CN104878020A - 一种控制水稻叶片直立性发育的基因及其应用 - Google Patents

一种控制水稻叶片直立性发育的基因及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104878020A
CN104878020A CN201510264375.3A CN201510264375A CN104878020A CN 104878020 A CN104878020 A CN 104878020A CN 201510264375 A CN201510264375 A CN 201510264375A CN 104878020 A CN104878020 A CN 104878020A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
rice
cyc
seq
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510264375.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104878020B (zh
Inventor
王学路
孙世勇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN201510264375.3A priority Critical patent/CN104878020B/zh
Publication of CN104878020A publication Critical patent/CN104878020A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104878020B publication Critical patent/CN104878020B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C12N15/8225—Leaf-specific, e.g. including petioles, stomata
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明提供了一种控制禾本科作物株型建成的基因及其应用，本发明的公开的基因CYC U4;1（Os10g41430）特异在水稻叶枕表达（相信也特意在其他禾本科作物表达），其CDS序列为SEQ ID NO.2所示，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。本发明还提供了该基因的启动子序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。将CYC U4;1的启动子和全长CDS克隆到pCAMBIA1301上，转入日本晴中，所获得的转基因系均表现为茎叶夹角比野生型要小，因此通过基因工程技术提高或减弱CYC U4;1基因的表达量能够控制植物株型发育，从而改善植物株型提高种质密度。

