CN105907851B - rs77191406位点在制备预测RA和SLE继发恶性肿瘤的试剂盒中的用途 - Google Patents

rs77191406位点在制备预测RA和SLE继发恶性肿瘤的试剂盒中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了rs77191406位点在制备预测RA和SLE继发恶性肿瘤的试剂盒中的用途。本发明发明人首次发现A20基因SNP rs77191406与RA和SLE并发恶性肿瘤相关，rs77191406可作为RA和SLE继发恶性肿瘤的预测指标。因此，提供了rs77191406位点在制备预测RA和SLE继发恶性肿瘤的试剂盒中的用途以及提供了一种预测RA和SLE继发恶性肿瘤的试剂盒。本发明的rs77191406对预测RA和SLE继发恶性肿瘤有重要的意义，有很大的临床应用价值和很好的应用前景。

Description

rs77191406位点在制备预测RA和SLE继发恶性肿瘤的试剂盒 中的用途
技术领域
本发明涉及一种SNP的用途，特别涉及rs77191406位点在制备预测RA和SLE继发恶性肿瘤的试剂盒中的用途。
背景技术
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)和系统性红斑狼疮(systemiclupus erythematosus，SLE)是两种最典型的系统性自身免疫性疾病。RA以累及周围对称性多关节为主要表现，以滑膜炎症和关节进行性破坏为主要特征，导致关节畸形和功能受限。SLE是一种多发于青年女性的累及多脏器的慢性系统性自身免疫病，B细胞和T细胞异常活化在RA和SLE发病过程中占有重要地位。临床研究证明，与普通人群相比，RA或SLE患者继发恶性肿瘤的风险增加。目前尚没有有效预测RA和SLE继发恶性肿瘤的标志物。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供rs77191406位点在制备预测RA和SLE继发恶性肿瘤的试剂盒中的用途。
本发明的另一目的在于提供一种预测RA和SLE继发恶性肿瘤的试剂盒。
本发明的目的通过下述技术方案实现：rs77191406位点在制备预测RA和SLE继发恶性肿瘤的试剂盒中的用途。
所述的rs77191406为CT基因型时，表明RA和SLE患者患恶性肿瘤的可能性较大。
所述的试剂盒包括检测rs77191406位点基因型的试剂。
所述的试剂包括用于扩增所述rs77191406位点的引物。
所述的用于扩增所述rs77191406位点的引物优选为扩增出来的序列能用于限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)的引物。
所述的用于扩增所述rs77191406位点的引物包括F1和R1：
F1：5'-CAACGGCTACTGCAACGAAT-3'；
R1：5'-GCTCATGCCCCAACAACAACCA-3'。
所述的试剂盒还包括限制性内切酶。
所述的限制性内切酶优选为BstuI。
一种预测RA和SLE继发恶性肿瘤试剂盒，包括检测rs77191406位点基因型的试剂。
所述的试剂包括用于扩增所述rs77191406位点的引物。
所述的用于扩增所述rs77191406位点的引物优选为扩增出来的序列能用于RFLP的引物。
所述的用于扩增所述rs77191406位点的引物包括F1和R1：
F1：5'-CAACGGCTACTGCAACGAAT-3'；
R1：5'-GCTCATGCCCCAACAACAACCA-3'。
所述的试剂盒还包括限制性内切酶。
所述的限制性内切酶优选为BstuI。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、rs77191406(19261C>T)位于A20基因3'端非编码区(3'UTR)，在6号染色体137881704位点发生C突变为T改变。本发明发明人首次发现A20基因SNP rs77191406与RA和SLE并发恶性肿瘤相关，rs77191406可作为RA和SLE继发恶性肿瘤的预测指标。如图1和表3所示。
2、本发明的rs77191406对预测RA和SLE继发恶性肿瘤有重要的意义，有很大的临床应用价值和很好的应用前景。
附图说明
图1是A20基因rs77191406核苷酸序列分析结果图。
图2是用PCR-BstuI-RFLP琼脂糖凝胶法分析rs77191406的结果图；其中，泳道M为100bp DNA Marker、泳道1～4为纯合子(CC)基因型；泳道5～7为杂合子(CT)基因型；泳道8为PCR产物。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)利用PCR-RFLP检测A20基因SNP rs77191406位点多态性。
