CN105968156A - 一种瑞加诺生的α异构体杂质及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种瑞加诺生的α异构体杂质，及其制备方法和医药用途。该杂质是通过定向合成所得，以2,6‑二氯腺嘌呤与β‑D‑四乙酰基核糖为起始原料，经缩合、氨解、成盐纯化获得α型的2‑氯腺苷的盐，再不经游离直接经过肼解、缩合、氨解得到瑞加诺生α异构体杂质。本发明将该异构体作为瑞加诺生杂质对照品，能够有效鉴定合成中产生该杂质的含量，从而提高了瑞加诺生的药品质量标准。
Description
技术领域
本发明属于药物合成领域，具体涉及一种瑞加诺生的α异构体杂质，其制备方法以及在瑞加诺生药品质量控制方面的应用。
背景技术
瑞加诺生（Regadenoson），化学名称1-(6-氨基-9-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃环-基)-9H-嘌呤-2-基)-N-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺一水合物，结构式如下所示，
。
瑞加诺生（Regadenoson）是一种具有高度选择性的腺苷A2A受体激动剂，可通过激活A2A腺苷受体，促进冠脉舒张和增加冠脉血流量，在心肌灌注造影研究中显示其应激作用有效。这款药物用于不能接受运动压力测试患者的放射性核素心肌灌注显像。临床医师也超适用症将其用于CT影像。本品由CV Therapeutics公司开发，2008年4月美国FDA批准上市，商品名Lexiscan，用于心肌灌注显像。
瑞加诺生有4个手性中心，3个来源于β-D-四乙酰基核糖，另外1个手性中心由嘌呤和核糖之间的缩合反应产生。瑞加诺生的化学结构为β-D型核苷，其合成路线中嘌呤和核糖的缩合反应往往在高温熔合或者溶剂高热回流下进行，除了产生大部分的β-D构型，不可避免地存有一定量的α构型杂质。
瑞加诺生上市销售和临床应用过程中，关于其可致严重心脏病的不良反应的风险就从未放松过警惕。2013年11月20日，美国食品与药物管理局（FDA）提醒医疗工作人员，心血管造影剂瑞加诺生（Lexiscan/regadenoson）和腺苷（Adenoscan/adenosine）存在导致罕见但严重的心脏病发作和死亡的危险。虽然该不良反应的引发可能是由多种因素导致，但是瑞加诺生药品中的杂质，特别是本发明首次报道所述α异构体杂质，会对瑞加诺生的安全用药带来风险。
现有技术中对该α异构体杂质的化学结构和药理活性均未见报道。因此，仔细研究瑞加诺生原料药和制剂中可能存在的α异构体杂质，有效控制该杂质含量是重要课题，由此带来的如何制备高纯度的该α异构体杂质作为对照品，对于控制瑞加诺生的药品质量是重中之重。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有瑞加诺生合成中产生的α异构体杂质不能有效鉴定和质量控制的技术问题，提供了一种瑞加诺生α异构体杂质及其制备方法和医药用途。本发明瑞加诺生α异构体杂质是瑞加诺生质量控制的必需品，能够有效鉴定瑞加诺生合成中产生的α异构体杂质，从而严格把控瑞加诺生的药品质量。
发明人在重复文献“瑞加诺生的合成，中国医药工业杂志，2014，45（8），705-707”中的工艺路线来合成瑞加诺生过程中发现，在最后一步嘌呤物与核糖缩合而成的瑞加诺生产品中会包含一种α异构体杂质，其理化性质与瑞加诺生十分接近，普通薄层色谱TLC无法区分两者的分子极性大小，常规条件的纯化方法例如重结晶、柱层析在最终成品阶段将其除尽十分困难，且难以重复和放大，亟需定制严格的定向合成路线和中间体控制方案。该杂质的存在对瑞加诺生用药质量和安全性影响很大。能否有效控制该α异构体杂质含量是瑞加诺生的质量控制的关键。
发明人经大量试验发现，瑞加诺生的质量控制在分析方法建立上必须使用该α异构体杂质的对照品进行液相定位。否则，由于两者极性差别微小，很容易把杂质峰误认为是瑞加诺生出峰，该杂质峰也极易包裹在主峰之内导致无法区分。因此，本发明该α异构体是瑞加诺生质量控制的必需品，杂质的存在还有可能引起严重的不良反应，因而本领域迫切需要有效鉴定和控制瑞加诺生原料药或制剂中该α异构体杂质含量。
本发明最终通过以下技术方案成功地解决上述技术问题。
本发明提供了一种如式1所示的瑞加诺生α异构体杂质，结构如下所示，
。
上述杂质的用途是用于瑞加诺生质量控制的有关物质对照品，或者用于瑞加诺生的杂质鉴定。
本发明人曾尝试通过增加瑞加诺生合成过程中相关反应的投料量，浓缩收集母液，进行柱层析纯化后得到该α异构体杂质。但是该方法费时费力，得率很低，纯度不高，且操作步骤的重现性较差，因此，亟待定向合成制备方法。
本发明提供一种如式1的瑞加诺生α异构体杂质的制备方法，其特征在于，包含下列步骤：
（a）在溶剂中，将2,6-二氯腺嘌呤与β-D-四乙酰基核糖在酸催化剂的条件下缩合反应，得到式2化合物；其中，溶剂不选择乙腈或者1,2-二氯乙烷中的任一种，溶剂是醚类溶剂、酯类溶剂中的一种或几种；酸催化剂是甲磺酸、对甲基苯磺酸、三氟甲磺酸三甲基硅酯、四氯化锡、酸性树脂催化剂“Amberlyst 15”中的一种或几种；