Description

一种控制水稻叶片直立性发育的基因及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种控制水稻叶片直立性发育的基因，采用反向遗传学的方法，从水稻叶片、叶枕特异基因表达芯片分析中筛选特异在叶枕部位表达的基因，利用pCYCU4-GUS转基因系证明CYC U4；1的启动子特异在叶枕处表达；通过转基因提高CYC U4；1的表达量和RNAi技术降低CYC U4；1的表达量均证明CYC U4；1基因为控制水稻叶片直立性发育的基因。本发明还涉及含有该基因或其同源基因的载体和涉及利用该基因或其功能类似物调控植物叶片直立性在农业生产中的应用。
背景技术
作物的株型发育是高产育种的关键性状。叶片直立性(茎叶夹角的大小)是株型发育的重要性状之一，合适的茎叶夹角能使我们通过提高作物的田间种植密度，进而促进光能利用率，增加作物产量(Sakamoto et al.,2006；Sinclair et al.,1999)。叶枕是影响叶片直立性发育的关键部位，叶枕的发育程度直接影响茎叶夹角的大小。因此，发现和利用影响叶片直立性(茎叶夹角大小)的关键基因的最终目是改进水稻株型，促进分子设计育种，提高水稻单位面积产量。
单子叶植物的叶枕部位是连接叶片和叶鞘的中间枢纽，是形成茎叶夹角的基础结构。叶枕作为机械组织，当叶片和叶鞘伸长完毕后，促使叶片向远轴方向弯曲,所以叶枕区域的发育与叶片直立性密切相关(Hoshikawa,1989)。油菜素甾醇的合成和信号通路在调控单子叶植物茎叶夹角发育中具有重要而独特的作用，但其下的细胞学和分子机制还不清楚。已报道的BR合成相关的突变体d2、dwarf4、,d11和brd2均表现为茎叶夹角变小，叶片直立(Li etal.,2013；Hong et al.,2003,2005；Tanabe et al.,2005)。BR信号通路中的正调控因子的缺失突变体也表现为茎叶夹角变小，叶片直立。如受体突变体d61，dlt,d1和tud1(Yamamuro et al.,2000；Tong et al.,2012；Oki et al.，2009；Hu et al.,2013)。利用同源克隆的方法得到的OsBAK1、OsGSK2的转基因植株的茎叶夹角大小也发生变化(Li et al.,2009；Tong et al.,2012)。利用RNAi技术抑制水稻BR信号通路下游的正调节因子OsBZR1基因的表达，也会促进叶片直立(Bai et al.,2007)。而BR信号通路的负调节因子LIC的功能获得型突变体lic-1也表现为茎叶夹角变小，叶片直立(Zhang et al.,2012)。而被OsBZR1调节的ILI1的功能获得型突变体ili1-D,由于BR信号被放大，则表现为叶夹角增大(Zhang et al.,2009)。另外，水稻OsBZR1的靶基因OsIBH1也直接参与了对水稻叶片直立性的调节(Zhang et al.,2009)；外施BR处理导致野生型和BR合成途径突变体的叶片倾角变大，而BR信号突变体如受体突变体d61的叶片倾角几乎不受外源BR的影响。
除了油菜素甾醇途径，其他信号途径也参与了茎叶夹角的调控。虽然BR相关途径基因在参与调控水稻叶片倾角变化方面具有显著作用，但是还存在其它独立途径参与此生物性状的调控。负调控赤霉素(GAs)信号的基因SPINDLY(SPY)的表达量下降后茎叶夹角增大(Shimada et al.,2006)。而生长素信号途径负调节因子Aux/IAA家族成员OsIAA1过表达植株茎叶片夹角变大(Song et al.,2009)。调控生长素体内平衡的编码生长素偶联氨基酸的合成酶基因LC1通过调节叶枕部位细胞伸长决定水稻叶夹角大小(Zhao et al.，2013)。水稻rice leafinclination2(LC2)，一个VIN3-类似蛋白，突变后也能使茎叶夹角变大(Zhao et al.，2010)。MAPKKK家族C组成员的基因ILA1在叶枕的维管束中高表达，其基因T-DNA插入突变引起叶枕部位细胞壁主要成分纤维素和木聚糖含量下降，从而导致叶枕部位机械强度降低，叶夹角增大(Ning et al.，2011)。水稻中Loose Plant Architecture1(LPA1)基因的突变体lpa1表现为株型松散，其分蘖角和茎叶夹角均增大(Wu et al.,2013)。
