CN105294813A - 一种化合物止泻木碱及其在制备抑菌药物方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域,公开了一种化合物止泻木碱、制备方法及其在制备抑菌药物方面的应用。试验结果证明止泻木碱在单药抑菌试验中对选用的两种细菌菌株具有较好的抑制活性；在联合抑菌试验中与青霉素或万古霉素联合用药的体外抗菌活性作用显著。本发明能有效解决细菌对多种抗生素的耐药问题，组合物成分之间具有显著的协同增效作用，可减少抗生素的用量，从而相应降低抗生素产生的副作用和不良反应。

Description

一种化合物止泻木碱及其在制备抑菌药物方面的应用

技术领域

本发明属医药技术领域,涉及化合物止泻木碱及其在制备抑菌药物方面的新用途。

背景技术

由于近年来人们对抗生素的过分依赖和滥用，耐药菌的种类快速增加，并已迅速衍生出具有多重耐药性的新型菌株，这些多重耐药菌与结核菌、艾滋病病毒相并列，已成为对人类健康构成重大威胁的三大病原微生物。在被称为抗生素“黄金时代”的五六十年代，全世界每年死于感染性疾病的人数约为700万，而这一数字到了1999年上升到2000万。在号称世界上科技最发达国家的美国，1982至1992年间死于传染性疾病的人数上升了40％，死于败血症的人数上升了89％。造成病死率升高的主要原因是耐药菌带来的用药困难。

在我国，滥用抗生素的情况也十分普遍。据调查我国门诊感冒患者中约有75％使用抗生素进行治疗，而外科手术使用抗生素的情况则高达95％。在住院患者中，抗生素使用率为79％，而英国这一数字为22％，世界平均水平也仅为30％。如果我们继续这种抗生素的滥用，那么在不久的将来，会有一种对所有抗生素都具有耐药性的细菌出现，而那时人类将重新回到上个世纪没有青霉素的年代。

因此，为了缓解和避免这种情况的发生，在严格控制抗生素使用量的同时，积极开发针对多重耐药菌的抗菌药物则具有积极而重大的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新生物碱类化合物止泻木碱。

该化合物的化学名称为:(3S,3aS,5aS,5bR,9S,11aR,11bS,13aR)-氮,3,11a-三甲基-2,3,3a,4,5,5a,5b,6,8,9,10,11,11a,11b,12,13-十六氢-1氢-萘-[2',1':4,5]-吲哚-[1,7a-c]-吡咯-9-胺。

止泻木碱的结构式

本发明第二个目的是提供化合物止泻木碱的制备方法，具体地说是提供一种从植物、中药材或中药饮片中获得或者通过合成以及半合成手段获得化合物止泻木碱的方法。

方法一

(1)止泻木子药材粉碎后,经溶剂提取法,采用体积分数50％-100％的乙醇或甲醇浸泡后回流提取,提取2-3次,合并提取液,减压回收提取液至醇浓度低于5％(体积分数),所含生药浓度20-40g/mL,滤过后取滤液或离心后取上清液；

(2)步骤(1)中所得滤液或上清液(或止泻木子工业尾料浸膏)经非极性大孔树脂柱色谱处理,依次用水和醇梯度洗脱,得到体积分数为60％-100％醇洗脱部位,减压回收溶剂；

(3)步骤(2)所得醇洗物经硅胶柱色谱法分离,以二氯甲烷、甲醇或甲醇、乙酸乙酯梯度洗脱得到目标化合物。

方法二

(1)止泻木子药材粉碎后,经溶剂提取法,采用体积分数为50％-100％的乙醇或甲醇浸泡后回流提取,提取2-3次,合并提取液,减压回收提取液至醇浓度低于5％(体积分数),所含生药浓度20-40g/mL,滤过后取滤液或离心后取上清液；

(2)步骤(1)中所得滤液或上清液(或止泻木子工业尾料浸膏)经以体积比1:1～1:2的乙酸乙酯、正丁醇分别萃取2-4次,减压回收溶剂得到乙酸乙酯、正丁醇萃取部位；

(3)步骤(2)所得正丁醇萃取物经硅胶柱色谱法分离,以甲醇、乙酸乙酯或二氯甲烷、甲醇梯度洗脱,得目标化合物结晶。

上述方法制得的化合物的理化性质如下：

白色粉末(甲醇)，碘化铋钾反应阳性。该化合物的¹Hand¹³C-NMR数据归属见表1。

表1止泻木碱的¹H、¹³C-NMR光谱数据(CD₃OD,¹H:300MHz,¹³C:75MHz)

