CN105954214A

CN105954214A - 一种三氯化钒混合粉剂及其在快速测定食品中硝酸盐含量方面的应用

Info

Publication number: CN105954214A
Application number: CN201610271924.4A
Authority: CN
Inventors: 吴青; 翁柔丹; 孙远明; 雷红涛; 卢慧茵; 刘琦
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2016-04-27
Filing date: 2016-04-27
Publication date: 2016-09-21
Anticipated expiration: 2036-04-27
Also published as: CN105954214B

Abstract

本发明公开了一种三氯化钒混合粉剂及其在快速测定食品中硝酸盐含量方面的应用。所述三氯化钒混合粉剂由氯化钠、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺和三氯化钒组成。应用于快速测定食品中硝酸盐含量时，首先将食品匀浆后，用醋酸溶液定容，振荡后过滤得样液；再将三氯化钒混合粉剂加入样液中，摇匀，水浴，冷却，测定吸光值，根据标准曲线计算出硝酸盐含量。本发明的方法简单易操作、快速耗时短、灵敏、准确、试剂耗量少、成本低，操作人员不需要经过专门培训，而且所用试剂具有不挥发、无臭味和对人体毒性极小的特点，混合粉剂稳定性好，检测试剂对环境和人体无危害，在快速检测食品尤其是新鲜蔬菜中硝酸盐含量方面具有广泛的应用前景。

Description

一种三氯化钒混合粉剂及其在快速测定食品中硝酸盐含量方面的应用

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域。更具体地，涉及一种三氯化钒混合粉剂及其在快速测定食品中硝酸盐含量方面的应用。

背景技术

硝酸盐广泛存在于人们的生活中，人体摄取的硝酸盐81.2%来自蔬菜，其次来自水和饮料以及经过腌制色的肉制品。新鲜蔬菜中的硝酸盐主要来源于种植过程中过度施用的氮肥，而过度施用氮肥会污染水体，造成水体中硝酸盐含量过高；硝酸盐本身是植物中天然成分之一，美国食品和药品监督管理局（FDA）将硝酸盐列为安全的食品添加剂，本身对机体没有直接的危害，但植物、人的口腔和肠道中的细菌可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐被人体吸收后能使正常血红蛋白转变成高铁血红蛋白从而失去携氧功能，同时硝酸盐还是亚硝基化合物的重要前体，被还原成亚硝酸盐后能和人、动物体内的仲胺或叔胺结合转化成强致癌物质亚硝胺，从而诱发癌变。

目前，检测硝酸盐含量的方法很多，总结起来主要分为光谱分析法、色谱分析法、电化学分析法、快速检测法。随着国家对食品安全监控力度的加大以及人们对食品安全的重视，简单易用、快速、准确、低成本的硝酸盐快速检测方法有着巨大市场需求。

快速检测是指能在较短时间内完成样品前处理和检测，得出检测结果的行为。一般理化检测在2h内完成，微生物检验方法与常规方法相比能够缩短1/2或1/3的检测时间，并出具检测结果的方法可视为快速检测法。目前常见的硝酸盐快速检测法主要有粉剂法、试纸条法和试剂盒。常用的粉剂法主要以锌粉、锌粒、镉粉、镉粒、镁粉等不同还原物质而有所区分，显色体系则大致相同，均为Griess显色剂；粉剂法属于快速检测，测定结果既可以利用显色卡等载体做定性半定量检测，又可以在折光仪、分光光度计等简易仪器辅助的情况下做定量检测；所使用的粉剂是影响检测效果的重要因素之一。而试纸条法与试剂盒在借助试纸条、显色卡等载体的情况下直接比对得出结论，只能作定量与半定性检测，需进一步试验才能确定准确硝酸盐的含量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有检测硝酸盐含量的技术缺陷和不足，基于硝酸盐可被还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐可与对氨基苯磺酸重氮化，进而产物与盐酸萘乙二胺耦合生成紫红色化合物这个化学反应，以提高硝酸盐还原率、方法准确性为前提，着力于摸索该系列反应的最佳反应条件，包括显色剂比例、反应温度与时间、反应物比例等，致力于开发一种操作简便的、所需仪器少且可投入实际生产的快速检测方法。