（b）将式2化合物溶于醇溶剂中，通入干燥氨气或者在氨水作用下进行氨解反应，得到式3化合物；醇溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇中的一种；反应温度为30-50℃；
（c）将式3化合物溶于四氢呋喃或二氧六环中，加入“酸HX”进行成盐反应，再加入乙酸乙酯或丙酮析出固体，得到式4化合物；其中，酸HX选自盐酸、硫酸、L-酒石酸中的一种；并且，式4化合物通过N次重结晶来控制其含有的β型副产物小于等于0.5%，其中N=0-2，该“β型副产物”结构如下所示，
；
（d）将式4化合物溶于95%乙醇中，与一水合肼进行肼解反应，反应温度为55-75℃，得到式5化合物；
（e）在醇溶剂中，将式5化合物与2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯反应，得到式6化合物；其中醇溶剂选自乙醇或异丙醇，反应温度为65-85℃；
（f）将式6化合物溶解于甲胺醇溶液中反应，反应温度为25-60℃，得到终产物式1化合物，即瑞加诺生α异构体杂质。
本发明的瑞加诺生α异构体杂质的制备方法，优选地，步骤a中，先将2,6-二氯腺嘌呤与β-D-四乙酰基核糖溶于醚类溶剂中，加入酸催化剂后，再加入酯类溶剂进行反应；其中醚类溶剂选自四氢呋喃、甲基四氢呋喃、二氧六环中的一种或几种；酸性催化剂选自四氯化锡、酸性树脂催化剂“Amberlyst 15”中的一种或几种；酯类溶剂选自乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸异丙酯中的一种或几种。
进一步优选地，步骤a中还添加3A分子筛增强该反应的立体选择性效果，其中3A分子筛的重量为2,6-二氯腺嘌呤与β-D-四乙酰基核糖的总重量的0.2%-20%。
本发明的瑞加诺生α异构体杂质的制备方法，优选地，醚类溶剂是甲基四氢呋喃，酯类溶剂是乙酸异丙酯，酸性催化剂选自四氯化锡和酸性树脂催化剂“Amberlyst 15”中的一种或两种；反应温度范围是-5至25℃。
进一步优选地，酸性催化剂选自四氯化锡和酸性树脂催化剂“Amberlyst 15”的组合物，该组合物重量是2,6-二氯腺嘌呤重量的14-18倍，且其中四氯化锡/酸性树脂催化剂“Amberlyst 15”的质量比为大于等于1：1；并且3A分子筛重量为2,6-二氯腺嘌呤与β-D-四乙酰基核糖的总重量的2%-5%。
本发明还提供了一种在制备式1化合物过程中的重要中间体，该中间体是由式3化合物与“酸HX”成盐制备而得，统一记作“式4化合物”，其中，“酸HX”是盐酸、硫酸、L-酒石酸中的一种，如下所示，
。
上述三种盐中，特别优选的是“酒石酸型的式4化合物”，如下所示，
，
并且该中间体的制备是由式3化合物与L-酒石酸成盐而成；该中间体的作用在于，通过形成该中间体，无需重结晶，即可控制其含有的β型副产物小于等于0.5%，所述“β型副产物”的结构如下所示，
。
本发明的瑞加诺生α异构体杂质的制备方法，优选地 ，
步骤b中，将式2化合物溶于异丙醇中，通入干燥氨气进行氨解反应，反应温度为30-35℃；
步骤c中，式3化合物溶于二氧六环中，相应地加入浓盐酸、浓硫酸或者L-酒石酸，在50-60℃成盐反应3-4h，加入乙酸乙酯，降温至0-5℃，搅拌析晶1-2h；式4化合物的重结晶选用甲醇/乙酸乙酯混合溶剂，甲醇/乙酸乙酯的体积比为2:5，重结晶的次数N=0-2，直至控制其含有的β型副产物小于等于0.5%；
步骤d中，一水合肼：式4化合物的摩尔比为10:1至15:1，反应温度58-68℃；
步骤e中，将式5化合物与2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯在异丙醇中75℃下反应3-5h，其中式5化合物：2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯的摩尔比为1:1至1:2；
步骤f中，将式6化合物溶解于含甲胺40%w/w的甲醇溶液中，在温度30-35℃常压搅拌反应8-12h，即得式1化合物的粗品，用DMF/乙醇/水的混合溶剂重结晶，得到式1化合物的精制品，其中，式6化合物：甲胺甲醇溶液的质量比为1:20至1:40。
本发明的瑞加诺生α异构体杂质的制备方法，作为一个更加优选的实施方法，具体包含如下步骤：
(1) 在氮气保护下，将2,6-二氯腺嘌呤与β-D-四乙酰基核糖溶于无水的甲基四氢呋喃中，降温至-5℃，加入酸性树脂催化剂“Amberlyst 15”和3A分子筛，待搅拌均匀后，缓慢滴加四氯化锡的无水甲基四氢呋喃溶液，控制反应温度在-5至0℃，滴毕，加入乙酸异丙酯，缓慢升至30-35℃继续反应3-4h，TLC监测反应完全后，过滤，滤液在强烈搅拌下，缓慢加入饱和碳酸氢钠溶液，二氯甲烷萃取，合并有机相，浓缩至干后加入甲基叔丁基醚打浆1h，抽滤所得固体，烘干，即得式2化合物；其中，2,6-二氯腺嘌呤：β-D-四乙酰基核糖的摩尔比为1:1.1至1:1.2；无水甲基四氢呋喃：2,6-二氯腺嘌呤的体积质量比为20g/mL至30g/mL；乙酸异丙酯：无水甲基四氢呋喃的体积比为1:2；2,6-二氯腺嘌呤：四氯化锡：“Amberlyst 15”的重量比为1:0.9:0.5；3A分子筛重量为2,6-二氯腺嘌呤与β-D-四乙酰基核糖的总重量的2%；