(2)收集99例RA和37例SLE患者以及99例健康人外周血样本(表1)，将患者分为RA、SLE患者伴发肿瘤组和RA、SLE患者无肿瘤组，提取单个核细胞，提取DNA。
(3)在NCBI上确定rs77191406位点的基因序列，利用Primer Premier 5.0软件分析内切酶识别情况，确定限制性内切酶(BstuI)可以特异性识别该位点。PCR-RFLP的引物设计也采用Primer Premier 5.0软件对包含SNP位点在内的DNA片段设计引物(上游引物：5'-CAACGGCTACTGCAACGAAT-3'；下游引物：5'-GCTCATGCCCCAACAACAACCA-3')，保证扩增产物被酶切后的片段长度尽量相差100bp以上，以便琼脂糖凝胶电泳能进行分辨。
(4)酶切反应体系为30μL，PCR产物14μL、10倍缓冲液3μL、BstuI限制性内切酶1μL以及超纯水12μL，将混合物充分混匀后置于37℃1h。
(5)酶切产物用3％(w/v)琼脂糖凝胶进行电泳，25min后于凝胶成像仪观察成像。根据成像结果，判断rs77191406位点基因型，同时RCR产物随机送核苷酸序列分析鉴定，证实酶切分析结果与序列分析结果完全一致(图1和图2)，图2的酶切结果表明，泳道1～4为纯合子(CC)基因型为460bp和500bp两种产物，泳道5～7为杂合子(CT)基因型为460bp、500bp、960bp 3种产物。将RA、SLE患者和健康对照组rs77191406的基因型和等位基因频率进行比较，结果如表2所示。
(6)rs77191406位点多态性与RA/SLE患者临床疾病特点之间的关联性分析：收集rs77191406(CT基因型)的RA和SLE患者的临床资料，分析rs77191406(CT基因型)与RA/SLE继发恶性肿瘤的相关性。在99例RA患者中有1例检测到rs77191406(CT基因型)，37例SLE患者中有2例检测到rs77191406(CT基因型)。结合临床分析发现，携带rs77191406(CT基因型)的1例RA患者关节肿痛数、炎症指标明显升高，疾病反复发作，改变病情抗风湿药(DMARDs)治疗反应差。该患者在RA诊断10年后被诊断出结肠癌，1年后发生全身多发转移。而2例携带rs77191406(CT基因型)的SLE患者中，1例患者病情反复发作，环磷酰胺、羟氯喹疗效差，5年后被确诊为膀胱癌，9个月后发生肝转移，肝转移3月后死亡；另1例是严重的神经精神狼疮(NP-SLE)患者，男性，19岁，伴有脊髓萎缩、狼疮性肾炎、严重的全血细胞减少，目前高位截瘫。3例rs77191406(CT基因型)患者的具体临床信息见表3。为进一步明确rs77191406(CT基因型)是否与原发肿瘤相关，我们检测了6例不伴有自身免疫性疾病的结肠癌样本，6例结肠癌患者均为rs77191406(CC基因型)。进一步证实rs77191406(CT基因型)与RA/SLE继发恶性肿瘤具有相关性。
表1 RA and SLE患者和健康对照组临床资料
表2 RA、SLE患者和健康对照组rs77191406的基因型和等位基因频率比较
表3检出rs77191406(CT基因型)的RA和SLE患者的临床资料
上述实验结果说明了本发明提供的A20基因SNP rs77191406与RA和SLE伴发恶性肿瘤相关。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.rs77191406 位点在制备预测RA和SLE继发恶性肿瘤的试剂盒中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的试剂盒包括检测rs77191406位点基因型的试剂。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的试剂包括用于扩增所述rs77191406位点的引物，或是包括用于扩增所述rs77191406位点的引物和限制性内切酶。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的用于扩增所述rs77191406位点的引物为扩增出来的序列能用于RFLP的引物。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的用于扩增所述rs77191406位点的引物包括F1和R1：
F1：5'-CAACGGCTACTGCAACGAAT-3'；
R1：5'-GCTCATGCCCCAACAACAACCA-3'。
6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的限制性内切酶为BstuI。
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