育种实践证明，水稻茎叶夹角与产量密切相关。利用BR相关途径的基因作为改良水稻株型的靶基因，在生产上具有广阔的应用前景。例如，Morinaka等(2006)利用共抑制的策略，通过导入水稻肌动蛋白启动子驱动的OsBRI1的胞内区(OsACTIN::OsBRI1-KD)，部分抑制水稻内源OsBRI1的表达，从而在后代中分离出直叶型的转基因系；据估算它们通过密植可分别增产约35％和26％。Sakamoto等(2006)通过田间实验证实合理密植水稻BR合成途径OsDWARF4的突变体可增产达32％。通过对剑叶角度与主穗产量进行遗传剖析，应用244个珍汕97B/密阳46RIL群体，在1、3、5和11染色体上共检测到5个控制剑叶角度的QTL，其中在第1染色体RM24-RM294A区间同时检测到了控制剑叶角度(FLA)和结实率(SF)的QTL，且加性效应方向相反，表明剑叶角度与产量呈负相关，适当减小水稻剑叶夹角有利于结实率的提高，并最终提高产量(zhang et al.,2008)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种控制水稻叶片直立性发育的基因CYC U4；1，该基因从水稻叶枕处特异表达芯片中鉴定并分离克隆，该基因包含有SEQ.ID.No.1所示的启动子区域、具有SEQ ID No.2核苷酸所示的CDS序列，该基因编码SEQ.ID.No.3所示的氨基酸序列。
本发明的另一个目的是提供CYC U4；1基因在控制水稻叶片直立性中的应用，通过CYCU4；1基因启动子(SEQ ID.NO：1所示序列)驱动CYC U4；1基因在水稻植株中超量表达可达减小茎叶夹角，从而改善水稻品种的株型和提高单位面积的种植密度。
为了实现上述目的，本发明采取以下技术措施：
发明人构建水稻叶片和叶枕部位的基因特异表达芯片，通过反向遗传学的方法，从芯片的差异表达基因中挑选在叶枕处特异表达的基因CYC U4；1，利用real-time qRT-PCR验证了CYC U4；1在叶枕处表达的特异性。
一种控制水稻叶片直立性发育的基因CYC U4；1，利用下述方法得到：
反应体系的总体积为50μl，模板为日本晴CDNA 1ul(约50ng)、10×KOD酶反应缓冲液5μl、25mM MgCL2 2μl、5mM dNTP 5μl、5uM引物5μl(采用分步PCR方式，第一次使用引物CYCU4-U和CYCU4-L-1，第二次使用引物CYCU4-U和CYCU4-L-2，每条引物均为2.5μl)、1μl KOD酶，加ddH2O(无菌去离子水)至50μl。
反应程序为：94℃变性5min，94℃30s、55℃1min、68℃2min 35cycles，68℃延伸10min。
所述引物为：
CYCU4-U:ATATgagctcATGAGGACGGGGGAGGTGGCGGAGGCGGTG；
CYCU4-L-1:CGTCTTTGTAGTCGACGGCGAGCTGATGCTGCTGCTG；
CYCU4-L-2：ATATtctagactaCTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGACGGCGAG。
最终获得包含有SEQ ID NO.2所述核苷酸的基因序列，该基因编码的蛋白质为SEQ IDNO.3所示。
本发明的保护内容还包括SEQ ID NO.3所示氨基酸序列对应的核苷酸序列，还包括SEQID NO.3所示序列经过改造修饰的具有相同功能的蛋白。
CYC U4；1基因在控制水稻叶片直立性中的应用，包括将CYC U4的启动子和全长CDS克隆到pCAMBIA1301上，转入日本晴中，所获得的转基因系均表现为茎叶夹角比野生型(日本晴)变小，因此可通过该方法减小茎叶夹角，以提高种植密度。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、CYC U4；1是一个在水稻苗期只在叶枕部位特异表达的基因，这使利用该基因只改变作物茎叶夹角大小，而不影响其它性状成为可能。
2、CYC U4；1是一个改变茎叶夹角大小的有效基因，它可以通过直接影响叶枕处的特异类型细胞分裂，进而改变作物的茎叶夹角大小。
3、目前，对油菜素甾醇调控叶片直立性进而提高作物产量的分子机制并不清楚，该基因揭示了其介导的油菜素甾醇调控叶片直立性的分子机制。
附图说明
图1为Realtime qRT-PCT验证CYC U4；1在水稻叶枕中特异表达。
图2为pCYCU4：：GUS转基因水稻GUS染色结果。
图3为pCYCU4::CYC U4；1转基因水稻幼苗和成熟期表型和转基因的表达水平。
图4为RNAi-CYC U4；1转基因水稻幼苗和成熟期表型和基因表达水平。
图5为多个独立的pCYCU4：：CYCU4；1和RNAi-CYC U4；1转基因株系的表型和表达量分析。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或生物材料，如未特别说明，均已公开。
实施例1：
一种控制水稻叶片直立性发育的基因CYC U4；1的获得：