(2) 将式2化合物溶于异丙醇中，通入干燥的氨气，在30℃下搅拌反应12h，浓缩至干，得到式3化合物；
(3) 将式3化合物溶于二氧六环中，加入L-酒石酸，在60℃下搅拌反应4h，缓慢滴加乙酸乙酯，滴毕，降温至0℃，搅拌析晶2h，抽滤所得固体，烘干，即得式4化合物，HPLC纯度为99.7%；
(4) 将式4化合物加入95%乙醇中，在58℃下搅拌溶解，在氮气保护下，加入一水合肼，温度升至68℃反应15h，将反应液缓慢加入冰水中，搅拌1h，过滤所得固体，烘干，即得式5化合物；其中，一水合肼：式4化合物的摩尔比为12:1；
(5) 在氮气保护下，将式5化合物溶于异丙醇中，加热至75℃，加入2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯反应2h，TLC监测反应完全后，倒入冰水中，搅拌0.5h，过滤所得固体，用体积比为1:4的异丙醇/水混合溶剂打浆搅拌上述固体，抽滤干燥后得到式6化合物；其中式5化合物：2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯的摩尔比为1:1.2；
(6) 在常压下，将式6化合物溶解于含甲胺40%w/w的甲醇溶液中，在温度35℃搅拌反应12h，其中，式6化合物：甲胺甲醇溶液的质量比为1:30，当TLC监测反应完全后，浓缩反应液，加入甲基叔丁基醚醚，搅拌过滤，得到式1化合物粗品；
（7）将式1化合物粗品加入到体积比为1:2:1的DMF/乙醇/水的混合溶剂，该混合溶剂：粗品的体积重量比为8L/Kg-12L/Kg，回流搅拌1h后溶解，缓慢降温至0-5℃，静置析晶3h，抽滤所得固体，烘干，得到式1化合物精制品。
本发明中，如式1所示的瑞加诺生异构体杂质的制备方法和条件还可按照本领域的常规制备方法和条件获得，例如可以通过工艺放大试制、强制降解试验等，对瑞加诺生杂质进行富集与分离提纯。具体操作可采用本领域技术人员熟知的富集杂质和分离提纯的方法，例如，可以放大反应投料量，浓缩收集母液，进行柱层析、重结晶等方式提纯杂质。在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实施例。
由于瑞加诺生分子结构的不稳定性，往往会存在多种杂质化合物。这些杂质的存在会严重影响其产品的质量控制和用药安全，因此需要对瑞加诺生进行检测和监控。高效液相色谱法分为反向高效液相色谱和正相高效液相色谱，两者的固定相和流动相的不同，因此，正相色谱和反相色谱是差别显著的两种高效液相色谱方法。
瑞加诺生作为极性较大的化合物，采用通常的反相高效液相色谱法在等度洗脱条件下很难把瑞加诺生和其α异构体杂质进行洗脱和分离。现有技术中报道瑞加诺生检测分析方法的文献不多，文献“瑞加诺生的全合成研究，上海医药，2016,37（3）：73-75”中的液相条件是：色谱柱Agilent XDB-C18柱（4.6mm*250mm，10μm），流动相A：水，B：乙腈，梯度洗脱（0→5min：A95%；5→30min：A95%→90%；30→50min：A90%→50%），检测波长254nm，柱温25℃，流速1mL/min。该文献采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相高效液相色谱进行检测。鉴于该文献并未对瑞加诺生α异构体进行研究，本发明人按照上述文献中的液相条件，将本发明制备的α异构体杂质和瑞加诺生混合进样，发现两者的色谱峰重叠在一起，该方法不能用于检测瑞加诺生中的α异构体。文献“瑞加诺生的合成，中国医药工业杂志，2014，45（8），705-707”中采用的是等度洗脱方式，本发明人运用相同条件将α异构体杂质和瑞加诺生的混合溶液进样后确认该条件无法将两者加以区分。
本发明采用正相色谱方法的检测波长是在200-400nm波长范围内进行扫描所得，确定优选的检测波长为247nm。
瑞加诺生原料药的来源是参照文献“瑞加诺生的全合成研究，上海医药，2016,37（3）：73-75”，或者文献“瑞加诺生的合成，中国医药工业杂志，2014，45（8），705-707”中的制法来获得的。
根据以上，本发明还提供了一种利用如式1所示的瑞加诺生α异构体杂质作为杂质对照品，检测与分析瑞加诺生原料药中包含α异构体杂质含量的方法，具体包含如下步骤：
（I）色谱条件设置：采用正相高效液相色谱法检测，色谱柱为CHIRALPAK AD-H，该色谱柱的规格是内经4.6mm，长度250mm，填料粒径5μm，采用直链淀粉-三（3,5-二甲苯基氨基甲酸酯）涂布的硅胶为填充剂，流动相是正己烷-异丙醇-二乙胺的混合流动相，正己烷：异丙醇：二乙胺的体积比为72:27:1；检测波长247nm，柱温为30℃，流速为0.5mL/min；
（II）制备供试品溶液：取瑞加诺生原料药适量，甲醇溶解，再用流动相稀释，配成每1mL中含有0.02mg瑞加诺生的供试品溶液；
（III）制备对照品溶液：取瑞加诺生α异构体杂质对照品适量，用甲醇溶解，再用流动相稀释得对照品溶液，对照品溶液浓度为1μg/mL；
（IV）制备系统适用性溶液：分别取瑞加诺生对照品、α异构体杂质照品各适量，加甲醇溶解，并用流动相制成每1ml中各含约0.4μg的溶液，作为系统适应性溶液；
