壳寡糖C₄季铵盐纳米银为壳寡糖C₄季铵盐席夫碱制备获得，制备步骤同实施例2。接种后1d、4d、7d、10d、13d和16d分别取样装入锡箔纸，做好标记，置于-80℃冰箱中保存。检测叶绿素、超氧物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性，得到叶绿素含量及相关酶活性的动态活变化图。烟草花叶病毒的提纯采用Gooding＆Hebert方法。超氧物歧化酶(SOD)参照李合生(2000)的方法；过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)参照王小青(2006)的方法，脯氨酸参照邹琦（1995）的方法，采用Excel2003进行数据分析。

叶绿素主要包括叶绿素a和叶绿素b，出药剂处理下烟叶中叶绿素总含量的动态变化结果如图11所示。CK0处理下，叶绿素含量变化为前期含量变化不大，在第10天含量略有增加，之后含量骤降。在后期趋于平缓的降低。CK1处理下，叶绿素含量在第4天有一个明显的升高，之后含量缓慢下降，呈现出单峰曲线动态变化。T1和T2处理下，叶绿素含量变化趋势较为一致，即在喷施药剂初期到第4d有个较小的降低趋势，但到第7d又有一个较为明显的升高趋势，之后含量几乎逐渐趋于降低，呈现出单峰单谷的一个动态走势。T3处理下，叶绿素含量在前期稍有升高，后期逐渐下降，最高含量出现在第4d。T1和T3处理下，叶绿素的整体升降趋势缓和。

不同药剂处理后叶片中SOD、CAT、POD、PAL防御酶的含量变化，分别如图12、图13、图14及图15所示。结果表明，接种后CK0处理，四种防御酶活性变化规律不一致，随着喷施周期的推移，SOD与POD呈现出先升高后降低的单峰变化，但是最高活性出现的时间点不一致，SOD出现在第7d，POD则出现在第10d；CAT呈现出逐渐降低趋势，但在第4d到第7d这一段时间内，活性变化不太明显；而PAL则呈现出降低-上升-下降的规律，且中间的上升出现在第10d。CK1处理下，四种防御酶变化更为复杂，其中SOD呈现升高-降低-略升高的趋势；CAT呈现出降低-升高-降低的趋势，且在第10d升高到最高点；POD表现为先升高后下降的趋势，喷施药剂第4d到第7d时间段，升高最多，但是在第10d活性达到最高值；PAL前期略升高，之后下降，再略升高后下降。SOD活性变化在T1、T2和T3处理下一样，即均呈现先升高后降低的趋势且最高活性值均出现在第7d，而T1处理整体上变化较平缓。POD活性变化在T1、T2和T3处理下也较为一样，整体上也呈现出先升高后降低的趋势，但是T1处理下，后期活性略有升高且最高活性在第10d；T2和T3处理下，活性最高分别出现在第13d和第10d。CAT活性在T1处理下先升高后降低，最高活性值出现在第10d；T2处理下呈现降低-升高-降低趋势；T3处理下则与T2处理相反。PAL活性在T1和T3处理下表现一致，均呈现出降低-升高-降低的趋势且T1处理的降低趋势较缓和，降幅较小；但在T2处理下则呈现相反趋势，且在后期又有一个降低趋势。

Claims (10)

1.一种壳寡糖季铵盐衍生物，其特征在于：所述壳寡糖季铵盐衍生物是如下式的化合物；其中R为CH₃(CH₂)_m，1≦m≦17，X为Cl、Br、I的一种，6≦n≦20。

2.一种合成如权利要求1所述壳寡糖季铵盐衍生物的方法，其特征在于：通过对羟基苯甲醛与甲醛通过Mannich反应生成叔胺，叔胺与卤代烷生成季铵盐，季铵盐的醛基与壳寡糖上的氨基通过缩合获得壳寡糖季铵盐衍生物。

3.如权利要求2所述的合成壳寡糖季铵盐衍生物的方法，其特征在于它包括以下步骤：

a合成叔胺：取二甲胺水溶液、甲醛溶液与乙醇溶液混合，于40℃~70℃反应30min~120min，然后加入对羟基苯甲醛继续反应5h~15h；反应终止后经提纯、结晶，得到3-二甲氨甲基-4-羟基苯甲醛；二甲胺、甲醛与对羟基苯甲醛的摩尔比为1.0:(1~1.5):(0.18~1.0)；

b合成季铵盐：取叔胺加乙腈溶解，再加入卤代烷RX，于70℃~100℃加热回流6~20h；反应终止后，提纯、干燥得季铵盐；叔胺与卤代烷的摩尔比为(3-5):(5-7)；加入乙腈的摩尔量为叔胺的20-30倍；所述烷基化剂RX中R为CH₃(CH₂)_m，1≦m≦17，X为Cl、Br、I的一种；

c取季铵盐加甲醇溶解，再加冰乙酸，最后加入壳寡糖，季铵盐与壳寡糖单元的摩尔比为(0.8~1.5):(0.8~1.5)；添加甲醇与冰乙酸的体积比为(15-60):(2-10)，甲醇加入摩尔量为季铵盐的100-500倍；于65~70℃加热回流10h~12h；反应停止后，过滤，提纯，在低于50℃下减压干燥得壳寡糖季铵盐衍生物。

4.如权利要求3所述的合成壳寡糖季铵盐衍生物的方法，其特征在于：所述步骤a中二甲胺水溶液质量分数为39%~45%、甲醛溶液质量分数为36%~40%、乙醇溶液质量分数为50%~100%，其体积比为(10-15):(5-10):(15-100)。

5.如权利要求3所述的合成壳寡糖季铵盐衍生物的方法，其特征在于：所述步骤a中提取为用乙酸乙酯萃取，提纯为用石油醚重结晶。

6.如权利要求3所述的合成壳寡糖季铵盐衍生物的方法，其特征在于：所述步骤b中提纯为用乙酸乙酯萃取提纯。

7.如权利要求3所述的合成壳寡糖季铵盐衍生物的方法，其特征在于：所述步骤C中提纯为用无水乙醇索氏提取15h~25h，过滤得壳寡糖季铵盐衍生物。

8.一种利用如权利要求1所述壳寡糖季铵盐衍生物制备纳米银的方法，其特征在于它是通过壳寡糖季铵盐衍生物溶液与Ag(NH₃)₂ ⁺溶液反应生成纳米银。

9.如权利要求8所述的利用壳寡糖季铵盐衍生物制备纳米银的方法，其特征在于它包括以下步骤：壳寡糖季铵盐衍生物溶液与Ag(NH₃)₂ ⁺溶液混合，混合溶液中壳寡糖季铵盐衍生物单元与Ag(NH₃)₂ ⁺摩尔比为：（15~50）：（1~5），于20℃~80℃条件下反应30min~120min获得纳米银。

10.如权利要求9所述的利用壳寡糖季铵盐衍生物制备纳米银的方法，其特征在于所述壳寡糖季铵盐衍生物溶液浓度为0.001mol/L~0.010mol/L，壳寡糖季铵盐衍生物溶液摩尔浓度以壳寡糖季铵盐衍生物基本单元计；所述Ag(NH₃)₂ ⁺溶液浓度为0.002mol/L~0.01mol/L。