CN106046129A

CN106046129A - 一种控制水稻株高或叶片直立性发育的基因及其应用

Info

Publication number: CN106046129A
Application number: CN201610506115.7A
Authority: CN
Inventors: 王学路; 孙世勇; 乔胜龙
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2016-07-01
Filing date: 2016-07-01
Publication date: 2016-10-26
Anticipated expiration: 2036-07-01
Also published as: CN106046129B

Abstract

本发明公开了一种控制水稻株高或叶片直立性发育的基因及其应用，本发明的公开的基因RLA1在水稻油菜素甾醇的信号转导途径中起重要作用，其CDS序列为SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。利用RNA干扰技术特异性的将野生型日本晴的RLA1基因敲除掉，所获得的转基因系均表现为茎叶夹角比野生型要小，株高变矮，因此通过基因工程技术提高或减弱RLA1基因的表达量能够控制植物株型发育，从而改善植物株高和种植密度。

Description

一种控制水稻株高或叶片直立性发育的基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种控制水稻植株高矮及叶片直立性发育的基因，采用正向遗传学的方法，一个直立矮化的突变体出发，构建分离群体进行图位克隆获得相关基因RLA1(Os05g32270)，并且转基因验证发现过表达和RNA干扰RLA1均证明RLA1控制水稻株型或叶片直立性发育。本发明还涉及含有该基因或其同源基因的载体和涉及利用该基因或其功能类似物调控植物株高和叶片直立性在农业生产中的应用。

背景技术

作物的株型发育是高产育种的关键性状。植株的高矮和叶片直立性(茎叶夹角的大小)是株型发育的重要性状，较矮的株型抗倒伏，合适的茎叶夹角能使我们通过提高作物的田间种植密度，进而促进光能利用率，增加作物产量(Sakamoto et al.,2006；Sinclairet al.,1999)。因此，发现和利用影响植株高矮及叶片直立性(茎叶夹角大小)的关键基因的最终目是改进水稻株型，促进分子设计育种，提高水稻单位面积产量。

油菜素甾醇的合成和信号通路在调控单子叶植物植株的高矮和茎叶夹角发育中具有重要而独特的作用，但其下的细胞学和分子机制还不清楚。已报道的BR合成相关的突变体d2、dwarf4、,d11和brd2均表现为植株矮小，茎叶夹角变小，叶片直立(Li et al.,2013；Hong et al.,2003,2005；Tanabe et al.,2005)。BR信号通路中的正调控因子的缺失突变体也表现为茎叶夹角变小，叶片直立。如突变体d61，dlt,d1和tud1(Yamamuro et al.,2000；Tong et al.,2012；Oki et al.，2009；Hu et al.,2013)。利用同源克隆的方法得到的OsBAK1、OsGSK2的转基因植株的茎叶夹角大小也发生变化(Li et al.,2009；Tong etal.,2012)。利用RNA干扰技术抑制水稻BR信号通路下游的正调节因子OsBZR1基因的表达，也会促进叶片直立(Bai et al.,2007)。而BR信号通路的负调节因子LIC的功能获得型突变体lic-1也表现为茎叶夹角变小，叶片直立(Zhang et al.,2012)。而被OsBZR1调节的ILI1的功能获得型突变体ili1-D,由于BR信号被放大，则表现为叶夹角增大(Zhang et al.,2009)。另外，水稻OsBZR1的靶基因OsIBH1也直接参与了对水稻叶片直立性的调节(Zhanget al.,2009)；外施BR处理导致野生型和BR合成途径突变体的叶片倾角变大，而BR信号突变体如受体突变体d61的叶片倾角几乎不受外源BR的影响。

除了油菜素甾醇途径，其他信号途径也参与了茎叶夹角的调控。虽然BR相关途径基因在参与调控水稻叶片倾角变化方面具有显著作用，但是还存在其它独立途径参与此生物性状的调控。负调控赤霉素(GAs)信号的基因SPINDLY(SPY)的表达量下降后茎叶夹角增大(Shimada et al.,2006)。而生长素信号途径负调节因子Aux/IAA家族成员OsIAA1过表达植株茎叶片夹角变大(Song et al.,2009)。调控生长素体内平衡的编码生长素偶联氨基酸的合成酶基因LC1通过调节叶枕部位细胞伸长决定水稻叶夹角大小(Zhao et al.，2013)。水稻rice leaf inclination2(LC2)，一个VIN3-类似蛋白，突变后也能使茎叶夹角变大(Zhao et al.，2010)。MAPKKK家族C组成员的基因ILA1在叶枕的维管束中高表达，其基因T-DNA插入突变引起叶枕部位细胞壁主要成分纤维素和木聚糖含量下降，从而导致叶枕部位机械强度降低，叶夹角增大(Ning et al.，2011)。水稻中Loose Plant Architecture1(LPA1)基因的突变体lpa1表现为株型松散，其分蘖角和茎叶夹角均增大(Wu et al.,2013)。