（V）检测：精密量取系统适应性溶液20μl，注入液相色谱仪，分离度应符合要求；再精密量取对照品溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按照外标法以峰面积计算供试品中的α异构体杂质的含量。
本发明带来了以下有益的技术效果：
（1）本发明通过定向合成所得，以2,6-二氯腺嘌呤与β-D-四乙酰基核糖为起始原料，经缩合、氨解、成盐纯化获得α型的2-氯腺苷的盐，再不经游离直接经过肼解、缩合、氨解得到瑞加诺生α异构体杂质。条件易控，试剂易得，路线简单，本发明制备的瑞加诺生α异构体HPLC纯度大于等于99.7%，十分胜任作为对照品使用。
（2）合成瑞加诺生α异构体不仅为瑞加诺生的杂质鉴定和检测提供对照品，为瑞加诺生原料药和制剂的质量标准的提高和质量控制提供有益参考，也为同类化合物合成提供参考。
（3）合成方法中，将式3化合物进行成盐，例如盐酸、硫酸或者L-酒石酸以得到式4化合物的盐型，可以在成盐过程或后续重结晶操作中除去β型副产物，大大提高了手性纯度，本发明特别优选的是L-酒石酸盐，仅需成盐过程，无需进一步重结晶即可得到HPLC纯度大于等于 99.7%的式4化合物纯品。
（4）瑞加诺生合成文献中惯用的酸催化剂如对甲苯磺酸、三氟甲磺酸三甲基硅酯，会使得产物中瑞加诺生β构型占绝大多数。出乎意料地，本发明人发现四氯化锡催化剂在相对低的温度下，能够获得α异构体占多数的产物，在此基础再再重结晶可实现α异构体的富集。进一步的研究中，本发明人发现四氯化锡遇水急剧地形成粘稠状的固态不溶物，使得搅拌困难，造成后处理和萃取操作的诸多操作不便。本发明创造性地减少四氯化锡用量，改用用固体酸催化剂“Amberlyst 15”代替， 一定程度上提高了α异构体生成量，并且本发明人还出人意料地发现3A分子筛可以起到固体载体的原位催化作用，进一步提升了反应的立体选择性，并且后处理产生的粘稠状的固态不溶物也由于3A分子筛的分散稀释作用变得方便抽滤。此外，发明人研究获得反应溶剂的影响因素，即反应所用溶剂的极性以及溶剂中的具有大的空间位阻的烷基基团，会对反应产物中的产物的比例发生影响，本发明的甲基四氢呋喃和乙酸异丙酯组合溶剂使得获得目标物的效率最高。
（5）传统制备杂质的方法往往是浓缩大量反应母液再柱层析分离。本发明采用的是定向合成方法，定向合成法中无需柱层析，简洁方便，终产品HPLC纯度大于等于99.7%。本方案实现了对瑞加诺生中存在的α异构体杂质的定向合成，使得用外标法（杂质对照品法）检测该异构体成为可能。运用外标法（杂质对照品法）检测时，具有如下优点：外标法更为准确，且实现对该杂质含量的测定；外标法可增大杂质峰与主峰的分离度。因此，采用外标法检测瑞加诺生中的异构体时，能够大大提高检测的精确度，从而实现对瑞加诺生的质量控制，提高临床用药的安全性。
附图说明
图1是式1化合物的ROESY图谱。
图2是瑞加诺生的ROESY图谱。
图3是式1化合物和瑞加诺生的对比合并的ORD图谱。
图4是用本发明分析方法检测的瑞加诺生原料药中该α异构体杂质含量的图谱。
图5是用文献“瑞加诺生的全合成研究，上海医药，2016,37（3）：73-75”中分析方法检测的图谱。
具体实施方式
下面结合优选实施例，对本发明进行进一步说明，但本发明决不限于下述实施例。
本发明所用试剂和物料均市售可得。瑞加诺生原料药的来源是参照文献“瑞加诺生的全合成研究，上海医药，2016,37（3）：73-75”，或者文献“瑞加诺生的合成，中国医药工业杂志，2014，45（8），705-707”中的制法来获得的。
实施例1 式2化合物的制备
在氮气保护下，将2,6-二氯腺嘌呤（500g，2.64mol）与β-D-四乙酰基核糖（923g，2.90mol）溶于无水的甲基四氢呋喃10L中，降温至-5℃，加入酸性树脂催化剂“Amberlyst15”约250g和3A分子筛约28.5g，待搅拌均匀后，缓慢滴加四氯化锡约450g的无水甲基四氢呋喃溶液800mL，控制反应温度在-5至0℃，滴毕，加入乙酸异丙酯5L，缓慢升至30-35℃继续反应3-4h，TLC监测反应完全后，过滤，滤液在强烈搅拌下，缓慢加入饱和碳酸氢钠溶液10L，二氯甲烷萃取（4L*3），合并有机相，浓缩至干后加入甲基叔丁基醚约5L打浆1h，抽滤所得固体，烘干，即得式2化合物约1063g，收率93%。HPLC检测α/β 产物比率为93:7。
实施例2 式3化合物的制备
将式2化合物（1063g，2.37mol）溶解于异丙醇25L中，持续通入干燥的氨气，在30℃下搅拌反应12h，浓缩至干，得到式3化合物约595g，收率83%。
实施例3 式4化合物的制备
将式3化合物（595g，1.97mol）溶于二氧六环4.5L中，加入L-酒石酸（310g，2.05mol），在60℃下搅拌反应4h，缓慢加入乙酸乙酯9L，滴毕，降温至0℃，搅拌析晶2h，抽滤所得固体，烘干，即得式4化合物约740g，收率83%，HPLC纯度为99.7%。
实施例4 式5化合物的制备
将式4化合物（740g，1.63mol）加入95%乙醇7L中，在58℃下搅拌溶解，在氮气保护下，加入80%质量分数的一水合肼（1.22Kg，19.56mol），温度升至68℃反应15h，将反应液缓慢加入冰水10L中，搅拌1h，过滤所得固体，烘干，即得式5化合物约445g，收率92%。