本发明目的是提供一种三氯化钒混合粉剂及其在快速测定食品（尤其是新鲜蔬菜）中硝酸盐含量方面的应用。

本发明的另一目的是提供一种快速测定食品（尤其是新鲜蔬菜）中硝酸盐含量的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种三氯化钒混合粉剂，包含以下组分：氯化钠、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、三氯化钒。

其中，优选地，：氯化钠、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺和三氯化钒的质量比为200～600：10～60：20～30：0.5～1.5：0.3～1.5。

更优选地，氯化钠、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺和三氯化钒的质量比为300～500：10～30：20～30：0.5～1.5：0.3～0.9。

最优选地，氯化钠、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺和三氯化钒的质量比为400：20：25：0.9：0.6。

上述三氯化钒混合粉剂在快速测定食品中硝酸盐含量方面的应用也在本发明的保护范围之内。优选地，所述食品为新鲜蔬菜。

一种快速测定食品中硝酸盐含量的方法，包括以下步骤：

S1.食品经过匀浆后，用醋酸溶液定容，振荡3～10min，过滤得样液；

S2.将权利要求1～3任一所述三氯化钒混合粉剂加入步骤S1的样液中，摇匀，70℃～90℃水浴20～40min，冷却，测定吸光值，根据标准曲线计算出硝酸盐含量。

其中，优选地，所述食品为新鲜蔬菜。

优选地，步骤S1所述醋酸溶液的浓度为2%。

优选地，步骤S1所述食品与醋酸溶液的用量比为5～10g：250mL。

优选地，步骤S1所述振荡5min。

优选地，步骤S2所述水浴的条件为80℃水浴30min。

优选地，步骤S2所述三氯化钒混合粉剂和样液的比例为0.01～5g/mL。

更优选地，步骤S2所述三氯化钒混合粉剂和样液的比例为0.1g/mL。

本发明经过大量的研究和探索，在国内已有的锌粉混合粉剂的基础上，就其较差的还原效果进行改进，结合锌粉粉剂法与氯化钒溶液检测法，开发出氯化钒粉剂法测定蔬菜中硝酸盐含量，总结了一种新的混合粉剂，用于快速准确测定蔬菜样品中硝酸盐的含量，并通过单因素实验筛选出对测定结果存在影响的单因素水平，利用Plackett-Burman实验从7个因素中筛选出3个对实验结果有显著影响的因素，进一步设计3因素3水平的响应面实验，研究3个显著因素之间的交互效应，对实验结果进行模型拟合和回归方程分析，摸索出氯化钒混合粉剂的最佳比例以及反应的最佳条件；最后运用方法学验证该混合试剂的有效性。

本发明具体方法为氯化钠、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、氯化钒五种试剂以400：20：25：0.9：0.6的比例混合均匀，混合而成的粉剂作为反应试剂，反应条件为80℃水浴30min。平均还原率可达90%以上。

另外，需要说明的是本方法测定的结果是蔬菜样品中硝酸盐与亚硝酸盐含量，对于新鲜蔬菜而言，亚硝酸盐含量极低，相对硝酸盐可以不计，此时测定值可直接作为硝酸盐测定值，但非新鲜蔬菜的测定，需在测定总值中减去亚硝酸盐含量才是硝酸盐含量。同时本发明也为亚硝酸盐的测定提供了理论研究基础。

本发明具有以下有益效果：

本发明的方法简单易操作、快速耗时短、灵敏、准确、试剂耗量少、成本低，操作人员不需要经过专门培训，在快速检测食品尤其是新鲜蔬菜中硝酸盐含量方面具有广泛的应用前景。

本发明通过氯化钠与氨基磺酸溶解提供酸性环境，代替挥发性盐酸，不仅避免了使用具有腐蚀性的强酸，而且反应过程所需的试剂均配成了一种混合粉剂，减少实验操作步骤，节约时间，同时氨基磺酸本身具有不挥发、无臭味和对人体毒性极小的特点，增加混合粉剂稳定性，减少检测试剂对环境的危害。

