CN106018454A - 一种基于氢核磁共振快速测定奥贝胆酸纯度的方法 - Google Patents

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CN106018454A CN201610322784.9A CN201610322784A CN106018454A CN 106018454 A CN106018454 A CN 106018454A CN 201610322784 A CN201610322784 A CN 201610322784A CN 106018454 A CN106018454 A CN 106018454A
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李锋
赵汝松
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Abstract

本发明公开了一种基于氢核磁共振快速测定奥贝胆酸原料药纯度的方法，包括以下步骤：(1)测定奥贝胆酸和内标物各定量目标峰的纵向弛豫时间T1；(2)根据所测定的T1值设置核磁共振波普仪的倾倒角和弛豫延迟时间(d1)，所述倾倒角为30～90°，弛豫延迟时间(d1)≥(7/3×T1max～5×T1max)；(3)设定核磁共振波谱仪的其他相关检测参数，测定奥贝胆酸及内标物中各定量目标峰的积分面积，根据以下公式计算奥贝胆酸纯度：W％＝(mIS×HIS×AS×MS×100％)/(MIS×AIS×HS×mS)。本发明具有操作简便，内标物廉价易得，结果准确且重复性好等优点。

Description

一种基于氢核磁共振快速测定奥贝胆酸纯度的方法
技术领域
本发明属于医药分析技术领域，具体涉及一种基于氢核磁共振快速测定奥贝胆酸纯度的检测方法。
背景技术
原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)是一个相对罕见的肝硬化，一般认为是自身免疫紊乱造成，具体发病机制不明。PBC病人多数没有症状，所以诊断需要多个步骤。首先是发现来自血液指标异常。最终确诊需要超声和活体检测。PBC患者最后通常需要肝移植，但器官供应远低于需求，而且肝移植并不一定能根治PBC，所以亟需其它治疗方法。现在仅有熊去氧胆酸批准用于临床中PBC的治疗。已有临床证据表明熊去氧胆酸无法改善PBC患者生存期和降低肝移植风险。最近FDA专家组支持奥贝胆酸(Obeticholic acid)用于治疗原发性胆汁性肝硬化，其对血液中碱磷酸酶指标具有较好的改善作用，该品种被业界普遍认为具有较好的市场前景。
目前，对奥贝胆酸纯度的检测通常使用HPLC-UV方法。然而如下式所示，奥贝胆酸分子中无共轭结构，在近紫外区无吸收，采用HPLC-UV方法测定其纯度时，紫外检测波长只能选择末端吸收，从而造成了仪器噪音高，选择性差等缺点；同时HPLC-UV方法对样品中存在的溶剂残留(水、乙醇等)，无法一次性测定，仍需结合气相色谱等方法扣除溶剂残留量，才能最终获得奥贝胆酸真实的纯度；而且定量时需要高纯度的奥贝胆酸标准品，价格昂贵，长期使用成本高，而且在存放过程中标准样品发生吸潮、污染或降解等均会严重影响测定结果。而药品原料药纯度检测方法的研究是医药研发中一项重要内容，药品制剂原料的纯度最终影响成药的用药安全和疗效。因此，有必要开发一种能对奥贝胆酸纯度进行廉价、简便、快速、准确测定的分析方法。
氢核磁共振法因其具有的高灵敏度、高精确度、分析快速等优点已被广泛应用于有机化合物的结构解析和定性分析中，然而使用氢核磁共振法对某种特定化合物进行纯度测定定量分析时，由于影响其测量准确性的参数众多，而各化合物之间结构、性质上差异巨大，且参数设置无明确规律可以依循，因此构建一套基于氢核磁共振法准确测定化合物纯度的体系十分困难。目前，尚未有基于氢核磁共振法测定奥贝胆酸纯度的报道。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供基于氢核磁共振快速测定奥贝胆酸纯度的方法，该方法具有操作简便，内标物廉价易得，结果准确且重复性好等优点。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于氢核磁共振快速测定奥贝胆酸纯度的方法，包括以下步骤：
(1)测定奥贝胆酸和内标物各定量目标峰的纵向弛豫时间T1；
(2)根据所测定的T1值设置核磁共振波普仪的倾倒角和弛豫延迟时间(d1)，所述倾倒角为30～90°，弛豫延迟时间(d1)≥(7/3×T1max～5×T1max)；