育种实践证明，水稻茎叶夹角与产量密切相关。利用BR相关途径的基因作为改良水稻株型的靶基因，在生产上具有广阔的应用前景。例如，Morinaka等(2006)利用共抑制的策略，通过导入水稻肌动蛋白启动子驱动的OsBRI1的胞内区(OsACTIN：：OsBRI1-KD)，部分抑制水稻内源OsBRI1的表达，从而在后代中分离出直叶型的转基因系；据估算它们通过密植可分别增产约35％和26％。Sakamoto等(2006)通过田间实验证实合理密植水稻BR合成途径OsDWARF4的突变体可增产达32％。通过对剑叶角度与主穗产量进行遗传剖析，应用244个珍汕97B/密阳46RIL群体，在1、3、5和11染色体上共检测到5个控制剑叶角度的QTL，其中在第1染色体RM24-RM294A区间同时检测到了控制剑叶角度(FLA)和结实率(SF)的QTL，且加性效应方向相反，表明剑叶角度与产量呈负相关，适当减小水稻剑叶夹角有利于结实率的提高，并最终提高产量(zhang et al.,2008)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种控制水稻植株高矮或叶片直立性发育的基因RLA1，该基因从水稻矮化直立突变体rla1中鉴定并分离克隆，该基因包含SEQ ID No.1所示的CDS序列，该基因编码SEQ.ID.No.2所示的氨基酸序列。

本发明的另一个目的是提供RLA1基因在控制水稻株高或叶片直立性中的应用，通过RNA干扰技术特异性的抑制RLA1基因的表达可减小茎叶夹角或株高，或同时减小水稻茎叶夹角和株高，从而改善水稻品种的株型和提高单位面积的种植密度。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种控制水稻叶片直立性发育的基因RLA1，以日本晴CDNA为模板，通过下述引物扩增得到：

RLA1-F：CGGGATCCATGCCGCCCTGCGCCGCC(加BamHI位点)

RLA1-R：GCTCTAGACTCTTGACCATGGAATGGATCAC(加XBaI位点)

最终获得包含有SEQ ID NO.1所述核苷酸的基因序列，该基因编码的蛋白质为SEQID NO.2所示。

本发明的保护内容还包括SEQ ID NO.2所示氨基酸序列对应的核苷酸序列，还包括SEQ ID NO.2所示序列经过改造修饰的具有相同功能的蛋白。

RLA1基因在控制水稻株高或叶片直立性中的应用，包括：RLA1基因在控制水稻株高中的应用，或RLA1基因在控制水稻叶片直立性中的应用，或RLA1基因在控制水稻株高和叶片直立性中的应用。

以上所述应用中，通过抑制RLA1基因的表达以实现对水稻叶片直立性或水稻株高的控制的应用过程包括：

将RLA1特异序列作为靶点构建RNA干扰片段并连到pTCK303上，转入日本晴中，所获得的转基因系均表现为茎叶夹角比野生型(日本晴)变小，因此可通过该方法减小茎叶夹角，以提高种植密度。RNA干扰针对的片段为RLA1的CDS的第845-1044碱基。此段在水稻中无同源序列。引物如下：

正序Ri-RLA1-1F GGGGTACCTGCAAAGAGCTCCATAC(加KPnI位点)

Ri-RLA1-1RCCCTCGAGCTCTTGACCATGGAATG(加XHOI位点)

反序Ri-RLA1-1FCGGGATCCCTCTTGACCATGGAATG(加BamHI位点)

Ri-RLA1-1RGCTCTAGATGCAAAGAGCTCCATAC(加XBaI位点)

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、RLA1是一个改变株高和茎叶夹角大小的有效基因，它可以通过调控油菜素甾醇信号，进而改变作物的株高和茎叶夹角大小。

