CN105941308A - 一种通过药物净化和筛选法培育清洁级实验树鼩的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过药物净化和筛选法培育清洁级实验树鼩的方法，属于培育清洁级实验动物技术领域。该方法包括体外寄生虫净化、肠道蠕虫净化、沙门氏菌和志贺氏菌净化、弓形虫筛选、疱疹病毒筛选等步骤。本发明方法简单，利用药物净化与和筛选法相结合，将实验树鼩的微生物和寄生虫等级由普通级净化为清洁级，效果明显。本发明体外寄生虫和肠道蠕虫的净化率达到100%，沙门氏菌和志贺氏菌净化率达到97.5%，同时采用筛选法剔除了弓形虫、疱疹病毒和皮肤病原真菌阳性的个体，建立了一种通过药物净化和筛选法培育清洁级实验树鼩的方法。在国内实属首创，填补了迄今为止国内尚无培育清洁级实验树鼩的空白。
Description
技术领域
本发明属于培育清洁级实验动物技术领域，具体涉及一种通过药物净化和筛选法培育清洁级实验树鼩的方法。
背景技术
实验动物的药物净化是指利用药物的方式在保留该实验动物遗传性状的前提下，提高该品种品系的微生物和寄生虫质量等级。
现有的实验动物按照微生物学质量控制的程度或根据微生物净化程度分类，可分为四种等级。
(1)普通级动物，conventional(CV)animal，不携带所规定的人兽共患病病原和动物烈性传染病的病原。(2)清洁动物，clean(CL)animal，除普通动物应排除的病原外，不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原。(3)无特定病原体动物，specific pathogen free(SPF)animal，除清洁动物应排除的病原外，不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原。(4)无菌动物，germ free(GF)animal，无可检出的一切生命体。
根据GB14922.2-2011《实验动物微生物学等级及监测》与GB14922.1-2001《实验动物寄生虫学等级及监测》划分的实验动物等级，将实验小鼠和大鼠分为清洁级、无特定病原体级和无菌级三个级别，普通级的实验小鼠和大鼠原则上不再使用；豚鼠、地鼠和兔分为普通级、清洁级、无特定病原体级和无菌级四个级别。犬和猴分为普通级和无特定病原体级两个级别。
树鼩(tree shrews，Tupaia belangeri)是一种生活在热带和亚热带地区的哺乳纲攀鼩目的小型动物，形态酷似松鼠，是灵长类动物的近亲。由于树鼩具有体型小，经济易得，易驯养，繁殖能力强，饲养管理成本低，对人类病毒易感等优点，常常用于替代或减少一些非人灵长类动物的使用，所以很早就被用作灵长类目(包括人类)的疾病动物模型。近年来研究发现，树鼩在丙型肝炎、乙型肝炎、手足口疾病、肝癌、糖尿病、肿瘤等疾病的研究中充当重要角色，已经在生物医药领域得到广泛应用。
我国现生树鼩被认为有1属1种6亚种，即中缅树鼩(Tupaia belangeri Chinensis)1个种。我国从上世纪80～90年代开展树鼩人工驯养繁殖及相关研究，进入21世纪，随着树鼩在生物医学方面的特殊地位和重要作用，我国的昆明、北京、上海、兰州、南宁、广州等地区的诸多科研院所和大专院校，像雨后春笋般地开展了树鼩的饲养繁殖与疾病动物模型的研究。2006年，中国医学科学院医学生物学研究所率先完成了野生树鼩的驯化，攻克了人工繁殖关键技术，初步实现了规模化标准化饲养繁殖。2010年云南省陆续颁布了实验树鼩地方标准10项，其中DB53/T 328.1-2010实验树鼩第1部分：微生物学等级及监测以及DB53/T 328.2-2010实验树鼩第2部分：寄生虫学等级及监测，将实验树鼩分为普通级和无特定病原体级两个等级。此后，中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心也在长期的实验树鼩标准化研究过程中，通过对野生树鼩自然携带微生物种类和寄生虫种类调查，制订了实验树鼩微生物等级及监测的国家标准《实验树鼩第1部分：微生物学等级及监测》及《实验树鼩第2部分：寄生虫学等级及监测》研究稿，目前已通过国家标准委员会立项，将实验树鼩分为普通级、清洁级和无特定病原体三个等级，具体项目见表1和表2。