附图说明

图1为氯化钒用量对吸光值的影响。

图2为氯化钒用量对标准曲线系数的影响。

图3为响应面图；A图为Y与A、G的响应面图，B图为Y与A、F的响应面图，C图为Y与F、G的响应面图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例 1 氯化钒混合粉剂

一种三氯化钒混合粉剂，包含以下组分：氯化钠、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺和三氯化钒的质量比为200～600：10～60：20～30：0.5～1.5：0.3～1.5。

优选地，氯化钠、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺和三氯化钒的质量比为300～500：10～30：20～30：0.5～1.5：0.3～0.9。

更优选地，氯化钠、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺和三氯化钒的质量比为400：20：25：0.9：0.6。

实施例 2 快速测定新鲜蔬菜中硝酸盐含量的方法

1、快速测定新鲜蔬菜中硝酸盐含量的方法，包括如下步骤：

（1）取5~10g蔬菜匀浆，用2%醋酸溶液定容至250mL，振荡5min，过滤取3mL样液置于试管中，待用；

（2）氯化钠、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、三氯化钒以400：20：25：0.9：0.6的比例混合均匀，得到混合粉剂；

（3）称取0.3g混合粉剂加入3mL样液中，摇匀，80℃水浴30min，冷却，测定吸光值，根据标准曲线计算出硝酸盐含量。

2、上述方法的理论基础如下：

酸性条件下，利用具有还原活性的化合物——三氯化钒，将硝酸盐还原成亚硝酸盐，再用对氨基苯磺酸与亚硝酸盐发生重氮化反应，最后与盐酸萘乙二胺耦合生成紫红色的偶氮染料，在一定范围内颜色的吸光度与硝酸根浓度呈线性关系，通过测定吸光值确定硝酸盐含量。

具体反应方程式如下：

（1）还原反应：

（2）重氮化反应：

（3）耦合反应

实施例 3 测定条件优化

1、氯化钒用量对吸光值的影响

（1）取一组5mL的具塞刻度试管，依次加入3mL浓度为1.5mg/L硝酸盐标准溶液，取5份由0.5g氯化钠、0.085g氨基磺酸、0.025g对氨基苯磺酸、0.9mg盐酸萘乙二胺组成的混合粉剂，分别加入0.3mg、0.6mg、0.9mg、1.2mg、1.5mg氯化钒，配制成5种含不同氯化钒量的混合粉剂，再分别加入各试管中（试管中装有样液），振荡至粉剂完全溶解于样液溶液中，80℃水浴30min，取出冷却，测定吸光值。上述步骤重复3次。

（2）将上述步骤中1.5 mg/L硝酸盐标准溶液换成一系列标准硝酸盐标准溶液，按照上述步骤再次测定这一系列标准溶液的吸光值，绘制成标准曲线，求出回归方程，得出标准曲线系数，重复3次。

（3）结果如附图1所示，当硝酸盐标准溶液浓度为1.5mg/L时，随着氯化钒用量的增加，吸光值先增大后减小，在氯化钒用量为0.6mg时达到最大吸光值，并且与其他氯化钒用量的吸光值有显著性差异；

如附图2所示，氯化钒用量对于一系列硝酸盐标准溶液的吸光值的影响通过标准曲线的系数呈现，氯化钒用量对于标注曲线系数的影响所呈现的变化趋势，与1.5mg/L硝酸盐浓度时保持一致。可见，在硝酸盐标准曲线的浓度范围内，不同的氯化钒用量均能满足不同浓度的硝酸盐的反应需求。

