CN105963368B - 抗耐药菌的药物组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗耐药菌的药物组合物及其制备方法和应用。所述药物组合物是一种由金银花和连翘配伍后的药物组合物为原料制备得到的精制产物。该药物组合物包含金银花0‑10重量份，连翘0‑10重量份，将上述的药物组合物进行初次精制和再次精制，得到最优活性组分。试验研究结果表明，该两次精制后的产物具有显著的抗菌活性，与传统的抗生素相比，具有独特的抗菌优势，为临床上耐药菌的彻底杀灭增加了候选药物，丰富了现有技术。

Description

抗耐药菌的药物组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种抗耐药菌的药物组合物，尤其涉及一种抗耐药菌的金银花、连翘配伍后的药物组合物及其制备方法和应用，属于医药技术领域。

背景技术

由于抗生素的滥用，耐药菌大量出现，导致临床治疗失败、感染的复发、并增加死亡的危险性。耐药菌感染已遍布全球，在社区或医院中可引起散发、交叉传播，甚至爆发流行，对婴幼儿、免疫缺陷者和老年人的威胁很大。针对抗生素产生耐药性的此类病菌感染，已成为全球医疗卫生界面临的难题。中药在这方面的研究已取得了一定的进展。双黄连粉针剂对上述耐药菌均有抑菌和杀菌作用，但作用相对较弱。本发明所涉及的药物对临床常见耐药菌均有抑菌和杀菌作用，并且作用明显优于双黄连粉针剂。

发明内容

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种抗耐药菌的药物组合物，包含金银花0-10重量份，连翘0-10重量份。

优选地，包含金银花2重量份，连翘8重量份。

本发明提供了一种由上述的抗耐药菌的药物组合物为原料制备得到的提取物。

本发明提供了制备上述的提取物的方法，按以下步骤进行：

按照上述的重量份分别称取金银花、连翘后，加入溶剂中，回流提取，过滤，合并滤液，浓缩，干燥即得。

其中，所述的溶剂选自水或50％(v/v)乙醇或95％(v/v)乙醇。

本发明提供了一种由上述的提取物为原料制备得到的最佳初次精制产物。

本发明提供了制备上述的最佳初次精制产物的方法，按以下步骤进行：

将所述提取物，进行柱色谱分离，用溶剂梯度洗脱，回收溶剂后干燥，得到初次精制产物，选取其中的最佳初次精制产物。

其中，所述梯度洗脱的溶剂分别为：水、20％(V/V)乙醇、40％(V/V)乙醇、60％(V/V)乙醇、80％(V/V)乙醇。

其中，所述的最佳初次精制产物是20％(V/V)乙醇～40％(V/V)乙醇洗脱部位得到的产物。

本发明提供了一种由上述的最佳初次精制产物为原料制备得到的最佳再次精制产物。

本发明提供了制备上述的最佳再次精制产物的方法，按以下步骤进行：

将上述的最佳初次精制产物，进行柱色谱分离，用溶剂梯度洗脱，回收溶剂后干燥，得到再次精制产物，选取其中的最佳再次精制产物。

其中，所述梯度洗脱的溶剂分别为：20％(V/V)乙醇、25％(V/V)乙醇、30％(V/V)乙醇、35％(V/V)乙醇、40％(V/V)乙醇。

其中，所述的最佳再次精制产物是25％(V/V)乙醇～30％(V/V)乙醇洗脱部位得到的产物。

本发明还提供了上述的提取物在制备抗耐药菌的药物中的应用。

本发明还提供了上述的最佳初次精制产物在制备抗耐药菌的药物中的应用。

本发明还提供了上述的最佳再次精制产物在制备抗耐药菌的药物中的应用。

其中，所述的耐药菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MDR-MRSA)、耐大环内酯类和四环素类无乳链球菌、多药耐药粪肠球菌HLAR菌⁺、耐头孢菌素类嗜麦芽寡养单胞菌、多药耐药阴沟肠杆菌、耐四环素类聚团肠杆菌、多药耐药大肠埃希菌、多药耐药奇异变形杆菌、多药耐药肺炎克雷伯菌、多药耐药产碱假单胞菌。上述耐药菌均为临床常见致病菌，主要是呼吸系统和泌尿生殖系统感染，对常用抗生素多有耐药性，给临床治疗带来了困难。