发明人构建水稻叶片和叶枕部位的基因特异表达芯片，通过反向遗传学的方法，从芯片的差异表达基因中挑选在叶枕处特异表达的基因CYC U4；1，利用real-time qRT-PCR验证了CYC U4；1在叶枕处表达的特异性。具体如下：
一种控制水稻叶片直立性发育的基因CYC U4；1，利用下述方法得到：
反应体系的总体积为50μl，模板为日本晴CDNA 1ul(约50ng)、10×KOD酶反应缓冲液5μl、25mM MgCL2 2μl、5mM dNTP 5μl、5uM引物5μl(采用分步PCR方式，第一次使用引物CYCU4-U和CYCU4-L-1，第二次使用引物CYCU4-U和CYCU4-L-2，每条引物均为2.5μl)、1μl KOD酶，加ddH2O(无菌去离子水)至50μl。
反应程序为：94℃变性5min，94℃30s、55℃1min、68℃2min 35cycles，68℃延伸10min。
所用引物如下：
CYCU4-U:ATATgagctcATGAGGACGGGGGAGGTGGCGGAGGCGGTG；
CYCU4-L-1:CGTCTTTGTAGTCGACGGCGAGCTGATGCTGCTGCTG；
CYCU4-L-2：ATATtctagactaCTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGACGGCGAG。
最终获得包含有SEQ ID NO.2所述核苷酸的CYC U4；1基因序列，该基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。
Real time qRT-PCT验证CYC U4；1在水稻叶枕中特异表达：
生长1周的水稻日本晴苗，分别取叶片和夹角，利用Tiangen RNApre Plant Kit(Tiangen)提取总RNA，然后利用Takara PrimeScript First-strand cDNA synthesis kit(TaKaRa)合成第一链cDNA，然后利用实时定量PCR检测叶片和叶枕中的CYCY U4；1的相对表达量。实时定量PCR引物：CYCU4；1:R-TGAGGTGGACTTCCTCTTTG；F-CCAGGTAGGTCATCTCGCTC。发现基因CYC U4；1在叶枕处特异性表达(图1)。
实施例2：
CYC U4；1基因在控制水稻叶片直立性中的应用，应用过程如下：
1)植物表达载体pCYCU4；1-GUS的构建
扩增CYC U4；1启动子区，利用HindIII/BamH1酶切位点将片段克隆到pCAMBIA1300GNGUS(Ren Z H,Gao J P,Li L G,et al.A rice quantitative trait locus for salt tolerance encodes asodium transporter[J].Nature genetics,2005,37(10):1141-1146.)载体上。
所述的CYC U4；1启动子区通过以下方式获得：
反应体系的总体积为50μl，模板为日本晴基因组DNA1ul(约50ng)、1×KOD酶反应缓冲液5μl、25mM MgCL2 2μl、5mM dNTP 5μl、5uM引物5μl(引物pCYCU4-U和pCYCU4-L分别2.5μl)、1μl KOD酶，加ddH2O(无菌去离子水)至50μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃30s、55℃1min、68℃2min 35cycles，68℃延伸10min。
所用引物如下：
pCYCU4-U:atatAAGCTTacttgtactacctcattggcacaggcac；
pCYCU4-L：atatGGATCCcgatcgctcgccacgaggaggaagg。
最终获得含有SEQ.ID.No.1所示的CYC U4；1基因启动子区域。
2)植物表达载体pCYCU4::CYC U4；1的构建
利用分步法先将CYC U4；1启动子区(启动子区的扩增方法同步骤1))，利用HindIII/BamH1酶切位点将片段克隆到pCAMBIA1301，获得pCAMBIA1301-pCYCU4；1，然后再将连有FLAG标签的CYC U4；1全长cDNA(SEQ ID NO.2所示)利用Sac1/Xba1克隆到pCAMBIA1301-pCYCU4；1上，获得植物表达载体pCYCU4::CYC U4；1，转入日本晴中。
3)植物表达载体RNAi-CYC U4；1的构建
将CYC U4；1(345-639bp)利用Kpn1/BamH1和Sac1/Spe1酶切位点克隆到RNAi载体pTCK303上，转入日本晴中。