2、目前，水稻中油菜素甾醇信号转导通路并不完善，该基因的发现进一步完善了此通路的作用机制。

附图说明

图1为RNA干扰RLA1转基因植株的表型。

图2为RealtimeqRT-PCT验证RNA干扰转基因植株RLA1的表达量。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或生物材料，如未特别说明，均已公开。

实施例1：

一种控制水稻叶片直立性发育的基因RLA1的获得：

发明人发现了一个矮化直立的突变体rla1，构建F2分离群体之后进行图位克隆得到相关基因RLA1，通过反向遗传学的方法，利用RNA干扰技术抑制RLA1的表达得到了矮化直立表型的转基因植株，利用real-time qRT-PCR验证了RLA1确实被抑制。

具体如下：

一种控制水稻植株高矮和叶片直立性发育的基因RLA1，利用下述方法得到：

发明人在突变体库里发现了一株矮化直立的突变体rla1。通过BR敏感性检测发现其确实对BR不敏感确定了它是一个BR相关的突变体。为了获得相关基因，首先我们把rla1与野生型日本晴进行回交，F1代显示野生型表型，F2代野生型与突变体表型比例3:1，说明这是一个单基因控制的隐性突变。进一步我们将突变体与另外一种籼稻9311杂交获得了F2代，取样突变体表型的进行图位克隆获得了导致突变的基因RLA1。我们将野生型的RLA1转化到突变体rla1中，突变体表型得到了回复，证明我们克隆到了相关基因。此基因的序列由以下方法获得：

反应体系的总体积为50μl，模板为日本晴CDNA 1ul(约50ng)、10×KOD酶反应缓冲液5μl、25mM MgCL₂ 2μl、5mM dNTP 5μl、5uM引物5μl(每条引物均为2.5μl)、1μl KOD酶，加ddH₂O(无菌去离子水)至50μl。

反应程序为：94℃变性5min，94℃30s、55℃1min、68℃1min 35cycles，68℃延伸10min。

所述引物为：

RLA1-F：CGGGATCCATGCCGCCCTGCGCCGCC(加BamHI位点)

RLA1-R：GCTCTAGACTCTTGACCATGGAATGGATCAC(加XBaI位点)

最终获得包含有SEQ ID NO.1所述的基因序列，该基因编码的蛋白质为SEQ IDNO.2所示。

实施例2：

RLA1基因在控制水稻植株高矮或叶片直立性中的应用，应用过程如下：

1)植物表达载体RNAi-RLA1的构建

将RLA1(845-1044bp)利用Kpn1/XHO1和BamHI/XbaI酶切位点克隆到RNAi载体pTCK303上，转入日本晴中。引物如下：

正序Ri-RLA1-1F：GGGGTACCTGCAAAGAGCTCCATAC(加KPnI位点)

Ri-RLA1-1R：CCCTCGAGCTCTTGACCATGGAATG(加XHOI位点)

反序Ri-RLA1-1F：CGGGATCCCTCTTGACCATGGAATG(加BamHI位点)

Ri-RLA1-1R：GCTCTAGATGCAAAGAGCTCCATAC(加XbaI位点)

2)水稻遗传转化

步骤1)中的水稻转化采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，具体如下：

①愈伤诱导。将水稻种子去壳，取饱满清亮的籽粒先用70％乙醇浸泡1min，无菌水冲洗1-2次；再用含2％活性氯的NaClO溶液(40ml含>5.2％活性氯的NaClO溶液加60ml水)，加1-3滴Tween 20，浸泡30min以上(一般40min，最长可至1h)。不时摇动，然后用无菌水冲洗4-5次。倒在灭菌的平板和滤纸上吸干，约1h左右。将之置入N6D固体培养基上(10粒/25ml/瓶)，种胚朝上或接触培养基，28℃，暗培养25～30d。N6D2培养基：N6盐分和维生素,0.5g/l酪蛋白水解物,30g/l蔗糖,2mg/l 2,4-D,2.5g/l Phytagel(Sigma),pH5.8。

②农杆菌的培养及其与水稻愈伤组织的共培养。取灭菌小勺刮取农杆菌，用勺背面将菌体贴在管壁轻轻拍散，OD600＝0.8～1.0。将前培养的愈伤在无菌滤纸上晾一下，然后集中至一个平皿一次性转入菌液中，轻轻转动离心管使菌液均匀分布，静置时间约15～20min。将菌液倒出，愈伤在无菌滤纸上放约1.5h,保证菌液吸干，接至1/2N6D AS中，20℃、暗培养2～3天，看到愈伤与培养基接触部分有菌膜，就可以除菌了。1/2N6D AS培养基：N6D2,10g/l葡萄糖,100～400μmol/l乙酰丁香酮(用时现加),pH5.2。