表1实验树鼩病原菌检测项目
表2实验树鼩寄生虫检测项目
目前为止，国内的实验树鼩均为普通级种群，随着生命科学的发展和社会公共安全意识的提高，以及科研试验对实验动物质量要求的提高，清洁级及以上等级的实验树鼩将成为科学研究的必要条件。树鼩从20世纪60年代开始应用于医学生物研究以来，培育清洁级实验树鼩一直是树鼩饲养繁殖中的难点问题，迄今为止国内尚无通过药物净化培育清洁级实验树鼩的研究报道，包括对药物种类、剂量、用药途径、用药时间间隔、用药后的处理等诸方面的操作技术的文字记载。其他实验动物中一般采用的方法为在无菌条件下剖腹取出仔动物寻找其他泌乳期的清洁级的实验动物作为代乳动物提供仔动物母乳或者人工授乳的方式，但在我们长期的树鼩饲养繁殖过程中，对这两种方式均进行了长久的尝试，但对于树鼩来说，首先无法找到适合的清洁级代乳实验动物，其次也没有树鼩适合的人工授乳配方，从而清洁级实验树鼩的研究一直是空白状态。
之后我们在尝试使用药物净化和筛选法相结合来进行清洁级实验树鼩培育的时候，意外的发现这种药物净化和筛选法培育清洁级实验树鼩的方法能够通过几个简单易行的步骤，成功的培育清洁级实验树鼩，这几个步骤是相互配伍、相辅相成、缺一不可的。
发明内容
本发明的目的是为了填补清洁级实验树鼩的空白，提供一种通过药物净化和筛选法培育清洁级实验树鼩的方法，该方法可以将实验树鼩的微生物和寄生虫等级由普通级净化为清洁级。其中，所使用的微生物和寄生虫均为DB53/T 328.1-2010实验树鼩第1部分：微生物学等级及监测以及DB53/T 328.2-2010实验树鼩第2部分：寄生虫学等级及监测中要求的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种通过药物净化和筛选法培育清洁级实验树鼩的方法，包括如下步骤：
步骤(1)，体外寄生虫净化：取灭虱精，配制为质量浓度为0.01％的水溶液后，加热至38℃～40℃，抓取并保定树鼩，然后将树鼩除头部外全身浸入灭虱精水溶液中，药浴2～3min，离开灭虱精水溶液，待树鼩的毛发干了后，转入洁净设施中饲养，7天后，再采用上述相同方法进行药浴，待树鼩的毛发擦干后，按照《GB/T 18448.1-2001实验动物体外寄生虫检测方法》的规定进行检测，检测时，用显微镜观察树鼩毛发，见到体外寄生虫卵和/或成虫者，判为阳性；反之判为阴性；将检测结果为阴性的树鼩转入洁净设施中饲养；
所述的体外寄生虫为虱、螨或蚤；
步骤(2)，绦虫和吸虫净化：口服吡喹酮，每天2次，间隔12小时1次，每次剂量为120mg/kg，连续给药2天，然后对树鼩新鲜粪便进行检测，按照《GB/T 18448.6-2001实验动物蠕虫检测方法》的规定进行，显微镜下观察到绦虫的卵、绦虫的成虫、吸虫的卵和吸虫的成虫中的一种或几种时，判为阳性；反之判为阴性；将检测结果为阴性的树鼩转入洁净设施中饲养；
步骤(3)，线虫净化：皮下注射伊维菌素，剂量为每只动物0.03m l/次，每14天注射1次，共注射3次；然后对树鼩新鲜粪便进行检测，按照《GB/T18448.6-2001实验动物蠕虫检测方法》的规定进行，显微镜下观察到线虫卵和/或成虫时，判为阳性；反之判为阴性；将检测结果为阴性的树鼩；
步骤(4)，沙门氏菌和志贺氏菌净化：口服诺氟沙星，每天2次，间隔12小时1次，每次剂量为100mg/kg，连续给药2天，然后取树鼩肛拭子按照《GB/T 14926.1-2001实验动物沙门氏菌检测方法》和《GB/T 14926.47-2008实验动物志贺菌检测方法》的规定进行检测，根据生化鉴定结果判定，剔除检测结果为阳性的树鼩，保留检测结果为阴性的树鼩；
