CN105925688A - 继发性肺结核患者调节性t细胞频率的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了继发性肺结核患者调节性T细胞频率的检测方法。本发明公开的方法包括：利用引物对与探针对含有FOXP3 TSDR DNA片段的标准质粒进行荧光定量PCR，确定M，M为不同FOXP3 TSDR拷贝数与荧光定量PCR体系中荧光强度的对应关系；将625‑1000个调节性T细胞混于(0.5‑10)×106个单个核细胞中，得到混合细胞；利用引物对与探针对混合细胞的基因组DNA进行荧光定量PCR，依据M确定FOXP3TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系；利用荧光定量PCR检测待测对象FOXP3TSDR拷贝数，根据FOXP3TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系确定待测对象调节性T细胞频率。

Description

继发性肺结核患者调节性T细胞频率的检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中继发性肺结核患者调节性T细胞频率的检测方法。
背景技术
结核病是慢性传染性疾病，据世界卫生组织评估，目前我国结核病年发病人数约为130万，占全球发病人数的14％，位居全球第二位，我国已成为全球22个结核病高负担国家之一。结核病免疫机制主要依赖细胞免疫，结核分枝杆菌感染后，是巨噬细胞分泌大量的细胞因子，同时T淋巴细胞与巨噬细胞相互作用和协调，T淋巴细胞识别特异性抗原受体，分化参与结核结节的形成等迟发型超敏反应。研究发现抗结核整体的免疫网络需要一种调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)，这种T细胞特异性分子标记是一种转录因子Foxp3(forkhead box P3 protein)，又称叉头状/翅膀状螺旋转录因子，Shohei Hori和Ohkura等已证实Foxp3在调节性T细胞在免疫应答中起关键作用(细胞谱系的形成)。调节性T细胞(CD4+CD25+Foxp3+Treg)是针对自身和外来抗原下调抗原特异性T细胞应答，抑制免疫病理损伤CD4+T细胞亚群。
目前在实验小鼠中,基于细胞表面抗原,已经被分离、鉴定出来的最重要的一类调节性T细胞,是CD4+CD25+T细胞亚群。机体内自然生成的CD4+CD25+调节性T细胞,在胸腺中发育、成熟为具有特定功能的T细胞群,并表达叉状头/翼状螺旋转录因子(forhead-winged helix transcription factor,Foxp3).Foxp3在调节性T细胞的发生发展及免疫调节功能中有关键性的作用。
调节性T细胞是免疫系统的重要成分,尤其在自身免疫性疾病中发挥重要作用,掌握调节性T细胞的作用机制具有相当重要的意义。
Foxp3基因组位置Xp11.23，NCBI基因ID:50943，NC_000023.11(49250436..49265738,complement)由12外显子构成。外显子-2b和-1被5000bp分割，这个片段存在几个顺式作用元件。依据Foxp3的启动子和基因内在增强子区域的后天修饰可以区分Tconv细胞(conventional T cell，普通T细胞)和Treg细胞，Treg的基因内在增强子区域被称为(Treg-specific demethylatedregion,TSDR)，TSDR的调节顺式作用原件出现在非编码外显子-2b和-1之间被称为基因内在增强子，主要作用是调节Foxp3表达，在其+4201至+4500bp范围存在CpG残基，Tconv细胞表现为完全的甲基化，而Treg表现为完全的去甲基化。TSDR的-2786至-5558bp间存在CpG岛上游增强子，天然外周CD4+CD25-T、活化的CD4+T细胞和分泌TGF-β的Foxp3+Treg细胞表现为甲基化，而Treg表现为去甲基化。TSDR这些基因片段是Treg和其他表达Foxp3的T细胞辨别标志物。常规评价细胞功能依靠细胞培养及流式细胞检测技术，方法繁琐，技术要求高，一般医院均无法完成。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测调节性T细胞频率。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了调节性T细胞频率的检测方法，所述方法包括：通过荧光定量PCR确定FOXP3 TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系；利用荧光定量PCR检测待测对象FOXP3 TSDR拷贝数，根据所述FOXP3 TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系确定所述待测对象调节性T细胞频率；
