CN105963246B - 一种染料木素盐口服溶液剂及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种染料木素盐口服溶液剂及制备方法和应用，它由一定比例的赖氨酸、染料木素、阿斯巴甜、小苏打原料制成。步骤是：A、称取一定比例的赖氨酸加入3‑10倍水，40‑60℃搅拌溶解；B、将一定比例的染料木素加入上述A溶液中，在40‑60℃继续搅拌4‑6 h，过滤，滤液备用；C、称取一定比例的阿斯巴甜、小苏打加入上述B溶液，室温搅拌溶解，过滤分装。本发明还提供了染料木素口服溶液剂在制备治疗或预防肺癌药物中的应用，该溶液剂对非小细胞肺癌A549/DPP细胞株具有耐药逆转作用，同时可抑制肺癌细胞A549细胞和非小细胞肺癌细胞A549/DPP增殖并诱导其凋亡，显示出较好的抗肿瘤作用。

Description

一种染料木素盐口服溶液剂及制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药、保健品领域，更具体是涉及一种染料木素口服溶液剂，同时还涉及一种染料木素口服溶液剂的制备方法，还涉及一种染料木素口服溶液剂在制备治疗或预防肺癌药物中的应用。
背景技术
染料木素(Genistein)又称金雀异黄素、染料木黄酮、5，7，4′-三羟基异黄酮，主要是从大豆、三叶草、葛根、槐花、槐角、染料木(金雀花)和广豆根等豆科植物中提取出来的活性成分，是一种天然的酪氨酸激酶和大豆代谢物，被称为植物雌激素。染料木素为异黄酮类物质中活性功能最高的一种，为单一成分，是一种非雌激素类化合物，具有雌激素及抗雌激素的双重调节作用，同时广泛应用于制药、保健品等领域。经研究认为，染料木素具有如下功效：
(一)具有雌性激素及抗雌激素性质
(二)具有抗氧化作用
(三)可以抑制酪氨酸蛋白激酶(PTK)的活性
(四)可以抑制拓扑异购酶Ⅱ的活性
(五)抑制细胞周期：使细胞停止于G2/M期；诱导肿瘤细胞凋亡：通过上调相关促凋亡基因，下调相应抗凋亡基因，来促进肿瘤细胞的凋亡进而预防限制肿瘤的发生。因而具有诱发细胞程序性死亡、提高抗癌药效、抑制血管生成等作用。
由于染料木素药理活性的综述指明，染料木素具有明显的降血脂、抗癌、抗肿瘤(刘莉,李鑫,刘丰等,中国动脉硬化杂志,2008,16(12):928-932；刘春龙,李忠秋,孙海霞等,大豆科学,2008,27(4):693-696)、防治骨质疏松、抗氧化、抗动脉粥样硬化、雌激素样作用等生理活性(F G E Perabo,E C Von L w,J Ellinger et al.Prostate Cancer&Prostatic Diseases,2008,11(1):6-12；J Wu,X X Wang,H Chiba et al.Appl.Physiol.,2003,94:335-342；C M Rassi,M Lieberherr,G Chaumaz et al.J.Bone&Mineral Res.,2002,17(4):630-638)，所以广泛应用于制药、保健品等领域，近年来染料木素已逐渐成为国内外学者研究的热点。
赖氨酸是人体必需氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。赖氨酸为碱性必需氨基酸，由于谷物食品中的赖氨酸含量甚低，且在加工过程中易被破坏而缺乏，故称为第一限制性氨基酸。
蛋白质是构成人体细胞的主要成份，食物中的蛋白质进入人体后经过消化先分解成氨基酸，然后人体又利用这些氨基酸再合成新的人体蛋白质，如免疫抗体、消化酶、血浆蛋白、生长激素等都是合成后的人体蛋白质。在合成蛋白质的各种氨基酸中，L-赖氨酸是最重要的一种，少了它，其它氨基酸就受到限制或得不到利用，科学家称它为人体第一必需氨基酸。科学家还发现，L-赖氨酸是控制人体生长的重要物质抑长素(Somatotation，ss)中最重要的也是最必需的成份，对人的中枢神经和周围神经系统都起着重要作用。人体不能自身合成L-赖氨酸，必须从食物中吸取，赖氨酸是帮助其它营养物质被人体充分吸收和利用的关键物质，人体只有补充了足够的L-赖氨酸才能提高食物蛋白质的吸收和利用，达到均衡营养，促进生长发育。其作用有：
1、提高智力、促进生长、增强体质；
2、增进食欲、改善营养不良状况；
3、改善失眠，提高记忆力；