本发明中的试验研究结果表明，以金银花、连翘配伍后的药物组合物经过两次精制后的产物具有显著的抗菌活性，与传统的抗生素相比，具有独特的抗菌优势，为临床上耐药菌的彻底杀灭增加了候选药物，丰富了现有技术，可以为临床用药提供选择。

附图说明

图1是金银花、连翘及其配伍后用不同溶剂提取得到的提取物抗MDR-MRSA对比图(MIC)；

图2是金银花、连翘及其配伍后用不同溶剂提取得到的提取物抗MDR-MRSA对比图(MBC)；

图3是不同洗脱部位得到的初次精制产物抗MDR-MRSA对比图(MIC)；

图4是不同洗脱部位得到的初次精制产物抗MDR-MRSA对比图(MBC)；

图5是不同洗脱部位得到的再次精制产物抗MDR-MRSA对比图(MIC)；

图6是不同洗脱部位得到的再次精制产物抗MDR-MRSA对比图(MBC)；

图7是最佳再次精制产物对临床常见耐药菌的作用对比图(MIC)；

图8是最佳再次精制产物对临床常见耐药菌的作用对比图(MBC)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

一、药物提取物的制备

本发明中使用的金银花和连翘均符合2015年版《中国药典》中的各项规定。

本发明中所述的乙醇百分含量均为体积百分含量(v/v)。

实施例1水作为提取溶剂

(1)金银花提取物的制备：取50g金银花加入800ml水中，回流提取3次，过滤，合并滤液，浓缩，干燥即得金银花水提取物；

(2)连翘提取物的制备：取50g连翘加入800ml水中，回流提取3次，过滤，合并滤液，浓缩，干燥即得连翘水提取物；

(3)药物组合物提取物的制备：将金银花50g、连翘50g按照重量比为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9的配伍比例计算后分别称重、混合后得到不同配伍比例的药物组合物，然后分别加入800ml水中，回流提取3次，过滤，合并滤液，浓缩，干燥即得金银花、连翘不同配伍比例的药物组合物水提取物。

实施例2 50％(v/v)乙醇作为提取溶剂

(1)金银花提取物的制备：取50g金银花加入800ml的50％乙醇中，回流提取3次，过滤，合并滤液，浓缩，干燥即得金银花的50％(v/v)乙醇提取物；

(2)连翘提取物的制备：取50g连翘加入800ml的50％乙醇中，回流提取3次，过滤，合并滤液，浓缩，干燥即得连翘的50％(v/v)乙醇提取物；

(3)药物组合物提取物的制备：将金银花50g、连翘50g按照重量比为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9的配伍比例计算后分别称重、混合后得到不同配伍比例的药物组合物，然后分别加入800ml的50％乙醇中，回流提取3次，过滤，合并滤液，浓缩，干燥即得金银花、连翘不同配伍比例的药物组合物的50％(v/v)乙醇提取物。

实施例3 95％(v/v)乙醇作为提取溶剂

(1)金银花提取物的制备：取50g金银花加入800ml的95％乙醇中，回流提取3次，过滤，合并滤液，浓缩，干燥即得金银花的95％(v/v)乙醇提取物；

(2)连翘提取物的制备：取50g连翘加入800ml的95％乙醇中，回流提取3次，过滤，合并滤液，浓缩，干燥即得连翘的95％(v/v)乙醇提取物；

(3)药物组合物提取物的制备：将金银花50g、连翘50g按照重量比为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9的配伍比例计算后分别称重、混合后得到不同配伍比例的药物组合物，然后分别加入800ml的95％乙醇中，回流提取3次，过滤，合并滤液，浓缩，干燥即得金银花、连翘不同比例配伍的药物组合物的95％(v/v)乙醇提取物。

二、抗MDR-MRSA的性能评价

将上述实施例中得到的各种提取物采用微量稀释法进行体外抗菌实验，确定最佳提取方法及配伍比例，确定最优抗MDR-MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)的药物提取物。

