CN105943571A - 一种猕猴桃废弃物抗肿瘤提取物的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用微生物发酵提取软枣猕猴桃抗肿瘤物质的方法，属于微生物利用技术领域。所述方法包括如下步骤：(1)向软枣猕猴桃或其近缘种的废弃物碎粒中加入黑曲霉，调节湿度1～8％，pH 6.0～6.5，混匀发酵；(2)向步骤(1)所得物加入丙酮，浸提2～3次，每次浸提2～3h；(3)浸提后过滤，将滤液进行减压蒸馏除去丙酮，冷却至室温，得到析出产物；(4)将析出产物溶于90～95％的乙醇中，搅拌均匀，加入石油醚萃取，收集萃取液，将萃取液减压蒸馏，得到萃取产物，将所得萃取产物重复步骤(4)的操作一次，得到抗肿瘤提取物。本发明的方法提取效率高，产品纯度高，产品收率大幅度提高，所得提取物对多种肿瘤细胞具有抑制作用。
Description
技术领域
本发明属于微生物利用技术领域，具体涉及一种利用微生物发酵从猕猴桃废弃物中提取天然抗肿瘤物质的方法及该抗肿瘤提取物的应用。
背景技术
恶性肿瘤一直以来对人类健康和生命产生着严重的威胁，是人类最主要的死因之一。目前化学药物的治疗，均伴随着严重的毒副反应，甚至免疫力极度下降，癌细胞迅速扩散而不能达到治疗作用。随着生命科学研究的飞速发展，人们对肿瘤机制的研究不断深入，肿瘤细胞内信号转导、细胞周期调控、细胞凋亡、血管生成以及细胞转移、浸润等各种基本过程正在被逐步阐明，在寻求导向治疗、基因治疗、综合治疗等多途径方法的同时，在天然药物中寻找有效的抗肿瘤药物，已在国内外医药界达成了共识，对天然药物的研究占有相当大的比例。这些天然药物除通过抑制增殖或诱导凋亡等直接杀伤外，还通过免疫调节、抑制转移等间接调节作用于肿瘤细胞，从而诱导肿瘤细胞死亡。
软枣猕猴桃是我国一种分布较为广泛的野生果树，这种猕猴桃品种在我国有五十多种，大多分布于东北、华北、西北、西南及长江流域，其中以西南的资源最为丰富，主要分布于四川多地。国内外研究结果表明，软枣猕猴桃具有天然的抗肿瘤成分，侯玉芳等对长白山产软枣猕猴桃茎多糖的抗肿瘤和抗感染作用进行了体内外试验研究，结果表明，软枣猕猴桃茎多糖具有明显的抗肿瘤和抗感染作用；方永璋等对黑龙江省产软枣猕猴桃进行了抗癌作用试验，结果表明，在拟胃液条件下，软枣猕猴桃果汁能够阻断N-亚硝基吗啉的形成，其阻断率达79.52％，好于等量的抗坏血酸溶液，说明软枣猕猴桃桃汁具有良好的抗癌作用；翟延君等通过药理试验研究表明，软枣猕猴桃根具有抗癌作用。
目前对于从软枣猕猴桃中提取天然抗肿瘤成分的研究已有相关文献报道，如王小平等采用甲醇索氏提取法提取藤梨根中总黄酮，得到的总黄酮含量为0.0830g，总黄酮百分含量为7.93％；王菲采用超声辅助提取软枣猕猴桃中黄酮类化合物，黄酮类化合物的得率为0.297mg/g(湿重)。王岚等报道藤梨根正丁醇提取物对A549肺癌细胞的生长抑制作用明显，抑制率达78.44％；杜庆聪等对藤梨根乙酸乙酯提取物进行了研究，结果表明藤梨根乙酸乙酯提取物可以明显抑制肺癌A549细胞的生长、增殖。
然而，上述利用有机溶剂提取软枣猕猴桃中抗肿瘤成分的方法，普遍存在提取效率不高，有效成分含量低的问题，往往在提取过后，还需要对粗提物进行反复的纯化过程，步骤较为繁琐，且对设备要求高、成本较高。提供一种新的软枣猕猴桃中抗肿瘤物质的提取方法，提高有效成分含量和提取效率，充分发挥其抗肿瘤作用，成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种软枣猕猴桃中抗肿瘤物质的提取方法，采用该方法得到的抗肿瘤提取物，具备有效成分含量高，提取效率高，产品收率大幅提升，且工艺简单，运行成本较低。
本发明的目的之一是提供一种抗肿瘤提取物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将采集的软枣猕猴桃或其近缘种的废弃物，粉碎成不大于3mm的碎粒，向上述碎料原料中加入黑曲霉，调节湿度为1～8％，pH为6.0～6.5，混匀后进行发酵，发酵时间不少于48h；所述废弃物为果实、茎、叶和果渣中的至少一种；