③农杆菌的去除。将共培养的愈伤装入50ml的离心管，用无菌水清洗3次以上，至液体比较清亮。倒出无菌水，N6D+Cn500mg/L(或AP500ml/L)，100rpm,15-20min,2-3次。将愈伤倒在无菌滤纸上吸干2h左右，视情况而定。将干燥的愈伤转入N6D-AS中，加头孢霉素Cn250mg/L，28℃，暗培养7～10d。

④愈伤组织的筛选。挑出没被农杆菌污染的愈伤，第一次加Cn250mg/L和Hn(50mg/L),15～20d。第二次同上，不加Cn，加潮霉素Hn，把所有的愈伤全部再转一次，15～20d。第三次选出新的愈伤，用Hn筛选，15～20d。次数部用一定按上述安排，但应保证愈伤在Hn上筛选的时间至少45d以上，第三次挑出的新长出的愈伤最好筛选20d。N6D筛选培养基：N6D+Cn250mg/L+Hn50mg/L,PH＝5.8～5.9。

⑤分化和生根。将第四次筛选的全部愈伤组织移入MS中，Hn 50mg/L，暗培养，预分化(PH5.9)12～15d。选出长势好的新鲜的愈伤，移入MS(PH 6.0)中，光培养15～20d，可看到有绿芽长出，一般15d换一次培养基。选长出1cm以上的绿芽，剥去周围多余的愈伤，剪去根(可留约0.5cm长)移入试管中，1/2MS生根培养。MS分化培养基：MS盐分和维生素,2g/l酪蛋白水解物,30g/l蔗糖,25g/L山梨醇，2mg/l 6-BA,0.5mg/l NAA,0.2mg/l玉米素(Zeatin),0.5mg/l KT,3.0g/l Phytagel,pH5.8,50mg/l潮霉素B,200mg/l头孢霉素；1/2MS生根培养基：1/2MS盐分,MS维生素,30g/l蔗糖,1mg/l多效唑，0.5mg/l NAA,50mg/l潮霉素,2.5g/lPhytagel,pH5.8。

3)移栽、表达量鉴定和表型分析。

将生根的转基因植株每个遗传构建30个系，移栽温室，取叶片进行realtime qRT-PCR表达量鉴定。RNAi-RLA1:F-CTCTTCCGTGGTCCTATC，R-GGTAACTGTCTTTCCTTCATC。

4)结果：

(1)将RLA1(845-1044bp)克隆到RNAi载体pTCK303上，在水稻日本晴中做RNAi(RNAinterference)实验，结果发现成功被RNAi的转基因水稻的茎叶夹角均比野生型(日本晴)小，(图1)，被RNAi的转基因水稻的株高也比野生型小(图1)，并做了表达量鉴定(图2)。

图1中WT为日本晴野生型，RLA1-Ri-1和RLA1-Ri-1为成功被RNAi的转基因水稻，从图1和图2中可以看出，抑制RLA1的表达可以减小水稻茎叶夹角，或减小水稻株高，或同时减小水稻茎叶夹角和株高。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种控制水稻株高或叶片直立性发育的基因及其应用

<130> 一种控制水稻株高或叶片直立性发育的基因及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1047

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgccgccct gcgccgccgg gaagcgcagc tccatctacc gcggcgtcac ccggcatagg 60

tggacaggcc gatatgaagc tcacctctgg gataaaagca catggaatca gaatcagaac 120

aaaaaaggga aacaagtata tttaggtgca tatgatgatg aagaggctgc agcaagagct 180

tatgaccttg ctgcattgaa atactgggga gctgggacac aaataaactt tcctgtctct 240

gattatgcaa gagatcttga ggaaatgcag atgatctcca aggaggatta tcttgtgtct 300

cttcggagaa agagcagtgc cttttccagg ggtttaccaa aatatcgcgg ccttcctagg 360

cagctccata attccagatg ggatgcttct ttgggacact tgcttggcaa tgactacatg 420

agcctaggga aggacatcac gctggatggg aaatttgcag gaacctttgg cttagagagg 480

aaaattgatc tgacaaatta cataaggtgg tggctcccaa aaaagacacg gcagtcagat 540

acatctaaaa tggaagaggt tactgatgaa atccgtgcta ttgaaagttc aatgcaacgg 600

actgagcctt ataagtttcc ttcccttggc ctccattcta actcaaagcc ctcttccgtg 660

gtcctatcag catgtgatat cttatctcag tctgatgcct tcaaaagctt ctcagaaaaa 720

tctacaaaac tatctgaaga atgtactttt agcaaagaaa tggatgaagg aaagacagtt 780

accccagtac ctgcaactgg acatgacaca actgcagtta acatgaacgt gaatgggttg 840

cttgtgcaaa gagctccata cacattgccc tctgttactg cacaaatgaa aaatacctgg 900

aaccctgctg atccttctgc ggaccctctt ttctggacca acttcatcct gccagcaagt 960

caacctgtca cgatggcaac aatagcaaca acaacgtttg caaagaatga ggtgagttca 1020

agtgatccat tccatggtca agagtga 1047

<210> 2

<211> 348

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Pro Pro Cys Ala Ala Gly Lys Arg Ser Ser Ile Tyr Arg Gly Val

1 5 10 15

Thr Arg His Arg Trp Thr Gly Arg Tyr Glu Ala His Leu Trp Asp Lys

20 25 30

Ser Thr Trp Asn Gln Asn Gln Asn Lys Lys Gly Lys Gln Val Tyr Leu

35 40 45

Gly Ala Tyr Asp Asp Glu Glu Ala Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Leu Ala

50 55 60

Ala Leu Lys Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Gln Ile Asn Phe Pro Val Ser

65 70 75 80

Asp Tyr Ala Arg Asp Leu Glu Glu Met Gln Met Ile Ser Lys Glu Asp

85 90 95

Tyr Leu Val Ser Leu Arg Arg Lys Ser Ser Ala Phe Ser Arg Gly Leu

100 105 110

Pro Lys Tyr Arg Gly Leu Pro Arg Gln Leu His Asn Ser Arg Trp Asp

115 120 125

Ala Ser Leu Gly His Leu Leu Gly Asn Asp Tyr Met Ser Leu Gly Lys

130 135 140

Asp Ile Thr Leu Asp Gly Lys Phe Ala Gly Thr Phe Gly Leu Glu Arg

145 150 155 160

Lys Ile Asp Leu Thr Asn Tyr Ile Arg Trp Trp Leu Pro Lys Lys Thr

165 170 175

Arg Gln Ser Asp Thr Ser Lys Met Glu Glu Val Thr Asp Glu Ile Arg

180 185 190

Ala Ile Glu Ser Ser Met Gln Arg Thr Glu Pro Tyr Lys Phe Pro Ser

195 200 205

Leu Gly Leu His Ser Asn Ser Lys Pro Ser Ser Val Val Leu Ser Ala

210 215 220

Cys Asp Ile Leu Ser Gln Ser Asp Ala Phe Lys Ser Phe Ser Glu Lys

225 230 235 240

Ser Thr Lys Leu Ser Glu Glu Cys Thr Phe Ser Lys Glu Met Asp Glu

245 250 255

Gly Lys Thr Val Thr Pro Val Pro Ala Thr Gly His Asp Thr Thr Ala

260 265 270

Val Asn Met Asn Val Asn Gly Leu Leu Val Gln Arg Ala Pro Tyr Thr

275 280 285

Leu Pro Ser Val Thr Ala Gln Met Lys Asn Thr Trp Asn Pro Ala Asp

290 295 300

Pro Ser Ala Asp Pro Leu Phe Trp Thr Asn Phe Ile Leu Pro Ala Ser

305 310 315 320

Gln Pro Val Thr Met Ala Thr Ile Ala Thr Thr Thr Phe Ala Lys Asn

325 330 335

Glu Val Ser Ser Ser Asp Pro Phe His Gly Gln Glu

340 345

Claims

1.一种分离的蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。

4.权利要求1所述蛋白或权利要求2所述基因在控制水稻株高中的应用。

5.权利要求1所述蛋白或权利要求2所述基因在控制水稻茎叶夹角中的应用。

6.权利要求1所述蛋白或权利要求2所述基因在同时控制水稻株高和茎叶夹角中的应用。

7.一种分离的基因，其具有SEQ ID No．1所示核苷酸序列至少50％同源性的序列。

8.一种分离的蛋白质，其具有与SEQ ID No．2所示氨基酸序列至少50％同源性的序列。