所述通过荧光定量PCR确定FOXP3 TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系包括：
a1)利用引物对与探针对含有FOXP3 TSDR或其DNA片段的标准质粒进行荧光定量PCR，确定M，所述M为不同FOXP3 TSDR拷贝数与荧光定量PCR体系中荧光强度的对应关系；
a2)将625-1000个调节性T细胞混于(0.5-10)×106个单个核细胞中，得到混合细胞；利用所述引物对与所述探针对所述混合细胞的基因组DNA进行荧光定量PCR，依据所述M确定FOXP3 TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种构建检测调节性T细胞频率模型的方法，所述方法包括：
b1)利用引物对与探针对含有FOXP3 TSDR或其DNA片段的标准质粒进行荧光定量PCR，确定M，所述M为不同FOXP3 TSDR拷贝数与荧光定量PCR体系中荧光强度的对应关系；
b2)将625-1000个调节性T细胞混于(0.5-10)×106个单个核细胞中，得到混合细胞；利用所述引物对与所述探针对所述混合细胞的基因组DNA进行荧光定量PCR，依据所述M确定FOXP3 TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系。
上述方法中，所述调节性T细胞可为CD4+CD25+T细胞。
上述方法中，所述625-1000个调节性T细胞可为1250-5000个调节性T细胞。所述1250-5000个调节性T细胞具体可为2500个调节性T细胞。
上述方法中，所述(0.5-10)×106个单个核细胞具体可为2×106个单个核细胞。
上述方法中，所述引物对可由序列表中序列1与序列2所示的单链DNA组成。所述探针的序列可为序列表中序列3。
上述方法中，所述标准质粒可为将FOXP3 TSDR或其DNA片段导入克隆质粒中得到的重组质粒。
上述方法中，所述克隆质粒可为pCR2.1-TOPO TA载体。
上述方法中，所述FOXP3 TSDR DNA片段可为以调节性T细胞的基因组DNA为模板，用所述引物对进行PCR扩增得到的DNA片段。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测调节性T细胞频率的成套试剂，所述成套试剂包括所述引物对与所述探针。
上述成套试剂可由所述引物对、所述探针与克隆质粒组成。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述方法在检测或辅助检测继发性肺结核患者调节性T细胞频率中的应用。
本发明中，所述调节性T细胞频率是指CD4+T细胞中调节性T细胞的百分比。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述成套试剂在检测或辅助检测继发性肺结核患者调节性T细胞频率中的应用。
本发明的发明人通过调整粒细胞的数目，使整体的检测数据刚好处于技术检测限范围内，结果质量得到保证。实验证明，发明人通过调节性T细胞频率的检测方法分析继发性肺结核患者与非继发性肺结核患者抗酸染色及其对应的FOXP3 TSDR结果，发现调节性T细胞的数量与抗酸染色结果有关。继发性肺结核患者组的调节性T细胞频率为1.05％±0.43％，非继发性肺结核患者组的调节性T细胞频率为1.63％±0.70％，继发性肺结核患者组与非继发性肺结核患者组的调节性T细胞频率差异有统计学意义(Ρ＜0.05)。表明，本发明的调节性T细胞频率的检测方法可以用来检测继发性肺结核患者的调节性T细胞频率。
附图说明
图1为质粒标准品的荧光定量PCR的曲线。其中，1和2表示FOXP3 TSDR拷贝数为20000，3和4表示FOXP3 TSDR拷贝数为2000，5和6表示FOXP3 TSDR拷贝数为200，7和8表示FOXP3 TSDR拷贝数为20，9和10分别表示CUT-OFF值和稀释10倍的CUTOFF，11表示FOXP3 TSDR拷贝数为痰涂片阳性病人，实验中为阳性对照，12表示反应基线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、调节性T细胞频率的检测
一、调节性T细胞频率的检测方法确立
1.1研究对象
1.1.1研究组：根据根据《中华人民共和国卫生行业标准肺结核诊断标准(WS288-2008)》，选取继发性肺结核病人(以浸润性肺结核为主，含纤维空洞性肺结核和干酪样肺炎)47人，男32例，女15例，年龄18～47岁，平均年龄(32±11.2)岁，细菌学(痰涂片、痰培养)和影像学均为阳性继发性肺结核患者作为研究对象，排除HIV、自身免疫疾病、肿瘤、炎症性肠病、过敏和伴X-染色体多内分泌病等疾病，治疗期间未用免疫抑制剂和激素类药物，治疗方案依据肺结核标准化学治疗方案-复治涂阳肺结核治疗方案2HRZSE/4～6HRE。
1.1.2对照组：选择健康人群40例，男26例，女14例，年龄17～40岁，平均年龄(28±9.6)岁，与研究组比较，年龄、性别和职业分布无统计学差异。