(3)设定核磁共振波谱仪的其他相关检测参数，测定奥贝胆酸及内标物中各定量目标峰的积分面积，根据如下公式(1)计算奥贝胆酸纯度；
W％＝(mIS×HIS×AS×MS×100％)/(MIS×AIS×HS×mS) (1)
其中，W％为奥贝胆酸的纯度；mIS为内标物的实际质量(内标物的质量×纯度)，单位为mg；HIS为内标物定量目标峰的质子数；AS为奥贝胆酸定量目标峰的积分值；MS为奥贝胆酸的摩尔质量，单位为g/mol；MIS为内标物的摩尔质量，单位为g/mol；AIS为内标物定量目标峰的积分值；HS为奥贝胆酸定量目标峰的质子数；mS为奥贝胆酸样品的质量，单位为mg。
优选的，所述倾倒角为30°、50°或90°，弛豫延迟时间(d1)为6～100s；
优选的，所述核磁共振波谱仪的检测参数为：共振频率为400-600MHz，谱宽20ppm，测试温度26℃，采样时间(AQ)为2.0～4.1s；采样累加次数为32～128次；
优选的，氘代试剂为重水、氘代甲醇或氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)；
进一步优选的，所述氘代试剂为氘代二甲基亚砜；
优选的，所述奥贝胆酸的检测浓度为14.7-15.5mg/mL；
优选的，所述奥贝胆酸的定量目标峰化学位移为δH 0.61(18位角甲基信号)；
优选的，所述内标物为其质子化学位移在δH 16.00～6.27、δH 6.27～3.50、δH 3.50～2.50或δH 0.61～0.00范围内，且室温条件下不与奥贝胆酸发生化学反应的任意物质；
进一步优选的，所述内标物为顺丁烯二酸；
优选的，测定奥贝胆酸及内标物中各定量目标峰的积分面积的计算方法为对每一信号6次积分取平均值。
氢核磁共振定量的基础是在合适的仪器参数下，定量目标信号的积分值与引起该信号的质子数成正比关系，通过选择适当的内标物，根据定量目标峰的积分值推算该信号所属化合物的摩尔浓度，进而计算各定量化合物的质量及纯度。在实际研究过程中，申请人发现脉冲倾倒角和弛豫延迟时间(d1)直接影响最终定量结果的准确性。当采用90°脉冲时，d1≥5×T1max是确保含量测定数据准确性的必须条件，但此时分析时间较长，氢核磁定量快速性的优点得不到发挥；当采用较小脉冲倾倒角时，如30°脉冲，此时d1≥(7/3)×T1max，就能够获得准确的分析结果，且分析时间大大缩短。因此，本申请首先通过测定定量目标信号的纵向弛豫时间(T1)，进而确定脉冲倾倒角和弛豫延迟时间(d1)及其他参数设置，并最终建立了基于氢核磁共振快速测定奥贝胆酸原料药纯度的方法。由于在测定过程中不需要特定研发药品的对照品，因此，特别适合新药研发原料药的纯度测定。与现有技术相比，本发明有如下有益效果：
(1)本发明利用氢核磁共振技术，选择廉价稳定的内标物替代需要使用标准品作外标的HPLC-UV进行奥贝胆酸原料药纯度测定，操作简便，结果准确且重复性好；
(2)本发明样品前处理简单，分析时间短，特别适合无紫外吸收的医药品种原料药的纯度分析及质量控制，能够有效解决奥贝胆酸以及类奥贝胆酸的新药纯度测定的技术问题，为此类药物纯度测定提供了新方法。
核磁共振定量的原理是含氢有机化合物NMR波谱信号直接与原子数目成正比，因此在实验参数设定时，需要被测物和内标物上的共振峰与其对应的原子数尽可能保持一致，若选择不合适位置的氢进行纯度的测定，则受溶剂中杂质以及溶剂本身等干扰峰的影响较大，被测组分和杂质信号之间存在干扰，被测组分和内标也会出现信号重叠，导致积分不准确，检测结果重现性差。本发明中的待检测物质奥贝胆酸分子量高达421，结构式如背景技术中所示，实际上除了羰基、羟基等位置上比较活泼的氢不易被测出外，奥贝胆酸还有二十余个不同位置的氢，每一位移峰都会对应不同的倾倒角和弛豫延迟时间等参数，所以选择哪个位置的氢进行纯度测定是目前限制利用氢核磁共振测定奥贝胆酸纯度的技术难题之一。
而内标物的选择最基本的原则是室温条件下不与奥贝胆酸发生化学反应的物质，但是在内标物的物的选择时还要考虑被测物质的氢共振峰与内标的氢共振峰之间要避免重叠以及内 标物是否廉价易得等，目前可用于作为内标物的物质有苯、苯甲酸苄酯、马来酸、过氧化苯甲酰、非那西汀、2,4-二硝基甲苯、三氟乙酸钠，DMSO-d6，邻苯二甲酸氢钾等多种，每种内标物都有至少一种氢共振峰，待测物质奥贝胆酸的选择哪个位置的氢作为检测对象并不确定，所以选择何种内标物，何种氢共振峰都是没有任何依据的，这也是目前限制利用氢核磁共振测定奥贝胆酸纯度的技术难题之一。