步骤(5)，弓形虫筛选：采集树鼩全血样本，按照《GB/T18448.2-2008实验动物弓形虫检测方法》的规定执行，根据该规定中检测方法检测弓形虫抗原，根据检测结果，剔除检测结果为阳性的树鼩，保留检测结果为阴性的树鼩；
步骤(6)，疱疹病毒筛选：采集树鼩血液样本，根据实验动物国家标准GB/T 14926.60-2001实验动物猕猴疱疹病毒Ⅰ型(B病毒)检测方法规定，提取DNA进行疱疹病毒的PCR检测，根据检测结果，剔除检测结果为阳性的树鼩，保留检测结果为阴性的树鼩；
步骤(7)，皮肤病原真菌筛选：采集树鼩毛发和皮屑，分离培养真菌，涂片镜检，按照《GB/T14926.4-2001实验动物皮肤病原真菌检测方法》规定进行，根据动物皮肤癣菌的病原真菌形态进行鉴定，剔除检测结果为阳性的树鼩，保留检测结果为阴性的树鼩；
步骤(8)，清洁级实验树鼩的判定：经步骤(1)-步骤(7)净化均为阴性的树鼩为清洁级实验树鼩。
进一步，优选的是步骤(1)中采用消毒干毛巾擦干和/或电吹风吹干树鼩的毛发。
进一步，优选的是在体外寄生虫净化过程中的非药浴日期，可同时进行绦虫和吸虫的药物净化，以及线虫的药物净化；需要进行完绦虫和吸虫的药物净化后，才能进行线虫的药物净化；
待体外寄生虫净化、绦虫和吸虫净化以及线虫净化完毕后，再进行沙门氏菌和志贺氏菌净化，沙门氏菌和志贺氏菌检测均为阴性的树鼩，同时进行弓形虫、疱疹病毒和皮肤病原真菌三种病原的筛选法。
操作程序顺序组合：
为达到培育清洁级树鼩的最优效果，实施次序原则上按照上述操作顺序依次进行。
但是为了时间的最大化利用，所以可以在体外寄生虫净化过程中的非药浴日期，同时进行绦虫和吸虫的药物净化；绦虫和吸虫的药物净化完成之后，也在体外寄生虫净化过程中的非药浴日期进行线虫的药物净化；待体外寄生虫净化、绦虫和吸虫净化以及线虫净化完毕后，再进行沙门氏菌和志贺氏菌的药物净化。检测为阴性的树鼩进行弓形虫、疱疹病毒和皮肤病原真菌三种病原的筛选法，利用筛选剔除这三种病原的筛选可以同时进行(即不按照顺序)，也可以按顺序进行。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明操作方法步骤简单，效果明显，采用药物净化与和筛选法相结合的方法，将实验树鼩的微生物和寄生虫等级由普通级净化为清洁级。
本发明体外寄生虫和肠道蠕虫的净化率达到100％，沙门氏菌和志贺氏菌净化率达到97.5％，同时采用筛选法剔除了弓形虫、疱疹病毒和皮肤病原真菌阳性的个体，建立了一种通过药物净化和筛选法培育清洁级实验树鼩的方法。在国内实属首创，填补了迄今为止国内尚无通过药物净化培育清洁级实验树鼩的空白。
附图说明
图1是本发明通过药物净化和筛选法培育清洁级实验树鼩的方法流程图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用原来或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
下面对实验树鼩药物净化中药物种类、剂量、配比、用药方法、用药时间间隔等诸方面关键技术的详细描述，培育清洁级实验树鼩的方法如图1所示。
1净化候选种群实验树鼩200只，雌雄各半。
2体外寄生虫净化操作程序
2.1操作：使用灭虱精(杭州时新卫生用品厂生产，为1.5％菊酯水剂10mL/袋)配制为0.01％浓度，最少配制量为5000mL溶液，可药浴10只树鼩；加热水温至38℃～40℃；手握保定树鼩，除头部外全身浸入药液中，让树鼩皮毛充分浸透，药浴2～3min；离开药液，用消毒灭菌的干毛巾檫干树鼩毛发，电吹风吹干，放入洁净笼具中，疗程为7天1次，共2次，即第0天、第7天各1次；