(2)向步骤(1)的发酵所得物中加入丙酮，所述丙酮的加入量与发酵所得物的重量比为1.5～3:1，充分搅拌，浸提2～3次，每次浸提的时间为2～3h；
(3)浸提结束后进行过滤，将所得滤液进行减压蒸馏除去丙酮，将剩余物冷却至室温，得到析出产物；
(4)将析出产物溶于90～95％的乙醇溶液中，搅拌均匀，向其中加入石油醚进行萃取，所述石油醚与乙醇溶液的体积比为1～3:1，收集萃取液，将萃取液进行减压蒸馏，得到萃取产物，将萃取产物重复步骤(4)的操作一次，即得抗肿瘤提取物。
经紫外分光光度法检测发现，上述得到的抗肿瘤提取物为叶绿素衍生物，经MTT比色法测定该软枣猕猴桃的提取物对多种肿瘤细胞具有一定的抑制作用，特别是对有代表性的人类白血病细胞系中U937和HL-60细胞凋亡，具有较好的抗肿瘤活性。本发明的方法，很好地提取到了该抗肿瘤叶绿素衍生物，并且提取效率高，有效成分含量高，产品收率大幅提高。本发明通过对材料的预处理，再经过微生物发酵处理，提高了材料的稳定性，降低分离难度，加速有效成分的释放和提取，更利于分离纯化提取抗肿瘤物质，本发明提供的方法具备提取物收率高，叶绿素衍生物纯度高的特点。
进一步的，所述步骤(1)中黑曲霉的保藏号为CICC 40273，所述黑曲霉的种子液培养5-10h后，按重量百分比计为废弃物碎粒的1～8％加入。
进一步的，所述步骤(1)中发酵温度为25～28℃。
进一步的，所述步骤(2)中的丙酮为体积含量80～90％的丙酮。
进一步的，所述步骤(2)中浸提的温度为45～50℃。
进一步的，所述步骤(3)中进行减压蒸馏的温度为不高于40℃。
进一步的，所述步骤(4)中乙醇溶液的用量为，按步骤(1)中的废弃物碎粒与乙醇溶液的m/v比为1:1～2g/mL。
进一步的，所述步骤(4)中进行减压蒸馏的温度为不超过50℃。
本发明的目的之二是提供一种由上述方法制备得到的抗肿瘤提取物在抗肿瘤中的应用，具体是将上述抗肿瘤提取物作为活性成分与可接受的药物载体结合制成用于治疗各种肿瘤的口服制剂，或注射单方以及复方制剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：提供了一种软枣猕猴桃或其近缘种抗肿瘤物质的提取制备方法，经检测该物质为叶绿素衍生物；采用本发明的提取方法，叶绿素衍生物的提取效果好，产品纯度高，产品收率大幅度提高，经MTT比色法检测表明该叶绿素衍生物具有较好的抗肿瘤活性，能够有效抑制多种肿瘤细胞的生长，并能引起细胞凋亡，可以制成各种抗肿瘤药剂。
附图说明
图1为实施例1中软枣猕猴桃近缘种抗肿瘤提取物的紫外分光光度法测定的吸光度曲线；
图2为实施例1中软枣猕猴桃近缘种抗肿瘤提取物对U937细胞和HL-60细胞的半抑制浓度IC50值。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
按以下方法制备得到抗肿瘤提取物：
(1)选取软枣猕猴桃的近缘种，即紫果猕猴桃，将其废弃的茎、叶和果实，粉碎成不大于3mm的碎粒，取1kg上述碎粒的混合物，向其中加入黑曲霉(保藏号为CICC 40273)，调节湿度为8％，pH为6.5，混匀后采用曲盒进行发酵，控制发酵温度为28℃，发酵48h；
(2)向步骤(1)的发酵所得物中加入体积含量85％的丙酮，丙酮的加入量与发酵所得物的重量比为2:1，充分搅拌，在50℃下浸提2次，每次浸提的时间为2h；
(3)浸提结束后进行过滤，将所得滤液进行减压蒸馏除去丙酮，将剩余物冷却至室温，得到析出产物40g；
(4)将40g析出产物溶于1L体积含量为95％的乙醇溶液中，搅拌均匀，向其中加入石油醚进行萃取，所述石油醚与乙醇溶液的体积比为2:1，收集萃取液，将萃取液进行减压蒸馏，得到萃取产物，将萃取产物重复步骤(4)的操作一次，得到紫果猕猴桃提取物300mg。
经检测，该紫果猕猴桃提取物的纯度达96.5％以上，与仅仅只用有机溶剂提取的方法相比(不经过微生物发酵)，产品收率提高50％以上。
实施例2
按以下方法制备得到抗肿瘤提取物：
(1)取紫果猕猴桃果实榨汁后的果渣200g，向其中加入黑曲霉(保藏号为CICC 40273)，调节湿度为4％，pH为6.2，混匀后采用堆料方式进行发酵，控制发酵温度为26℃，发酵60h；