此外，需要说明的是，研究者通常对核磁共振检测过程中的测定温度和待测物检测浓度并不关注，对于测定温度研究者基本都选定室温作为测定温度，但申请人在基于氢核磁共振快速测定奥贝胆酸纯度的研究中发现，适度提高温度能够有效促使HOD峰向高场移动，而且有效提高谱图分辨率，申请人发现在26℃时效果最佳，过高温度反而使谱图分辨率下降，不利于检测结果的准确测定。同时，对待测物浓度选取学术界也是莫衷一是，目前对核磁共振检测样品的浓度一般为20mg/mL左右，有学者认为提高检测样品浓度，可以增大样品信号在采集到信号中所占百分比，可达到提高信噪比目的。然而申请人在实际检测中发现，在保证一定信噪比的条件下，适当降低浓度反而有利于提高检测的准确度，经过分析奥贝胆酸检测浓度为14.7-15.5mg/mL检测精度最高。
申请人有必要指出，脉冲倾倒角和弛豫延迟时间(d1)是建立氢核磁共振定量方法过程中两个重要仪器参数，直接影响最终定量结果的准确性，目前虽然也有研究这些参数与检测结果关系的文献报道，然而在实际测定纯度时研究人员往往直接将内标物与待测物质溶解于溶剂中，进行仪器参数设定的测量，在进行参数的设定时则将脉冲倾倒角和弛豫延迟时间等同于共振频率等常规参数一起进行设定，这使得使用测量时对参数设置存在盲目性，往往需要进行多次试验才能确定较佳参数，费时费力。本申请发明人在研究过程中则突破传统思维，首先测定奥贝胆酸及内标物定量目标峰在氘代试剂中的纵向弛豫时间(T1)，再根据所测定的T1值设置核磁共振波谱仪的倾倒角和弛豫延迟时间(d1)，提高分析样品的准确性和效率。
附图说明
图1为实例1中核磁共振氢谱图；
图2为实例2中核磁共振氢谱图；
图3为实例3中核磁共振氢谱图；
图4为实例4中核磁共振氢谱图；
图5为实例5中核磁共振氢谱图；
图6为实例6中核磁共振氢谱图；
图7为实例7中核磁共振氢谱图；
图8为实例8中核磁共振氢谱图；
图9为实例9中核磁共振氢谱图；
图10为实例10中核磁共振氢谱图；
图11为实例11中核磁共振氢谱图；
图12为实例12中核磁共振氢谱图；
图13为实例13中核磁共振氢谱图；
图14为实例14中核磁共振氢谱图。
具体实施方式
称取奥贝胆酸7.39mg、顺丁烯二酸0.654mg,分别置于核磁管中，加入0.5mL DMSO-d6溶解，用于1H NMR测试。采用质子反转-恢复T1实验方法测定各定量目标峰的纵向弛豫时间T1，并用Bruker的T1计算程序计算。设定脉冲弛豫延迟时间范围为1秒至30秒。经测定以DMSO-d6为溶剂时，顺丁烯二酸δH 6.27信号峰T1为2.5s，奥贝胆酸δH 0.61处信号T1为373ms。
下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1-14奥贝胆酸样品实际纯度为99.0％。
实施例1
精密称取奥贝胆酸样品8.393mg、顺丁烯二酸4.706mg，分别以500μL、250μL DMSO-d6溶解，后精密取440μL奥贝胆酸溶液、60μL顺丁烯二酸溶液转移到核磁管中，进行1H NMR测试。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，d1为100s，采样累加次数为32次，谱宽20ppm，测试温度为26℃，AQ为4.1s。
在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δH 6.27信号峰积分值为1，奥贝胆酸δH 0.61处信号积分值为2.71，根据公式-1可计算得到奥贝胆酸的纯度为98.4％，重复5次，相对标准偏差0.2％。
W％＝(mIS×HIS×AS×MS×100％)/(MIS×AIS×HS×mS) (公式-1)
W％—奥贝胆酸的纯度
mIS—内标物的实际质量(内标物的质量×纯度)，1.118mg
HIS—内标物定量目标峰的质子数，为2
AS—奥贝胆酸定量目标峰的积分值，为2.69
MS—奥贝胆酸的摩尔质量，420.63g/mol
MIS—内标物的摩尔质量，116.07g/mol
AIS—内标物定量目标峰的积分值，为1
HS—奥贝胆酸定量目标峰的质子数，为3
mS—奥贝胆酸样品的质量，7.386mg
实施例2
1H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，d1为80s，采样累加次数为32次，谱宽20ppm，测试温度为26℃，AQ为2.0s。
在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δH 6.27信号峰积分值为1，奥贝胆酸δH 0.61处信号积分值为2.71，根据公式-1可计算得到奥贝胆酸的纯度为99.1％，重复5次，相对标准偏差0.2％。
实施例3