1、MDR-MRSA菌株

由黑龙江中医药大学附属第一医院检验科分离并鉴定。

2、菌液的制备

无菌条件下，挑取单个菌落，放入生理盐水中，混匀，其浊度与0.5麦氏比浊管比对，浊度相同后，取100μL加10mL液体培养基，即得浓度为10⁶CFU/mL的试验菌液。

3、实验方法

取96孔细胞培养板，从A行开始，每孔加入100μL液体培养基，然后在A孔加入待测药液，将A行的药液与培养基混匀后取出100μL加入B孔，依次类推至H孔，最后一孔取出的液体弃去之后取试验菌液，除阴性对照行外，均加入已配好的试验菌液100μL，盖好盖子，用封口膜封好，37℃孵育18h。

4、MIC及MBC的测定

MIC的测定：将药物倍比稀释，加入菌液，37℃孵育18h，无细菌生长的最低药物浓度。为使结果快速清晰，可在每孔中加入5g/L氯化三苯四氮唑(TTC)5μL，35℃孵育1～3h后有细菌生长孔呈红色。培养板中有混浊的孔既有细菌生长，每列最后一个澄清的孔即为该药物的最低抑菌浓度。

MBC的测定：将MIC结果中澄清各孔的液体取10μL，加在固体培养基上，培养18h，没有细菌生长的最低药物浓度即为杀菌浓度。

5、实验结果

实验结果见表1-表3，结果对比见图1、图2。

表1 水提取物的抗MDR-MRSA作用结果

表2 50％乙醇提取物的抗MDR-MRSA作用结果

表3 95％乙醇提取物的抗MDR-MRSA作用结果

6、结论

通过上述实验可以看出，对于配伍后的组合物和连翘单味药，均是水提取物的抗MDR-MRSA效果优于50％乙醇提取物和95％乙醇提取物的抗MDR-MRSA的效果，对于金银花单味药来说，50％乙醇提取物的抗MDR-MRSA效果优于水提取物和95％乙醇提取物的抗MDR-MRSA的效果。此外，金银花、连翘配伍使用抗MDR-MRSA的作用优于单味药的使用，因此，二者配伍使用效果更好。在药物组合物的三种溶剂提取物中，金银花和连翘重量比为2：8配伍得到的水提取物的抗菌效果最好，因此，确定药物组合物中金银花药材和连翘药材的最佳配伍重量比为2：8。

三、精致工艺的确定

在确定金银花和连翘最佳配伍重量比的基础上，对精致工艺进行优化。将连翘的水提取物、金银花的50％乙醇提取物及最佳配伍后所得的药物组合物的水提取物经AB-8大孔树脂柱色谱分离。AB-8大孔树脂预处理方法及流程为：以0.5倍柱体积的95％乙醇浸泡树脂24小时(1倍柱体积为1个树脂床体积)后，用2倍柱体积的95％乙醇以2倍柱体积/小时的流速洗涤树脂至流出液加水不呈白色混浊为止。再用水以2倍柱体积/小时的流速洗净。用2倍柱体积的5％盐酸溶液以4-6倍柱体积/小时的流速通过树脂层，并浸泡2-4小时，而后用水以同样流速洗至出水pH中性。再用2倍柱体积的2％氢氧化钠溶液以4-6倍柱体积/小时的流速通过树脂层，并浸泡2-4小时，而后用水以同样流速洗至出水pH中性。分别用水和不同体积百分比的乙醇进行梯度洗脱，将各洗脱部位采用微量稀释法进行体外抗菌实验，确定抗MDR-MRSA最优活性组分。

1、初次精制

实施例4金银花50％乙醇提取物的初次精制

将实施例2中的金银花50％乙醇提取物5g用10L水溶解，进行大孔树脂柱色谱分离，分别用水8L、20％乙醇20L、40％乙醇10L、60％乙醇3L、80％乙醇2L进行梯度洗脱，将各洗脱部位回收溶剂后干燥得到初次精制产物，备用。

实施例5连翘水提取物的初次精制

将实施例1中的连翘水提取物5g用10L水溶解，进行大孔树脂柱色谱分离，分别用水8L、20％乙醇20L、40％乙醇10L、60％乙醇3L、80％乙醇2L进行梯度洗脱，将各洗脱部位回收溶剂后干燥得到初次精制产物，备用。

