CN105985915A - 调整gre3基因表达活性的酿酒酵母重组菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种调整酿酒酵母1308-P中的GRE3基因表达活性的基因工程菌株。本发明发现酿酒酵母中GRE3基因可导致木糖代谢时产生副产物木糖醇，并与发酵木糖过程中的耐受性相关。本发明还发现，虽然GRE3基因是负调控基因，但不应完全敲除。本发明经实验证实，通过敲除1308-P中的一个GRE3基因得到的工程菌株能够提高木糖发酵乙醇的效率，降低副产物木糖醇的生成。而且，该改造菌还具有不影响出发菌原有的葡萄糖利用率，同时抑制物耐受力高等优点。

Description

调整GRE3基因表达活性的酿酒酵母重组菌株及其应用

技术领域：

本发明涉及一种新的代谢木糖的基因工程菌株，具体涉及调整酿酒酵母1308-P中的GRE3基因表达活性的得到的基因工程菌株。

背景技术：

大多数工业酿酒酵母菌株不能代谢木糖，原因是其自身缺乏木糖到木酮糖的代谢途径。

酿酒酵母重组菌株1308-P是转入了Piromyces sp.njau1菌株XI基因的工程菌株，将自然界中木糖转化的代谢途径引入酿酒酵母并得到活性表达，提高了它们在厌氧条件下发酵葡萄糖和木糖产乙醇的能力。

但是，目前所获得的酿酒酵母重组菌株1308-P尚不能达到工业化生产要求，还有相当大的差距。该菌有两个主要缺点，一是在发酵过程中生成较多副产物木糖醇，降低了木糖发酵乙醇的效率；二是该菌在代谢木糖时，会受到木质纤维素水解物中所含的糠醛和羟甲基糠醛等的明显抑制作用，导致乙醇发酵难以达到最优效果。

因此，如果能够通过进行酿酒酵母1308-P的基因改造，得到新的基因工程菌株，能够提高对抑制物的耐受力，高效共发酵葡萄糖和木糖，并且在代谢木糖时降低副产物木糖醇生成，将会推进和加快秸秆乙醇生产技术的实用化进程，具有重要的经济和社会效益。

发明内容：

本发明的目的在于对酿酒酵母1308-P进行基因改造，得到一种新的能够高效共发酵葡萄糖和木糖的基因工程菌株，并且能够降低木糖醇生成，提高其对抑制物的耐受力。

本发明的研究工作得到了如下发现：

1、发现酿酒酵母中GRE3基因是负调控基因，导致木糖转化为乙醇的效率下降

本发明人发现，GRE3基因可导致木糖代谢时产生副产物木糖醇

发明人对转入了Piromyces sp.njau1菌株XI基因的工程酵母菌株1308-P，以秸秆糖化液进行培养，发现有明显的木糖醇生成，从而导致木糖转化为乙醇的效率下降。初步判断是通过GRE3基因(GeneID:856504)编码的内源性醛糖还原酶将木糖还原为木糖醇；

2、发现虽然GRE3基因是负调控基因，但不应完全敲除，只能合理调整GRE3基因的表达活性

工程酵母菌株1308-P是双倍体，有两条等位GRE3基因。

GRE3基因编码的内源性醛糖还原酶将木糖还原为木糖醇，会降低木糖发酵乙醇的产率。因此，理论上来讲，敲除GRE3基因可以提高表达木糖异构酶酿酒酵母的木糖利用率。

现有技术中，对具有负调控作用的两条GRE3等位基因的改造方法通常是：要么完全保留，要么完全敲除掉，使之完全丧失功能。

然而，由GRE3基因编码的醛糖还原酶属于应激蛋白，完全敲除有可能影响酵母对抑制物的耐受能力。合理调整GRE3基因的表达活性可以在不影响抑制物耐受力的前提下，有效降低副产物木糖醇的生成进而提高木糖转化为乙醇的效率。

本发明的解决问题的技术方案：

本发明对1308-P中GRE3基因表达活性进行了合理调整，即，利用双倍体的酵母的两条等位基因，敲除其中一条，使GRE3基因的表达活性下降，但又不完全丧失功能。通过此，证实了本发明的上述发现。

具体如下：

1)以质粒pUG6为模板，用所设计的引物克隆两端包含loxp位点的Kanr基因，其大小为1815bp，胶回收PCR敲除组件片段，连接T载体，测序；

2)用GRE3基因的敲除组件化转酿酒酵母1308-P，筛选转进G418抗性片段的菌株；

3)化转pSH65到以上所得的G418抗性菌株中，用YPG液体培养基诱导表达pSH65质粒上Cre基因表达将酿酒酵母基因组上Kanr基因切除，最终得到敲除一个GRE3基因的工程菌1308-GRE3Δ1。

GRE3序列如SEQ ID NO:1所示(Gene ID:856504)