1.2试剂和仪器
人外周血基因组提取试剂盒(QIAamp DNA Mini kit)与质粒纯化试剂(QiagenPlasmid Midi Kit)均为凯杰企业管理(上海)有限公司产品，CD4+T细胞阴性选择试剂(磁珠分离系统)与CD4+T细胞anti-CD25-APC荧光染液均为MiltenyiBiotec公司产品，DP214-通用型-DNA纯化回收试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品，pCR2.1-TOPO TA载体为Invitrogen公司产品，荧光定量PCR试剂为ABI公司产品。
使用的仪器有BioPhotometerD30(EppendorfμCuvette G1.0，德国Eppendorf公司)，ABI7500(美国ABI公司)，-80℃冰箱(Thermo,美国)。
1.3方法
1.3.1样品采集及疗程中临床资料收集:研究组在诊断初期和治疗后2周、4周、8周分别用EDTA抗凝管采集清晨空腹血液样本3ml，收集研究对象的初诊、2周、4周和8周的清晨、夜间和即时痰样。对照组只采集一次清晨空腹3ml用EDTA抗凝新鲜血液。收集上述各时间点研究组患者的痰涂片、痰培养、影像学及临床评价资料。
1.3.2痰涂、染色和镜检：按照参考文献(张贺秋,赵雁林.现代结核病诊断技术[M].人民卫生出版社.2013年3月：47-55.)进行。
1.3.3外周血单个核细胞(PBMC)的提取:用Ficoll密度梯度离心法分离研究组和对照组单个核细胞(淋巴细胞和单核细胞)，洗涤，制备PBMC悬液，分成三份，取微量用细胞计数板计数细胞总数和活细胞百分率，分离的血浆冻存-80℃备用。
1.3.4CD4+CD25+T细胞筛选：取步骤1.3.3的PBMC悬液，分离CD4+T细胞，分离余液及细胞-80℃备用。CD4+T细胞用anti-CD25-APC荧光染液分离成CD4+CD25+T和CD4+CD25-T细胞，收集细胞及余液-80℃保存备用。
1.3.5CD4+CD25+T细胞基因组DNA的提取：利用人外周血基因组提取试剂盒提取基因组DNA，将得到的基因组DNA溶解于0.1×TE缓冲液，置于-80℃储存备用。
1.3.6质粒标准品的制备：
将对照组40人份基因组DNA等比例混匀，得到混合基因组DNA，利用去甲基化FOXP3 TSDR特异性引物(F:cgtgatgaggcgagacttttc(序列表中序列1)和R:tccctggctcccagaatcta(序列表中序列2))扩增。
PCR反应体系如下：反应体积50μl，其中15pmol/μl上游引物(序列1)2.5μl,15pmol/μl下游引物(序列2)2.5μl，PCR反应体系中四种dNTPs的混合物中每种dNTP的浓度均为200μM,混合基因组DNA 2μl，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)(TaKaRa公司)1μL，无菌水补至50μl。
反应条件为：95℃2min预变性；然后按95℃15s，61℃1min，72℃2分钟，共40个循环；72℃7分钟延伸。
PCR产物切胶回收，纯化，将纯化后的DNA片段克隆至pCR2.1-TOPO TA载体，得到向中插入序列4所示DNA片段的重组载体，测序鉴定。调整重组载体的浓度，得到浓度分别为100fg/μL，10fg/μL，1fg/μL和0.1fg/μL的质粒标准品溶液，其拷贝数浓度分别为20000拷贝/μL，2000拷贝/μL，200拷贝/μL和20拷贝/μL。
1.3.7FOXP3 TSDR去甲基化实时定量PCR分析：
实时定量PCR反应体系如下：反应体积20μl，其中15pmol/μl上游引物(上游引物的序列为序列1)1μl,15pmol/μl下游引物(下游引物的序列为序列2)1μl，5pmol/μl杂交探针(探针的序列为ttcctcattcagtaactgtc(序列3)，探针被Reporter Dye:FAM,Quencher Dye:TAMRA标记)1μl，反应体系中四种dNTPs的混合物中每种dNTP的浓度均为200μM,15ng/μl重亚硫酸盐处理的质粒标准品溶液2μl，TaqMan Universal PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific产品)10μl，无菌水补至20μl。每个反应体系中一种基因组DNA或一种浓度的质粒标准品溶液
反应条件为：95℃2min预变性，然后按95℃15s，61℃1min，共40个循环。
其中，重亚硫酸盐处理的质粒标准品溶液采用Active motif公司的MethylDetectorTM重亚硫酸盐修饰试剂盒进行，操作步骤如下：将目的DNA用蛋白酶K处理，加入重亚硫酸盐转化试剂和DNA变性剂，在温度循环仪中进行快速热变性。经过1.5小时的DNA转化反应，样品加入到试剂盒里的DNA纯化柱，脱盐后洗脱DNA。