因此，氯化钒的用量为0.3～1.5mg，最佳为0.6mg。

2、氯化钠用量对吸光值的影响

（1）取一组5mL的具塞刻度试管，依次加入3mL浓度为1.5mg/L硝酸盐标准溶液，取5份由0.6m氯化钒、0.02g氨基磺酸、0.02g对氨基苯磺酸、0.9mg盐酸萘乙二胺组成的混合粉剂，分别加入0.2g、0.3g、0.4g、0.5g、0.6g氯化钠，配制成5种不同氯化钠含量的混合粉剂，再分别加入各试管中（试管中装有样液），振荡至粉剂完全溶解于样液溶液中，80℃水浴30min，取出冷却，测定吸光值。上述步骤重复3次。

（3）同上分析，结果显示，氯化钠用量为0.2～0.6g，最佳为0.4g。

3、氨基磺酸用量对吸光值的影响

（1）取一组5mL的具塞刻度试管，依次加入3mL浓度为2mg/L硝酸盐标准溶液，称取5份由0.5g氯化钠、0.6m氯化钒、0.025g对氨基苯磺酸、0.9mg盐酸萘乙二胺组成的混合粉剂，分别加入0.01g、0.015g、0.02g、0.03g、0.06g氨基磺酸，配制成5种不同氨基磺酸含量的混合粉剂，再分别加入各试管中（试管中装有样液），振荡至粉剂完全溶解于样液溶液中，80℃水浴30min，取出冷却，测定吸光值。上述步骤重复3次。

（3）同上分析，结果显示，氨基磺酸用量为0.01～0.06g，最佳为0.02g。

4、显色剂用量对吸光值的影响

（1）取一组5mL的具塞刻度试管，依次加入3mL浓度为1.5mg/L硝酸盐标准溶液，称取6份由0.5g氯化钠、0.6m氯化钒、0.085g氨基磺酸组成的混合粉剂，分别加入不同比例的对氨基苯磺酸和盐酸萘乙二胺，配制成6种不同显色剂比例的混合粉剂，再分别加入各试管中（试管中装有样液），振荡至粉剂完全溶解于样液溶液中，80℃水浴30min，取出冷却，测定吸光值。上述步骤重复3次。

（3）同上分析，结果显示，对氨基苯磺酸最佳用量为0.02～0.03g，盐酸萘乙二胺最佳用量为0.5～1.5mg。

对氨基苯磺酸最佳用量为0.025g，盐酸萘乙二胺最佳用量为0.9mg。

5、反应（水浴）温度对吸光值的影响

（1）取一组5mL的具塞刻度试管，依次加入3mL浓度为1.5mg/L硝酸盐标准溶液，取6份由0.4g氯化钠、0.02g氨基磺酸、0.6m氯化钒、0.02g对氨基苯磺酸、0.9mg盐酸萘乙二胺组成的混合粉剂，分别加入各试管中（试管中装有样液），振荡至粉剂完全溶解于样液溶液中，分别置于70、75、80、85、90、95℃水浴锅中水浴30min，取出冷却，测定吸光值。上述步骤重复3次。

（3）同上分析，结果显示，水浴反应温度为70℃～90℃，最佳为80℃。

6、反应（水浴）时间对吸光值的影响

（1）取一组5mL的具塞刻度试管，依次加入3mL浓度为1.5mg/L硝酸盐标准溶液，取6份由0.4g氯化钠、0.02g氨基磺酸、0.6m氯化钒、0.02g对氨基苯磺酸、0.9mg盐酸萘乙二胺组成的混合粉剂，分别加入各试管中（试管中装有样液），振荡至粉剂完全溶解于样液溶液中，置于80℃水浴锅中，分别设定水浴时间为10、20、30、40min，取出冷却，测定吸光值。上述步骤重复3次。

（3）同上分析，结果显示，水浴反应时间为20～40min，最佳为30min。

7、影响吸光值的显著因素筛选

（1）本研究采用Plackett-Burman设计选取重要因素，是一种两水平的实验设计方法，基于非完全平衡块原理，可以用最少的实验次数估计出因素的主效应，适用于从众多因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素，供进一步研究用。