(2)向步骤(1)的发酵所得物中加入体积含量90％的丙酮，丙酮的加入量与发酵所得物的重量比为3:1，充分搅拌，在45℃下浸提3次，每次浸提的时间为2h；
(3)浸提结束后进行过滤，将所得滤液进行减压蒸馏除去丙酮，将剩余物冷却至室温，得到析出产物4g；
(4)将4g析出产物溶于400mL体积含量为90％的乙醇溶液中，搅拌均匀，向其中加入石油醚进行萃取，所述石油醚与乙醇溶液的体积比为2:1，收集萃取液，将萃取液进行减压蒸馏，得到萃取产物，将萃取产物重复步骤(4)的操作一次，得到紫果猕猴桃提取物40mg。
经检测，该紫果猕猴桃提取物的纯度达97.1％，与仅仅只用有机溶剂提取的方法相比(不经过微生物发酵)，产品收率提高34％以上。
实施例3
按以下方法制备得到抗肿瘤提取物：
(1)将采集的软枣猕猴桃的叶，粉碎成不大于3mm的碎粒，取500g碎粒，向其中加入黑曲霉(保藏号为CICC 40273)，调节湿度为1％，pH为6.0，混匀后采用曲盒进行发酵，控制发酵温度为25℃，发酵96h；
(2)向步骤(1)的发酵所得物中加入体积含量80％的丙酮，丙酮的加入量与发酵所得物的重量比为1.5:1，充分搅拌，在48℃下浸提3次，每次浸提的时间为3h；
(3)浸提结束后进行过滤，将所得滤液进行减压蒸馏除去丙酮，将剩余物冷却至室温，得到析出产物15g；
(4)将15g析出产物溶于1L体积含量为95％的乙醇溶液中，搅拌均匀，向其中加入石油醚进行萃取，所述石油醚与乙醇溶液的体积比为1:1，收集萃取液，将萃取液进行减压蒸馏，得到萃取产物，将萃取产物重复该步骤1次，得软枣猕猴桃提取物120mg。
经检测，该软枣猕猴桃提取物的纯度达96.9％以上，与仅仅只用有机溶剂提取的方法相比(不经过微生物发酵)，产品收率提高40％以上。
实施例4
按以下方法制备得到抗肿瘤提取物：
(1)将采集的软枣猕猴桃废弃的茎和叶的混合物，粉碎成不大于3mm的碎粒，取500g上述碎粒，向其中加入黑曲霉(保藏号为CICC 40273)，调节湿度为2％，pH为6.0，混匀后采用堆料方式进行发酵，控制发酵温度为25℃，发酵96h；
(2)向步骤(1)的发酵所得物中加入体积含量85％的丙酮，丙酮的加入量与发酵所得物的重量比为2:1，充分搅拌，在50℃下浸提3次，每次浸提的时间为2h；
(3)浸提结束后进行过滤，将所得滤液进行减压蒸馏除去丙酮，将剩余物冷却至室温，得到析出产物17g；
(4)将17g析出产物溶于1L体积含量为95％的乙醇溶液中，搅拌均匀，向其中加入石油醚进行萃取，所述石油醚与乙醇溶液的体积比为1.5:1，收集萃取液，将萃取液进行减压蒸馏，得到萃取产物，将萃取产物重复步骤(4)的操作一次，得到软枣猕猴桃提取物125mg。
经检测，该软枣猕猴桃提取物的纯度达97.2％以上，与仅仅只用有机溶剂提取的方法相比(不经过微生物发酵)，产品收率提高42％以上。
实施例5
按以下方法制备得到抗肿瘤提取物：
(1)将废弃的软枣猕猴桃的果实，粉碎成不大于3mm的碎粒，与果实榨汁后的果渣的混合物共计200g，向其中加入黑曲霉(保藏号为CICC 40273)，调节湿度为4％，pH为6.5，混匀后采用曲盒进行发酵，控制发酵温度为28℃，发酵72h；
(2)向步骤(1)的发酵所得物中加入体积含量85％的丙酮，丙酮的加入量与发酵所得物的重量比为2:1，充分搅拌，在45℃下浸提2次，每次浸提的时间为3h；
(3)浸提结束后进行过滤，将所得滤液进行减压蒸馏除去丙酮，将剩余物冷却至室温，得到析出产物3.8g；
(4)将3.8g析出产物溶于400mL体积含量为90％的乙醇溶液中，搅拌均匀，向其中加入石油醚进行萃取，所述石油醚与乙醇溶液的体积比为2:1，收集萃取液，将萃取液进行减压蒸馏，得到萃取产物，将萃取产物重复该步骤1次，得到软枣猕猴桃提取物45mg。
经检测，该软枣猕猴桃提取物的纯度达97.4％以上，与仅仅只用有机溶剂提取的方法相比(不经过微生物发酵)，产品收率提高38％以上。
测试例1
软枣猕猴桃及其近缘种抗肿瘤提取物的鉴定
取实施例1中得到的猕猴桃提取物1μg溶解于1mL甲醇中，采用紫外分光光度计测量在200～800nm下的吸光度曲线，得到的曲线图如附图1所示，实施例2-5中得到的提取物检测结果与实施例1相似，均为同一种物质。