4)水稻遗传转化
步骤1)-3)中的水稻转化均采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，具体如下：
①愈伤诱导。将水稻种子去壳，取饱满清亮的籽粒先用70％乙醇浸泡1min，无菌水冲洗1-2次；再用含2％活性氯的NaClO溶液(40ml含>5.2％活性氯的NaClO溶液加60ml水)，加1-3滴Tween 20，浸泡30min以上(一般40min，最长可至1h)。不时摇动，然后用无菌水冲洗4-5次。倒在灭菌的平板和滤纸上吸干，约1h左右。将之置入N6D固体培养基上(10粒/25ml/瓶)，种胚朝上或接触培养基，28℃，暗培养25～30d。N6D2培养基：N6盐分和维生素,0.5g/l酪蛋白水解物,30g/l蔗糖,2mg/l 2,4-D,2.5g/l Phytagel(Sigma),pH5.8。
②农杆菌的培养及其与水稻愈伤组织的共培养。取灭菌小勺刮取农杆菌，用勺背面将菌体贴在管壁轻轻拍散，OD600＝0.8～1.0。将前培养的愈伤在无菌滤纸上晾一下，然后集中至一个平皿一次性转入菌液中，轻轻转动离心管使菌液均匀分布，静置时间约15～20min。将菌液倒出，愈伤在无菌滤纸上放约1.5h,保证菌液吸干，接至1/2N6D AS中，20℃、暗培养2～3天，看到愈伤与培养基接触部分有菌膜，就可以除菌了。1/2N6D AS培养基：N6D2,10g/l葡萄糖,100～400μmol/l乙酰丁香酮(用时现加),pH5.2。
③农杆菌的去除。将共培养的愈伤装入50ml的离心管，用无菌水清洗3次以上，至液体比较清亮。倒出无菌水，N6D+Cn500mg/L(或AP500ml/L)，100rpm,15-20min,2-3次。将愈伤倒在无菌滤纸上吸干2h左右，视情况而定。将干燥的愈伤转入N6D-AS中，加头孢霉素Cn250mg/L，28℃，暗培养7～10d。
④愈伤组织的筛选。挑出没被农杆菌污染的愈伤，第一次加Cn250mg/L和Hn(50mg/L),15～20d。第二次同上，不加Cn，加潮霉素Hn，把所有的愈伤全部再转一次，15～20d。第三次选出新的愈伤，用Hn筛选，15～20d。次数部用一定按上述安排，但应保证愈伤在Hn上筛选的时间至少45d以上，第三次挑出的新长出的愈伤最好筛选20d。N6D筛选培养基：N6D+Cn250mg/L+Hn50mg/L,PH＝5.8～5.9。
⑤分化和生根。将第四次筛选的全部愈伤组织移入MS中，Hn 50mg/L，暗培养，预分化(PH 5.9)12～15d。选出长势好的新鲜的愈伤，移入MS(PH 6.0)中，光培养15～20d，可看到有绿芽长出，一般15d换一次培养基。选长出1cm以上的绿芽，剥去周围多余的愈伤，剪去根(可留约0.5cm长)移入试管中，1/2MS生根培养。MS分化培养基：MS盐分和维生素,2g/l酪蛋白水解物,30g/l蔗糖,25g/L山梨醇，2mg/l 6-BA,0.5mg/l NAA,0.2mg/l玉米素(Zeatin),0.5mg/l KT,3.0g/l Phytagel,pH5.8,50mg/l潮霉素B,200mg/l头孢霉素；1/2MS生根培养基：1/2MS盐分,MS维生素,30g/l蔗糖,1mg/l多效唑，0.5mg/l NAA,50mg/l潮霉素,2.5g/l Phytagel,pH5.8。
5)移栽、表达量鉴定和表型分析。
将生根的转基因植株每个遗传构建40个系，移栽温室，取叶片进行realtime qRT-PCR表达量鉴定和GUS染色分析。RNAi-CYCU4；1:R-GTCGCCTACATCTACCTC；F-GATAATTCATCTCCATCAAGC。
6)结果：
(1)将获得的载体转入水稻日本晴中，利用pCYCU4：：GUS转基因水稻报告系统表明CYC U4；1主要在叶枕部位表达(图2)。
(2)将CYC U4；1的启动子和全长CDS克隆到pCAMBIA1301上，转入日本晴中，所获得的转基因系均表现为茎叶夹角比野生型(日本晴)变小(图3)。说明CYC U4；1具有控制水稻叶片直立性发育(茎叶夹角大小)的功能
(3)将CYC U4；1(345-639bp)克隆到RNAi载体pTCK303上，在水稻日本晴中做RNAi(RNA interference)实验，结果发现成功被RNAi的转基因水稻的茎叶夹角均比野生型(日本晴)大(图4)。
(4)通过获得的多个独立的pCYCU4：：CYCU4；1和RNAi-CYC U4；1转基因株系的表型和表达量分析，表明CYC U4；1的表达量与水稻夹角的大小相关(图5)。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  华中农业大学
 