实施例5 式6化合物的制备
在氮气保护下，将式5化合物（445g，1.48mol）溶于异丙醇8L中，加热至75℃，加入2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯（256g，1.77mol）反应2h，TLC监测反应完全后，倒入冰水15L中，搅拌0.5h，过滤所得固体，用体积比为1:4的异丙醇/水混合溶剂约6L打浆搅拌上述固体，抽滤干燥后得到式6化合物约527g，收率88%。
实施例6 式1化合物粗品的制备
在常压下，将式6化合物（527g，1.28mol）溶解于含甲胺40%w/w的甲醇溶液约15.8Kg中，在温度35℃搅拌反应12h，TLC监测反应完全后，浓缩反应液，加入甲基叔丁基醚醚15L，搅拌过滤，得到式1化合物粗品约369g，收率74%。
实施例7 式1化合物精制品的制备
将式1化合物粗品约369g加入到体积比为1:2:1的DMF/乙醇/水的混合溶剂约4.4L，回流搅拌1h后溶解，缓慢降温至0-5℃，静置析晶3h，抽滤所得固体，烘干，得到式1化合物精制品324g，收率88%。HPLC检测纯度为99.7%。
实施例8 式2化合物的制备
在氮气保护下，将2,6-二氯腺嘌呤（500g，2.64mol）与β-D-四乙酰基核糖（923g，2.90mol）溶于无水的甲基四氢呋喃10L中，降温至-5℃，缓慢滴加四氯化锡约700g的无水甲基四氢呋喃溶液1L，控制反应温度在-5至0℃，滴毕，加入乙酸异丙酯5L，缓慢升至30-35℃继续反应3-4h，TLC监测反应完全后，过滤，滤液在强烈搅拌下，缓慢加入饱和碳酸氢钠溶液10L，二氯甲烷萃取（4L*3），合并有机相，浓缩至干后加入甲基叔丁基醚约5L打浆1h，抽滤所得固体，烘干，即得式2化合物，约838g，收率71%。HPLC检测α/β 产物比率为60:40。
实施例9 式2化合物的制备
在氮气保护下，将2,6-二氯腺嘌呤（500g，2.64mol）与β-D-四乙酰基核糖（923g，2.90mol）溶于无水的甲基四氢呋喃10L中，降温至-5℃，加入酸性树脂催化剂“Amberlyst15”约250g，待搅拌均匀后，缓慢滴加四氯化锡约450g的无水甲基四氢呋喃溶液800mL，控制反应温度在-5至0℃，滴毕，加入乙酸异丙酯5L，缓慢升至30-35℃继续反应3-4h，TLC监测反应完全后，过滤，滤液在强烈搅拌下，缓慢加入饱和碳酸氢钠溶液10L，二氯甲烷萃取（4L*3），合并有机相，浓缩至干后加入甲基叔丁基醚约5L打浆1h，抽滤所得固体，烘干，即得式2化合物，约968g，收率82%。HPLC检测α/β 产物比率为86:14。
实施例10 式2化合物的制备
在氮气保护下，将2,6-二氯腺嘌呤（500g，2.64mol）与β-D-四乙酰基核糖（923g，2.90mol）溶于无水的甲基四氢呋喃10L中，降温至-5℃，加入酸性树脂催化剂“Amberlyst15”约350g，待搅拌均匀后，缓慢滴加四氯化锡约350g的无水甲基四氢呋喃溶液800mL，控制反应温度在-5至0℃，滴毕，加入乙酸异丙酯5L，缓慢升至30-35℃继续反应3-4h，TLC监测反应完全后，过滤，滤液在强烈搅拌下，缓慢加入饱和碳酸氢钠溶液10L，二氯甲烷萃取（4L*3），合并有机相，浓缩至干后加入甲基叔丁基醚约5L打浆1h，抽滤所得固体，烘干，即得式2化合物，约920g，收率78%。HPLC检测α/β 产物比率为74:26。
试验例1 式2化合物制备中催化剂的考察
其中，条件A：1.4倍重量四氯化锡；条件B：0.7倍重量四氯化锡,0.7倍重量Amberlyst15；条件C：0.9倍重量四氯化锡，0.5倍重量Amberlyst15；条件D：0.9倍重量四氯化锡，0.5倍重量Amberlyst15， 2%的3A分子筛。
注：固定溶剂为甲基四氢呋喃和乙酸异丙酯不变，“收率”是指反应后处理得到产物的重量，其中包含有α和β型的化合物。
实施例11 式2化合物的制备
在氮气保护下，将2,6-二氯腺嘌呤（500g，2.64mol）与β-D-四乙酰基核糖（923g，2.90mol）溶于无水的甲基四氢呋喃10L中，降温至-5℃，加入酸性树脂催化剂“Amberlyst15”约250g和3A分子筛约28.5g，待搅拌均匀后，缓慢滴加四氯化锡约450g的无水甲基四氢呋喃溶液800mL，控制反应温度在-5至0℃，滴毕，加入乙酸乙酯5L，缓慢升至30-35℃继续反应3-4h，TLC监测反应完全后，过滤，滤液在强烈搅拌下，缓慢加入饱和碳酸氢钠溶液10L，二氯甲烷萃取（4L*3），合并有机相，浓缩至干后加入甲基叔丁基醚约5L打浆1h，抽滤所得固体，烘干，即得式2化合物，约920g，收率78%。HPLC检测α/β 产物比率为75:25。
实施例12 式2化合物的制备
在氮气保护下，将2,6-二氯腺嘌呤（500g，2.64mol）与β-D-四乙酰基核糖（923g，90mol）溶于无水的甲基四氢呋喃10L中，降温至-5℃，加入酸性树脂催化剂“Amberlyst 15”约250g和3A分子筛约28.5g，待搅拌均匀后，缓慢滴加四氯化锡约450g的无水甲基四氢呋喃溶液800mL，控制反应温度在-5至0℃，滴毕，加入乙酸异丁酯5L，缓慢升至30-35℃继续反应3-4h，TLC监测反应完全后，过滤，滤液在强烈搅拌下，缓慢加入饱和碳酸氢钠溶液10L，二氯甲烷萃取（4L*3），合并有机相，浓缩至干后加入甲基叔丁基醚约5L打浆1h，抽滤所得固体，烘干，即得式2化合物，约956g，收率81%。HPLC检测α/β 产物比率为88:12。