从图1可以看出，实施例中得到的抗肿瘤提取物在410nm和665nm处有叶绿素的典型吸收峰，证明该提取物是一种叶绿素衍生物。测试例2
采用MTT比色法测定实施例1中得到的抗肿瘤提取物在各步骤处理后对人体白血病细胞株中U937细胞和HL-60细胞的半抑制浓度IC50情况。
检测结果如图2所示，从图2可以看出，在浸提过后得到的析出产物已经表现出对U937细胞和HL-60细胞具有很好的抑制作用，能够迅速诱导细胞凋亡，二者的半抑制浓度IC50值均降到40μg/mL以下，证明该析出产物的抗肿瘤活性成分含量高，提取效率高。最终得到的猕猴桃提取物对人体白血病细胞株中U937细胞和HL-60细胞表现出强烈的诱导凋亡能力。
测试例3
猕猴桃提取物对肿瘤细胞株生长的抑制作用研究。
将上述实施例中得到的猕猴桃提取物配制成浓度为2.0μg/mL的溶液，采用MTT比色法测定上述实施例中得到的猕猴桃提取物对各种肿瘤细胞株生长抑制的影响，以波长为550nm，参比波长为450nm测定OD值，计算各种肿瘤细胞的生长抑制率，各肿瘤细胞株的OD值测定结果如表1所示，从表1可以看出，本发明得到的软枣猕猴桃及其近缘种的抗肿瘤提取物对各种肿瘤细胞均有较好的抑制作用。
按下式计算猕猴桃提取物溶液对肿瘤细胞生长的抑制率：
表1
Claims (10)
1.一种利用微生物发酵制备抗肿瘤提取物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将采集的软枣猕猴桃或其近缘种的废弃物，粉碎成不大于3mm的碎粒，向废弃物碎粒中加入黑曲霉，调节湿度为1～8％，pH为6.0～6.5，混匀后进行发酵，发酵时间不少于48h；所述废弃物为果实、茎、叶和果渣中的至少一种；
(2)向步骤(1)的发酵所得物中加入丙酮，所述丙酮的加入量与发酵所得物的重量比为1.5～3:1，充分搅拌，浸提2～3次，每次浸提的时间为2～3h；
(3)浸提结束后进行过滤，将所得滤液进行减压蒸馏除去丙酮，将剩余物冷却至室温，得到析出产物；
(4)将析出产物溶于90～95％的乙醇溶液中，搅拌均匀，向其中加入石油醚进行萃取，所述石油醚与乙醇溶液的体积比为1～3:1，收集萃取液，将萃取液进行减压蒸馏，得到萃取产物，将萃取产物重复步骤(4)的操作一次，即得抗肿瘤提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中黑曲霉的保藏号为CICC 40273，所述黑曲霉的种子液培养5-10h后，按重量百分比计为废弃物碎粒的1～8％加入。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中发酵温度为25～28℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的丙酮为体积含量80～90％的丙酮。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中浸提的温度为45～50℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中进行减压蒸馏的温度为不高于40℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中乙醇溶液的用量为，按步骤(1)中的废弃物碎粒与乙醇溶液的m/v比为1:1～2g/mL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中进行减压蒸馏的温度为不超过50℃。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的抗肿瘤提取物在抗肿瘤中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，是将上述抗肿瘤提取物作为活性成分与可接受的药物载体结合制成用于治疗肿瘤的口服制剂，或注射单方以及复方制剂。
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