<120>  一种控制水稻叶片直立性发育的基因及其应用
 
<130>  一种控制水稻叶片直立性发育的基因及其应用
 
<160>  3    
 
<170>  PatentIn version 3.1
 
<210>  1
<211>  1835
<212>  DNA
<213>  水稻
 
<400>  1
acttgtacta cctcattggc acaggcacat tcttgtggga gaaattttgg atagagaaat     60
 
ggagatgatg ctcctgatgc tgggaaagaa catcacatgc ttgcatgctc ctcgacgtga    120
 
tgagcaacat gtaagtatat gttagtactg cagtagtgcc cttgcagcat cgatcaccaa    180
 
ccaatctgtc gcctgcatgg cagaatctga ttgtctgttc ctcacaaaca tgtcatattc    240
 
tgatgcctcc tagcaatctg aattactacc atattaaaat tttcacccct cctgatggtg    300
 
ttttcacctt ctgttctgac acatatgtta agatttcaag ttgttcaggg aaacacttgt    360
 
gatatgtata tccacccatc ccaccagggt tcaagtcctg ttgcccatga atattacaga    420
 
catactagtg ggcattcaat agaatttagt aagatcaggg atgtgttgtg gattcccgtc    480
 
tctttgagca tgtgttagat ggcgcatctg tcattgtgtg agtgtggtgt tacgtgtgta    540
 
gtgttgtgca tgcatttaca tctgtcgtgt aatcgcaaaa agatttcagg ttgttcaggt    600
 
gtgtatgtgt tcagtgtatc tctgaattga tctgtgctgt tgctgcatat gctgaagctg    660
 
acacacatat gttcagtttc agagttcagt ctgtttcgag tgttcaatgt atctctgaac    720
 
tgatcactgt tgatgctgaa tatactacgc tgaagacgac actgacattt tgactaactg    780
 
ggtgcctata atcagcacgg aatacacgag gaaaaacaaa aaatgaagcg ccactaatca    840
 
gttaattacc gtttcaaatg atccatcatt agccaataca tgcatgaatt tttcgtgcgg    900
 
aatgcccact gctagaactg cgaaacaccc taattctcgc tgaatttgtg tgcatgtata    960
 
tccatccatt catcgttcgg ctgcctaaca gctggaaaaa tgactttgtg catcttgtga   1020
 
gaattgcagc taaagtcagg ttagctctga aagtgctcta ccctgcattc ttgccaaggt   1080
 
taaattcttc caaccaatac acgctctcga atcgaacctt atcactcttg tcataaatta   1140
 
agctgcaaga atcagatgat tccacagttc agataaccct caagaaaaga acttcacaag   1200
 
ttcagaattc agactgactt aattcaccag gttgccgaaa attcactgca agtactaatg   1260
 
cagtgcagcc gtacgaacct atctgtacgg tcgatacgaa tttaagcaaa aatccgatcc   1320
 
atcattataa tctaaatttg agagtctgat caaacccaga tttaaactaa tttttaccag   1380
 
gttgctcaaa attcactgca cgtactagtg cagtgcagcc gacaaatcca tctgtacagt   1440
 
tgatacgaat ttaaagcaaa attaaatcca tctttataat ctaaatttga gaatctgatc   1500
 
aaacccagac ttaaactaat ttttacctgc ttgctcaaaa ttcactgcaa ggactagtgc   1560
 
agtgcagccg acaaatacat ctgtacagtt aatgaaattt taaagcgaaa ttcaatttaa   1620
 
attcgagaga gagaagaaga agaagaagaa gaaagacaga ctaatcatgc caacttgcaa   1680
 
gcccaaagac ccaatctttc cttagaaatt taattttttt ttcatctctt tcctcgcgtt   1740
 
ttccctccct ttataaccac caccaccatc tcgtctcctt cctcccgctc gcttactgct   1800
 
cgactcgtcg ccttcctcct cgtggcgagc gatcg                              1835
 
 
<210>  2
<211>  639
<212>  DNA
<213>  水稻
 
<400>  2
atgaggacgg gggaggtggc ggaggcggtg ccgagggtgg tggcgatcct gtcgtcgctg     60
 
ctgcagcggg tggcggagcg gaacgacgcg gcggcggcgg cggcggcggt gggggaggag    120
 
gcggcggcgg tgtcggcgtt ccaggggctg acgaagccgg cgatatccat cggagggtac    180
 
ctggagcgga tcttccggtt cgccaactgc agcccgtcgt gctacgtcgt cgcctacatc    240
 
tacctcgacc gcttcctccg ccgccgccct gccctcgccg tcgactcctt caacgtccac    300
 
cgcctcctca tcacatccgt cctcaccgcc gtcaagttcg tcgacgacat atgctacaac    360
 
aatgcctact tcgcgagggt gggaggcatc agcttgatgg agatgaatta tcttgaggtg    420
 
gacttcctct ttggcatcgc cttcgacctc aatgtcacgc cggctgcctt cgcctcctac    480
 
tgcgccgtgc tgcagagcga gatgacctac ctggagcagc cgcccgccgt cgatctcccc    540
 
aggctgcact gctgtccgtc cgatcaggac gatgccggct gccatcacaa gcagcagcag    600
 
cagcagcaac aacagcagca gcatcagctc gccgtctga                           639
 
 
<210>  3
<211>  212
<212>  PRT
<213>  水稻
 
<400>  3
 
Met Arg Thr Gly Glu Val Ala Glu Ala Val Pro Arg Val Val Ala Ile
1               5                   10                  15     
 
 
Leu Ser Ser Leu Leu Gln Arg Val Ala Glu Arg Asn Asp Ala Ala Ala
            20                  25                  30         
 
 
Ala Ala Ala Ala Val Gly Glu Glu Ala Ala Ala Val Ser Ala Phe Gln
        35                  40                  45             
 
 
Gly Leu Thr Lys Pro Ala Ile Ser Ile Gly Gly Tyr Leu Glu Arg Ile
    50                  55                  60                 
 
 
Phe Arg Phe Ala Asn Cys Ser Pro Ser Cys Tyr Val Val Ala Tyr Ile
65                  70                  75                  80 
 
 
Tyr Leu Asp Arg Phe Leu Arg Arg Arg Pro Ala Leu Ala Val Asp Ser
                85                  90                  95     
 
 
Phe Asn Val His Arg Leu Leu Ile Thr Ser Val Leu Thr Ala Val Lys
            100                 105                 110        
 
 
Phe Val Asp Asp Ile Cys Tyr Asn Asn Ala Tyr Phe Ala Arg Val Gly
        115                 120                 125            
 
 
Gly Ile Ser Leu Met Glu Met Asn Tyr Leu Glu Val Asp Phe Leu Phe
    130                 135                 140                
 
 
Gly Ile Ala Phe Asp Leu Asn Val Thr Pro Ala Ala Phe Ala Ser Tyr
145                 150                 155                 160
 