试验例2 式2化合物的制备中溶剂的考察
注：“收率”是指反应后处理得到产物的重量，其中包含有α和β型的化合物。
实施例13 盐酸盐型的式4化合物的制备
将式3化合物（297g，0.98mol）溶于二氧六环2.2L中，加入浓盐酸（110g，1.1mol），在50℃下搅拌反应4h，缓慢加入丙酮4.5L，滴毕，降温至0℃，搅拌析晶2h，抽滤所得固体，烘干，即得式4化合物约302g，HPLC检测纯度为89.3%。
实施例14 硫酸盐型的式4化合物的制备
将式3化合物（297g，0.98mol）溶于二氧六环2.2L中，加入浓硫酸（105g，1.05mol），在50℃下搅拌反应4h，缓慢加入乙酸乙酯4.5L，滴毕，降温至0℃，搅拌析晶2h，抽滤所得固体，烘干，即得式4化合物约309g，HPLC检测纯度为92.4%。
试验例3 式4化合物盐型的考察
注:上述重结晶体系选用甲醇/乙酸乙酯混合溶剂，体积比为甲醇：乙酸乙酯=2:5。
实施例14 式2化合物的制备
在氮气保护下，将2,6-二氯腺嘌呤（250g,1.32mol）与β-D-四乙酰基核糖（502g,1.58mol）溶于无水的二氧六环6L中，降温至-5℃，加入酸性树脂催化剂“Amberlyst 15”约125g和3A分子筛约14g，待搅拌均匀后，缓慢滴加四氯化锡约225g的无水二氧六环溶液300mL，控制反应温度在-5至0℃，滴毕，加入乙酸异丁酯5L，缓慢升至30-35℃继续反应3-4h，TLC监测反应完全后，过滤，滤液在强烈搅拌下，缓慢加入饱和碳酸氢钠溶液5L，二氯甲烷萃取（2L*3），合并有机相，浓缩至干后加入甲基叔丁基醚约3L打浆1h，抽滤所得固体，烘干，即得式2化合物，约478g，收率81%。
实施例15 式1化合物的制备
将酒石酸型式4化合物（370g，0.81mol）加入95%乙醇3.5L中，在55℃下搅拌溶解，在氮气保护下，加入80%质量分数的一水合肼（0.61Kg，9.78mol），温度升至75℃反应15h，将反应液缓慢加入冰水5L中，搅拌1h，过滤所得固体，烘干，即得式5化合物约211g，收率88%。
在氮气保护下，将式5化合物（211g，0.71mol）溶于异丙醇4L中，加热至65℃，加入2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯（123g，0.85mol）反应2h，TLC监测反应完全后，倒入冰水6L中，搅拌0.5h，过滤所得固体，用体积比为1:4的异丙醇/水混合溶剂约3L打浆搅拌上述固体，抽滤干燥后得到式6化合物约287g，收率82%。
在常压下，将式6化合物（287g，0.71mol）溶解于含甲胺40%w/w的甲醇溶液约8.6Kg中，在温度35℃搅拌反应12h，TLC监测反应完全后，浓缩反应液，加入甲基叔丁基醚醚7L，搅拌过滤，得到式1化合物粗品约194g，收率70%。
将式1化合物粗品约194g加入到体积比为1:2:1的DMF/乙醇/水的混合溶剂约1.6L，回流搅拌1h后溶解，缓慢降温至0-5℃，静置析晶3h，抽滤所得固体，烘干，得到式1化合物精制品168g，收率87%。
实施例16 式1化合物的结构确证
质谱：ESI-MS（m/z）：413.13[M+Na]+，391.14[M+H]+
图1是式1化合物的ROESY图谱。
图2是瑞加诺生的ROESY图谱。
图3是式1化合物和瑞加诺生的对比合并的ORD图谱，其中上面谱线对应瑞加诺生，下面谱线对应式1化合物。
实施例17 检测瑞加诺生原料药中α异构体杂质的正相高效液相色谱方法
该方法利用瑞加诺生α异构体杂质作为杂质对照品，用外标法检测瑞加诺生原料药中α异构体杂质含量，具体包含如下步骤：
（I）色谱条件设置：采用正相高效液相色谱法检测，色谱柱为CHIRALPAK AD-H，且该色谱柱的规格是内经4.6mm，长度250mm，填料粒径5μm，采用直链淀粉-三（3,5-二甲苯基氨基甲酸酯）涂布的硅胶为填充剂，流动相是正己烷-异丙醇-二乙胺混合流动相，正己烷：异丙醇：二乙胺的体积比为72:27:1；检测波长247nm，柱温为30℃，流速为0.5mL/min；
（II）制备供试品溶液：精密取瑞加诺生原料药适量，甲醇溶解，再用流动相稀释，配成每1mL中含有0.02mg瑞加诺生的供试品溶液；
（III）制备对照品溶液：取瑞加诺生α异构体杂质对照品适量，用甲醇溶解，再用流动相稀释得对照品溶液，对照品溶液浓度为1μg/mL；
（IV）制备系统适用性溶液：分别取瑞加诺生对照品、α异构体杂质照品各适量，加甲醇溶解，并用流动相制成每1ml中各含约0.4μg的溶液，作为系统适应性溶液；
（V）检测：精密量取系统适应性溶液20μl，注入液相色谱仪，分离度应符合要求；再精密量取对照品溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按照外标法以峰面积计算供试品中的α异构体杂质的含量。
采用上述液相方法测得按照文献制备的瑞加诺生中，α异构体杂质的含量为0.13%。
液相图谱见附图4。
试验例4 采用文献报道的反相高效液相色谱法检测
按照文献“瑞加诺生的全合成研究，上海医药，2016,37（3）：73-75”中的液相条件：色谱柱Agilent XDB-C18柱（4.6mm*250mm，10μm），流动相A：水，B：乙腈，梯度洗脱（0→5min：A95%；5→30min：A95%→90%；30→50min：A90%→50%），检测波长254nm，柱温25℃，流速1mL/min。
混合溶液：取瑞加诺生和α异构体杂质各20μg，加入1mL流动相作为混合溶液
混合溶液的检测结果是瑞加诺生与α异构体的色谱峰重叠在一起，上面文献中反相高效液相色谱条件不能用于检测瑞加诺生中的异构体杂质，详见附图5。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围汇总，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于本权利要求范围之中。
Claims (10)
1.一种如式1所示的瑞加诺生α异构体杂质，其特征在于，该杂质的用途是用于瑞加诺生质量控制的有关物质对照品，或者用于瑞加诺生的杂质鉴定，
。
2.一种如式1的瑞加诺生α异构体杂质的制备方法，其特征在于，包含下列步骤：
（a）在溶剂中，将2,6-二氯腺嘌呤与β-D-四乙酰基核糖在酸催化剂的条件下缩合反应，得到式2化合物；其中，溶剂不选择乙腈或者1,2-二氯乙烷中的任一种，溶剂是醚类溶剂、酯类溶剂中的一种或几种；酸催化剂是甲磺酸、对甲基苯磺酸、三氟甲磺酸三甲基硅酯、四氯化锡、酸性树脂催化剂“Amberlyst 15”中的一种或几种；
（b）将式2化合物溶于醇溶剂中，通入干燥氨气或者在氨水作用下进行氨解反应，得到式3化合物；醇溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇中的一种；反应温度为30-50℃；
（c）将式3化合物溶于四氢呋喃或二氧六环中，加入“酸HX”进行成盐反应，再加入乙酸乙酯或丙酮析出固体，得到式4化合物；其中，酸HX选自盐酸、硫酸、L-酒石酸中的一种；并且，式4化合物通过N次重结晶来控制其含有的β型副产物小于等于0.5%，其中N=0-2，该“β型副产物”结构如下所示，
；
（d）将式4化合物溶于95%乙醇中，与一水合肼进行肼解反应，反应温度为55-75℃，得到式5化合物；
（e）在醇溶剂中，将式5化合物与2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯反应，得到式6化合物；其中醇溶剂选自乙醇或异丙醇，反应温度为65-85℃；
（f）将式6化合物溶解于甲胺醇溶液中反应，反应温度为25-60℃，得到终产物式1化合物，即瑞加诺生α异构体杂质。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤a中，先将2,6-二氯腺嘌呤与β-D-四乙酰基核糖溶于醚类溶剂中，加入酸催化剂后，再加入酯类溶剂进行反应；其中醚类溶剂选自四氢呋喃、甲基四氢呋喃、二氧六环中的一种或几种；酸性催化剂选自四氯化锡、酸性树脂催化剂“Amberlyst 15”中的一种或几种；酯类溶剂选自乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸异丙酯中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤a中还添加3A分子筛增强该反应的立体选择性效果，其中3A分子筛的重量为2,6-二氯腺嘌呤与β-D-四乙酰基核糖的总重量的0.2%-20%。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，醚类溶剂是甲基四氢呋喃，酯类溶剂是乙酸异丙酯，酸性催化剂选自四氯化锡和酸性树脂催化剂“Amberlyst 15”中的一种或两种；反应温度范围是-5至25℃。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，酸性催化剂选自四氯化锡和酸性树脂催化剂“Amberlyst 15”的组合物，该组合物重量是2,6-二氯腺嘌呤重量的14-18倍，且其中四氯化锡/酸性树脂催化剂“Amberlyst 15”的质量比为大于等于1：1；并且3A分子筛重量为2,6-二氯腺嘌呤与β-D-四乙酰基核糖的总重量的2%-5%。
7.一种式1化合物制备过程中的重要中间体，其特征在于，其是如下所示的“酒石酸型的式4化合物”，
；
并且，该中间体的制备是由式3化合物与L-酒石酸成盐而成；该中间体的作用在于，通过形成该中间体，无需重结晶，即可控制其含有的β型副产物小于等于0.5%，所述“β型副产物”的结构如下所示，
。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
步骤b中，将式2化合物溶于异丙醇中，通入干燥氨气进行氨解反应，反应温度为30-35℃；
步骤c中，式3化合物溶于二氧六环中，相应地加入浓盐酸，浓硫酸或者L-酒石酸，在50-60℃成盐反应3-4h，加入乙酸乙酯，降温至0-5℃，搅拌析晶1-2h；式4化合物的重结晶选用甲醇/乙酸乙酯混合溶剂，甲醇/乙酸乙酯的体积比为2:5，重结晶的次数N=0-2，直至控制含有的β型副产物小于等于0.5%；
步骤d中，一水合肼：式4化合物的摩尔比为10:1至15:1，反应温度58-68℃；
步骤e中，将式5化合物与2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯在异丙醇中75℃下反应3-5h，其中式5化合物：2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯的摩尔比为1:1至1:2；
步骤f中，将式6化合物溶解于含甲胺40%w/w的甲醇溶液中，在温度30-35℃常压搅拌反应8-12h，即得式1化合物的粗品，用DMF/乙醇/水的混合溶剂重结晶，得到式1化合物的精制品，其中，式6化合物：甲胺甲醇溶液的质量比为1:20至1:40。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，作为一个更加优选的实施方法，具体包含如下步骤：
(1) 在氮气保护下，将2,6-二氯腺嘌呤与β-D-四乙酰基核糖溶于无水的甲基四氢呋喃中，降温至-5℃，加入酸性树脂催化剂“Amberlyst 15”和3A分子筛，待搅拌均匀后，缓慢滴加四氯化锡的无水甲基四氢呋喃溶液，控制反应温度在-5至0℃，滴毕，加入乙酸异丙酯，缓慢升至30-35℃继续反应3-4h，TLC监测反应完全后，过滤，滤液在强烈搅拌下，缓慢加入饱和碳酸氢钠溶液，二氯甲烷萃取，合并有机相，浓缩至干后加入甲基叔丁基醚打浆1h，抽滤所得固体，烘干，即得式2化合物；其中，2,6-二氯腺嘌呤：β-D-四乙酰基核糖的摩尔比为1:1.1至1:1.2；无水甲基四氢呋喃：2,6-二氯腺嘌呤的体积质量比为20g/mL至30g/mL；乙酸异丙酯：无水甲基四氢呋喃的体积比为1:2；2,6-二氯腺嘌呤：四氯化锡：“Amberlyst 15”的重量比为1:0.9:0.5；3A分子筛重量为2,6-二氯腺嘌呤与β-D-四乙酰基核糖的总重量的2%；
(2) 将式2化合物溶于异丙醇中，通入干燥的氨气，在30℃下搅拌反应12h，浓缩至干，得到式3化合物；
(3) 将式3化合物溶于二氧六环中，加入L-酒石酸，在60℃下搅拌反应4h，缓慢滴加乙酸乙酯，滴毕，降温至0℃，搅拌析晶2h，抽滤所得固体，烘干，即得式4化合物，HPLC纯度为99.7%；
(4) 将式4化合物加入95%乙醇中，在58℃下搅拌溶解，在氮气保护下，加入一水合肼，温度升至68℃反应15h，将反应液缓慢加入冰水中，搅拌1h，过滤所得固体，烘干，即得式5化合物；其中，一水合肼：式4化合物的摩尔比为12:1；
(5) 在氮气保护下，将式5化合物溶于异丙醇中，加热至75℃，加入2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯反应2h，TLC监测反应完全后，倒入冰水中，搅拌0.5h，过滤所得固体，用体积比为1:4的异丙醇/水混合溶剂打浆搅拌上述固体，抽滤干燥后得到式6化合物；其中式5化合物：2-甲酰基-3-氧代丙酸乙酯的摩尔比为1:1.2；
(6) 在常压下，将式6化合物溶解于含甲胺40%w/w的甲醇溶液中，在温度35℃搅拌反应12h，其中，式6化合物：甲胺甲醇溶液的质量比为1:30，当TLC监测反应完全后，浓缩反应液，加入甲基叔丁基醚醚，搅拌过滤，得到式1化合物粗品；
（7）将式1化合物粗品加入到体积比为1:2:1的DMF/乙醇/水的混合溶剂，该混合溶剂：粗品的体积重量比为8L/Kg-12L/Kg，回流搅拌1h后溶解，缓慢降温至0-5℃，静置析晶3h，抽滤所得固体，烘干得到式1化合物精制品。
10.一种利用如式1所示的瑞加诺生α异构体杂质作为杂质对照品，检测与分析瑞加诺生原料药中包含α异构体杂质含量的方法，具体包含如下步骤：
（I）色谱条件设置：采用正相高效液相色谱法检测，色谱柱为CHIRALPAK AD-H，该色谱柱的规格是内经4.6mm，长度250mm，填料粒径5μm，采用直链淀粉-三（3,5-二甲苯基氨基甲酸酯）涂布的硅胶为填充剂，流动相是正己烷-异丙醇-二乙胺的混合流动相，正己烷：异丙醇：二乙胺的体积比为72:27:1；检测波长247nm，柱温为30℃，流速为0.5mL/min；
（II）制备供试品溶液：取瑞加诺生原料药适量，甲醇溶解，再用流动相稀释，配成每1mL中含有0.02mg瑞加诺生的供试品溶液；
（III）制备对照品溶液：取瑞加诺生α异构体杂质对照品适量，用甲醇溶解，再用流动相稀释得对照品溶液，对照品溶液浓度为1μg/mL；
（IV）制备系统适用性溶液：分别取瑞加诺生对照品、α异构体杂质照品各适量，加甲醇溶解，并用流动相制成每1ml中各含约0.4μg的溶液，作为系统适应性溶液；
（V）检测：精密量取系统适应性溶液20μl，注入液相色谱仪，分离度应符合要求；再精密量取对照品溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按照外标法以峰面积计算供试品中的α异构体杂质的含量。
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