1H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，d1为50s，采样累加次数为32次，谱宽20ppm，测试温度为26℃，AQ为4.1s。
在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δH 6.27信号峰积分值为1，奥贝胆酸δH 0.61处信号积分值为2.70，根据公式-1可计算得到奥贝胆酸的纯度为98.8％，重复5次，相对标准偏差0.1％。
实施例4
1H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，30°脉冲，d1为30s，采样累加次数为32次，谱宽20ppm，测试温度为26℃，AQ为4.1s。
在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δH 6.27信号峰积分值为1，奥贝胆酸δH 0.61处信号积分值为2.71，根据公式-1可计算得到奥贝胆酸的纯度为99.1％，重复5次，相对标准偏差0.3％。
实施例5
1H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，d1为25s，采样累加次数为32次，谱宽20ppm，测试温度为26℃，AQ为4.1s。
在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δH 6.27信号峰积分值为1，奥贝胆酸δH 0.61处信号积分值为2.71，根据公式-1可计算得到奥贝胆酸的纯度为99.1％，重复5次，相对标准偏差0.3％。
实施例6
1H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为600MHz，90°脉冲，d1为20s，采样累加次数为128次，谱宽20ppm，测试温度为26℃，AQ为3.0s。
在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δH 6.27信号峰积分值为1，奥贝胆酸δH 0.61处信号积分值为2.72，根据公式-1可计算得到奥贝胆酸的纯度为99.5％，重复5次，相对标准偏差0.2％。
实施例7
1H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，d1为15s，采样累加次数为64次，谱宽20ppm，测试温度为26℃，AQ为4.1s。
在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δH 6.27信号峰积分值为1，奥贝胆酸δH 0.61处信号积分值为2.72，根据公式-1可计算得到奥贝胆酸的纯度为99.5％，重复5次，相对标准偏差0.1％。
实施例8
1H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，50°脉冲，d1为100s，采样累加次数为128次，谱宽20ppm，测试温度为26℃，AQ为4.1s。
在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δH 6.27信号峰积分值为1，奥贝胆酸δH 0.61处信号积分值为2.72，根据公式-1可计算得到奥贝胆酸的纯度为99.5％，重复5次，相对标准偏差0.2％。
实施例9
1H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，90°脉冲，d1为15s，采样累加次数为64次，谱宽20ppm，测试温度为26℃，AQ为2.0s。
在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δH 6.27信号峰积分值为1，奥贝胆酸δH 0.61处信号积分值为2.71，根据公式-1可计算得到奥贝胆酸的纯度为99.1％，重复5次，相对标准偏差0.3％。
实施例10
1H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，30°脉冲，d1为30s，采样累加次数为32次，谱宽20ppm，测试温度为26℃，AQ为4.1s。
在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δH 6.27信号峰积分值为1，奥贝胆酸δH 0.61处信号积分值为2.71，根据公式-1可计算得到奥贝胆酸的纯度为99.1％，重复5次，相对标准偏差0.3％。
实施例11
1H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，30°脉冲，d1为20s，采样累加次数为64次，谱宽20ppm，测试温度为26℃，AQ为4.1s。
在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δH 6.27信号峰积分值为1，奥贝胆酸δH 0.61处信号积分值为2.72，根据公式-1可计算得到奥贝胆酸的纯度为99.5％，重复5次，相对标准偏差0.2％。
实施例12
1H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，30°脉冲，d1为15s，采样累加次数为32次，谱宽20ppm，测试温度为26℃，AQ为4.1s。
在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δH 6.27信号峰积分值为1，奥贝胆酸δH 0.61处信号积分值为2.70，根据公式-1可计算得到奥贝胆酸的纯度为98.8％，重复5次，相对标准偏差0.2％。
实施例13
1H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为400MHz，30°脉冲，d1为6s，采样累加次数为32次，谱宽20ppm，测试温度为26℃，AQ为4.1s。
在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δH 6.27信号峰积分值为1，奥贝胆酸δH 0.61处信号积分值为2.70，根据公式-1可计算得到奥贝胆酸的纯度为98.8％，重复5次，相对标准偏差0.1％。
实施例14
1H NMR测试样品同实施例1。核磁共振波谱仪共振频率为600MHz，30°脉冲，d1为15s，采样累加次数为32次，谱宽20ppm，测试温度为26℃，AQ为2.0s。
在1H NMR谱中，内标物顺丁烯二酸δH 6.27信号峰积分值为1，奥贝胆酸δH 0.61处信号积分值为2.71，根据公式-1可计算得到奥贝胆酸的纯度为99.1％，重复5次，相对标准偏差 0.2％。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种基于氢核磁共振快速测定奥贝胆酸原料药纯度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)测定奥贝胆酸和内标物各定量目标峰的纵向弛豫时间T1；
(2)根据所测定的T1值设置核磁共振波普仪的倾倒角和弛豫延迟时间(d1)，所述倾倒角为30～90°，所述弛豫延迟时间(d1)≥(7/3×T1max～5×T1max)。
2.如权利要求1所述的一种基于氢核磁共振快速测定奥贝胆酸原料药纯度的方法，其特征在于，所述倾倒角为30°、50°或90°，所述弛豫延迟时间(d1)为6～100s。
3.如权利要求1所述的一种基于氢核磁共振快速测定奥贝胆酸原料药纯度的方法，其特征在于，所述核磁共振波谱仪的检测参数为：共振频率为400～600MHz，谱宽20ppm，测试温度26℃，采样时间(AQ)为2.0～4.1s；采样累加次数为32～128次。
4.如权利要求1所述的一种基于氢核磁共振快速测定奥贝胆酸原料药纯度的方法，其特征在于，氘代试剂为重水、氘代甲醇或氘代二甲基亚砜。
5.如权利要求4所述的一种基于氢核磁共振快速测定奥贝胆酸原料药纯度的方法，其特征在于，所述氘代试剂为氘代二甲基亚砜。
6.如权利要求1所述的一种基于氢核磁共振快速测定奥贝胆酸原料药纯度的方法，其特征在于，所述奥贝胆酸的检测浓度为14.7-15.5mg/mL。
7.如权利要求1所述的一种基于氢核磁共振快速测定奥贝胆酸原料药纯度的方法，其特征在于，所述奥贝胆酸的定量目标峰化学位移为δH 0.61。
8.如权利要求1所述的一种基于氢核磁共振快速测定奥贝胆酸原料药纯度的方法，其特征在于，所述内标物为其质子化学位移在δH 16.00～6.27、δH 6.27～3.50、δH 3.50～2.50或δH 0.61～0.00范围内，且室温条件下不与奥贝胆酸发生化学反应的任意物质。
9.如权利要求1或8所述的一种基于氢核磁共振快速测定奥贝胆酸原料药纯度的方法，其特征在于，所述内标物为顺丁烯二酸。
10.如权利要求1所述的一种基于氢核磁共振快速测定奥贝胆酸原料药纯度的方法，其特征在于，测定奥贝胆酸及内标物中各定量目标峰的积分面积的计算方法为对每一信号6次积分取平均值。
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