4、帮助产生抗体、激素和酶，提高免疫力、增加血色素；
5、帮助钙的吸收，治疗防止骨质疏松症；
6、降低血中甘油三酯的水平，预防心脑血管疾病的产生。
缺乏赖氨酸的症状包括疲劳、虚弱、恶心、呕吐、头晕、没有食欲、发育迟缓、贫血等，可以在医疗专业人员建议下采取赖氨酸营养补品。赖氨酸每日的建议摄入量是儿童每磅体重10毫克，成年人每天在3000-9000毫克之间，已经证明它对一些特定疾病是有益的。已知赖氨酸的功效包括治疗单纯疱疹病毒和带状疱疹引起的唇疱疹。研究已经表明，它具有改善免疫系统，抵制单纯疱疹和带状疱疹病毒的功效。一些研究还表明，赖氨酸的功效还可能包括防止骨质流失(可造成骨质疏松症)，因为它能够帮助身体组织吸收钙。赖氨酸(结合其他氨基酸)可以促进骨骼活力，并通过增加女性胶原蛋白，促使骨骼和结缔组织更柔韧，预防骨质疏松症。研究还显示，赖氨酸与某些非甾体抗炎药结合，能够治疗与经前综合症和月经初潮相关的偏头痛和腹部绞痛。
据文献报道，染料木素具强疏水性，几乎不溶于水、稀盐酸(0.1mol·L-1)、十二烷基硫酸钠水溶液(十二烷基磺酸钠水溶液)、人工肠液(pH：6.8)，在一般的有机溶媒中溶解度较差，而易溶于二甲基亚砜，在甲醇、乙醇中亦有一定的溶解度，结构中含有酚羟基而显弱酸性，溶于稀碱。由于染料木素的亲脂性、亲水性均较弱，故影响了其在体内的吸收，直接口服生物利用度低，存在较强的首过效应，难以达到临床治疗疾病的目的，限制了其临床应用(V R Chinthalapally,C X Wang,S Barbara et al.Cancer Res.,1997,57:3717-3722)。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种染料木素口服溶液剂，解决了染料木素不溶于水的问题，且仍然具有抗肿瘤活性，再辅配以赖氨酸，帮助患者产生抗体、激素和酶，提高免疫力、增加血色素，且配制的溶液酸甜可口，利于病人服用。
本发明的另一个目的是在于提供了一种染料木素口服溶液剂的制备方法，方法易行，操作简单。首先解决了染料木素不溶于水，而难以制成口服溶液剂的问题；其次，染料木素制成口服溶液剂避免了首过效应，提高了生物利用度；其三，溶液剂具有抗肿瘤活性，再辅配以赖氨酸，帮助患者产生抗体、激素和酶，提高免疫力、增加血色素，有利于疾病治疗。
本发明的再一个目的是在于提供了一种染料木素口服溶液剂在制备治疗或预防肺癌药物中的应用，该溶液剂对非小细胞肺癌A549/DPP细胞株具有耐药逆转作用，同时可抑制肺癌细胞A549细胞和非小细胞肺癌细胞A549/DPP增殖并诱导其凋亡，显示出较好的抗肿瘤作用。
为了完成上述的目的，本发明采用如下技术方案：
一种染料木素口服溶液剂，它由以下重量份的原料制成：
一种染料木素口服溶液剂，它由以下重量份的原料制成(优选范围)：
一种染料木素口服溶液剂，它由以下重量份的原料制成(优选范围)：
一种染料木素口服溶液剂，它由以下重量份的原料制成(较好范围)：
一种染料木素口服溶液剂，它由以下重量份的原料制成(最好范围)：
一种染料木素口服溶液剂，它由以下重量份的原料制成(最好值)：
一种染料木素口服溶液剂制备方法，其制备步骤是：
A、称取一定比例的赖氨酸加入3-10倍水，40-60℃搅拌溶解，备用；
B、将一定比例的染料木素加入步骤A溶液中，在40-60℃继续搅拌4-6h，过滤，滤液备用；
C、称取一定比例的阿斯巴甜、小苏打加入步骤B溶液中，室温(20-25℃，以下相同)搅拌溶解，过滤分装滤液。
一种染料木素口服溶液剂在制备治疗或预防肺癌药物中的应用：
1、A549细胞及A549/DPP细胞的生长曲线比较
将非小细胞肺癌A549/DPP耐药细胞和肺癌细胞A549(均由武汉大学药学院提供)分别接种于含10％胎牛血清、1％双抗的MEM完全培养基中，置于37℃、CO2体积分数为5％的细胞培养箱中培养，2-3d传代1次。其中A549/DPP细胞培养基中添加6μmol/L DPP以维持其耐药性，于实验前更换成无DDP的上述完全培养基。
将处于对数生长期的A549和A549/DPP细胞分别用0.25％胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，经台盼蓝染色计数活细胞，每24h计数1次，连续计数7d，绘制细胞生长曲线图，并计算细胞倍增时间。