2.2作用：杀灭虱、螨、蚤的幼虫；
2.3效果：给药前，虱、螨、蚤感染为64只；药浴后，虱、螨、蚤感染为0只转阴率100％。
2.4检测方法：透明胶带纸取树鼩耳背、颈部、腋下、腹股沟部位的毛发，贴于载玻片上，直接显微镜观察。见到卵和成虫者，判为阳性；反之判为阴性。
2.5操作时间：第0天，第7天。
2.6处理：将药浴后的树鼩转入洁净设施中饲养。
3蠕虫净化操作程序
3.1绦虫和吸虫净化操作程序
3.1.1操作：口服吡喹酮，剂量为120mg/kg(树鼩平均体重按150g计算，即每只动物给药量约18mg/次)，疗程为每天2次(间隔12小时1次)，共服药2天；
3.1.2作用：杀灭绦虫和吸虫；
3.1.3效果：转阴率100％；
3.1.4检测方法：取树鼩新鲜粪便，生理盐水稀释后直接涂片，显微镜观察。见到卵和成虫者，判为阳性；反之判为阴性。
3.1.5操作时间：第3天，第4天，每天2次。
3.1.6处理：将检测结果为阴性的树鼩转入洁净设施中饲养。
3.2线虫净化操作程序
3.2.1操作：皮下注射清体康(佛山市南海东方澳龙药业有限公司生产，为伊维菌素2mL：4000单位)，使用剂量为每只动物0.03m l/次，疗程为14天1次，共3次，即第0天、第14天和第28天各1次；
3.2.2作用：杀灭体内线虫，并可辅助性杀灭体外螨虫；
3.2.3效果：转阴率100％；
3.2.4检测方法：取树鼩新鲜粪便，生理盐水稀释后直接涂片，显微镜观察。见到卵和成虫者，判为阳性；反之判为阴性；
3.2.5操作时间：第10天，第24天，第38天各1次。
3.2.6处理：将检测结果为阴性的树鼩转入洁净设施中饲养。
4沙门氏菌、志贺氏菌两种肠道致病细菌净化操作程序
4.1操作：口服诺氟沙星，剂量为100mg/kg(树鼩平均体重按150g计算，即每只动物给药量约15mg/次)，每天2次(间隔12小时1次)，连续给药2天；
4.2作用：杀沙门氏菌和志贺氏菌；
4.3效果：给药前，沙门氏菌及志贺氏菌感染为40只；给药后，沙门氏菌及志贺氏菌感染为1只。第40天，第41天，每天2次(间隔12小时1次)。
4.4检测方法：取树鼩肛拭子进行分离培养，根据生化鉴定结果判定；
4.5操作时间：第40天，第41天。
4.6处理：将检测结果为阴性的树鼩转入实验动物屏障设施中饲养。
5弓形虫筛选操作程序
5.1操作：采用筛选剔除法；即不作药物处理，直接进行病原筛查，根据结果，剔除阳性动物，保留阴性动物进入候选清洁级种群；
5.2检测方法：采集树鼩全血样本，根据实验动物国家标准GB/T18448.2-2008弓形虫PCR检测方法检测弓形虫抗原。
5.3效果：筛选剔除弓形虫感染实验树鼩0只；
5.4操作时间：第42天。
6病毒筛选操作程序
6.1操作：采用筛选剔除法；直接进行病原筛查，根据检测结果，剔除阳性动物，保留阴性动物进入候选清洁级种群；
6.2检测方法：采集树鼩血液样本，提取DNA进行疱疹病毒的PCR检测。
6.3效果：筛选剔除疱疹病毒感染树鼩2只。
6.4操作时间：第42天。
7皮肤病原真菌筛选操作程序
7.1操作：采用筛选剔除法；直接进行病原筛查，根据检测结果，剔除阳性动物，保留阴性动物进入候选清洁级种群；
7.2检测方法：采集动物毛、皮屑，分离培养真菌，涂片镜检，根据动物皮肤癣菌的病原真菌形态进行鉴定。
7.3效果：筛选剔除皮肤病原真菌感染实验树鼩3只。
7.4操作时间：第42天。
经上述七步净化均为阴性的树鼩为清洁级实验树鼩。
8药物净化和筛选前后结果比较
药物净化前后结果对比详见表3药物处理前后实验树鼩寄生虫和肠道致病菌携带情况表。筛选前树鼩弓形虫、疱疹病毒和皮肤病原真菌携带情况见表4。
同时，为验证净化和筛选结果，经抽样送第三方实验动物检测机构进行复核，结果完全一致。
表3药物处理前后实验树鼩寄生虫、肠道致病菌携带情况表
表4筛选前实验树鼩弓形虫、疱疹病毒和皮肤病原真菌携带情况表