实施例6药物组合物水提取物的初次精制

将实施例1中的金银花、连翘按照重量比为2:8配伍后的药物组合物的水提取物5g用10L水溶解，进行大孔树脂柱色谱分离，分别用水8L、20％乙醇20L、40％乙醇10L、60％乙醇3L、80％乙醇2L进行梯度洗脱，将各洗脱部位回收溶剂后干燥得到初次精制产物，备用。

2、抗MDR-MRSA的性能评价

将实施例4、5、6得到的各种初次精制产物采用前述相同的微量稀释法进行体外抗菌实验，确定最佳初次精制产物。

3、实验结果

见表4、表5、图3、图4。

表4 不同洗脱部位得到的初次精制产物抗MDR-MRSA的MIC(mg·mL^-1)结果表

表5 不同洗脱部位得到的初次精制产物抗MDR-MRSA的MBC(mg·mL^-1)结果表

从上述内容可以看出，初次精制产物中20％乙醇～40％乙醇洗脱部位中的活性组分抗菌效果最好，因此，确定初次精制工艺中的最佳初次精制产物为20％乙醇～40％乙醇洗脱部位得到的产物。

4、再次精制

实施例7金银花最佳初次精制产物的再次精制

将实施例4中得到的最佳初次精制产物10克，用水5L溶解，进行大孔树脂柱色谱分离，分别用20％乙醇8L、25％乙醇10L、30％乙醇15L、35％乙醇20L、40％乙醇18L进行梯度洗脱，将各洗脱部位回收溶剂后干燥得到再次精制产物，备用。

实施例8连翘最佳初次精制产物的再次精制

将实施例5中得到的最佳初次精制产物10克，用水5L溶解，进行大孔树脂柱色谱分离，分别用20％乙醇8L、25％乙醇10L、30％乙醇15L、35％乙醇20L、40％乙醇18L进行梯度洗脱，将各洗脱部位回收溶剂后干燥得到再次精制产物，备用。

实施例9药物组合物最佳初次精制产物的再次精制

将实施例6中得到的最佳初次精制产物10克，用水5L溶解，进行大孔树脂柱色谱分离，分别用20％乙醇8L、25％乙醇10L、30％乙醇15L、35％乙醇20L、40％乙醇18L进行梯度洗脱，将各洗脱部位回收溶剂后干燥得到再次精制产物，备用。

5、抗MDR-MRSA的性能评价

将实施例7、8、9得到的各种再次精制产物采用前述相同的微量稀释法进行体外抗菌实验，确定最佳再次精制产物。

6、实验结果

见表6、表7、图5、图6。

表6 不同洗脱部位得到的再次精制产物抗MDR-MRSA的MIC(mg·mL^-1)结果表

表7 不同洗脱部位得到的再次精制产物抗MDR-MRSA的MBC(mg·mL^-1)结果表

从上述内容可以看出，再次精制产物中25％乙醇～30％乙醇洗脱部位中的活性组分抗菌效果最好，因此，确定再次精制工艺中的最佳再次精制产物为25％乙醇～30％乙醇洗脱部位得到的产物。

四、对临床常见耐药菌的作用

1、菌株来源

从临床分离并鉴定了9种耐药菌，分别是耐大环内酯类和四环素类无乳链球菌、多药耐药粪肠球菌HLAR菌⁺、耐头孢菌素类嗜麦芽寡养单胞菌、多药耐药阴沟肠杆菌、耐四环素类聚团肠杆菌、多药耐药大肠埃希菌、多药耐药奇异变形杆菌、多药耐药肺炎克雷伯菌、多药耐药产碱假单胞菌。

采用微量稀释法，考察了分别以金银花、连翘及二者以最佳配伍后的药物组合物为原料制备得到的最佳再次精致产物对这9种耐药菌的作用。

2、药物的配制

将实施例7中得到的金银花再次精制产物100.60mg，用2ml液体培养基溶解，备用。

将实施例8中得到的连翘再次精制产物100.20mg，用2ml液体培养基溶解，备用。

将实施例9中得到的药物组合物再次精制产物100.60mg，用2ml液体培养基溶解，备用。

取双黄连粉针剂100.80mg，用2ml液体培养基溶解，备用。

3、抗MDR-MRSA的性能评价

将上述2中配制好的药物采用前述相同的微量稀释法进行体外抗菌实验。

4、实验结果见表8、表9、图7、图8。

表8 连翘、金银花及其配伍后的最佳再次精致产物对临床常见耐药菌的抑菌作用结果表MIC(mg·mL^-1)

表9 连翘、金银花及其配伍后的最佳再次精致产物对临床常见耐药菌的杀菌作用结果表MBC(mg·mL^-1)

表8中菌株1到9与表9中的菌株相同。分别是：1-耐大环内酯类和四环素类无乳链球菌、2-多药耐药粪肠球菌HLAR菌⁺、3-耐头孢菌素类嗜麦芽寡养单胞菌、4-多药耐药阴沟肠杆菌、5-耐四环素类聚团肠杆菌、6-多药耐药大肠埃希菌、7-多药耐药奇异变形杆菌、8-多药耐药肺炎克雷伯菌、9-多药耐药产碱假单胞菌。

从上述结果可以看出，金银花、连翘配伍后所得再次精致产物对临床常见的耐药菌均具有不同程度的抑菌和杀菌作用，其作用优于单味药的再次精致产物，也优于双黄连粉针剂。上述耐药菌主要来自呼吸系统和泌尿生殖系统，因此本发明对上述两系统的耐药菌具有抗菌作用，且作用优于双黄连粉针剂。

Claims (3)

1.一种抗耐药菌的药物组合物的再次精制产物，其特征在于，按照以下步骤制备得到：

分别称取金银花2重量份、连翘8重量份后，加入水中，回流提取，过滤，合并滤液，浓缩，干燥即得抗耐药菌的药物组合物的提取物；

将所述提取物，进行AB-8大孔树脂柱色谱分离，用溶剂梯度洗脱，回收溶剂后干燥，得到初次精制产物，其中，所述梯度洗脱的溶剂分别为：水、20％(V/V)乙醇、40％(V/V)乙醇、60％(V/V)乙醇、80％(V/V)乙醇，所述的初次精制产物是20％(V/V)乙醇～40％(V/V)乙醇洗脱部位得到的产物；

将所述的初次精制产物，进行AB-8大孔树脂柱色谱分离，用溶剂梯度洗脱，回收溶剂后干燥，得到再次精制产物，其中，所述梯度洗脱的溶剂分别为：20％(V/V)乙醇、25％(V/V)乙醇、30％(V/V)乙醇、35％(V/V)乙醇、40％(V/V)乙醇；所述的再次精制产物是25％(V/V)乙醇～30％(V/V)乙醇洗脱部位得到的产物。

2.一种制备抗耐药菌的药物组合物的再次精制产物的方法，其特征在于，按照以下步骤制备得到：

分别称取金银花2重量份、连翘8重量份后，加入水中，回流提取，过滤，合并滤液，浓缩，干燥即得抗耐药菌的药物组合物的提取物；

将所述提取物，进行AB-8大孔树脂柱色谱分离，用溶剂梯度洗脱，回收溶剂后干燥，得到初次精制产物，其中，所述梯度洗脱的溶剂分别为：水、20％(V/V)乙醇、40％(V/V)乙醇、60％(V/V)乙醇、80％(V/V)乙醇，所述的初次精制产物是20％(V/V)乙醇～40％(V/V)乙醇洗脱部位得到的产物；

将所述的初次精制产物，进行AB-8大孔树脂柱色谱分离，用溶剂梯度洗脱，回收溶剂后干燥，得到再次精制产物，其中，所述梯度洗脱的溶剂分别为：20％(V/V)乙醇、25％(V/V)乙醇、30％(V/V)乙醇、35％(V/V)乙醇、40％(V/V)乙醇；所述的再次精制产物是25％(V/V)乙醇～30％(V/V)乙醇洗脱部位得到的产物。

3.权利要求1所述的再次精制产物在制备抗耐药菌的药物中的应用。