细胞培养试验表明(见图1)，A549/DPP组和A549组的细胞生长曲线相似，性状稳定，倍增时间分别为(25.37±0.25)h和(15.32±0.35)h。
2、MTT法检测染料木素口服溶液剂对A549/DPP细胞的耐药逆转作用
取对数生长期的肺癌细胞A549和非小细胞肺癌A549/DPP耐药细胞，分别配成浓度为2.5×104个/mL的细胞悬液，按每孔90μL分别接种于96孔板中，并分为A549空白对照组、A549组、A549/DPP空白对照组、A549/DPP组和染料木素口服溶液剂组。对照组加入等体积不含细胞的RPMI1640培养液，染料木素口服溶液剂组为A549/DPP细胞加入12.5μg/mL染料木素口服溶液剂。各组细胞培养24h后分别加入不同浓度的DPP液10μL(DPP液的浓度依次为为：0，1.25，2.5，5.0，10，20，40，80，160μmol/L)。每个浓度设6个复孔，每孔终体积为100μL，再培养48h后，每孔加入10μL 5mg/mL的MTT溶液，继续培养4h，弃去96孔培养板中的液体，加入200μL DMSO，避光轻摇10min，在全自动酶标仪波长为565nm处测定吸光度值(OD值)。根据OD值计算出细胞生长抑制率，细胞生长抑制率(％)＝[1—(OD实验值—OD空白对照值)/(OD对照值—OD空白对照值)]×100％。用SPSS21.0软件计算细胞的半数抑制率IC50值(通过SPSS21.0电脑软件，以浓度、抑制率和总数三个变量，按照程序进行计算得到)及耐药倍数(耐药倍数＝A549/DPP细胞IC50值/A549细胞IC50值)。
实验结果表明，用12.5μg/mL染料木素口服溶液剂预处理后，A549/DPP细胞耐药倍数从2.23倍下降至1.61倍，A549/DPP细胞对染料木素口服溶液剂的作用较敏感。
3、倒置荧光显微镜下检测染料木素口服溶液剂对A549细胞和A549/DPP细胞的抑制作用
用0，5.25，12.5，20μg/mL染料木素口服溶液剂分别作用于A549细胞及A549/DPP细胞24h后，在倒置荧光显微镜下观察细胞形态变化。
镜检发现(图2)，在5.25，12.5，20μg/mL染料木素口服溶液剂的作用下，A549细胞及A549/DPP细胞形态出现体积过大、伪足过度伸展、细胞边缘模糊等变化。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
1、本发明提供的一种染料木素口服溶液剂，解决了染料木素不溶于水而难于制成口服溶液剂的问题，染料木素制成口服溶液剂避免了首过效应，提高了生物利用度，该制备方法简单易行；
2、本发明提供的一种染料木素口服溶液剂，以染料木素为主要原料，辅以赖氨酸、矫味剂阿斯巴甜、稳定剂小苏打，能帮助患者产生抗体、激素和酶，可提高免疫力、增加血色素，且配制的溶液利于病人服用。
3、在染料木素口服溶液剂的作用下，A549/DPP细胞耐药倍数从2.23倍下降至1.61倍，A549/DPP细胞对染料木素口服溶液剂的作用较敏感，该溶液剂还可抑制肺癌细胞A549细胞和非小细胞肺癌细胞A549/DPP增殖并诱导其凋亡，显示较好的抗肿瘤作用。
附图说明
图1为一种A549细胞及A549/DPP细胞的生长曲线图。
图2为一种不同浓度的染料木素口服溶液剂作用于A549及A549/DPP细胞24h后的细胞显微图。
具体实施方式
实施例1：
一种染料木素口服溶液剂，它由以下重量份的原料制成：
一种染料木素口服溶液剂的制备方法，其步骤是：
A、称取实施例1所述40重量份的赖氨酸加入3或5或6或8或10倍水，40℃或44℃或48℃或52℃或56℃或60℃搅拌溶解，备用；
B、将实施例1所述15重量份染料木素加入步骤A溶液中，在40℃或45℃或50℃或55℃或60℃继续搅拌4h或5h或6h，过滤，滤液备用；
C、称取实施例1所述0.04重量份阿斯巴甜、0.05重量份小苏打加入步骤B溶液中，室温(20或23或25℃)搅拌溶解，过滤分装即得。
实施例2-7：
一种染料木素盐溶液，它由以下重量份的原料制成：
上述染料木素口服溶液剂的制备方法与实施例1相同。
实施例8:
一种染料木素口服溶液剂在制备治疗或预防肺癌药物中的应用，其步骤是：
1、A549细胞及A549/DPP细胞的生长曲线比较