根据前面单因素实验结果，使用Design Expert 8.0软件，选用N=12的Plackett-Burman实验设计，对A：氯化钒用量、B：氯化钠用量、C：氨基磺酸、D：对氨基苯磺酸用量、E：盐酸萘乙二胺、F：反应温度、G：反应时间这7个因素用于考察，每个因素取高（+1）低（-1）两个水平，高水平为低水平的2~3倍，响应值为硝酸盐的吸光值Y，因素及水平设计如表1。

表1 Plackett-Burman实验各因素的水平取值

（2）Plackett-Burman实验结果分析

用Design Expert 8.0制作Plackett-Burman实验设计表，并取得吸光值的结果，见表2，效应及显著分析结果见表3和表4。

表2 Plackett-Burman实验设计表与实验结果

表3 Plackett-Burman实验的参数估计和各水平的影响

表4 Plackett-Burman实验分析结果

由表4可以得知，主效应P=0.0333<0.05，说明该模型是显著的，具有一定的可信度，R2=93.11%，R2（adj）=81.04%，说明该模型拟合了大多数的因素，还有部分的数据失拟可能是由于操作误差等原因造成的；由表2.6可知，对吸光值影响的因素按显著程度排序是A、F、G、C、D、B、E；其中A、F、G的P<0.05，是显著影响因素，其余为非显著影响因素，因此选取A:氯化钒用量、F:反应温度、G：反应时间为响应面实验的因素。

8、响应面法实验设计

（1）响应面分析法（Response Surface methodology,RSM）是综合了实验设计和数学建模的一种方法，它通过分析实验所得数据，建立多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的关系，并对影响响应值的各因子水平及其交互作用进行优化与评价，本文响应面法的设计基于单因素实验与Plackett-Burman设计的结果所确定的水平范围和因素，RSM实验因素水平见表5。

表5 响应面法实验设计的因素及水平设计表

（2）响应面结果分析

1）响应面结果：

根据Plackett-Burman实验结果确定的三个显著因素作为响应面实验考察的因素和水平，运用Box-Behnken的中心组合原理设计因素水平表并测得结果，再用Design-Expert8.0软件对二元线性回归方程模型的各项系数进行显著性检验并获得方差分析结果。

响应面图如附图3所示。响应面实验的对应结果见表6，模型的各项系数显著性检验和方差分析结果见表7。

表6 响应面法实验设计结果表

表7 回归方程的显著性检验

2）方差分析

由表7可知，常数项P=0.0111，说明该方程是显著的；项A、G、FG、A2、G2的P值均小于0.05，说明这些项对Y构成显著影响；由F值大小可知，对吸光值构成显著影响的因素按其显著性由大到小的排列顺序，依次为氯化钒用量、反应时间、反应温度，这与Plackett-Burman实验确定的显著排序大致相符；失拟项P=0.1857>0.05,说明方程失拟性不显著，证明该模型合理。复相关系数R2=89.27%，R2（adj）=75.48%，该方程拟合情况较好，大部分数据的差异因变量而变化，小部分数据失拟可能是由于操作误差等不确定引起的。总体上讲，模型的拟合程度较好，实验误差较小，模型成立，可以用此模型优化检测方法，同时也表明该模型能够代替真实实验点对结果进行表征。

3）交互作用分析

由表7回归方程显著性分析结果可以看出，F：反应温度与G：反应时间之间存在显著的交互效应(P=0.011<0.05)，其他各因素之间的交互作用不显著，所以在交互效应分析中，只需分析反应温度与反应时间之间的交互效应。如图3中C图所示，当反应时间在较短水平时，吸光值随着反应温度的增加先是显著升高，这可能是因为在反应温度较低时，还原反应不完全，吸光值偏低，而反应温度过高时，氯化钒还原硝酸盐得到的产物亚硝酸盐进一步还原，导致过度还原，使吸光值偏低。当反应时间在较长水平时，吸光值随着反应时间的增加缓慢升高再逐渐下降。表明在较短的反应时间内，适当提高温度有助于还原反应的进行，增大吸光值。