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (3)
1.一种通过药物净化和筛选法培育清洁级实验树鼩的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），体外寄生虫净化：取灭虱精，配制为质量浓度为0.01%的水溶液后，加热至38℃～40℃，抓取并保定树鼩，然后将树鼩除头部外全身浸入灭虱精水溶液中，药浴2～3min，离开灭虱精水溶液，待树鼩的毛发干了后，转入洁净设施中饲养，7天后，再采用上述相同方法进行药浴，待树鼩的毛发擦干后，按照《GB/T
18448.1-2001 实验动物 体外寄生虫检测方法》的规定进行检测，检测时，用显微镜观察树鼩毛发，见到体外寄生虫卵和/或成虫者，判为阳性；反之判为阴性；将检测结果为阴性的树鼩转入洁净设施中饲养；
所述的体外寄生虫为虱、螨或蚤；
步骤（2），绦虫和吸虫净化：口服吡喹酮，每天2次，间隔12小时1次，每次剂量为120mg/kg，连续给药2天，然后对树鼩新鲜粪便进行检测，按照《GB/T 18448.6-2001 实验动物 蠕虫检测方法》的规定进行，显微镜下观察到绦虫的卵、绦虫的成虫、吸虫的卵和吸虫的成虫中的一种或几种时，判为阳性；反之判为阴性；将检测结果为阴性的树鼩转入洁净设施中饲养；
步骤（3），线虫净化：皮下注射伊维菌素，剂量为每只动物0.03ml/次，每14天注射1次，共注射3次；然后对树鼩新鲜粪便进行检测，按照《GB/T 18448.6-2001
实验动物 蠕虫检测方法》的规定进行，显微镜下观察到线虫卵和/或成虫时，判为阳性；反之判为阴性；将检测结果为阴性的树鼩；
步骤（4），沙门氏菌和志贺氏菌净化：口服诺氟沙星，每天2次，间隔12小时1次，每次剂量为100mg/kg，连续给药2天，然后取树鼩肛拭子按照《GB/T 14926.1-2001实验动物 沙门氏菌检测方法》和《GB/T 14926.47-2008 实验动物 志贺菌检测方法》的规定进行检测，根据生化鉴定结果判定，剔除检测结果为阳性的树鼩，保留检测结果为阴性的树鼩；
步骤（5），弓形虫筛选：采集树鼩全血样本，按照《GB/T18448.2-2008
实验动物 弓形虫检测方法》的规定执行，根据该规定中检测方法检测弓形虫抗原，根据检测结果，剔除检测结果为阳性的树鼩，保留检测结果为阴性的树鼩；
步骤（6），疱疹病毒筛选：采集树鼩血液样本，根据实验动物国家标准GB/T
14926.60-2001 实验动物 猕猴疱疹病毒Ⅰ型(B病毒)检测方法规定，提取DNA进行疱疹病毒的PCR检测，根据检测结果，剔除检测结果为阳性的树鼩，保留检测结果为阴性的树鼩；
步骤（7），皮肤病原真菌筛选：采集树鼩毛发和皮屑，分离培养真菌，涂片镜检，按照《GB/T14926.4-2001实验动物 皮肤病原真菌检测方法》规定进行，根据动物皮肤癣菌的病原真菌形态进行鉴定，剔除检测结果为阳性的树鼩，保留检测结果为阴性的树鼩；
步骤（8），清洁级实验树鼩的判定：经步骤（1）-步骤（7）净化均为阴性的树鼩为清洁级实验树鼩。
2.根据权利要求1所述的通过药物净化和筛选法培育清洁级实验树鼩的方法，其特征在于：步骤（1）中采用消毒干毛巾擦干和/或电吹风吹干树鼩的毛发。
3.根据权利要求1所述的通过药物净化和筛选法培育清洁级实验树鼩的方法，其特征在于：在体外寄生虫净化过程中的非药浴日期，可同时进行绦虫和吸虫的药物净化，以及线虫的药物净化；需要进行完绦虫和吸虫的药物净化后，才能进行线虫的药物净化；
待体外寄生虫净化、绦虫和吸虫净化以及线虫净化完毕后，再进行沙门氏菌和志贺氏菌净化，沙门氏菌和志贺氏菌检测均为阴性的树鼩，同时进行弓形虫、疱疹病毒和皮肤病原真菌三种病原的筛选法。
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