将非小细胞肺癌A549/DPP耐药细胞和肺癌细胞A549(均由武汉大学药学院提供)分别接种于含10％胎牛血清、1％双抗的MEM培养基中，置于37℃、CO2体积分数为5％的细胞培养箱中培养，2-3d传代1次。其中A549/DPP细胞培养基中添加6μmol/L DPP以维持其耐药性，于实验前更换成无DDP的上述完全培养基。
将处于对数生长期的A549和A549/DPP细胞分别用0.25％胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，经台盼蓝染色计数活细胞，每24h计数1次，连续计数7d，绘制细胞生长曲线图，并计算细胞倍增时间。
细胞培养试验表明(见图1)，A549/DPP组和A549组的细胞生长曲线相似，性状稳定，倍增时间分别为(25.37±0.25)h和(15.32±0.35)h。
2、MTT法检测染料木素口服溶液剂对A549/DPP细胞的耐药逆转作用
取对数生长期的肺癌细胞A549和非小细胞肺癌A549/DPP耐药细胞，分别配成浓度为2.5×104个/mL的细胞悬液，按每孔90μL分别接种于96孔板中，并分为A549空白对照组、A549组、A549/DPP空白对照组、A549/DPP组和染料木素口服溶液剂组。对照组加入等体积不含细胞的RPMI1640培养液，染料木素口服溶液剂组为A549/DPP细胞加入12.5μg/mL染料木素口服溶液剂。各组细胞培养24h后分别加入不同浓度的DPP液10μL(DPP液的浓度依次为为：0，1.25，2.5，5.0，10，20，40，80，160μmol/L)。每个浓度设6个复孔，每孔终体积为100μL，再培养48h后，每孔加入10μL 5mg/mL的MTT溶液，继续培养4h，弃去96孔培养板中的液体，加入200μL DMSO，避光轻摇10min，在全自动酶标仪波长为565nm处测定吸光度值(OD值)。根据OD值计算出细胞生长抑制率，细胞生长抑制率(％)＝[1—(OD实验值—OD空白对照值)/(OD对照值—OD空白对照值)]×100％。用SPSS21.0软件计算细胞的半数抑制率IC50值(通过SPSS21.0电脑软件，以浓度、抑制率和总数三个变量，按照程序进行计算得到)及耐药倍数(耐药倍数＝A549/DPP细胞IC50值/A549细胞IC50值)。
实验结果表明，用12.5μg/mL染料木素口服溶液剂预处理后，A549/DPP细胞耐药倍数从2.23倍下降至1.61倍，A549/DPP细胞对染料木素口服溶液剂的作用较敏感。
3、倒置荧光显微镜下检测染料木素口服溶液剂对A549细胞和A549/DPP细胞的抑制作用
用0，5.25，12.5，20μg/mL染料木素口服溶液剂分别作用于A549细胞及A549/DPP细胞24h后，在倒置荧光显微镜下观察细胞形态变化。
镜检发现(图2)，在5.25，12.5，20μg/mL染料木素口服溶液剂的作用下，A549细胞及A549/DPP细胞形态出现体积过大、伪足过度伸展、细胞边缘模糊等变化。
综上所述，染料木素口服溶液剂对非小细胞肺癌A549/DPP细胞株具有耐药逆转作用，同时可抑制肺癌细胞A549细胞和非小细胞肺癌细胞A549/DPP增殖并诱导其凋亡，显示较好的抗肿瘤作用。

Claims (7)

1.一种染料木素口服溶液剂，它由以下重量份的原料制成：
所述的染料木素口服溶液剂的制备方法，其步骤是：
A、称取一定比例的赖氨酸加入3-10倍水，40-60℃搅拌溶解，备用；
B、称取一定比例的染料木素加入步骤A溶液中，在40-60℃继续搅拌4-6h，过滤，滤液备用；
C、称取一定比例的阿斯巴甜、小苏打加入步骤B溶液中，室温搅拌溶解，过滤，分装，得一种染料木素溶液。
2.根据权利要求1所述的一种染料木素口服溶液剂，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的一种染料木素口服溶液剂，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的一种染料木素口服溶液剂，其特征在于：
5.根据权利要求1所述的一种染料木素口服溶液剂，其特征在于：
6.根据权利要求1所述的一种染料木素口服溶液剂，其特征在于：
7.权利要求1所述的一种染料木素口服溶液剂在制备治疗或预防肺癌药物中的应用。
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