4）期望参数分析

根据实验结果，采用最小二乘法拟合二次多项方程表达响应值，并利用Design-Expert8.0软件对实验数据进行分析，建立最高吸光值的数学模型，该模型为二元线性回归方程，如下：

y=0.70970+4.50284*A-0.11289*F+0.21124*G+0.0925*A*F+2.75*10-3*A*G-2.1610-3*FG+10.168*A2+8.826*10-4*F2+9.54*10-4*G2

用Design-Expert8.0软件对实验结果进行计算，可得：A=0.59，F=80，G=20.99，此时Y极大值等于1.231，理论上得到的测定硝酸盐含量的最佳的反应条件为氯化钒用量0.6mg，反应温度80℃，反应时间20min。

然而，实际响应面设计中，由于温度达到80℃以上时吸光值不稳定，实验误差较大，虽最适反应温度为80℃，但根据实际情况调整后，最适反应温度调整为75℃。响应面设计中反应温度这一因素的三水平设计分别为70℃、75℃、80℃。

因此结合交互作用分析结果，综合理论分析结果，考虑实际条件，最终得出结论为：测定硝酸盐含量最佳的反应条件为氯化钒用量0.6mg，反应温度80℃，反应时间30min。

9、模型有效性验证

（1）响应面确定了硝酸盐含量测定的最佳反应条件以及对应最高吸光值的预测值，在此参数下进行3组重复实验区算术平均数，求其余预测值的相对误差，验证方程模型的有效性。

（2）混合粉剂加入量的确定

取浓度为1.2mg/L的NaNO₃标准溶液3mL于8支5mL的具塞刻度试管中，分别加入0、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45g混合试粉（试粉比例为上述试验得出的最佳反应条件），振荡均匀后加热，冷却，在538nm处测其吸光值，同样吸取2.5mg/L的NaNO3标准溶液3mL于8支5mL的具塞刻度试管中。同上加入不同量的混合粉剂，按上述操作步骤测定。各重复3次。

对上述中研制出的混合粉剂进行方法学验证，包括混合粉剂线性范围、准确度、精确度、样品回收率、最低检测限及混合粉剂的有限使用日期，验证本文的分析方法。

（3）方法学验证结果分析

通过方法学验证可得，氯化钒混合粉剂法的线性范围为0~2.5mg/L，线性方程y=0.5011x-0.0223，相关系数r=0.999，最低检测限为0.3mg/L，具有良好的精密度和准确度，粉剂稳定性较好，在所研究的2个月的时间范围内，粉剂的检测结果有效；相对于国标法，省时简便易操作，操作人员不需要经过专门培训。

综上所述，本发明的具体方法为氯化钠、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、氯化钒五种试剂以400：20：25：0.9：0.6的比例混合均匀，混合而成的粉剂作为反应试剂，反应条件为80℃水浴30min，该氯化钒粉剂法的平均还原率可达90%以上。

Claims

1.一种三氯化钒混合粉剂，其特征在于，包含以下组分：氯化钠、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、三氯化钒。

2. 根据权利要求1所述的三氯化钒混合粉剂，其特征在于，氯化钠、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺和三氯化钒的质量比为200～600：15～25：20～30：0.5～1.5：0.3～1.5。

3. 根据权利要求2所述的三氯化钒混合粉剂，其特征在于，氯化钠、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺和三氯化钒的质量比为300～500：10～30：20～30：0.5～1.5：0.3～0.9。

4. 权利要求1～3任一所述三氯化钒混合粉剂在快速测定食品中硝酸盐含量方面的应用。

5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述食品为新鲜蔬菜。

6. 一种快速测定食品中硝酸盐含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述食品为新鲜蔬菜。

8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S1所述醋酸溶液的浓度为2%，步骤S1所述食品与醋酸溶液的用量比为5～10g：250mL。

9. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S1所述振荡5min，步骤S2所述水浴的条件为80℃水浴30min。

10. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S2所述三氯化钒混合粉剂和样液的比例为0.01～5g/mL。