FOXP3 TSDR PCR拷贝数与反应体系的平均Ct的线性关系为：y＝-3.328x+33.91,R2＝0.997，EF:99.735％。质粒标准品的荧光定量PCR的曲线如图1所示。
1.3.8CD4+CD25+T细胞频率与FOXP3 TSDR PCR拷贝换算
将对照组分离的CD4+CD25+T细胞计数分为10000，5000，2500，1250和625细胞群，分别混于2×106个人血液的单个核细胞，对应CD4+CD25+T细胞频率比例为0.5％，0.25％，0.13％，0.06％和0.03％。将上述混合后细胞群提取基因组DNA，按照步骤1.3.7中的方法进行实时定量PCR，分析不同CD4+CD25+T细胞频率对应的FOXP3 TSDR模板拷贝数。CD4+CD25+T细胞频率为0.5％，0.25％，0.13％，0.06％和0.03％时FOXP3 TSDR的拷贝数分别为56，28，14，7和3.5拷贝。
二、继发性肺结核患者调节性T细胞频率的检测
将步骤一的研究组和对照组利用抗酸染色。按照步骤一的方法检测研究组与对照组各人的调节性T细胞频率。
应用spss16.0软件统计分析实验所得数据。利用独立样本T-test分析对照组和研究组时FOXP3 TSDR去甲基化(调节性T细胞频率)差异，用Barlett法和Levene检验判断方差齐性，Ρ＜0.05判断为差异有统计学意义。
结果如表1所示，47名研究组抗酸染色均为阳性，对照组均为阴性。研究组的调节性T细胞频率为1.0547％±0.4354％，对照组的调节性T细胞频率为1.6288％±0.6989％，研究组与对照组的调节性T细胞频率差异有统计学意义(Ρ＜0.05)。

Claims (10)

1.调节性T细胞频率的检测方法，包括：通过荧光定量PCR确定FOXP3TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系；利用荧光定量PCR检测待测对象FOXP3TSDR拷贝数，根据所述FOXP3TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系确定所述待测对象调节性T细胞频率；
所述通过荧光定量PCR确定FOXP3TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系包括：
a1)利用引物对与探针对含有FOXP3TSDR或其DNA片段的标准质粒进行荧光定量PCR，确定M，所述M为不同FOXP3TSDR拷贝数与荧光定量PCR体系中荧光强度的对应关系；
a2)将625-1000个调节性T细胞混于(0.5-10)×106个单个核细胞中，得到混合细胞；利用所述引物对与所述探针对所述混合细胞的基因组DNA进行荧光定量PCR，依据所述M确定FOXP3TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系。
2.一种构建检测调节性T细胞频率模型的方法，包括：
b1)利用引物对与探针对含有FOXP3TSDR或其DNA片段的标准质粒进行荧光定量PCR，确定M，所述M为不同FOXP3TSDR拷贝数与荧光定量PCR体系中荧光强度的对应关系；
b2)将625-1000个调节性T细胞混于(0.5-10)×106个单个核细胞中，得到混合细胞；利用所述引物对与所述探针对所述混合细胞的基因组DNA进行荧光定量PCR，依据所述M确定FOXP3TSDR拷贝数与调节性T细胞频率的关系。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述调节性T细胞为CD4+CD25+T细胞；和/或，所述引物对由序列表中序列1与序列2所示的单链DNA组成，所述探针的序列为序列表中序列3。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述标准质粒为将FOXP3TSDR或其DNA片段导入克隆质粒中得到的重组质粒。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述克隆质粒为pCR2.1-TOPO TA载体。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述FOXP3TSDR DNA片段为以调节性T细胞的基因组DNA为模板，用所述引物对进行PCR扩增得到的DNA片段。
7.检测调节性T细胞频率的成套试剂，包括权利要求1-6中任一所述引物对与所述探针。
8.根据权利要求7所述的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂由权利要求1-5中任一所述引物对、所述探针与克隆质粒组成。
9.权利要求1-6中任一所述方法在检测或辅助检测继发性肺结核患者调节性T细胞频率中的应用。
10.权利要求8或9所述成套试剂在检测或辅助检测继发性肺结核患者调节性T细胞频率中的应用。
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