 
Cys Ala Val Leu Gln Ser Glu Met Thr Tyr Leu Glu Gln Pro Pro Ala
                165                 170                 175    
 
 
Val Asp Leu Pro Arg Leu His Cys Cys Pro Ser Asp Gln Asp Asp Ala
            180                 185                 190        
 
 
Gly Cys His His Lys Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His
        195                 200                 205            
 
 
Gln Leu Ala Val
    210        
 
 

Claims (10)

1.一种分离的蛋白，其序列为SEQ ID NO.3所示。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其序列为SEQ ID NO.2所示。
4.权利要求2或3所述基因的启动子，其序列为SEQ ID NO.1所示。
5.权利要求1所述蛋白或权利要求2所述基因在控制水稻植物叶片直立性发育中的应用。
6.权利要求1所述蛋白或权利要求2所述基因在改善水稻品种的株型和提高单位面积的种植密度。
7.权利要求1所述蛋白或权利要求3所述基因和权利要求4所述的启动子在减小水稻茎叶夹角中的应用。
8.权利要求1所述蛋白或权利要求所述基因和权利要求4所述的启动子在禾本科作物株型改良中的应用。
9.一种分离的基因，其具有SEQ ID No．2 所示核苷酸序列至少50％同源性的序列。
10.一种分离的蛋白质，其具有与SEQ ID No．3所示氨基酸序列至少50％同源性的序列。
CN201510264375.3A 2015-04-29 2015-05-21 一种控制水稻叶片直立性发育的基因及其应用 Active CN104878020B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510264375.3A CN104878020B (zh) 2015-04-29 2015-05-21 一种控制水稻叶片直立性发育的基因及其应用

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2015102192532 2015-04-29
CN201510219253 2015-04-29
CN201510264375.3A CN104878020B (zh) 2015-04-29 2015-05-21 一种控制水稻叶片直立性发育的基因及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104878020A true CN104878020A (zh) 2015-09-02
CN104878020B CN104878020B (zh) 2017-09-15

Family

ID=53945696

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510264375.3A Active CN104878020B (zh) 2015-04-29 2015-05-21 一种控制水稻叶片直立性发育的基因及其应用

Country Status (3)

Country Link
US (2) US20180127768A1 (zh)
CN (1) CN104878020B (zh)
WO (1) WO2016173475A1 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106046129A (zh) * 2016-07-01 2016-10-26 华中农业大学 一种控制水稻株高或叶片直立性发育的基因及其应用
WO2016173475A1 (zh) * 2015-04-29 2016-11-03 华中农业大学 一种控制水稻叶片直立性发育的基因及其应用
CN111118021A (zh) * 2019-12-13 2020-05-08 浙江省农业科学院 水稻bHLH转录因子OsbHLH091基因和编码蛋白及其在调控水稻叶夹角中的应用
CN111793635A (zh) * 2020-07-28 2020-10-20 河南大学 水稻基因ljs5-1在控制水稻叶枕发育和叶夹角大小中的应用
CN111826392A (zh) * 2020-07-28 2020-10-27 河南大学 水稻基因ljs5-2及其同源基因在控制水稻叶枕发育和叶夹角大小中的应用
CN112063626A (zh) * 2019-06-10 2020-12-11 中国农业大学 玉米基因ZmRAVL1和功能位点及其用途