本发明的第三个目的是提供化合物止泻木碱在制备抑菌药物方面的新应用。

止泻木碱采用体外培养法筛选实验,结果表明:止泻木碱在单药抑菌试验中对选用的两种细菌菌株具有较好的的抑制活性；在联合抑菌试验中与青霉素或万古霉素联合用药的体外抗菌活性作用显著。具体数据为单独抑菌试验中止泻木碱对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌有极强的抑制作用,MIC值128μg/mL；对耐甲氧西林并耐万古霉素的金黄色葡萄球菌有极强的抑制作用,MIC值为128μg/mL。联合抑菌实验结果：止泻木碱与青霉素联合用药时对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌、对耐甲氧西林并耐万古霉素的金黄色葡萄球菌的MIC值分别为：1.100μg/mL、0.116μg/mL，止泻木碱与万古霉素联合用药时对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌、对耐甲氧西林并耐万古霉素的金黄色葡萄球菌的MIC值分别为：0.127μg/mL、0.116μg/mL。

以及其在制药领域中在抑菌方面的新用途

止泻木碱在临床上可以制备成用于抑菌的药物制剂。用该化合物做为药效成分来制备用于抑菌的药物制剂,可单独或与制药工艺中可接受的赋形剂结合,按照常规方法制成口服给药、腔道给药、肌肉或静脉给药的药物剂型。

具体实施方式

下面结合实施例来更详细的说明本发明,但本发明并不受这些实施例的限制。

实施例1：止泻木碱的制备方法：

称取止泻木子20Kg，用10倍量体积分数为75％的乙醇-水溶液加热回流提取3次，每次1h，提取液经过滤，减压回收乙醇得浸膏。浸膏经水分散后，用正丁醇萃取，所得萃取液经减压回收得正丁醇萃取物566g。取300g正丁醇萃取物，经反复硅胶吸附柱色谱，以二氯甲烷一甲醇(100:1-1:100)系统进行梯度洗脱得流分49-68，合并为A；将A流分经SephadexLH-20柱色谱以二氯甲烷-甲醇(5:1-1:1)进行梯度洗脱得流分A8-A18,合并为H；再经HPLC以甲醇一水(5:95-95:5)系统进行梯度洗脱,同时结合重结晶等手段分离纯化，得化合物结晶6.1mg，经理化性质和波谱数据鉴定为止泻木碱。

实施例2止泻木碱对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林并耐万古霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)的体外抗菌活性测定与抗菌活性比较

参照美国临床实验室标准化委员会CLSI(前身NCCLS)药敏实验方案,测定化合物Conimine的体外抑菌活性。

材料与方法

实验菌株：

实验菌株MSSA(甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌)，MRSA(耐甲氧西林并耐万古霉素的金黄色葡萄球菌)，对这些菌株进行了传代培养，然后用于本实施例中。

药品与试剂：

青霉素与万古霉素为华北制药股份有限公司产品，生化分析纯。MH培养基、BHI肉汤为北京奥博星生物技术有限公司产品，Na₂S₂O₃、NaOH、氯化钠为天津市大茂化学试剂厂产品，琼脂为北京科密欧化学试剂有限公司产品，蒸馏水(沈阳药科大学)。

细菌BHI肉汤培养基的配制：

取脑心浸出液肉汤(BHI)24.5g，溶于500mL蒸馏水中，再加10g琼脂，调pH7.4±0.2，分装后115℃灭菌30min。

细菌MH肉汤培养基的配制：

取MH培养基24.0g，加热溶于1000mL蒸馏水中，调pH7.2±0.2，分装后115℃灭菌30min。

细菌菌悬液的制备：

用接种环挑取形态相近的菌落3-5个，接种于含有5mLBHI肉汤培养基的试管中，37℃孵育24h。增菌后的菌液用M-H肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含有1-2×10⁴CFU/mL。经M-H肉汤1：1000稀释后，作为接种用菌悬液。

实验仪器：

仪器与试剂分析天平；721-2000型分光光度计(上冻高密彩虹分析仪器有限公司)；ZHJH-C型豪华型超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)；LDZX型立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；WMK-02型电热恒温培养箱(湖北省黄石市医疗器械厂)

实验方案

药品配制：

浓度配成2560μg/mL：称取2560μg样品后，用1mL体积的溶剂溶解。

实验方法

在96孔培养板中加100μL培养基，然后加化合物止泻木碱，受试样品设不同浓度，每浓度均设3复孔，分别加100μL菌悬液，将96孔板放入小盒中，尽量不要接触到板，培养箱中37℃培养，24h时观察结果。

以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳性对照孔(即不含药物)内细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。

实验结果

结果显示,在单药抑菌实验以及联合抑菌试验中生物碱类化合物止泻木碱对选用的2种细菌菌株均有显著的抑制活性。

青霉素、万古霉素抑菌实验结果：青霉素对MSSA菌、MRSA菌的MIC值分别为：16μg/mL、0.5μg/mL，万古霉素对MSSA菌、MRSA菌的MIC值分别为：4μg/mL、32μg/mL。

单药抑菌实验结果：止泻木碱对MSSA菌、MRSA菌的MIC值分别为：128μg/mL、128μg/mL。

联合抑菌实验结果：止泻木碱与青霉素联合用药时对MSSA菌、MRSA菌的MIC值分别为：1.100μg/mL、0.116μg/mL，止泻木碱与万古霉素联合用药时对MSSA菌、MRSA菌的MIC值分别为：0.127μg/mL、0.116μg/mL。

实验结果表明，止泻木碱单独用药时对MSSA以及MRSA具有较好的抑制活性；止泻木碱与青霉素、万古霉素联合用药时对MSSA以及MRSA的抑制活性显著增强，止泻木碱与青霉素联合用药在抑制MRSA菌活性方面具有协同作用、止泻木碱与万古霉素联合用药在抑制MSSA菌、MRSA菌活性方面均具有协同作用。

实施例3:片剂的制备

取止泻木碱50g,加入淀粉细粉150g,用等量递增法混匀,加入滑石粉5g,硬脂酸镁2g,混匀,用85％乙醇制粒,干燥,整粒,压制成1000片,每日3次,每次2片。

实施例4:胶囊的制备

取止泻木碱50g,加入淀粉细粉200g,滑石粉10g,硬脂酸镁5g,混匀,制粒,干燥,装入胶囊,制成1000粒,每日3次,每次2片。

实施例5:片剂的制备

取Conimine100g,加入微晶纤维素250g,交联聚乙烯毗咯烷酮50g,混匀,加入90乙醇制粒,干燥,整粒,加入梭甲基淀粉钠10g,硬脂酸镁5g,混匀,压制成1000片,每日服用3次,每次1片。

实施例6:注射液的制备

取止泻木碱50g,甘露醇150g,加注射用水2000ml,搅拌使溶解,用1MNaOH溶液调pH至9.60-10.0,搅拌使溶解,滤过,滤液按1％溶液体积量加入活性炭,在70～80℃下加热30分钟,粗滤过,管道及容器用400mL注射用水洗涤,加水到2500ml,药液经0.22pm无菌过滤器过滤,灌装,冻干,压塞,轧盖,制成1000瓶,即得。

实施例5：

止泻木碱的制备方法：称取止泻木子20Kg，用10倍量体积分数为75％的乙醇-水溶液加热回流提取3次，每次1h，提取液经过滤，减压回收乙醇得浸膏。浸膏经水分散后，用正丁醇萃取，所得萃取液经减压回收得正丁醇萃取物566g。取300g正丁醇萃取物，经反复硅胶吸附柱色谱，以二氯甲烷一甲醇(100:1-1:100)系统进行梯度洗脱得流分49-68，合并为A；将A流分经SephadexLH-20柱色谱以二氯甲烷-甲醇(5:1-1:1)进行梯度洗脱得流分A8-A18,合并为H；再经HPLC以甲醇一水(5:95-95:5)系统进行梯度洗脱,同时结合重结晶等手段分离纯化，得化合物结晶6.1mg，经理化性质和波谱数据鉴定为止泻木碱。

Claims (8)

1.止泻木碱，其特征在于具有以下结构：

。

2.根据权利要求1所述化合物的制备方法，其步骤为：

(1)止泻木子药材粉碎后,采用体积分数50%-100%的乙醇或甲醇浸泡后回流提取,提取2-3次,合并提取液,减压回收提取液至醇浓度低于5%,所含生药浓度20-40g/mL,滤过后取滤液或离心后取上清液;

(2)步骤(1)中所得滤液或上清液或止泻木子工业尾料浸膏经非极性大孔树脂柱色谱处理,依次用水和醇梯度洗脱,得到体积分数为60%-100%醇洗脱部位,减压回收溶剂;

(3)步骤(2)所得醇洗物经硅胶柱色谱法分离,以二氯甲烷、甲醇或甲醇、乙酸乙酯梯度洗脱即得。

3.根据权利要求1所述化合物的制备方法，其步骤为：

(1)止泻木子药材粉碎后,经溶剂提取法,采用体积分数为50%-100%的乙醇或甲醇浸泡后回流提取,提取2-3次,合并提取液,减压回收提取液至醇浓度低于5%,所含生药浓度20-40g/mL,滤过后取滤液或离心后取上清液;

(2)步骤(1)中所得滤液或上清液(或止泻木子工业尾料浸膏)经以体积比1:1～1:2的乙酸乙酯、正丁醇分别萃取2-4次,减压回收溶剂得到乙酸乙酯、正丁醇萃取部位;

(3)步骤(2)所得正丁醇萃取物经硅胶柱色谱法分离,以甲醇、乙酸乙酯或二氯甲烷、甲醇梯度洗脱,即得。

4.根据权利要求1所述的化合物在制备抑菌药物方面的应用。

5.一种药物组合物，包括止泻木碱和药学上可以接受的载体。

6.根据权利要求5所述的组合物,其可制成口服给药制剂。

7.根据权利要求5所述的组合物,其可制成肌肉或静脉给药制剂。

8.根据权利要求6所述的口服给药制剂,包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、缓释制剂、滴丸。