敲除GRE3基因的GRE3Δ序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的有益结果：

本发明通过敲除一个GRE3基因得到的工程菌株1308-P-GRE3Δ1达到了本发明的目的。

通过与对照菌株(即，敲除二个GRE3基因得到的工程菌株1308-P-GRE3Δ2，以及出发菌株1308-P)所进行的生理生化的测定比较，1308-P-GRE3Δ1具有如下有益效果：

1)提高了生长速率和对抑制物的耐受力

在抑制物糠醛存在的情况下，工程菌株1308-P-GRE3Δ1生长速率比出发菌株1308-P约有提升(2.4％)，说明抑制物耐受力没有下降；

而1308-P-GRE3Δ2比出发菌株1308-P生长速率下降了9.21％，明显受到抑制物糠醛的抑制，抑制物耐受力下降明显。说明仅敲除一个GRE3基因比完全敲除GRE3基因效果好。

2)不影响出发菌原有的葡萄糖的利用率

1308-P-GRE3Δ1培养基的葡萄糖均几乎完全利用完；表明该工程菌株不影响葡萄糖的利用。

3)木糖利用率高，生成副产物木糖醇少

经过48h培养，出发菌株1308-P木糖利用率达到41.2％，副产物木糖醇最高达到5.65g/L；

而工程菌株1308-P-GRE3Δ1木糖利用率达到43.7％，副产物木糖醇相比出发菌株降低了75.1％；

虽然1308-P-GRE3Δ2副产物木糖醇和1308-P-GRE3Δ1相当，但木糖利用率低的多，仅为35.4％。

4)乙醇产量均比出发菌株和完全敲除GRE3基因的菌株高

在48h，工程菌株1308-P-GRE3Δ1比出发菌株1308-P提高了7.46％，比1308-P-GRE3Δ2也提高了8.11％。

此外，本发明通过以上实验首次发现并证明：

酿酒酵母中GRE3基因是影响其抑制物耐受力的因素之一，合理调整GRE3基因的表达活性可以在不影响抑制物耐受力的前提下，有效降低副产物木糖醇的生成进而提高木糖转化为乙醇的效率。

附图说明：

图1是实验菌株1308-P-GRE3Δ1、对照菌株1308-P-GRE3Δ2、对照菌株1308-P三个菌株的生长速率比较；横坐标为培养时间，纵坐标为菌体密度OD600值；

图2-4是发酵实验，其中，图2是1308-P发酵实验；图3是1308-P-GRE3Δ1发酵实验；图4是1308-P-GRE3Δ2发酵实验；

具体为：1308-P-GRE3Δ1、1308-P-GRE3Δ2与1308-P葡萄糖利用、木糖利用、乙醇生成和木糖醇生成的比较；横坐标为培养时间，纵坐标为浓度。

具体实施方式：

以下实施例中所举的质粒、菌株只是用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

试验材料和试剂

1、菌株及载体：质粒pUG6、pSH65均购自Invitrogen公司，酿酒酵母工业菌株1308(双倍体酵母)由所在实验室保存。

2、酶类及其它生化试剂：糠醛、连接酶购自NEB公司，其它试剂如未作具体说明都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、l％NaCl，pH7.0)。

(2)酵母培养基YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖，平板添加2％琼脂)

(3)选择培养基SC(0.67％YNB、2％葡萄糖，平板添加2％琼脂)

(4)含有抑制物的酵母发酵培养基(0.67％YNB、14％葡萄糖，7％木糖，0.2％糠醛)

实施例1酿酒酵母1308-P中GRE3基因的敲除

根据已知的GRE3基因和质粒pUG6的核甘酸序列，设计引物：设计方向为需要扩增的方向，引物长度为63-64bp，退火温度在60-65℃。并将它们命名为敲5’GRE3::hphMX、3’GRE3::hphMX(下游特异性引物)见表1。

表1GRE3基因敲除及验证引物

通过PCR得到敲除组件(1815bp)，扩增得到产物胶回收后送华大基因测序，通过比对分析测序序列，证实获得的序列与理论设计引物序列一致。

实施例2敲除组件化转酿酒酵母1308-P

⑴活化酿酒酵母1308-P，用灭菌去离子水清洗两遍后加入1ml灭菌去离子水取100μl备用；

⑵鲑鱼精50μl放入沸水中煮10min备用；

⑶PEG3350取240μl及LiAC36μl加入以上酿酒酵母与鲑鱼精和敲除组件涡悬混匀后放入30℃水浴中30min，再入于42℃45min；

⑷加入1mlYPD培养基于30℃120rpm培养1h；

⑸取20μl涂于含有G418抗生素的YPD平板上48h左右观察。

实施例3以上工程菌株化转pSH65及Kanr基因的切除(敲除组件中抗性筛选标记的去除)

⑴活化转进敲除组件的酿酒酵母1308-P，用灭菌去离子水清洗两遍后加入1ml灭菌去离子水取100μl备用；

⑵鲑鱼精50μl放入沸水中煮10min备用；

⑶PEG3350取240μl及LiAC36μl加入以上酿酒酵母与鲑鱼精和敲除组件涡悬混匀后放入30℃水浴中30min，再入于42℃45min；

⑷加入1mlYPD培养基于30℃120rpm培养1h；

⑸取20μl涂于含有抗生素腐草霉素的YPD平板上48h左右观察。

⑹将转进pSH65的菌株用YPG培养基(葡萄糖换成半乳糖)培养4-7h，诱导质粒pSH65上cre基因表达，切除基因组上Kanr基因，去除抗性；

⑺用YPD培养基传代丢失酿酒酵母中质粒pSH65，得到gre3缺失的1308-P-GRE3Δ1。重复操作去除工业酵母另一个GRE3等位基因，得到1308-P-GRE3Δ2。

实施例4各工程菌株生理生化的测定比较

1、实验目的

1)对比缺失一个或两个GRE3基因的工业酵母工程菌与出发菌的葡萄糖和木糖糖利用率、生长速率和乙醇产率

2)研究考核GRE3基因的作用，以发现如何合理调整GRE3基因的表达活性。

2、实验对象

实验菌株：1308-P-GRE3Δ1，为缺失一个GRE3基因并含pYES-PXI的工业酵母工程菌；

对照菌株1：1308-P，为含pYES-PXI的工业酵母菌；

对照菌株2：1308-P-GRE3Δ2，为缺失两个GRE3基因并含pYES-PXI的工业酵母工程菌。

3、实验方法

分别将各菌株在以葡萄糖/木糖的混合物(分别为140g/L和分别为70g/L的初始浓度)为唯一碳源并加有抑制物糠醛的发酵培养基中，30℃180rpm摇培71h；

间隔6h到12h取样一次；

用高效液相色谱法(HPLC)测定上清葡萄糖和木糖含量；

比较各菌株的葡萄糖和木糖糖利用率、生长速率和乙醇产率。

以上实验均重复3次以上。

4、实验结果

1)生长速率和抑制物耐受力

在抑制物糠醛存在的情况下，工程菌株1308-P-GRE3Δ1的生长速率比出发菌株1308-P约有提升(2.4％)，说明对抑制物耐受力没有下降；

而与1308-P-GRE3Δ2相比，1308-P生长速率下降了9.21％，明显受到抑制物糠醛的抑制，抑制物耐受力下降明显。

结果数据见图1、表2。

2)葡萄糖利用率

经过48h培养，实验菌株1308-P-GRE3Δ1与对照菌株1308-P以及1308-P-GRE3Δ2一样，培养基的葡萄糖均几乎完全利用；表明本实验菌株不影响葡萄糖的利用。

结果数据见图2-4、表2。

3)木糖利用率和副产物木糖醇生成

经过48h培养，出发菌株1308-P培养基的木糖利用率仅达到41.2％，木糖醇最高达到5.65g/L；

1308-P-GRE3Δ2木糖利用率达到35.4％，副产物木糖醇最高仅为1.39g/L，相比对照菌株1308-P降低了75.4％；

实验菌株1308-P-GRE3Δ1的木糖利用率最高，达到43.7％，副产物木糖醇最高仅为1.41g/L，和1308-P-GRE3Δ2相当，相比出发菌株1308-P降低了75.1％,。

结果数据见图2-4、表2。

4)乙醇产量

实验菌株1308-P-GRE3Δ1比出发菌株1308-P在48h高了7.46％，比对照菌株1308-P-GRE3Δ2提高了了8.11％。

结果数据见图2-4、表2。

表2菌株发酵数据

4、结论

1)1308-P-GRE3Δ1生长速率高，比出发菌株1308-P有提升；

2)与出发菌株相比，1308-P-GRE3Δ1可显著提高乙醇产量；

去除一个GRE3基因，菌的生长速率不会受到抑制物的抑制；

3)证明合理调整酿酒酵母中GRE3基因的表达活性非常关键

从以上实验中可看到：

A去除GRE3基因不影响出发菌原有的葡萄糖利用率；

B去除GRE3基因可显著降低副产物木糖醇的生成；

C去除一个GRE3基因与去除两个GRE3基因对降低木糖醇生成的影响相当；

D本发明通过合理调整GRE3基因的表达活性，不仅提高了木糖转化为乙醇的效率，而且有效降低副产物的生成。

Claims (10)

1.一种基因工程菌株，特征是在酿酒酵母1308-P中缺失一个具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的GRE3基因。

2.权利要求1所述菌株的构建方法，其特征在于用SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列替换酿酒酵母1308-P中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

3.权利要求2所述的方法，其步骤包括：构建GRE3基因敲除组件、将GRE3基因敲除组件转入酵母、敲除GRE3基因\去除抗性标记，最终得到缺失一个GRE3基因的重组菌株。

4.权利要求1所述菌株在发酵葡萄糖和木糖中的应用。

5.权利要求1所述菌株在乙醇生产中的应用。

6.一种重组基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

7.包含权利要求6所述基因的载体。

8.用权利要求7所述的载体转化的宿主细胞。

9.权利要求6所述基因在构建发酵葡萄糖和木糖的工程菌株中的应用。

10.SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的基因在调整木糖转化为乙醇的效率及调整木糖醇生成中的应用。