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108085319B (zh) * 2017-12-25 2020-05-22 中国科学院遗传与发育生物学研究所 植物分蘖角度相关蛋白及其编码基因与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101617626A (zh) * 2009-07-30 2010-01-06 浙江大学 一种新株型高产抗病水稻的培育方法
CN101659965A (zh) * 2009-08-25 2010-03-03 中国科学院植物研究所 一种培育叶夹角改变的转基因水稻的方法及其专用重组载体
CN103014025A (zh) * 2011-09-22 2013-04-03 中国水稻研究所 水稻brd3基因及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101144624B1 (ko) * 2010-01-22 2012-05-11 경상대학교산학협력단 식물의 외형 (초형)을 변화시키는 ＯｓＭＰＴ 유전자 및 이의 용도
CN104878020B (zh) * 2015-04-29 2017-09-15 华中农业大学 一种控制水稻叶片直立性发育的基因及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101617626A (zh) * 2009-07-30 2010-01-06 浙江大学 一种新株型高产抗病水稻的培育方法
CN101659965A (zh) * 2009-08-25 2010-03-03 中国科学院植物研究所 一种培育叶夹角改变的转基因水稻的方法及其专用重组载体
CN103014025A (zh) * 2011-09-22 2013-04-03 中国水稻研究所 水稻brd3基因及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KIKUCHI,S.等: "Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:002-129-G08, full insert sequence", 《GENBANK: AK107529.1》 *
KIKUCHI,S.等: "unnamed protein product [Oryza sativa Japonica Group]", 《GENBANK: BAG98076.1》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016173475A1 (zh) * 2015-04-29 2016-11-03 华中农业大学 一种控制水稻叶片直立性发育的基因及其应用
CN106046129A (zh) * 2016-07-01 2016-10-26 华中农业大学 一种控制水稻株高或叶片直立性发育的基因及其应用
CN106046129B (zh) * 2016-07-01 2019-06-21 华中农业大学 一种控制水稻株高或叶片直立性发育的基因及其应用
CN112063626A (zh) * 2019-06-10 2020-12-11 中国农业大学 玉米基因ZmRAVL1和功能位点及其用途
CN111118021A (zh) * 2019-12-13 2020-05-08 浙江省农业科学院 水稻bHLH转录因子OsbHLH091基因和编码蛋白及其在调控水稻叶夹角中的应用
CN111793635A (zh) * 2020-07-28 2020-10-20 河南大学 水稻基因ljs5-1在控制水稻叶枕发育和叶夹角大小中的应用
CN111826392A (zh) * 2020-07-28 2020-10-27 河南大学 水稻基因ljs5-2及其同源基因在控制水稻叶枕发育和叶夹角大小中的应用
CN111826392B (zh) * 2020-07-28 2022-04-01 河南大学 水稻基因ljs5-2及其同源基因在控制水稻叶枕发育和叶夹角大小中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20200199611A1 (en) 2020-06-25
WO2016173475A1 (zh) 2016-11-03
US11339401B2 (en) 2022-05-24
CN104878020B (zh) 2017-09-15
US20180127768A1 (en) 2018-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104878020B (zh) 一种控制水稻叶片直立性发育的基因及其应用
Yan et al. A major QTL, Ghd8, plays pleiotropic roles in regulating grain productivity, plant height, and heading date in rice
JP5779619B2 (ja) 草高調節遺伝子およびその使用
CN110628808B (zh) 拟南芥AtTCP5基因及其在调控株高上的应用
CN106868021B (zh) 控制水稻种子大小基因OsNAC1及其应用
CN102776201B (zh) OsELF3基因在控制水稻抽穗期中的应用
CN113150097B (zh) 一种与植物耐逆性相关的蛋白OsERF096及其编码基因与应用
RU2665804C2 (ru) Рнк-интерференция гена phya1 хлопчатника, повышающая качество волокон, удлинение корня, цветение, созревание и потенциал урожайности у хлопчатника мохнатого (gossypium hirsutum l.)
CN108794607B (zh) 一种调控水稻开花期和每穗颖花数的产量基因OsAFB6及应用
CN106046129B (zh) 一种控制水稻株高或叶片直立性发育的基因及其应用
WO2012139532A1 (en) Use of oxhs4 gene in controlling rice drought resistance
US10072271B2 (en) Methods for improving crop yield
CN110577938B (zh) ABA 8’-羟化酶基因OsABA8ox2在植物光形态建成和根发育中的应用
CN105802931B (zh) Crk4蛋白及其编码基因在调控植物茎叶生长中的应用
WO2010138328A2 (en) Light-regulated promoters
WO2022257697A1 (zh) 调控植物半矮化株型和叶比值的cll1基因及其豆科的直系同源基因的应用
CN113980106B (zh) 调控植物种子和器官大小的小肽及其编码基因和应用
CN113136398B (zh) GsHA24蛋白及其相关生物材料在调控植物耐逆性中的应用
CN108752443B (zh) 水稻cyc u2；1基因在控制水稻中胚轴发育中的应用
CN109971765B (zh) 一种调控拟南芥脂肪酸和淀粉含量的玉米基因ZmNAC77及其应用
CN108034001B (zh) OsGBP1基因在调控水稻开花及粒型中的应用
CN108795942B (zh) 一种水稻外因胁迫诱导表达启动子Psubs3及其应用
CN105316346A (zh) 基因OsPIL16在降低水稻株高、提高分蘖数中的应用
CN114958866B (zh) 调控大豆分枝数的基因及其用途
CN111826393B (zh) 一种同时调控水稻粒型粒重和抗性的基因及其编码蛋白的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant