JP2022527316A - ウィルスに関連した癌のリスクの層別化 - Google Patents
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Abstract
本明細書で提供されることは、被験者の生物学的サンプルからの無細胞核酸分子の分析に基づいて、被験者が病原体関連障害を発症するリスクを層別化するための方法およびシステムである。様々な例において、スクリーニング頻度はリスク分析に基づいて決定される。また、無細胞核酸分子中の病原体ゲノムの変異パターンを分析するための方法およびシステムも、本明細書で提供される。
Description
相互参照
本出願は、２０２０年１月１５日に出願された米国仮出願第６２／９６１，５１７号、および２０１９年４月２日に出願された米国仮出願第６２／８２８，２２４号の利益を主張するものであり、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１月１５日に出願された米国仮出願第６２／９６１，５１７号、および２０１９年４月２日に出願された米国仮出願第６２／８２８，２２４号の利益を主張するものであり、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
多くの病気や症状は、ウィルスなどの病原体の感染に関連している可能性がある。鼻咽頭癌（ＮＰＣ）は、中国南部および東南アジアで最も蔓延している癌の１つであり、ＮＰＣの病因は、エプスタインバー（Epstein-Barr）ウィルス（ＥＢＶ）感染症と密接に関連している可能性がある。ＮＰＣの発生率の高い地域であれば、ほとんどすべてのＮＰＣ腫瘍にＥＢＶゲノムが潜んでいるであろう。ＥＢＶとＮＰＣの密接な関係性に基づき、血漿ＥＢＶ ＤＮＡが、ＮＰＣのバイオマーカーとして開発された。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析を使用して、血漿（plasma）ＥＢＶ ＤＮＡの検出が、ＮＰＣの検出に対して、９５％の感度および９３％の特異性を有することが示された（Lo et al. CancerRes.1999; 59：1188-91）。生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の分析に基づき、これら病原体関連障害のリスクを層別化するために、非侵襲的または低侵襲的診断アッセイを開発することには、大きな臨床的利益がある。
ある態様において、本明細書にて提供されることは、被験者(subject)における病原体関連障害をスクリーニングする方法であり、該方法は：前記被験者の生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の特性(characteristic)を決定することを含む、第１の時点で実施される第１のアッセイからのデータを受け取るステップであって、前記病原体からの無細胞核酸分子の特性が、量、メチル化状態、変異(variant)パターン、フラグメントサイズ、または前記生物学的サンプル中の被験者からの無細胞核酸分子と比較した相対的存在量を含み、かつ、前記特性が、前記被験者が前記病原体関連障害を発症するリスクを示す受け取るステップと；前記特性に基づいて、前記被験者における前記病原体関連障害をスクリーニングするために第２のアッセイが実施される第２の時点を決定するステップであって、前記第１の時点および前記第２の時点との間の間隔が、前記リスクと逆相関する決定するステップと、を含む。
ある態様において、本明細書にて提供されることは、被験者における病原体関連障害を予後診断する方法であり、該方法は：
被験者の生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の特性を決定することを含む、第１のアッセイからのデータを受け取るステップであって、前記病原体からの無細胞核酸分子の特性が、量、メチル化状態、変異パターン、フラグメントサイズ、または前記生物学的サンプル中の被験者からの無細胞核酸分子と比較した相対的存在量を含む、受け取るステップと；前記病原体由来の無細胞核酸分子の特性、ならびに前記被験者の年齢、前記被験者の喫煙習慣、前記被験者の病原体関連障害の家族歴、前記被験者の遺伝子型因子、前記被験者の民族性、もしくは前記被験者の食歴の１つ以上の要因に基づいて、前記被験者が、病原体関連障害を発症するリスクを示すレポートを作成するステップと、を含む。
被験者の生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の特性を決定することを含む、第１のアッセイからのデータを受け取るステップであって、前記病原体からの無細胞核酸分子の特性が、量、メチル化状態、変異パターン、フラグメントサイズ、または前記生物学的サンプル中の被験者からの無細胞核酸分子と比較した相対的存在量を含む、受け取るステップと；前記病原体由来の無細胞核酸分子の特性、ならびに前記被験者の年齢、前記被験者の喫煙習慣、前記被験者の病原体関連障害の家族歴、前記被験者の遺伝子型因子、前記被験者の民族性、もしくは前記被験者の食歴の１つ以上の要因に基づいて、前記被験者が、病原体関連障害を発症するリスクを示すレポートを作成するステップと、を含む。
あるケースでは、第１のアッセイの結果は、病原体関連障害の被験者の医学的治療という結果をもたらさない。あるケースでは、医学的治療は、治療薬による治療、放射線療法または外科的治療を含む。あるケースでは、被験者は、偽陽性率が１％未満である臨床診断検査によって第２の時点の決定前に、病原体関連障害を有さないと診断される。あるケースでは、臨床診断検査は、身体検査、侵襲的生検、内視鏡検査、磁気共鳴画像法、陽放射断層撮影法、コンピュータ断層撮影法、またはＸ線画像法を含む。あるケースでは、臨床診断検査は、組織学的分析、細胞学的分析、または細胞核酸分析を含む侵襲的生検を含む。あるケースでは、間隔は少なくとも約２か月、４か月、６か月、８か月、１０か月、または１２か月である。あるケースでは、間隔は少なくとも約１２ヶ月である。
あるケースでは、前記方法は、前記第１のアッセイを実施することをさらに含む。あるケースでは、前記第１のアッセイを実施することは：（ｉ）前記被験者から第１の生物学的サンプルを取得すること；と、（ｉｉ）前記第１の生物学的サンプル中の病原体から、第１の量の無細胞核酸分子を測定すること、とを含む。あるケースでは、前記第１の量の測定は、前記第１の生物学的サンプル中の病原体から、前記無細胞核酸分子のコピー数を測定することを含む。あるケースでは、前記測定は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。あるケースでは、前記測定は、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む。あるケースでは、前記第１の量は、前記第１の生物学的サンプル中の病原体から、前記無細胞核酸分子の第１のパーセンテージを測定することを含む。あるケースでは、前記第１のアッセイは：（ｉｉｉ）前記第１の量が閾値を超える場合、前記被験者から第２の生物学的サンプルを取得すること、および該第２の生物学的サンプル中の病原体から、第２の量の無細胞核酸分子を測定することをさらに含む。あるケースでは、前記第２の生物学的サンプルは、前記第１の生物学的サンプルから約４週間後に取得される。あるケースでは、前記第１の時点と第２の時点との間の間隔は、第２の量が閾値を下回る場合の間隔と比較して、第１の量および第２のコピー数の両方が閾値を上回る場合の方がより短い。あるケースでは、前記第１の時点と第２の時点との間の間隔は、第１の量が閾値を上回る場合の間隔と比較して、第１の量が閾値を下回る場合の方がより長い。あるケースでは、前記第１の時点と第２の時点との間の間隔は、第１の量および第２の量の両方が閾値を上回る場合、約１年である。あるケースでは、前記第１の時点と第２の時点との間の間隔は、第２の量が閾値を下回る場合、約２年である。あるケースでは、前記第１の時点と第２の時点との間の間隔は、第１の量が閾値を下回る場合、約４年である。あるケースでは、前記第１のアッセイは：前記生物学的サンプル中の病原体から、前記無細胞核酸分子のメチル化状態を決定することを含む。あるケースでは、前記メチル化状態の決定は、前記生物学的サンプル中の前記無細胞核酸分子をメチル化感受性制限酵素(methylation-sensitive restriction enzyme)またはバイサルファイトで処理することを含む。あるケースでは、前記メチル化状態の決定は、前記被験者の生物学的サンプル中の無細胞核酸のメチル化認識配列決定(methylation-aware sequencing)を実施することを含む。あるケースでは、前記メチル化認識配列決定は、メチル化されていないシトシンのウラシルへのバイサルファイト変換を含む。あるケースでは、前記メチル化認識配列決定は、メチル化感受性制限酵素による処理を含む。あるケースでは、前記第１のアッセイは：前記生物学的サンプル中の病原体から、前記無細胞核酸分子のフラグメントサイズ分布を決定することを含む。あるケースでは、前記フラグメントサイズ分布の決定は、前記生物学的サンプル中の無細胞核酸分子の配列決定を実施することと、前記病原体の参照ゲノムにマッピングされたシーケンスリードに基づいて、前記生物学的サンプル中の病原体から、前記無細胞核酸分子のフラグメントサイズを決定することと、を含む。
あるケースでは、前記第１のアッセイは：前記生物学的サンプル中の病原体から、前記無細胞核酸分子の変異パターンを決定することを含む。あるケースでは、前記変異パターンの決定は、前記生物学的サンプル中の無細胞核酸分子の配列決定を実施することと、前記病原体の前記参照ゲノムにマッピングされたシーケンスリードに基づいて、前記生物学的サンプル中の病原体から、前記無細胞核酸分子の前記変異パターンを決定することと、を含む。あるケースでは、前記病原体からの無細胞核酸分子の変異パターンは、一塩基変異を含む。あるケースでは、前記変異パターンの同定(identifying)は：前記病原体の参照ゲノムにマッピングされたシーケンスリードと、前記病原体の障害関連参照ゲノムとの間の類似性レベルの決定を含む。あるケースでは、前記病原体の障害関連参照ゲノムは、病変組織で同定された該病原体のゲノムを含む。あるケースでは、前記類似性レベルの決定は：前記病原体の参照ゲノムを、複数のビンに分離することと、前記病原体の障害関連参照ゲノムに対する複数のビンのそれぞれの類似性指数を決定することであって、前記類似性指数が、前記病原体の参照ゲノムにマッピングされたシーケンスリードの少なくとも１つが、病原体の障害関連参照ゲノムと同じヌクレオチド変異体を有する、各々のビンの中の変異サイトの割合と相関する、決定することと、を含む類似性レベルの決定である。あるケースでは、前記病原体の障害関連参照ゲノムが、前記病原体の複数の障害関連参照ゲノムを含み、かつ、前記類似性レベルの決定が：前記病原体の複数の障害関連参照ゲノムのそれぞれに対して、前記複数のビンのそれぞれについて各々、類似性指数を決定することと；前記各々のビン内の前記各々の類似性指数が、カットオフ値を上回る前記複数の障害関連参照ゲノムの比率に基づいて、前記複数のビンのそれぞれについてビンスコア(bin score)を決定することと、を含む。あるケースでは、前記複数のビンの長さはそれぞれ、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ｂｐである。あるケースでは、前記第１のアッセイが、前記生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の、前記メチル化状態か、前記フラグメントサイズ分布か、または前記変異パターンか、を決定することを含む。
あるケースでは、前記方法はさらに、前記生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の特性を含む、データ入力に適用される分類子(classifier)を使用して、前記被験者が前記病原体関連障害を発症するリスクスコアを計算することを含むものであって、前記分類子が、前記生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の特性を含む前記データ入力に関数を適用するように構成され、前記被験者が障害を発症するリスクを評価する前記リスクスコアを含む出力を生成する。あるケースでは、前記分類子が、ラベル付けされたデータセットでトレーニングされる。
あるケースでは、前記方法が、前記第２の時点で前記第２のアッセイを実施することをさらに含む。あるケースでは、前記第２のアッセイが、前記第１のアッセイと同じである。あるケースでは、前記第２のアッセイが、前記被験者からの無細胞核酸分子のアッセイ、前記被験者の侵襲的生検、前記被験者の内視鏡検査、または前記被験者の磁気共鳴画像検査を含む。
ある態様において、本明細書にて提供されることは、被験者の生物学的サンプルから核酸分子を分析する方法であり、該方法は：コンピュータシステムにおいて、前記被験者の生物学的サンプルから無細胞核酸分子のシーケンスリードを取得するステップであって、前記生物学的サンプルが、前記被験者からの、および潜在的に病原体からの無細胞核酸分子を含む、取得するステップと；前記コンピュータシステムにおいて、前記無細胞核酸分子のシーケンスリードを、前記病原体の参照ゲノムにアラインさせるステップと；前記コンピュータシステムにおいて、前記病原体からの無細胞核酸分子の変異パターンを同定するステップであって、前記変異パターンが、前記病原体の参照ゲノム上の複数の変異サイトのそれぞれで、該病原体の参照ゲノムにマッピングされた前記シーケンスリードのヌクレオチド変異体を特性化し、前記複数の変異サイトが、前記病原体の参照ゲノムにわたり少なくとも３０のサイトを含み、かつ、前記変異パターンが、前記被験者における病原体関連障害の状態、またはそのリスクを示す、同定するステップと、を含む。
あるケースでは、前記複数の変異サイトが、前記病原体の参照ゲノムにわたって、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、または少なくとも１２００のサイトを含む。あるケースでは、前記複数の変異サイトが、前記病原体の参照ゲノムにわたって、少なくとも６００のサイトを含む前記複数の変異サイトを含む。あるケースでは、前記複数の変異サイトが、前記病原体の参照ゲノムにわたって、約６６０のサイトを含む前記複数の変異サイトを含む。あるケースでは、前記複数の変異サイトが、前記病原体の参照ゲノムにわたって、少なくとも１０００のサイトを含む前記複数の変異サイトを含む。あるケースでは、前記複数の変異サイトが、前記病原体の参照ゲノムにわたって、約１１００のサイトを含む。あるケースでは、前記複数の変異サイトが、前記病原体の参照ゲノムにマッピングされたシーケンスリードが、前記病原体の参照ゲノムとは異なるヌクレオチド変異を有するすべてのサイトからなる。あるケースでは、前記シーケンスリードのアラインが、前記病原体の参照ゲノムにマッピングされた前記シーケンスリードと、前記病原体の参照ゲノムとの間で、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１塩基の最大ミスマッチを許容するように構成されている。あるケースでは、前記シーケンスリードのアラインが、前記病原体の参照ゲノムにマッピングされた前記シーケンスリードと、前記病原体の参照ゲノムとの間で、２塩基の最大ミスマッチを許容するように構成されている。あるケースでは、前記方法はさらに：前記病原体の参照ゲノムにマッピングされた前記シーケンスリードの変異パターンに基づいて、前記被験者における病原体関連障害を、診断(diagnosing)、予後診断、またはモニタリングすることを含む。あるケースでは、前記病原体からの無細胞核酸分子の変異パターンが、一塩基変異を含む。あるケースでは、前記変異パターンの同定が：前記病原体の参照ゲノムにマッピングされた前記シーケンスリードと、前記病原体の障害関連参照ゲノムとの間の類似性レベルを決定することを含む。あるケースでは、前記病原体の障害関連参照ゲノムは、病変組織で同定された前記病原体のゲノムを含む。あるケースでは、前記類似性レベルの決定が：前記病原体の参照ゲノムを複数のビンに分離することと；前記病原体の障害関連参照ゲノムに対する、前記複数のビンのそれぞれの類似性指数を決定することであって、前記類似性指数が、前記病原体の参照ゲノムにマッピングされた前記シーケンスリードの少なくとも１つが、前記病原体の障害関連参照ゲノムと同じヌクレオチド変異を有する、前記各々のビン内の変異サイトの割合と相関する、決定することと、を含む。あるケースでは、前記病原体の障害関連参照ゲノムが、前記病原体の複数の障害関連参照ゲノムを含み、かつ、前記類似性レベルの決定が：前記病原体の複数の障害関連参照ゲノムそれぞれに対して、前記複数のビンのそれぞれについて各々の類似性指数を決定すること、と；前記各々のビン内の各々の類似性指数が、カットオフ値を上回る前記複数の障害関連参照ゲノムの比率に基づいて、前記複数のビンそれぞれのビンスコアを決定すること、とを含む。あるケースでは、前記カットオフ値が、約０.９である。あるケースでは、前記複数のビンの長さはそれぞれ、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ｂｐである。あるケースでは、前記方法がさらに：前記病原体からの無細胞核酸分子の変異パターンを含むデータ入力に適用された分類子を使用して、前記被験者が前期病原体関連障害を発症するリスクスコアを計算することであって、前記分類子が、前記病原体からの無細胞核酸分子の変異パターンを含むデータ入力に関数を適用するように構成され、前記被験者が、障害を発症するリスクを評価する前記リスクスコアを含む出力を生成する、計算することを含む。あるケースでは、前記分類子が、ラベル付けされたデータセットでトレーニングされる。あるケースでは、前記分類子が、ナイーブベイズモデル(Naive Bayes model)、ロジスティック回帰(logistics regression)、ランダムフォレスト、ディシジョンツリー(decision tree)、勾配ブースティングツリー(gradient boosting tree)、ニューラルネットワーク、深層学習(deep learning)、線形／カーネルサポートベクターマシン(linear/kernel support vector machine)（ＳＶＭ）、線形／非線形回帰、または線形判別分析(linear discriminative analysis)を使用した数学モデルを含む。
あるケースでは、前記病原体がウィルスである。あるケースでは、前記ウィルスが、エプスタイン・バール・ウィルス（ＥＢＶ）である。あるケースでは、前記病原体関連障害が、鼻咽頭癌、ＮＫ細胞リンパ腫（NK cell lymphoma）、バーキット（Burkitt's）リンパ腫、移植後リンパ増殖性疾患（post-transplant lymphoproliferative disorders）、またはホジキン(Hodgkin's)リンパ腫を含む。あるケースでは、前記病原体からの無細胞核酸分子の変異パターンが、ＥＢＶ参照ゲノム（ＡＪ５０７７９９．２）に関連する表６に記載されているゲノムサイトから選択される少なくとも３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、または６００のサイトを含む、複数の変異サイトのそれぞれで前記病原体の参照ゲノムにマッピングされた、前記シーケンスコードのヌクレオチド変異体を特性化する。あるケースでは、前記複数の変異サイトが、ＥＢＶ参照ゲノム（ＡＪ５０７７９９．２）に関連する表６に記載されているゲノムサイトを含む。あるケースでは、前記病原体からの無細胞核酸分子の変異パターンが、ＥＢＶ参照ゲノム（ＡＪ５０７７９９．２）に関連する表６に記載されているゲノムサイトからランダムに選択された、複数の変異サイトのそれぞれで前記病原体の参照ゲノムにマッピングされた、前記シーケンスコードのヌクレオチド変異体を特性化する。あるケースでは、前記病原体からの無細胞核酸分子の変異パターンが、ＥＢＶ参照ゲノム（ＡＪ５０７７９９．２）に関連する表６に記載されているゲノムサイトからランダムに選択される、少なくとも３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、または６００のサイトを含む、複数の変異サイトのそれぞれで前記病原体の参照ゲノムにマッピングされた前記シーケンスコードのヌクレオチド変異体を特性化する。
あるケースでは、前記ウィルスが、ヒトパピローマ(human papilloma)ウィルス（ＨＰＶ）である。あるケースでは、前記病原体関連障害が、子宮頸癌、中咽頭癌、または頭頸部癌を含む。あるケースでは、前記ウィルスが、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）である。あるケースでは、前記病原体関連障害が、肝硬変または肝細胞癌（ＨＣＣ）を含む。あるケースでは、前記変異パターンが、前記被験者における病原体関連障害の状態を示し、かつ、該病原性関連障害の状態は、前記被験者における前記病原性関連障害の存在、前記被験者における腫瘍組織の量、前記被験者における腫瘍組織のサイズ、前記被験者における腫瘍の病期、前記被験者における腫瘍負荷、または前記被験者における腫瘍転移の存在を含む。あるケースでは、前記生物学的サンプルが：全血(whole blood)、血漿、血清、尿、脳脊髄液、バフィーコート(buffy coat)、膣液(vaginal fluid)、膣洗浄液(vaginal flushing fluid)、唾液、口腔リンス液(oral rinse fluid)、鼻洗浄液(nasal flushing fluid)、鼻ブラシサンプル(nasal brush sample)、および それらの組み合わせからなる群から選択される。
ある態様において、本明細書にて提供されることは、１つ以上のコンピュータプロセッサによる実行によって、上記の方法のいずれかを実装する機械実行可能コード(machine executable code)を含む非一時的な(non-transitory)コンピュータ可読媒体である。
ある態様において、本明細書にて提供されることは、コンピュータシステムを制御して上記の方法のいずれかのオペレーションを実施するための複数の命令を記憶する、非一時的なコンピュータ可読媒体を含むコンピュータ製品である。
ある態様において、本明細書にて提供されることは、本明細書に記載された前記コンピュータ製品と；前記コンピュータ可読媒体に記憶された命令を実行するための１つ以上のプロセッサと、を含む：システムである。
ある態様において、本明細書にて提供されることは、上記の方法のいずれかを実行するための手段を含むシステムである。
ある態様において、本明細書にて提供されることは、上記の方法のいずれかを実行するように構成されたシステムである。
ある態様において、本明細書にて提供されることは、上記の方法のいずれかのステップをそれぞれ実行するモジュールを含むシステムである。
参照による組み込み
本明細書で言及されるすべての公報、特許および特許出願は、個々の公報、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で言及されるすべての公報、特許および特許出願は、個々の公報、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本明細書に記載の特徴および利点のより良い理解は、本明細書に記載の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、およびその添付の図面を参照することによって得られる。
概要
態様において、本明細書にて提供されることは、被験者における病原体関連障害をスクリーニングするための方法およびシステムである。前記方法およびシステムは、前記被験者からの生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の特性に基づいて、前記被験者が前記病原体関連障害を発症するリスクの評価を提供することができる。中でも、リスク予測は適切なスクリーニング頻度の決定を可能にする。適切かつタイムリーな追跡(follow-up)スクリーニングは、被験者の費用を節約するだけでなく、障害の早期発見を可能にする。たとえば、ＥＢＶ－ＮＰＣの初期段階への段階分布のシフトは、ＮＰＣ患者の無増悪生存期間の大幅な改善という結果をもたらす可能性がある。
態様において、本明細書にて提供されることは、被験者における病原体関連障害をスクリーニングするための方法およびシステムである。前記方法およびシステムは、前記被験者からの生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の特性に基づいて、前記被験者が前記病原体関連障害を発症するリスクの評価を提供することができる。中でも、リスク予測は適切なスクリーニング頻度の決定を可能にする。適切かつタイムリーな追跡(follow-up)スクリーニングは、被験者の費用を節約するだけでなく、障害の早期発見を可能にする。たとえば、ＥＢＶ－ＮＰＣの初期段階への段階分布のシフトは、ＮＰＣ患者の無増悪生存期間の大幅な改善という結果をもたらす可能性がある。
前記被験者が前記病原体関連障害を発症するリスクは、該被験者が該病原体関連障害を発症する傾向がある可能性に言及することができる。あるケースでは、本明細書に記載のリスクは、前記病原体関連障害が前記被験者において、将来のある時点で臨床的に検出され得る状態（「臨床的に検出可能な障害」）へ発症する可能性に言及する。あるケースでは、前記被験者は、該被験者からの生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子を試験するスクリーニングアッセイによって最初の時点でスクリーニングされ、そして、前記被験者は、最初の時点では臨床的に検出可能な病原体関連障害を有さないと診断されるが、該被験者からの生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の特性は、該被験者が将来の時点で臨床的に検出可能な障害を有するリスクを示し得る。
臨床的に検出可能な障害は、１つ以上の十分に確立された臨床診断検査を介して検出することができる病理学的症状を明確にする障害に言及することができる。あるケースでは、前記十分に確立された臨床診断検査は、前記病原体関連障害の偽陽性検出率が低い医療テスト／アッセイを含み、その割合は例えば、３０％、２０％、１０％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２．５％、２％、１％、０．８％、０．５％、０．２５％、０．１５％、０．１未満％、０．０８％、０．０５％、０．０２％、０．０１％、０．００５％、０．００２％、０．００１％またはそれ以下である。前記十分に確立された臨床診断検査は、前記病原体関連障害を高感度でも検出することができる医療テスト／アッセイを含み、その割合は例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％、または１００％である。あるケースでは、前記病原体関連障害は、癌などの病原体関連増殖性障害であり、該癌は、１つ以上の侵襲的生検とそれに続く生検組織の組織学的または他の検査（例えば、組織分析、細胞ＤＮＡもしくはタンパク質分析などの細胞検査）、例えば、Ｘ線、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）といった画像検査、またはコンピュータ断層撮影（ＣＴ）、またはＰＥＴ－ＣＴ、臨床検査（例えば、血液検査または尿検査）、または身体検査によって高い信頼性および低い偽陽性率で臨床的に診断されることが可能である。前記病原体関連障害の前記診断は、前述のまたは他の十分に確立された臨床検査の結果に基づいて認定された医師によって行われ得る。あるケースでは、第１のスクリーニングアッセイの結果が、十分に確立された臨床診断検査によって前記被験者が障害を有していないと診断されるため、前記病原体関連障害について該被験者の医療的な治療という結果にならない。
評価されたリスクに基づいて、あるケースでは、前記方法は前記被験者に関連する病原体のスクリーニングアッセイの頻度を決定することを含む。前記スクリーニングアッセイの頻度はリスクと相関し得、２つのスクリーニングアッセイ、例えば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイとその後の追跡スクリーニングアッセイとの間の間隔は、リスクと逆相関し得る。あるケースでは、前記方法は第１の時点で実施される第１のスクリーニングアッセイからデータを受け取ることを含む。前記第１のスクリーニングアッセイは、前記被験者からの生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の特性を決定することを含み得る。例えば、前記第１のスクリーニングアッセイは、前記被験者からの生物学的サンプルの取得を含み、該生物学的サンプルは、該被験者からおよび潜在的に前記病原体からの無細胞核酸分子、例えば、無細胞ＤＮＡを含む。前記第１のスクリーニングアッセイはまた、生物学的サンプル中の病原体からの前記無細胞核酸分子の特性を決定することも含み得る。本明細書で提供される方法およびシステムで用いることができる病原体からの無細胞核酸分子の非限定的な特性は、量（例えば、コピー数またはパーセンテージ）、メチル化状態、フラグメントサイズ、変異パターン、および前記生物学的サンプル中の前記被験者からの無細胞核酸分子と比較した相対的な存在量を含む。本明細書に記載されるように、被験者または該被験者からの生物学的サンプルに対して実施される検査またはアッセイに関する時点(time point)は、実際のアッセイが該生物学的サンプルに対して行われる時点ではなく、該被験者が検査を受ける時点、または該生物学的サンプルが該被験者から得られる時点を指すことができる。
あるケースでは、本明細書で提供される方法が、（ａ）前記被験者の生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の特性を決定することを含む第１の時点で実施される第１のアッセイからデータを受け取るステップであって、前記病原体からの前記無細胞核酸分子の前記特性が、量（例えば、コピー数またはパーセンテージ）、メチル化状態、変異パターン、フラグメントサイズ、または前記生物学的サンプル中の前記被験者からの無細胞核酸分子と比較した相対的な存在量を含み、かつ、前記特性が、前記被験者が前記病原体関連障害を発症するリスクを示す、受け取るステップと、（ｂ）前記特性に基づいて、前記被験者における前記病原体関連障害をスクリーニングするために第２のアッセイが実施される第２の時点を決定するステップであって、前記第１の時点と前記第２の時点との間の間隔が、前記リスクと逆相関する、決定するステップと、を含む方法である。
あるケースでは、本明細書に記載される前記被験者の前記生物学的サンプル中の前記無細胞核酸分子の１つ以上の特性が、前記被験者における前記病原体関連障害（例えば、癌）の状態、または前記被験者が将来的に前記病原体関連障害を発症する前記リスクを評価するための非侵襲的アプローチを可能にする。特定の理論に縛られることを望むことなく、前記方法およびシステムで使用可能な前記無細胞核酸分子の１つ以上の特性と、前記被験者が前記病原体関連障害を発症する前記リスクとの間の関連性の根底にある、少なくとも２つの可能なシナリオがあり得る。１つの可能なシナリオにおいて、前記病原体関連障害、例えば、病原体関連腫瘍を患っている病変組織は、第１のスクリーニング（例えば、第１のスクリーニングアッセイ）の時点ですでに存在し得る。しかしながら、前記病変組織、例えば前記腫瘍のサイズが小さすぎて、他の古典的な健康診断アプローチ、例えば、内視鏡検査や磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）などの前記病原体関連障害を検出する偽陽性率が１０％、５％、２％、１％、０．５％、０．１％、または０．０５％未満であるアプローチによってピックアップできない可能性がある。障害の発症に伴い、例えば病変組織、例えば腫瘍のサイズの成長、より進行した病変組織、例えば拡大した組織（例えば拡大した腫瘍）を、その後のスクリーニング（第２のスクリーニングアッセイ）で検出することができる。もう一つの可能なシナリオは次のとおりである：前記病原体の核酸分子、例えば、ＥＢＶ ＤＮＡは、前癌状態の細胞などの予備的な病状にある細胞によって放出され得、のちに、これらの細胞は、癌細胞などの病細胞に潜在的に発症する可能性がある。前記関連性の根底にある正確なシナリオに関係なく、本明細書に記載された主題は、その後に臨床的に検出可能なＮＰＣを有するリスクについて被験者を層別化するために使用可能である。
あるケースでは、明細書に記載されている特定のスクリーニングプログラムに使用される実際の時間間隔は、医療経済的考慮事項（例えばスクリーニングの費用）、被験者の嗜好（例えばより頻繁なスクリーニング間隔は、特定の被験者のライフスタイルにとってより混乱を招くである可能性がある）およびその他の臨床パラメーター（例、個人の遺伝子型（例、ＨＬＡステータス（Bei et al. Nat Genet. 2010; 42：599-603; Hildesheim et al. JNatl Cancer Inst. 2002; 94：1780-9.）、ＮＰＣの家族歴、食事歴、民族的起源（例、広東語）））に従って調整される。
あるケースでは、本明細書で提供される方法が：前記被験者の生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の特性を決定することを含む第１のアッセイからデータを受け取るステップであって、前記病原体からの前記無細胞核酸分子の前記特性が、量（例えば、コピー数またはパーセンテージ）、メチル化状態、変異パターン、フラグメントサイズ、フラグメント末端の座標、フラグメント末端の配列モチーフ、または前記生物学的サンプル中の前記被験者からの無細胞核酸分子と比較した相対的な存在量を含む受け取るステップと；前記病原体からの前記無細胞核酸分子の特性および以下：前記被験者の年齢、前記被験者の喫煙習慣、前記被験者の病原体関連障害の家族歴、前記被験者の遺伝子型因子、または前記被験者の食歴、の１つ以上の要因に基づいて、前記被験者が前記病原体関連障害を発症するリスクを示すレポートを作成するステップと、を含む方法である。
態様において、本明細書にて提供されることは、被験者からの生物学的サンプル中の核酸分子を分析するための方法およびシステムである。方法およびシステムの例に、前記生物学的サンプル中の病原体からの核酸分子の変異パターンの分析が挙げられる。あるケースでは、前記生物学的サンプル中の病原体からの前記核酸分子が、無細胞核酸分子を含む。変異パターン分析は、病原体を起源とすると同定された生物学的サンプル中の前記核酸分子の配列を、該病原体の１つ以上の参照ゲノムと比較することと、続いて該生物学的サンプル中の該病原体からの該核酸分子中のヌクレオチド変異パターンを決定することと、を含み得る。
あるケースでは、本明細書で提供される方法およびシステムは、前記生物学的サンプル中の前記病原体からの前記核酸分子の前記変異パターンに基づく、前記被験者における病原体関連障害の状態またはリスクの決定を含む。たとえば、血漿において検出されたＥＢＶゲノムの遺伝的変異は、将来のＮＰＣ発症のリスクを予測するために使用可能である。ＥＢＶ関連腫瘍および対照サンプルに存在するＥＢＶの株は異なる可能性があることが過去に報告されているが（Palser et al. J Virol 2015; 89：5222-37）、この研究の該腫瘍および該対照のサンプルは、地理的に異なる場所から収集されていた。したがって、ＥＢＶ変異体の地理的変動を考えると、腫瘍サンプルにおいて同定された変異体が地理的に関連しているか、または疾患に関連しているかを結論付けることは困難である。
あるケースでは、本明細書に記載の変異パターン分析は、前記生物学的サンプル中の前記病原体からの前記核酸分子と前記病原体の１つ以上の参照ゲノムとの間のゲノムワイドな比較を含む。前記ゲノムワイドな比較は、前記病原体の全ゲノムにわたる配列アラインメント、およびそれに続くヌクレオチド変異パターンのクラスタリング分析を含み得る。あるケースでは、前記ゲノムワイドな比較は、前記病原体の前記参照ゲノムにわたる多数のサイトでのヌクレオチド変異体の分析を包含する。これらのサイトは、前記病原体のゲノム全体にわたるすべてのサイトを含むことが可能である。あるいは、前記病原体の前記参照ゲノムにわたるこれらのサイトまたは変異サイトは、ヌクレオチド変異体が典型的に見出され得る少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、少なくとも１４００、少なくとも１５００、少なくとも１６００、少なくとも１７００、少なくとも１８００、少なくとも１９００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、または少なくとも５０００のサイトを含み得る。本明細書に記載のヌクレオチド変異体は、一塩基変異体（ＳＮＶ）を含むことができる。本明細書で提供される変異パターン分析に使用される変異サイトは、前記病原体のゲノムで同定された典型的なＳＮＶｓを含むことができる。あるケースでは、前記変異サイトは、挿入、削除および融合を含むことができる。
本明細書で提供されるゲノムワイドな変異パターン分析は、個々の一塩基多型（ＳＮＰｓ）の分析よりも優れている可能性がある。ある例示的なケースでは、固定された数のサイト上のＳＮＰが、被験者の病理につながる可能性がある前記病原体の特定の株またはサブタイプに関連付けることができるが、これらの個々のＳＮＰｓの分析に基づくリスク評価は、前記病原体の特定の菌株またはサブタイプに限定される可能性があり、前記病原体の他の病気を引き起こす株またはサブタイプが存在する場合、該リスク評価は、リスクの正確な評価を提供するのに不十分である可能性がある。別の例示的なケースでは、本明細書で提供されるゲノムワイドな変異パターン分析は、前記生物学的サンプル中の病原体核酸分子が不足している場合、例えば、血漿などの生物学的サンプル中の無細胞核酸分子が分析される場合に有益であり得る。前記生物学的サンプル中の利用可能な病原体核酸分子は、前記病原体ゲノムの相当量をカバーしていない可能性がある。結果として、前記病原体の全ゲノムにわたる多数の変異サイトを包含するゲノムワイドな変異パターン分析は、前記生物学的サンプル中の前記病原体からの前記無細胞核酸分子の遺伝子型の特徴を比較的より包括的に読み出すことを提供できる。一方、固定された数の個々の多型を包含する分析は、比較的小さな領域または前記ゲノムのいくつかの小さな領域に限定され、したがって、前記生物学的サンプル中の前記病原体からの前記無細胞核酸分子の遺伝子型の特徴を比較的限定して読み出すことを提供できる。
あるケースでは、本明細書で提供される変異パターン分析は、ブロックベースのパターン分析を含み、それは、前記病原体の参照ゲノムを複数のビンに分離し、該複数のビンのそれぞれに関連するシーケンスリードを分析することを包含する。あるケースでは、前記方法は、前記病原体の前記障害関連参照ゲノムに対する前記複数のビンのそれぞれの類似性指数を決定することを含む。前記類似性指数は、前記病原体の前記参照ゲノムにマッピングされた少なくとも１つの前記シーケンスリードが、前記病原体の前記障害関連参照ゲノムと同じヌクレオチド変異体を有する、各々のビン内の変異サイトの割合と相関し得る。あるケースでは、前記病原体の前記障害関連参照ゲノムは、前記病原体の複数の前記障害関連参照ゲノムを含み、該方法は、前記病原体の前記複数の障害関連参照ゲノムのそれぞれに対する前記複数のビンのそれぞれについて各々の類似性指数を決定することと；前記各々のビン内の前記各々の類似性指数がカットオフ値を超える前記複数の障害関連参照ゲノムの割合に基づいて、前記複数のビンのそれぞれのビンスコアを決定すること、とを含む。
無細胞核酸分子のアッセイ
前記被験者の生物学的サンプルからの前記無細胞核酸分子のスクリーニングアッセイは、任意の適切な核酸アッセイであり得る。例えば、配列決定法は、量（例えば、コピー数またはパーセンテージ）、メチル化状態、フラグメントサイズ、または前記無細胞核酸分子の相対的な存在量を分析するために採用することができる。代替的または追加的に、増幅(amplification)またはハイブリダイゼーションベースの方法、例えば、様々なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法またはマイクロアレイベースのアプローチも用いることができる。あるケースでは、例えば前記核酸分子のメチル化状態を分析するために、免疫沈降法が用いられる。
前記被験者の生物学的サンプルからの前記無細胞核酸分子のスクリーニングアッセイは、任意の適切な核酸アッセイであり得る。例えば、配列決定法は、量（例えば、コピー数またはパーセンテージ）、メチル化状態、フラグメントサイズ、または前記無細胞核酸分子の相対的な存在量を分析するために採用することができる。代替的または追加的に、増幅(amplification)またはハイブリダイゼーションベースの方法、例えば、様々なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法またはマイクロアレイベースのアプローチも用いることができる。あるケースでは、例えば前記核酸分子のメチル化状態を分析するために、免疫沈降法が用いられる。
本開示のある例では、前記無細胞病原体核酸分子、例えば無細胞ＥＢＶ ＤＮＡを検出するための前記スクリーニングアッセイは、さまざまな時点で実施される２以上のテストを含み、複数のテストにわたる前記無細胞病原体核酸分子の検出可能性が、前記被験者が前記病原体関連障害を発症する前記リスクを示し得る。例えば、前記アッセイは、２段階アッセイまたは３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはさらに多くのテストを含むアッセイレジメンを含むことができる。一部のテストは同じ時点で実行できるが、他のテストは異なる時点で実行でき、あるいは、すべてのテストを異なる時点で実行することができる。
異なるスクリーニングアッセイのタイミングまたはスクリーニング頻度は、本明細書で提供される方法およびシステムによって決定することができる。前記第１のスクリーニングアッセイと前記第２のスクリーニングアッセイとの間の前記間隔は、少なくとも約２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、８ヶ月、１０ヶ月、または１２ヶ月であり得る。あるケースでは、前記間隔は、少なくとも約１２ヶ月である。前記第１のスクリーニングアッセイと前記第２のスクリーニングアッセイとの間の前記間隔は、約１年、１．５年、２年、２．５年、３年、３．５年、４年、４．５年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、またはそれ以上であり得る。前記被験者が、十分に確立された臨床診断法によって前記病原体関連障害を有さない（例えば、臨床的に検出可能な病原体関連障害を有さない）と普通に診断される限りにおいては、前記第１のスクリーニングアッセイが、前記病原体関連障害の存在を示す陽性結果をもたらし得るのだが、前記間隔は長くなり得る。本明細書で提供される方法およびシステムは、例えば６ヶ月、１２ヶ月、２年、３年、５年、または１０年以内といった将来において前記被験者が、前記病原体関連障害を発症するリスクの予測を可能にし得る。評価されたリスクに基づいて、適切な追跡の時点を決定できる。
サンプルを取得してからアッセイを実施するまでの時間は、アッセイまたは方法の感度および／または特異性を改善するために最適化し得る。ある実施形態では、サンプルは、アッセイを実施する直前に取得することができる（例えば、第１のサンプルは、第１のアッセイを実施する前に取得し、第２のサンプルは、第１のアッセイを実施した後、第２のアッセイを実施する前に取得する）。ある実施形態では、サンプルを取得し、アッセイを実施する前に一定期間（例えば、数時間、数日または数週間）保存することができる。ある実施形態では、アッセイは、被験者からサンプルを取得してから１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年以内、または１年以上で、該サンプルについて実施することができる。
アッセイ（例えば、第１のアッセイまたは第２のアッセイ）を実施してから、サンプルが、腫瘍などの障害を示すマーカーまたはマーカーのセットを含むかどうかを決定するまでの時間は変動し得る。ある例では、アッセイまたは方法の感度および／または特異性を改善するために、時間が最適化し得る。ある実施形態では、サンプルが腫瘍を示すマーカーまたはマーカーのセットを含むかどうかを決定は、アッセイを実施してから最大で０．１時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、または１ヵ月以内に生じ得る。
本明細書に記載の生物学的サンプルの配列決定分析は、病原体からの無細胞核酸分子の１つ以上の特性の分析について実施することができる。本明細書で提供される方法は、生物学的サンプルからの核酸分子、例えば、無細胞核酸分子、細胞核酸分子またはその両方を配列決定することを含み得る。ある例では、本明細書で提供される方法は、生物学的サンプルからの核酸分子からの配列決定の結果、例えば、配列決定リードを分析することを含む。本明細書で提供される方法およびシステムは、配列決定の能動的ステップを含むことも含まないこともできる。方法およびシステムは、シーケンサーから配列決定データを受け入れるおよび処理するための手段を含むか、または提供することができる。方法およびシステムはまた、シーケンサーに対して配列決定プロセスのパラメーターを調整するコマンド、例えば、配列決定結果の分析に基づくコマンドを与える手段を含むか、または提供することもできる。
イルミナシーケンスプラットフォームおよび４５４／ロシュプラットフォームなどの市販の配列決定装置を、本開示で提供される方法に使用することができる。核酸の配列決定は、当技術分野で知られている任意の方法を使用して実施することができる。例えば、配列決定は、次世代配列決定を含み得る。ある例では、核酸の配列決定は、連鎖停止配列決定(chain termination sequencing)、ハイブリダイゼーション配列決定(hybridization sequencing)、イルミナ配列決定(Illumina sequencing)（例えば、可逆的ターミネーター色素を用いる）、イオントレント半導体配列決定(ion torrent semiconductor sequencing)、質量分析配列決定(mass spectrophotometry sequencing)、超並列シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）(massively parallel signature sequencing)、マキサム-ギルバートシーケンシング(Maxam-Gilbert sequencing)、ナノポアシーケンシング(nanopore sequencing)、ポロニーシーケンシング(polony sequencing)、パイロシーケンシング(pyrosequencing)、ショットガンシーケンシング(shotgun sequencing)、一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンス（４つの蛍光標識二塩基プローブを使用したハイブリダイゼーション）、ユニバーサルシーケンシング(universal sequencing)、またはそれらの任意の組み合わせを使用して実施することができる。
本明細書で提供される方法において用いられる１つの配列決定方法は、例えば、イルミナの「ペアエンドモジュール」をそのゲノムアナライザーと共に使用する、ペアエンドシーケンシング(paired end sequencing)を含み得る。このモジュールを用いて、ゲノムアナライザーが第１の配列決定リードを完了した後、該ペアエンドモジュールは元のテンプレートの再合成およびクラスター生成の第２ラウンドを指示することができる。本明細書で提供される方法においてペアエンドリードを用いることにより、核酸分子の両端から配列情報を取得する、および両端を参照ゲノム、例えば、病原体のゲノムまたは宿主生物のゲノムにマッピングすることができる。両端をマッピングした後、本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態に従って、病原体統合プロファイルを決定することができる。
ペアエンドシーケンシングの間、核酸分子の第１の末端からのシーケンスリードは、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１０５、少なくとも１１０、少なくとも１１５、少なくとも１２０、少なくとも１２５、少なくとも１３０、少なくとも１３５、少なくとも１４０、少なくとも１４５、少なくとも１５０、少なくとも１５５、少なくとも１６０、少なくとも１６５、少なくとも１７０、少なくとも１７５、または少なくとも１８０の連続したヌクレオチドを含み得る。核酸分子の第１の末端からのシーケンスリードは、多くて２４、多くて２８、多くて３２、多くて３８、多くて４２、多くて４８、多くて５２、多くて５８、多くて６２、多くて６８、多くて７２、多くて７８、多くて８２、多くて８８、多くて９２、多くて９８、多くて１０２、多くて１０８、多くて１２２、多くて１２８、多くて１３２、多くて１３８、多くて１４２、多くて１４８、多くて１５２、多くて１５８、多くて１６２、多くて１６８、多くて１７２、または多くて１８０の連続したヌクレオチドを含み得る。核酸分子の第１の末端からのシーケンスリードは、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１０５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、約１６０、約１６５、約１７０、約１７５、または約１８０の連続するヌクレオチドを含み得る。核酸分子の第２の末端からのシーケンスリードは、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１０５、少なくとも１１０、少なくとも１０５、少なくとも１２０、少なくとも１２５、少なくとも１３０、少なくとも１３５、少なくとも１４０、少なくとも１４５、少なくとも１５０、少なくとも１５５、少なくとも１６０、少なくとも１６５、少なくとも１７０、少なくとも１７５、または少なくとも１８０の連続したヌクレオチドを含み得る。核酸分子の第２の末端からのシーケンスリードは、多くて２４、多くて２８、多くて３２、多くて３８、多くて４２、多くて４８、多くて５２、多くて５８、多くて６２、多くて６８、多くて７２、多くて７８、多くて８２、多くて８８、多くて９２、多くて９８、多くて１０２、多くて１０８、多くて１２２、多くて１２８、多くて１３２、多くて１３８、多くて１４２、多くて１４８、多くて１５２、多くて１５８、多くて１６２、多くて１６８、多くて１７２、または多くて１８０の連続したヌクレオチドを含み得る。核酸分子の第２の末端からのシーケンスリードは、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１０５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、約１６０、約１６５、約１７０、約１７５、または約１８０の連続するヌクレオチドを含み得る。あるケースでは、核酸分子の第１の末端からのシーケンスリードは、少なくとも７５の連続したヌクレオチドを含み得る。あるケースでは、核酸分子の第２の末端からのシーケンスリードは、少なくとも７５の連続したヌクレオチドを含み得る。核酸分子の第１の末端および第２の末端からのシーケンスリードは、同じ長さまたは異なる長さであり得る。生物学的サンプルからの複数の核酸分子からのシーケンスリードは、同じ長さまたは異なる長さであり得る。
本明細書で提供される方法における配列決定は、様々なシーケンス深度で実施することができる。シーケンス深度とは、遺伝子座にアラインされたシーケンスリードによって遺伝子座がカバーされる回数を指すことができる。遺伝子座は、ヌクレオチドと同程度な小ささ、染色体の腕と同程度な大きさ、またはゲノム全体と同程度な大きさであり得る。本明細書で提供される方法におけるシーケンス深度は、５０倍、１００倍などであり得、ここで、「ｘ」の前の数は、遺伝子座がシーケンスリードによってカバーされる回数を指す。シーケンス深度は、複数の遺伝子座またはゲノム全体に適用することもでき、この場合、ｘは、遺伝子座または半数体（ハプロイド）ゲノムもしくはゲノム全体がそれぞれ配列決定される平均回数を指す。あるケースでは、ウルトラディープ配列決定は、本明細書に記載の方法で実施され、これは、少なくとも１００倍のシーケンス深度で実施できることを指す。
配列決定プロセス（例えば、シーケンス深度）中に核酸内の特定のヌクレオチドが読み取られる回数または平均回数は、配列決定される核酸の長さよりも数倍大きくなり得る。ある例では、シーケンス深度が核酸の長さよりも十分に大きい（例えば、少なくとも５倍）場合、配列決定は「ディープ配列決定」と呼ぶことができる。ある例では、シーケンス深度は、配列決定される核酸の長さよりも平均して、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍大きくなり得る。ある例では、サンプルは特定の分析物（例えば、核酸フラグメント、または癌特異的核酸フラグメント）について濃縮することができる。
本明細書で提供される方法において生成されるシーケンスリード（または配列決定リード）は、核酸分子の任意の部分またはすべてから配列決定されたヌクレオチドのストリングを指すことができる。例えば、シーケンスリードは、核酸フラグメントに相補的なヌクレオチドの短いストリング（例えば、２０～１５０）、核酸フラグメントの末端に相補的なヌクレオチドのストリング、または生物学的サンプル中に存在する全ての核酸フラグメントに相補的なヌクレオチドのストリングを指すことができる。シーケンスリードは、様々な方法、例えば配列決定技術を用いて取得することができる。
量／検出可能性
前記方法およびシステムにおいて用いることができる無細胞核酸分子の特性の１つは、病原体からの無細胞核酸分子の量（例えば、コピー数またはパーセンテージ）である。本開示のある態様は、被験者由来の生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の量（例えば、コピー数またはパーセンテージ）の評価に基づく、被験者が病原体関連障害を発症するリスクの層別化に関する。
前記方法およびシステムにおいて用いることができる無細胞核酸分子の特性の１つは、病原体からの無細胞核酸分子の量（例えば、コピー数またはパーセンテージ）である。本開示のある態様は、被験者由来の生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の量（例えば、コピー数またはパーセンテージ）の評価に基づく、被験者が病原体関連障害を発症するリスクの層別化に関する。
生物学的サンプル中の核酸分子のコピー数は、核酸分子の検出可能性に関連し得る。特定のアッセイ法を考慮すると、核酸テンプレートの検出可能性は、テンプレート分子のコピー数と相関することができ、例えば、アッセイ法の検出下限を下回るコピー数は検出不可能となり得るが、アッセイ法の検出下限以上は「検出可能」と定義できる。例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）法には通常、テンプレート分子のシグナルをバックグラウンドノイズと区別することはできない検出限界を有し得る。したがって、あるケースでは、本明細書で提供される方法およびシステムは、生物学的サンプル中の無細胞核酸分子の検出可能性に直接依存し、これは、生物学的サンプル中のそれらのコピー数と相関し得る。あるケースでは、生物学的サンプル中の無細胞核酸分子のコピー数は直接測定される。他のケースでは、コピー数は、無細胞核酸分子自体の検出を介して暗黙的に測定または推測される。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの検出アッセイを実施して、生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の有無またはコピー数を評価できる。プローブは、病原体固有のゲノム領域、たとえば、ＥＢＶ固有のゲノムＤＮＡ配列、ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）固有のゲノムＤＮＡ配列、またはＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）固有のゲノムＤＮＡ配列をターゲットにするように設計できる。
実施例および実施形態が本明細書に提供されているが、例えば、コピー数およびＮＰＣに関連する追加の技術および実施形態は、２０１１年１１月３０日に出願されたＰＣＴ ＡＵ／２０１１／００１５６２において見出すことができ、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＮＰＣはＥＢＶ感染症と密接に関連し得る。中国南部では、ＥＢＶゲノムはほとんどすべてのＮＰＣ患者の腫瘍組織に見ることができる。ＮＰＣ組織に由来する血漿ＥＢＶ ＤＮＡが、ＮＰＣの腫瘍マーカーとして開発された（Lo et al. Cancer Res1999;59：1188-1191）。特に、リアルタイムｑＰＣＲアッセイは、ＥＢＶゲノムのＢａｍＨＩ－Ｗフラグメントをターゲットとする血漿ＥＢＶ ＤＮＡ分析に使用できる。各ＥＢＶゲノム５にはＢａｍＨＩ－Ｗフラグメントが約６～１２回繰り返され、各ＮＰＣ腫瘍細胞には約５０のＥＢＶゲノムが存在し得る（Longnecker et al. Fields Virology, 5th Edition Chapter 61“Epstein-Barr virus”; Tierney et al. JVirol. 2011; 85：12362-12375）。言い換えれば、各ＮＰＣ腫瘍細胞には、ＰＣＲターゲットの約３００～６００ほど（例えば、約５００）のコピーが存在し得る。腫瘍細胞あたりのこの多数のターゲットは、なぜ血漿ＥＢＶ ＤＮＡが初期のＮＰＣの検出において高感度のマーカーであるかという理由を説明することができる。ＮＰＣ細胞は、ＥＢＶ ＤＮＡのフラグメントを被験者の血流内に沈着させることができる。この腫瘍マーカーは、ＮＰＣのモニタリング（Lo et al. Cancer Res 1999;59：5452-5455）および予後診断（Lo et al. Cancer Res 2000;60：6878-6881）に有用である。
ｑＰＣＲアッセイはまた、サンプル中のＨＰＶ、ＨＢＶまたは任意の他のウィルスＤＮＡの量を測定するために、ＥＢＶについて本明細書に記載されるものと同様の方法で使用することもできる。かかる分析は、子宮頸癌（ＣＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、肝硬変または肝細胞癌（ＨＣＣ）のスクリーニングに特に有用である。１つの例では、ｑＰＣＲアッセイは、ＨＰＶゲノムの多型Ｌ１領域内の領域（例えば、２００ヌクレオチド）をターゲットとする。より具体的には、本明細書で企図されるのは、Ｌ１領域における１つ以上の超可変表面ループをコードする配列に選択的にハイブリダイズするｑＰＣＲプライマーの使用である。
あるいは、病原体からの無細胞核酸分子は、配列決定技術を使用して検出および定量化することができる。例えば、ｃｆＤＮＡフラグメントを配列決定し、ＨＰＶ参照ゲノムにアラインメントして定量化することができる。または、他の例では、ｃｆＤＮＡフラグメントのシーケンスリードをＥＢＶまたはＨＢＶの参照ゲノムにアラインメントして定量化する。
本明細書で提供されるアッセイによって測定される、病原体からの無細胞核酸分子の検出可能性またはコピー数は、被験者が病原体関連障害を発症するリスクを示し得る。ある例では、病原体からの無細胞核酸分子のコピー数が多いほど、被験者が病原体関連障害を発症するリスクが高くなる傾向にある。ある例では、１つの特定の時点または複数の時点にわたる１つ以上のアッセイを通した病原体からの無細胞核酸分子の検出可能性は、被験者が病原体関連障害を発症するリスクを示している。被験者由来の生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核分子が本明細書で提供されるアッセイによって検出できない場合と比較して検出可能である場合、被験者は病原体関連障害についてより高いリスクである傾向にある。マルチステップ検出アッセイは、上述したようなタイミングで実施することができる。
本開示のある例では、生物学的サンプル中の無細胞病原体核酸分子を検出するために２段階アッセイが実施される。あるケースでは、２段階アッセイの第１のテストが実施され、その後、第１の時点でのアッセイ結果に応じて、２段階アッセイの第２のテストが実施されるか、または実施されない。例として、第１のテストが陽性の結果であった場合、例えば、無細胞病原体核酸分子が第１の生物学的サンプルで検出される場合、２段階検出アッセイの第２のテストを実施することができ；第１のテストが陰性の結果であった場合、第２のテストは実施されない場合がある。他のケースでは、第１のテストに関係なく第２のテストが実施される。ある例では、２段階検出アッセイの両方のテストで陽性の結果が得られた場合は持続的に陽性と称され、第１のまたは第２のテストのみで陽性の結果が得られた場合は一時的に陽性と称される。１つの例示的な例において、「陽性」アッセイ結果は、「陰性」アッセイ結果と比較して、被験者が病原体関連障害、例えば、ＥＢＶ関連ＮＰＣを発症するリスクが高いことを示し、一方、「持続的に陽性」アッセイ結果は、「一時的に陽性」のアッセイ結果と比較してリスクが高いことを示す。ある例示的な例において、一時的に陽性の結果である場合と比較して、第１の時点で実施された２段階検出アッセイから永続的な陽性の結果が得られる場合は、第１の時点と第２の時点との間により長い間隔を設定することができる。例えば、ＥＢＶ関連ＮＰＣスクリーニングにおいて、第１の２段階検出アッセイから持続的に陽性の結果が得られた場合、第１の検出アッセイから約１年以内に追跡的に第２のスクリーニングアッセイを実施することが勧められ得る。対照的に、第１の２段階検出アッセイから一時的に陽性の結果が得られた場合、第１の検出アッセイから約２年以内に追跡的に第２のスクリーニングアッセイを実施し得る。陰性の結果が得られた場合、追跡的なスクリーニングアッセイについて４年またはそれ以上の間隔を置くことができる。あるケースでは、リスクが高いことを示す先行する陽性の結果が、リスクが低いことを示す後続の結果によって破棄されるであろう間隔の選択を上書きすることができる。例えば、１年目には永続的な陽性の結果が得られ、その後４年の間、実施された追跡的なアッセイから得られた結果に関係なく、被験者は次の４年間毎年追跡されることになる。例示的な例が図２に与えられ、実施例２でより詳細に説明されている。検出アッセイと同様に、病原体からの無細胞核酸分子の他の特性に基づくリスク評価は、この例示的または同様のスクリーニングレジメンに従うこともできる。
アッセイの第２のテストは、第１のアッセイの数時間、数日、または数週間後に実施することができる。１つの例では、第２のアッセイは、第１のアッセイの直後に実施することができる。他のケースでは、第２のアッセイは、第１のアッセイから１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年以内、または１年以上後に実施できる。特定の例では、第２のアッセイは、第１のサンプルから２週間以内に実施することができる。一般に、アッセイの第２のテストは、病原体関連障害、例えば腫瘍が患者において検出され得る特異性を改善するために使用され得る。第１のテストを実施してから第２のテストを実施するまでの時間は実験的に決定できる。ある実施形態では、方法は２つ以上のテストを含むことができ、両テストは同じサンプルを用いる（例えば、単一のサンプルは第１のアッセイを実施する前に被験者、例えば患者から得られ、第２のアッセイを実施するまでの期間保存される）。例えば、被験者から同時に２本の血液チューブを取得することができる。第１のチューブは、第１のテストに用いることができる。第２のチューブは、被験者からの第１のテストの結果が陽性である場合にのみ、用いることができる。サンプルは、当業者に知られている任意の方法を用いて（例えば、極低温で）保存することができる。この保存は、特定の状況で有益であり得、例えば被験者が陽性の検査結果を受け取ることができ（例えば、第１のアッセイが癌を示している）、該患者が第２のアッセイを実施するまで待つことができず、むしろセカンドオピニオンを求める場合である。
メチル化状態
本開示のある態様は、被験者由来の生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子のメチル化状態の評価に基づく、被験者が病原体関連障害を発症するリスクの層別化に関する。
本開示のある態様は、被験者由来の生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子のメチル化状態の評価に基づく、被験者が病原体関連障害を発症するリスクの層別化に関する。
細胞病原体核酸分子のメチル化は、病原体関連障害（例えば、ＥＢＶ関連ＮＰＣまたはＨＰＶ関連子宮頸癌）を有する患者および該障害のない被験者（例えば、非ＮＰＣ被験者）からのサンプルを識別することができる。例えば、ＮＰＣに関連する血漿ＥＢＶ ＤＮＡのメチル化状態は、米国特許出願第１６／０４６，７９５号に示されるように、非ＮＰＣ被験者において検出された血漿ＥＢＶ ＤＮＡのメチル化状態とは異なり得、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。バイサルファイトシーケンシングで分析すると、ＮＰＣ患者由来と検出可能なＥＢＶ ＤＮＡを持つ非ＮＰＣ被験者由来との血漿ＤＮＡ間にメチル化が異なる領域が存在し得る。結果として、これらの異なるメチル化領域でのメチル化状態の分析が、ＮＰＣおよび非ＮＰＣ被験者を識別することができる。本明細書に記載されるように、ＮＰＣ関連ＥＢＶ ＤＮＡメチル化状態は、ＮＰＣ発症のリスクを予測することもでき、ＮＰＣスクリーニングの間隔を調整するために用いることができる。例えば、ＮＰＣ関連ＥＢＶ ＤＮＡメチル化パターンのある被験者は、ＮＰＣ関連ＥＢＶ ＤＮＡメチル化パターンのない被験者と比較してより頻繁にスクリーニングされ得る。あるケースでは、バイサルファイトシーケンシングの代わりに、例えばPacific Biosciences（Kelleher et al. Methods Mol Biol. 2018;1681：127-137; Powers et al. BMC Genomics. 2013;14：675）およびOxford Nanopore（Simpson et al. Nat Methods. 2017;14：407-10）などの一分子シーケンシングシステム、ならびに配列決定前のメチル化感受性制限酵素処理を用いて、別のタイプのメチル化認識配列決定を実行できる。さらに別のケースでは、メチル化を認識し、配列決定に基づかない分子アプローチ、例えば、メチル化特異的ＰＣＲ（Herman et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93：9821-6）、メチル化感受性酵素（例えば制限酵素）およびバイサルファイト変換に基づく検出システムと、それに続く質量分析（van den Boom et al. Methods Mol Biol. 2009;507：207-27; Nygren et al. Clin Chem. 2010; 56：1627-35）、ならびにメチル化状態またはメチル化結合タンパク質（Zhang et al. Nat Commun. 2013; 4：1517）に基づくＤＮＡ分子の示差沈殿（例えば、抗メチル化シトシン抗体を使用する）に基づくアプローチ（Shen et al. Nature. 2018; 563：579-83; Zhou et al. PLoS One. 2018; 13：e0201586）を使用することができる。
あるケースでは、無細胞病原体核酸分子、例えば血漿ＥＢＶ ＤＮＡのメチル化パターンを、病原体関連障害、例えばＮＰＣなどの病原体関連癌の検出、または臨床的に検出可能な障害を有する将来のリスクの予測に対して用いることができる。上述したように、１つのアプローチは、バイサルファイトを使用して、非メチル化シトシンをウラシルに変換するために核酸分子を処理することである。メチル化されたシトシンは、バイサルファイトによって変化せずシトシンのままである。バイサルファイト処理された核酸分子のその後の検査、例えば配列決定が採用され、生物学的サンプル中の核酸分子のメチル化状態を検出することができる。
１つの例では、血漿ＥＢＶ ＤＮＡのメチル化レベルの差異は、メチル化感受性制限酵素分析を用いて決定される。メチル化感受性制限酵素の非限定的な例の１つは、非メチル化「ＣＣＧＧ」モチーフを持つ分子を切断できるが、「ＣＣＧＧ」なしまたはメチル化「ＣＣＧＧ」ありの分子を変更しないＨｐａＩＩである。あるいはまたはさらに、他のメチル化感受性制限酵素を用いることができる。１つの例では、非癌被験者の血漿ＥＢＶ ＤＮＡのメチル化レベルが低いため、非癌被験者の該血漿ＥＢＶ ＤＮＡは、メチル化感受性制限酵素による切断に対してより感受性があり得る。酵素消化による影響の受けやすさは、例えばこれらに限定されないが、超並列シーケンシング(massively parallel sequencing)、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、およびリアルタイムＰＣＲにより決定することができる。
超並列シーケンシングなどの配列決定を用いて、メチル化感受性制限酵素による消化の程度を分析する場合、酵素消化の有無にかかわらず、病原体の無細胞核酸分子、例えば血漿ＥＢＶ ＤＮＡのサイズ分布は、消化の程度を反映するために用いることができる。図１２および図１３に示されるように、サイズ分布曲線の左へのシフトは、血漿ＥＢＶ ＤＮＡのサイズ分布の短縮を示し得る。曲線が左にシフトするほど、酵素消化の程度が高くなり、ＤＮＡのメチル化レベルがより低くなることを意味する。
本明細書に記載の無細胞病原体核酸分子のメチル化状態は、個々のメチル化サイトに対するメチル化密度、病原体のゲノム上の隣接領域にわたるメチル化／非メチル化サイトの分布、病原体のゲノム上の１つ以上の特定の領域内、または病原体の全ゲノムにわたる個々のメチル化さいとごとのメチル化のパターンまたはレベル、および非ＣｐＧメチル化を含み得る。あるケースでは、メチル化状態は、個々の識別されたメチル化サイトのメチル化レベル（またはメチル化密度）を含み、これは例えば、病原体関連障害（ＥＢＶ関連ＮＰＣまたはＨＰＶ関連子宮頸癌など）を有する患者からのサンプルと障害なしの被験者（例えば、非ＮＰＣ被験者）との間で同定できる。メチル化密度は、所与のメチル化サイトについて、かかるメチル化サイトを含む目的の核酸分子の総数に対する、所与のメチル化サイトにてメチル化された核酸分子のフラクションを指し得る。例えば、肝臓組織の第１のメチル化サイトのメチル化密度は、肝臓ＤＮＡ分子全体に対する第１のサイトでメチル化された肝臓ＤＮＡ分子のフラクションを指し得る。あるケースでは、メチル化状態は、個々のメチル化サイト間のメチル化／非メチル化状態のコヒーレンス（パターンやハプロタイプなど）を含む。
あるケースでは、本明細書に記載のスクリーニングアッセイ（例えば、第１のアッセイまたは第２のアッセイ）は、利用可能な任意の技術、例えばこれに限定されないが、メチル化認識配列決定、メチル化感受性増幅またはメチル化感受性沈殿の実施による無細胞核酸分子のメチル化状態の決定を含み得る。実施例および実施形態が本明細書に提供されているが、例えば、メチル化状態の決定に関連する追加の技術および実施形態は、２０１３年９月２０日に出願されたＰＣＴＡＵ／２０１３／００１０８８に見出すことができ、参照により全体的に本明細書に組み込まれる。
フラグメントサイズ
本開示のある態様は、被験者由来の生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子のフラグメントサイズの評価に基づく、被験者が病原体関連障害を発症するリスクの層別化に関する。
本開示のある態様は、被験者由来の生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子のフラグメントサイズの評価に基づく、被験者が病原体関連障害を発症するリスクの層別化に関する。
無細胞病原体核酸分子のフラグメントサイズ分布および／または相対的存在量は、病原体関連障害（例えば、ＥＢＶ関連ＮＰＣまたはＨＰＶ関連子宮頸癌）を有する患者および該障害のない被験者（例えば、非ＮＰＣ被験者）からのサンプルを識別することができる。例えば、血漿ＥＢＶ ＤＮＡ分子のサイズ分布およびＥＢＶゲノムおよびヒトゲノムへの循環ＤＮＡ分子マッピングの比率は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるLam et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018;115:E5115-E5124において大規模並列シーケンスを使用して示されているように、ＮＰＣ患者と検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを持つ非ＮＰＣ被験者とを識別するのに有用であり得る。本開示のある例によれば、ＮＰＣ関連のサイズ分布およびＥＢＶおよびヒトゲノムへの循環ＤＮＡマッピングの相対的存在量はまた、将来の臨床的に検出可能なＮＰＣを発症するリスクの予測に有用であり得る。１つの実装において、血漿ＤＮＡ配列決定に関するこれらＮＰＣ関連の特徴を有するが検出可能なＮＰＣを有さない被験者は、検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有するがこれらＮＰＣ関連の特徴を有さない対象よりも頻繁に追跡することができる。ＮＰＣのリスクを層別化するために上記の２段階アッセイを用いるよりも、この配列決定ベースの分析を用いることの潜在的な実用上の１つの利点は、患者からの別の血液サンプルの収集を省略できることである。
あるケースでは、アッセイ（例えば、第１のアッセイまたは第２のアッセイ）は、核酸フラグメントサイズ、例えば血漿ＥＢＶ ＤＮＡのフラグメントサイズを分析するために、アッセイ、例えば次世代配列決定アッセイを実施することを含み得る。あるケースでは、配列決定を用いて、サンプル中の無細胞ウィルス核酸のサイズを評価する。例えば、配列決定された各血漿ＤＮＡ分子のサイズは、配列の開始座標と終了座標から導き出すことができ、座標は、シーケンスリードをウィルスゲノムにマッピング（アライン）することによって決定することができる。様々な例において、ＤＮＡ分子の開始および終了座標は、一分子シーケンシングにおいて達成され得るように、２つのペアエンドリードまたは両端をカバーする単一のリードから決定され得る。あるケースでは、増幅またはハイブリダイゼーションベースの方法をフラグメントサイズ分析に用いることもできる。例えば、プローブは、様々な長さのゲノム領域をターゲットとするように設計することができ、増幅（例えば、ＰＣＲもしくはｑＰＣＲ）またはハイブリダイゼーションシグナルは、ターゲット領域よりも同等以上の長さを有しながら、ターゲットゲノム領域における無細胞核酸フラグメントの数を示すことができる。したがって、フラグメントサイズの分布を推定することができる。フラグメントサイズのアッセイおよび分析の方法は、米国特許公開番号ＵＳ２０１８０２０８９９９Ａ１に記載されているものを含むことができ、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
フラグメントサイズ分布は、横軸に核酸フラグメントのサイズを備えるヒストグラムとして表示できる。各サイズ（例えば、１ｂｐの解像度内）での核酸フラグメントの数を決定し、例えば、生の数または頻度のパーセンテージとして縦軸にプロットすることができる。サイズの解像度は１ｂｐを超える場合がある（たとえば、２、３、４、または５ｂｐの解像度）。以下のサイズ分布の分析（サイズプロファイルとも呼ばれる）は、ＮＰＣ被験者からの無細胞混合物中のウィルスＤＮＡフラグメントが、観察可能な病理の無い被験者よりも統計的に長いことを示す。１つの例示的な例では、血漿ＥＢＶ ＤＮＡ分析から得られたフラグメントサイズ分布曲線において、ＮＰＣ患者の血漿ＥＢＶ ＤＮＡサイズプロファイルに特徴的な１６６ｂｐのピーク（ヌクレオソームパターン）があり得、一方、非癌被験者からの血漿ＥＢＶ ＤＮＡは典型的なヌクレオソームパターンを示さない。
あるケースでは、リスクを評価するために、被験者からの無細胞核酸分子と比較した病原体からの無細胞核酸分子の相対的な存在量が計算される。あるケースでは、相対的な存在量がサイズ比の観点から分析される。様々な例では、被験者からの病原体フラグメント対無細胞フラグメントのサイズ比は、病原体からの無細胞核酸フラグメントと被験者からの無細胞核酸フラグメントとの間の量比を指す。例えば、例えば、８０から１１０塩基対の間のＥＢＶ ＤＮＡフラグメントのサイズ比は、以下となり得る：
様々なケースでは、評価のためにカットオフ値または閾値が設定される。例えば、病原体フラグメントと被験者の常染色体フラグメントとの間のサイズ比を決定するためのサイズ閾値があり得る。あるいは、あるケースでは、閾値を下回るまたは上回るサイズを有するいくつかのフラグメントが、被験者が病原体関連障害を発症するリスクの標示であると見なされるように、サイズ閾値が設定される。サイズ閾値は任意の値にすることができることを理解されるべきである。サイズ閾値は、少なくとも約１０ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、５５ｂｐ、６０ｂｐ、６５ｂｐ、７０ｂｐ、７５ｂｐ、８０ｂｐ、８５ｂｐ、９０ｂｐ、９５ｂｐ、１００ｂｐ、１０５ｂｐ、１１０ｂｐ、１１５ｂｐ、１２０ｂｐ、１２５ｂｐ、１３０ｂｐ、１３５ｂｐ、１４０ｂｐ、１４５ｂｐ、１５０ｂｐ、１５５ｂｐ、１６０ｂｐ、１６５ｂｐ、１７０ｂｐ、１７５ｂｐ、１８０ｂｐ、１８５ｂｐ、１９０ｂｐ、１９５ｂｐ、２００ｂｐ、２１０ｂｐ、２２０ｂｐ、２３０ｂｐ、２４０ｂｐ、２５０ｂｐ、または２５０ｂｐ以上であってもよい。例えば、サイズ閾値は１５０ｂｐにすることができる。別の例では、サイズ閾値は１８０ｂｐにすることができる。ある実施形態では、上限および下限のサイズ閾値を使用することができる（例えば、値の範囲）。ある実施形態では、上限および下限のサイズ閾値を使用して、上限および下限のカットオフ値の間の長さを有する核酸フラグメントを選択することができる。ある実施形態では、上限および下限のカットオフを使用して、上限カットオフ値よりも長く、下限サイズ閾値よりも短い長さを有する核酸フラグメントを選択することができる。あるケースでは、サイズ比のカットオフ値を使用して、被験者にリスクがあるかどうか、または被験者が病原体関連障害、例えばＮＰＣを発症するリスクがどの程度あるかを決定する。例えば、ＮＰＣを有する被験者は、血漿ＥＢＶ ＤＮＡの偽陽性の結果が得られた被験者よりも、８０～１１０ｂｐのサイズ範囲内で低いサイズ比を有する。あるケースでは、サイズ比のカットオフ値は、約０．１、約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約５０、約１００、または約１００より大きくなることができる。あるケースでは、サイズ指数のカットオフ値は、約または少なくとも１０、約または少なくとも２、約または少なくとも１、約または少なくとも０．５、約または少なくとも０．３３３、約または少なくとも０．２５、約または少なくとも０．２、約または少なくとも０．１６７、約または少なくとも０．１４３、約または少なくとも０．１２５、約または少なくとも０．１１１、約または少なくとも０．１、約または少なくとも０．０９１、約または少なくとも０．０８３、約または少なくとも０．０７７、約または少なくとも０．０７１、約または少なくとも０．０６７、約または少なくとも０．０６３、約または少なくとも０．０５９、約または少なくとも０．０５６、約または少なくとも０．０５３、約または少なくとも０．０５、約または少なくとも０．０４、約または少なくとも０．０２、約または少なくとも０．００１、または約０．００１未満となることができる。
核酸フラグメントのサイズ分布の様々な統計値を決定することができる。例えば、サイズ分布の代表値、最頻値、中央値または平均値を使用できる。他の統計値、例えば所与のサイズの累積頻度、または様々なサイズの核酸フラグメントの量の様々な比率を使用することができる。累積頻度は、所与のサイズの、所与のサイズ未満、または所与のサイズよりも大きいＤＮＡフラグメントの割合（例えば、パーセンテージ）に対応し得る。統計値は、病原体に起因する病理のレベルを決定するための１つ以上のカットオフと比較するための核酸フラグメントのサイズの分布に関する情報を提供する。カットオフは、健康な被験者、１つ以上の病理を有することが知られている被験者、病原体に関連する病理の偽陽性である被験者、および本明細書に記載の他の被験者のコホートを用いて決定することができる。当業者は、本明細書の記載に基づいてかかるカットオフを決定する方法を知るであろう。
ある例では、病原体フラグメントのサイズの第１の統計値を、ヒトゲノムからのサイズの参照統計値と比較することができる。例えば、分離値(separation value)（例えば、差または比率）は、第１の統計値と、例えば、病原体参照ゲノムの他の領域から決定されるか、またはヒト核酸から決定される参照統計値との間で決定され得る。分離値は他の値からも決定できる。例えば、参照値は、複数の領域の統計値から決定することができる。分離値をサイズ閾値と比較して、サイズ分類（たとえば、ＤＮＡフラグメントが正常領域と比べて短いか、長いかまたは同じか）を取得できる。
ある例では、以下の式を用いて、参照病原体ゲノムと参照ヒトゲノムとの間の短いＤＮＡフラグメントの比率の差として定義できるパラメーター（分離値）を計算できる：
他の実施形態では、他のサイズ閾値、例えばこれらに限定されないが１００ｂｐ、１１０ｂｐ、１２０ｂｐ、１３０ｂｐ、１４０ｂｐ、１６０ｂｐ、および１６６ｂｐを使用することができる。他の実施形態では、サイズ閾値は、塩基もしくはヌクレオチド、または他の単位で表すことができる。
サイズベースのｚスコアは、対照被験者の平均値およびＳＤ値を使用して計算することができる。
ある実施形態では、３を超えるサイズベースのｚスコアは、病原体の短いフラグメントの割合の増加を示し、一方、３未満のサイズベースのｚスコアは、病原体の短いフラグメントの割合の減少を示す。他のサイズ閾値を用いることができる。サイズベースのアプローチのさらなる詳細は、米国特許第８，６２０，５９３号および第８，７４１，８１１号、ならびに米国特許公開第２０１３／０２３７４３１号に記載されており、これらはそれぞれ、参照によりその全体が組み込まれる。
核酸フラグメントのサイズを決定するために、本開示の少なくともいくつかの例は、染色体起源および分子の長さを分析することができる任意の一分子分析プラットフォームにより機能することができる。そのプラットフォームとは例えば、電気泳動、光学的方法（例えば、光学的マッピングとその変異体、en.wikipedia.org / wiki / Optical_mapping#cite_note-Nanocoding-3、およびJo et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104：2673-2678）、蛍光ベースの方法、プローブベースの方法、デジタルＰＣＲ（マイクロフルイディクスベース、またはエマルジョンベース、例えば、ＢＥＡＭｉｎｇ（Dressman et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100：8817-8822）、ＲａｉｎＤａｎｃｅ（www.raindancetech .com / technology / pcr-genomics-research.asp））、ローリングサークル増幅、質量分析、融解分析（または融解曲線分析）、モレキュラーシーブなどがある。質量分析の例として、分子が長いほど質量が大きくなる（サイズ値の例）。
１つの例では、核酸分子は、ペアエンドシーケンシングプロトコルを用いてランダムに配列決定することができる。両端の２つのリードは、参照ゲノムにマッピング（アライン）でき、繰り返しマスクすることができる（例えば、ヒトゲノムにアラインした場合）。ＤＮＡ分子のサイズは、２つのリードのマッピングするゲノム位置間の距離から決定することができる。
変異パターン分析
本開示のある態様は、被験者由来の生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の変異パターンの評価に基づく、被験者が病原体関連障害を発症するリスクの層別化に関する。生物学的サンプルで検出された病原体ゲノムの遺伝的変異は、病原体関連障害の将来の発症リスクの予測に用いることができる。
本開示のある態様は、被験者由来の生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の変異パターンの評価に基づく、被験者が病原体関連障害を発症するリスクの層別化に関する。生物学的サンプルで検出された病原体ゲノムの遺伝的変異は、病原体関連障害の将来の発症リスクの予測に用いることができる。
病原体核酸分子の変異パターンは、病原体関連障害のない被験者からのサンプルと比較して、病原体関連障害（例えば、病原体関連悪性腫瘍）を有する患者からの病変組織において異なり得る。ＥＢＶ関連腫瘍と対照サンプル（Palser et al. J Virol. 2015; 89：5222-37）に存在するＥＢＶの株は異なる可能性があることが報告されている。ただし、この以前の研究では、該腫瘍と対照のサンプルは地理的に異なる場所から収集された。ＥＢＶ変異体の潜在的な地理的変動を考慮すると、腫瘍サンプルにおいて同定された変異体が地理的に関連しているか、または疾患に関連しているかを結論付けることは困難である。ＮＰＣ腫瘍サンプルの分析を通じてＮＰＣ関連ＥＢＶ変異体を同定する試みが以前になされた。同じ地理的地域からのＥＢＶ関連疾患のない個人からのＮＰＣ腫瘍および唾液サンプルを分析した１つのゲノムワイドな関連解析（ＧＷＡＳ）（Hui et al. Int J Cancer 2019, doi.org / 10.1002 / ijc.32049）において、０．０５に調整されたＰを有する偽発見率未満で同定されたのは、２９の多型（一塩基多型（ＳＮＰ）またはインデル）であった。これらの２９のＮＰＣ関連ＥＢＶ変異体は、ＮＰＣ症例の９０％を超えて存在することが示されたが、対照症例の４０－５０％にすぎない。
ＮＰＣの発症についての個々のＥＢＶ多型の分析（Hui et al. Int J Cancer 2019, doi.org / 10.1002 / ijc.32049; Feng et al. Chin J Cancer 2015; 34：61）とは対照的に、本開示の態様は、ゲノムワイドな方法で変異パターンについて病原体核酸分子を分析するための方法およびシステムを提供する。さらに、腫瘍および細胞株サンプルの分析による疾患関連ＥＢＶ変異体の同定ではなく（Palser et al. J Virol. 2015; 89：5222-37、Correia et al. J Virol. 2018; 92：e01132-18、Hui et al. Int J Cancer 2019, doi.org / 10.1002 / ijc.32049）、本開示の態様は、血液（例えば、血漿もしくは血清）、鼻洗浄液、鼻ブラシサンプル、または腫瘍の侵襲的生検と比較して非侵襲的もしくは低侵襲的手順を介して得られた他の体液などの無細胞病原体核酸分子を分析することにより、病原体変異パターンを分析するための方法およびシステムを提供する。１つの例示的な例では、血液中のＥＢＶ ＤＮＡ分子の存在量が少なく、断片化された性質が、分析に技術的な課題をもたらし得る。無細胞ウィルスＤＮＡ分子の変異パターンを非侵襲的に分析することで、スクリーニング、予測医学、リスク層別化、監視、および予後診断を含む臨床応用を強化できる。１つの例では、該分析を使用して、様々なウィルス関連状態を有する被験者、例えばスクリーニングの文脈においてＮＰＣ患者および検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する非ＮＰＣ対象を識別することができる。別の例では、疾患または癌のリスク予測に使用できる。
変異パターンを得るために、異なるアプローチを使用することができる。非限定的なアッセイ法は、超並列シーケンシング（ＭＰＳ）、サンガーシーケンス（Lorenzetti et al. J Clin Microbiol. 2012; 50：609-18で使用されているものなど）、およびマイクロアレイベースのＳＮＰ分析（Wang et al. PNAS 2002; 99：15687-92に記載されているものなど）、ハイブリダイゼーション分析、および質量分光分析を含み得る。１つの例示的な例では、捕捉濃縮、ＭＰＳまたはサンガーシーケンシング(Sanger Sequencing)を伴うターゲットシーケンシングなどの配列決定法が使用され、シーケンスリードは、ヌクレオチドごとに病原体の参照ゲノム（例えば、ＥＢＶ参照ゲノム）を参照して分析される。該方法は、被験者の生物学的サンプルからの無細胞核酸分子のシーケンスリードを取得することを含み得る。該方法は、シーケンスリードを病原体の参照ゲノムにアラインさせることをさらに含み得る。該方法は、病原体の参照ゲノムと病原体の参照ゲノムにマッピングされたシーケンスリードとの間のヌクレオチド変異を分析することによって、病原体の参照ゲノムにわたるヌクレオチド変異パターンを分析することをさらに含み得る。本明細書で提供される変異パターンは、病原体の参照ゲノム上の複数の変異サイトのそれぞれで病原体の参照ゲノムにマッピングされたシーケンスリードのヌクレオチド変異体を特性化することができる。複数の変異サイトは、病原体の参照ゲノムにわたる少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００のサイトを含むことができる。あるケースでは、複数の変異サイトは、病原体の参照ゲノムにわたる少なくとも１０００のサイトを含む。あるケースでは、複数の変異サイトは、病原体の参照ゲノムにわたる少なくとも１１００のサイトを含む。あるケースでは、複数の変異サイトは、病原体の参照ゲノムにわたる少なくとも６００のサイトを含む。あるケースでは、複数の変異サイトは、病原体の参照ゲノムにわたる少なくとも６６０のサイトを含む。あるケースでは、複数の変異サイトは、ＥＢＶ参照ゲノム（ＡＪ５０７７９９．２）に関連する表６に記載されるようなゲノムサイトから選択される少なくとも３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、または６００のサイトを含む。あるケースでは、複数の変異サイトは、ＥＢＶ参照ゲノム（ＡＪ５０７７９９．２）に関連する表６に記載されるようなゲノムサイトを含む。
あるケースでは、病原体からの無細胞核酸分子の変異パターンは、ＥＢＶ参照ゲノム（ＡＪ５０７７９９．２）に関連する表６に記載されるようなゲノムサイトからランダムに選択される複数の変異サイトのそれぞれで、病原体の参照ゲノムにマッピングされたシーケンスリードのヌクレオチド変異体を特徴付ける。あるケースでは、本明細書で提供される方法は、ＥＢＶ参照ゲノム（ＡＪ５０７７９９．２）に関連する表６に記載されるように、ゲノムサイトから複数の変異サイトをランダムに選択するステップを含む。該方法は、病原体の参照ゲノムと病原体の参照ゲノムにマッピングされたシーケンスリードとの間のヌクレオチド変異を分析することによって、ランダムに選択された複数の変異サイトにわたるヌクレオチド変異パターンを分析することをさらに含み得る。
あるケースでは、病原体からの無細胞核酸分子の変異パターンは、ＥＢＶ参照ゲノム（ＡＪ５０７７９９．２）に関連する表６に記載されるようなゲノムサイトからランダムに選択される少なくとも３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、または６００のサイトを含む複数の変異サイトのそれぞれで、病原体の参照ゲノムにマッピングされたシーケンスリードのヌクレオチド変異体を特徴付ける。
あるケースでは、複数の変異サイトは、病原体の参照ゲノムにマッピングされたシーケンスリードが病原体の参照ゲノムとは異なるヌクレオチド変異体を有するすべてのサイトからなる。
あるケースでは、野生型の病原体ゲノムが参照ゲノムとして用いられる。例えば、ワイドタイプのＥＢＶゲノム（GenBank：AJ507799.2）を参照ＥＢＶゲノムとして用いることができる。他のケースでは、他の病原体ゲノムが参照ゲノムとして用いられる。さらに別の例では、複数の病原体ゲノム（例えば、ＥＢＶゲノム）が参照として用いられる。さらに別の例では、コンセンサス配列が参照として用いられる。コンセンサスは、異なる病原体ゲノム配列の変異体、例えば、de Jesus et al. J Gen Virol. 2003; 84：1443-50.に記載されているＥＢＶゲノムのコンセンサス配列を組み合わせることによって構築することができる。
例えば、コピー数、メチル化状態、フラグメントサイズ、相対的存在量、または変異パターンの分析のために、本明細書で提供される方法およびシステムで利用される配列アラインメントは、任意の適切なバイオインフォマティクスアルゴリズム、プログラム、ツールキット、またはパッケージによって実施され得る。例えば、明細書で提供される方法およびシステムの適用のためのアラインメントツールとして、短いオリゴヌクレオチド分析パッケージ（ＳＯＡＰ）を使用することができる。本明細書で提供される方法およびシステムで使用できる短いシーケンスリード分析ツールの例として、Ａｒｉｏｃ、ＢａｒｒａＣＵＤＡ、ＢＢＭａｐ、ＢＦＡＳＴ、ＢｉｇＢＷＡ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＴ、Ｂｏｗｔｉｅ、Ｂｏｗｔｉｅ２、ＢＷＡ、ＢＷＡ－ＰＳＳＭ、ＣＡＳＨＸ、Ｃｌｏｕｄｂｕｒｓｔ、ＣＵＤＡ－ＥＣ、ＣＵＳＨＡＷ、ＣＵＳＨＡＷ２、ＣＵＳＨＡＷ２－ＧＰＵ、ＣＵＳＨＡＷ３、ｄｒＦＡＳＴ、ＥＬＡＮＤ、ＥＲＮＥ、ＧＡＳＳＳＴ、ＧＥＭ、Ｇｅｎａｌｉｃｅ ＭＡＰ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ、ＧｅｎｓｅａｒｃｈＮＧＳ、ＧＭＡＰおよびＧＳＮＡＰ、ＧＮＵＭＡＰ、ＨＩＶＥ－ｈｅｘａｇｏｎ、Ｉｓａａｃ、ＬＡＳＴ、ＭＡＱ、ｍｒＦＡＳＴ、ｍｒｓＦＡＳＴ、ＭＯＭ、ＭＯＳＡＩＫ、ＭＰｓｃａｎ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ＆ＮｏｖｏａｌｉｇｎＣＳ、ＮｅｘｔＧＥＮｅ、ＮｅｘｔＧｅｎＭａｐ、Ｏｍｉｘｏｎ Ｖａｒｉａｎｔ Ｔｏｏｌｋｉｔ、ＰＡＬＭａｐｐｅｒ、 Ｐａｒｔｅｋ Ｆｌｏｗ、ＰＡＳＳ、ＰｅｒＭ、ＰＲＩＭＥＸ、ＱＰａｌｍａ、ＲａｚｅｒＳ、ＲＥＡＬ、ｃＲＥＡＬ、ＲＭＡＰ、ｒＮＡ、ＲＴＧ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ、Ｓｅｇｅｍｅｈｌ、ＳｅｑＭａｐ、Ｓｈｒｅｃ、ＳＨＲｉＭＰ、ＳＬＩＤＥＲ、ＳＯＡＰ、ＳＯＡＰ２、ＳＯＡＰ３、ＳＯＡＰ３－ｄｐ、ＳＯＣＳ、ＳｐａｒｋＢＷＡ、ＳＳＡＨＡ、ＳＳＡＨＡ２、Ｓｔａｍｐｙ、ＳＴｏＲＭ、Ｓｕｂｒｅａｄ、Ｓｕｂｊｕｎｃ、Ｔａｉｐａｎ、ＵＧＥＮＥ、ＶｅｌｏｃｉＭａｐｐｅｒ、ＸｐｒｅｓｓＡｌｉｇｎ、およびＺＯＯＭが挙げられる。
シーケンスリード内のいくつかの連続したヌクレオチド（「シーケンスストレッチ」）を用いて、参照ゲノムにアラインメントし、アラインメントに関する呼び出しを行うことができる。例えば、アラインメントは、参照ゲノム、例えば、病原体の参照ゲノム、または宿主生物の参照ゲノムに読み取られた配列の少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２８、少なくとも３０、少なくとも３２、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３８、少なくとも４０、少なくとも４２、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４８、少なくとも５０、少なくとも５２、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５８、少なくとも６０、少なくとも６２、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７８、少なくとも８０、少なくとも８２、少なくとも８４、少なくとも８５、少なくとも８６、少なくとも８８、少なくとも９０、少なくとも９２、少なくとも９４、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９８、少なくとも１００、少なくとも１０２、少なくとも１０４、少なくとも１０６、少なくとも１０８、少なくとも１１０、少なくとも１１２、少なくとも１１４、少なくとも１１６、少なくとも１１８、少なくとも１２０、少なくとも１２２、少なくとも１２４、少なくとも１２６、少なくとも１２８、少なくとも１３０、少なくとも１３２、少なくとも１３４、少なくとも１３６、少なくとも１３８、少なくとも１４０、少なくとも１４２、少なくとも１４５、少なくとも１４６、少なくとも１４８、または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドをアラインすることを含み得る。あるケースでは、本明細書で言及されるようなアラインメントは、参照ゲノム、例えば、病原体の参照ゲノム、または宿主生物の参照ゲノムに読み取られた配列の多くて５、多くて７、多くて９、多くて１１、多くて１３、多くて１５、多くて１７、多くて１９、多くて２１、多くて２３、多くて２５、多くて２７、多くて ２９、多くて３１、多くて３３、多くて３７、多くて３９、多くて４１、多くて４３、多くて４５、多くて４７、多くて４９、多くて５１、多くて５３、多くて５５、多くて５７、多くて５９、多くて６１、多くて６３、多くて６５、多くて６７、多くて６８、多くて６９、多くて７０、多くて７１、多くて７２、多くて ７３、多くて７４、多くて７５、多くて７６、多くて７８、多くて８０、多くて８１、多くて８３、多くて８５、多くて８７、多くて８９、多くて９１、多くて９３、多くて９５、多くて９７、多くて９９、多くて１０１、多くて１０３、多くて１０５、多くて１０７、多くて１０９、多くて１１１、多くて１１３、多くて１１５、多くて１１７、多くて１１９、多くて１２１、多くて１２３、多くて１２５、多くて１２７、多くて１２９、多くて１３１、多くて１３３、多くて１３５、多くて１３７、多くて１３９、多くて１４１、多くて１４３、 多くて１４５、多くて１４７、多くて１４９、または多くて１５１の連続したヌクレオチドをアラインすることを含み得る。ある例では、本明細書で言及されるようなアラインメントは、参照ゲノム、例えば、病原体の参照ゲノム、または宿主生物の参照ゲノムに読み取られた配列の約２０、約２２、約２４、約２５、約２６、約２８、約３０、約３２、約３４、約３５、約３６、約３８、約４０、約４２、約４４、約４５、約４６、約４８、約５０、約５２、約５４、約５５、約５６、約５８、約６０、約６２、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７８、約８０、約８２、約８４、約８５、約８６、約８８、約９０、約９２、約９４、約９５、約９６、約９８、約１００、約１０２、約１０４、約１０６、約１０８、約１１０、約１１２、約１１４、約１１６、約１１８、約１２０、約１２２、約１２４、約１２６、約１２８、約１３０、約１３２、約１３４、約１３６、約１３８、約１４０、約１４２、約１４５、約１４６、約１４８、約１５０、約１５２、約１５４、約１５５、約１５６、約１５８、約１６０、約１６２、約１６４、約１６５、約１６６、約１６８、約１７０、約１７２、約１７４、約１７５、約１７６、約１７８、約１８０、約１８５、約１９０、約１９５、または約２００の連続したヌクレオチドをアラインすることを含み得る。
あるケースでは、シーケンスストレッチが、シーケンスリード全体にわたる参照ゲノムの特定の領域、例えば、ヒト参照ゲノムに対する配列の同一性または相補性を少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、９９％、または１００％有するときに、アラインメントが呼び出される。あるケースでは、シーケンスストレッチが、シーケンスリード全体にわたる参照ゲノムの特定の領域、例えば、ヒト参照ゲノムに対する配列の同一性または相補性を少なくとも８０％有するときに、アラインメントが呼び出される。あるケースでは、シーケンスストレッチが、参照ゲノムの特定の領域、例えば、ヒト参照ゲノムに対する配列の同一または相補的であり、かつミスマッチがわずか２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２塩基に過ぎない、または１塩基、またはミスマッチがゼロであるときに、アラインメントが呼び出される。あるケースでは、シーケンスストレッチが、参照ゲノムの特定の領域、例えば、ヒト参照ゲノムに対する配列の同一または相補的であり、かつミスマッチがわずか２塩基に過ぎないときに、アラインメントが呼び出される。最大のミスマッチの数もしくはパーセンテージ、または最小の類似性の数もしくはパーセンテージは、本明細書で提供される方法およびシステムの適用の目的および文脈に応じて、選択基準として変化し得る。
あるケースでは、病原体の参照ゲノムへのシーケンスリードのアラインメントにより、最大のミスマッチをわずか２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１塩基にすることが可能となる。マッピングされたシーケンスリードと病原体の参照ゲノムとのミスマッチは、生物学的サンプルに存在する病原体ゲノム配列のヌクレオチド変異体を示すことができ、他の場合には、シーケンシングエラーを示すこともできる。特定の理論に縛られることを望むことなく、１つの生物学的サンプルにおいて所与のゲノムサイトで２以上のヌクレオチド変異体が同定されるのは、無細胞病原体核酸分子が由来する疾患細胞の配列決定エラーまたは不均一性が原因である可能性がある。あるケースでは、所与の生物学的サンプル中で１、２または３を超えるヌクレオチド変異体が同定された場合、ゲノムサイトのヌクレオチド変異体は分析から除外される。
例示的な例では、捕捉濃縮を伴うターゲットシーケンシングを用いて、ＮＰＣ被験者および検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する非ＮＰＣ被験者の循環中の無細胞ウィルスＤＮＡ分子を分析する。捕捉プローブは、ＥＢＶゲノム全体をカバーするように設計できる。他のケースでは、ＥＢＶゲノムの一部のみを分析でき、捕捉プローブは、ＥＢＶゲノムの一部のみをカバーするように設計される。同じ分析において、捕捉プローブを含めて、ヒトゲノムの対象ゲノム領域をターゲットにすることもできる。例えば、ヒト共通一塩基多型（ＳＮＰ）サイトおよびヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ＳＮＰをターゲットとするプローブを含めることができる。１つの実施形態では、他のウィルスゲノム配列、例えばＨＰＶまたはＨＢＶゲノムにハイブリダイズするように、より多くのプローブを設計することができる。
あるケースでは、病原体ゲノムの変異パターンは、参照ゲノムにマッピングされたシーケンスリードと参照ゲノムとを直接比較することによって分析される。これらの分析に利用できるバイオインフォマティクスツールは、ＭＥＧＡ４、ＭＥＧＡ５、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、Ｐｈｙｌｉｐ、ＲＡｘＭＬ、ＢＥＡＳＴ、ＰｈｙＭＬ、ＴｒｅｅＶｉｅｗ、ＭＡＦＦＴ、ＭｒＢａｙｅｓ、ＢＩＯＮＪ、ＭＬＴｒｅｅＭａｐ、Ｎｅｗｉｃｋ Ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ、Ｐｈｙｌｏ.ｉｏ、Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ.ｆｒ、ＲＥＡＬＰＨＹ、ＳｕｐｅｒＴｒｅｅ、ＴｈｅＰｈｙｌＯｇｅｎｅｔｉｃ Ｗｅｂリピーターを含み得る。クラスター分析または系統樹分析は、病原体参照ゲノムにマッピングされたシーケンスリードを、病変組織または健康な被験者から得られた、または病原体関連障害を引き起こすことができるまたはできないと示された、または病原体関連障害を引き起こすのに効果的または非効果的であると示された１つ以上の病原体ゲノムと比較する。
例示的な例では、本明細書で提供される方法およびシステムは、ブロックベースの変異パターン分析を含む。ブロックベースの変異パターン分析は、病原体の参照ゲノムを複数のビン（「ブロック」）に分離することを含み得る。病原体参照ゲノムにマッピングされたシーケンスリードは、複数のビンのそれぞれの中の障害関連病原体ゲノムと比較される。あるケースでは、ブロックベースの分析のために比較される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００などの異なる病原体ゲノムが複数あり、障害関連病原体ゲノム、および任意選択で、病原体関連障害を引き起こすことができない、または効果がないことが知られているかもしくは示されている病原体ゲノム（障害に関係のない病原体ゲノム）を含む。ブロックベースの分析において、複数のビンのそれぞれの中で、病原体参照ゲノムにマッピングされたシーケンスリードと、障害関連または障害非関連の病原体ゲノムのそれぞれとの間の共有ヌクレオチド(shared nucleotide)変異体に基づいて類似性指数が計算される。類似性指数は、病原体参照ゲノムにマッピングされたシーケンスリードの少なくとも１つが、障害関連または障害非関連の病原体ゲノムと同じヌクレオチド変異体を有する変異サイトの割合に依存し得る。シーケンスリードが比較される各病原体ゲノムに対する類似性指数に基づいて、ビンスコアは、例えば、類似性指数によって反映される類似性レベルに基づいて計算することができる。一例では、ビンスコアは、所定のカットオフを超える類似性指数の割合に依存し得る。類似性指数には、例えば、約０．６、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、または０．９５のカットオフを設定できる。カットオフを超える類似性指数は、シーケンスリードが、比較対象の病原体ゲノムと「類似」していることを示し得る。上記の分析に基づいて、パターン分析は、計算された類似性指数またはビンスコアを用いて、病原体ゲノムにわたりより大規模にまたは病原体ゲノムの一部で実行できる。上記の分析と同様のクラスター分析または系統発生分析は、ＥＢＶ関連ＮＰＣなどの病原体関連障害の発症リスクを予測するためのブロックベースの分析に従うことができる。
リスクスコア
本開示のある態様は、被験者由来の生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の１つ以上の特性の組み合わせ的な考察に基づく、被験者が病原体関連障害を発症するリスクの層別化に関する。あるケースでは、被験者が病原体関連障害、例えばＥＢＶ関連鼻咽頭癌を発症するリスクを示すリスクスコアが生成される。
本開示のある態様は、被験者由来の生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の１つ以上の特性の組み合わせ的な考察に基づく、被験者が病原体関連障害を発症するリスクの層別化に関する。あるケースでは、被験者が病原体関連障害、例えばＥＢＶ関連鼻咽頭癌を発症するリスクを示すリスクスコアが生成される。
あるケースでは、本開示は、被験者由来の生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の１つ以上の特性、および被験者の年齢、被験者の喫煙習慣、被験者のＮＰＣの家族歴、被験者の遺伝子型要因、食歴、または被験者の民族性の１つ以上の要因の組み合わせ的な考察に基づく、被験者が病原体関連障害を発症するリスクの層別化に関する。臨床的に検出可能なＮＰＣを有さない被験者における血漿ＥＢＶ ＤＮＡの検出の陽性率と、被験者の年齢との間には正の相関関係ができる。被験者の喫煙習慣は、被験者のＮＰＣ発症リスクを高め得る。ＮＰＣの家族歴がある被験者は、ＮＰＣを自身で発症するリスクを高め得る。それぞれその全体が本明細書に組み込まれているBei et al. Nat Genet. 2010; 42：599-603およびHildesheim et al. J Natl Cancer Inst. 2002; 94：1780-9に示されているように、ＨＬＡステータスなどの遺伝子型因子もまたＮＰＣのリスクと相関している。さらに、食歴はＮＰＣのリスクと相関し得、例えば、塩漬けの魚を大量に摂取している被験者は、ＮＰＣのリスクが比較的高くなり得る。広東人などの特定の民族性もまた、ＮＰＣを発症するリスクが高いことに関連し得る。
あるケースでは、方法およびシステムは、被験者が病原体関連障害を発症するリスクを示すレポートを作成することをさらに含む。このようなレポートは、数値のリスクスコア値またはカテゴリ別のリスク評価を有し得る。あるケースでは、レポートは、スクリーニング頻度または追跡スクリーニングアッセイの将来の時点に関する推奨事項を含む。レポートは、被験者や、被験者にサービスを提供する医療機関または医療専門家、または医療保険会社などの任意の関連するサードパーティに提供できる。レポートは、レポートのリリース前またはリリース後に、認定された医師がレビュー、評価または編集できる。あるケースでは、認定された医師がリスク評価について追加のコメントを提供し、または自分の医学的意見や独立した検査に基づいて最終的なリスク評価に貢献する。
あるケースでは、本開示は、分類子を用いることにより、ＥＢＶ関連ＮＰＣなどの病原体関連増殖性障害などの病原体関連障害を発症するリスクを層別化する方法を提供する。そのような分類子は、データ入力として本明細書に記載の１つ以上の要因を取り、リスクスコアを含む出力を提供することができ、これは、被験者が病原体関連障害を発症するリスクを示し得る。分類子に給送可能な１つ以上の要因は、無細胞病原体核酸分子の１つ以上の特性、被験者由来の生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の１つ以上の特性、ならびに被験者の年齢、被験者の喫煙習慣、被験者のＮＰＣの家族歴、被験者の遺伝子型要因、食歴および被験者の民族性の１つ以上の要因を含み得る。分類子の出力としてのリスクスコアは、病原体関連障害に対して被験者が現在苦しんでいるか、または将来的に発症するかのリスクを示し得る。あるケースでは、リスクスコアは、被験者が現在病原体関連障害に苦しんでいる可能性を示す。あるケースでは、リスクスコアは、被験者が将来の期間内、たとえば、これらに限定されないが１年以内、２年以内、３年以内、４年以内、５年以内、１０年以内、または１５年以内に病原体関連障害を発症する可能性を示す。あるケースでは、分類子は、追跡スクリーニングアッセイの推奨スクリーニング頻度または将来の時点を含む出力を提供する。かかる出力は、臨床推奨の形式にすることも、または上記のように被験者、医療機関、医療専門家もしくは医療保険会社などのサードパーティにレポートで提供することもできる。
本明細書に記載されたように、分類子は分類を実装する任意のアルゴリズムを指し得る。本開示において、分類子は、病原体関連障害の将来の発症のリスクを予測するための任意の適切なアルゴリズムに基づいて構築された分類モデルであり得る。適切なアルゴリズムは、機械学習アルゴリズム、およびこれらに限定されないが、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ナイーブベイズ(Naive Bayes)、ロジスティクス回帰、ランダムフォレスト、ディシジョンツリー、勾配ブースティングツリー、ニューラルネットワーク、ディープラーニング、線形／カーネルＳＶＭ、線形／非線形回帰、線形判別分析など他の数学/統計モデルを含み得る。あるケースでは、分類子は、複数の入力－出力ペアを含むラベル付きデータセットでトレーニングされる。例えば、データセットは、ＮＰＣを有す、もしくは有さないと診断された多数の被験者のサンプルの分析結果から生成された。これらの例では、該データセットは、これらの被験者からの血漿ＥＢＶ ＤＮＡの特性の１つ以上の要因（例えば、変異パターン、メチル化状態、検出可能性／コピー数、もしくはフラグメントサイズ）、年齢、家族歴、喫煙習慣、民族性、または食歴、さらには対応する被験者がＮＰＣを有しているかどうかを示す対応する出力を含む入力を含み得る。例示的な例では、分類子は、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１００００、または２００００ペアなど、多数の入力－出力ペアを含むラベル付きデータセットでトレーニングされ得る。
一例では、分類モデルは、変異パターンの分析を用いて、検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する被験者の将来のＮＰＣ発症のリスクを予測するために提供される。分類モデルは、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）アルゴリズムを用いて次のように構築された分類子にすることができる：
ｎ個のサンプルを含むトレーニングデータセットが与えられたとき：
（Ｍ１, Ｙ１）, …, （Ｍｎ, Ｙｎ）
ここで、ＹｉはサンプルｉのＮＰＣステータスを示す。Ｙｉは、ＮＰＣ患者からのサンプルの場合は１、またはＮＰＣを有さない被験者からのサンプルの場合は－１である；Ｍｉは、サンプルｉのウィルス変異パターンを含むｐ次元ベクトルである。例えば、Ｍｉは一連の変異サイト（例えば、表６に示すようにＮＰＣに関連した２９の変異サイトまたはＮＰＣに関連した６６１の変異サイト）となり得る。あるいは、Ｍｉは、ＮＰＣを有することが既知である被験者に存在する参照ＥＢＶ変異体に関して、一連のブロックベースの変異体類似性スコア（たとえば、５００ｂｐの重複しないウィンドウ）となり得る。
ｎ個のサンプルを含むトレーニングデータセットが与えられたとき：
（Ｍ１, Ｙ１）, …, （Ｍｎ, Ｙｎ）
ここで、ＹｉはサンプルｉのＮＰＣステータスを示す。Ｙｉは、ＮＰＣ患者からのサンプルの場合は１、またはＮＰＣを有さない被験者からのサンプルの場合は－１である；Ｍｉは、サンプルｉのウィルス変異パターンを含むｐ次元ベクトルである。例えば、Ｍｉは一連の変異サイト（例えば、表６に示すようにＮＰＣに関連した２９の変異サイトまたはＮＰＣに関連した６６１の変異サイト）となり得る。あるいは、Ｍｉは、ＮＰＣを有することが既知である被験者に存在する参照ＥＢＶ変異体に関して、一連のブロックベースの変異体類似性スコア（たとえば、５００ｂｐの重複しないウィンドウ）となり得る。
以下を満たす係数のセット（ｐ次元ベクトルを有するＷ）を求めることにより、トレーニングデータセット内で非ＮＰＣグループおよびＮＰＣグループを可能な限り正確に分離する「超平面(hyperplane)」を同定できる：
基準１：
Ｗ・Ｍｉ－ｂ≧１（ＮＰＣグループの被験者について）
および
基準２：
Ｗ・Ｍｉ－ｂ≦１（非ＮＰＣグループの被験者について）
ここで、Ｗは、超平面を決定する係数のｐ次元ベクトルであり；Ｍは、ｐ個の変異体（またはブロックベースの類似度スコア）およびｎ個のサンプルを有する行列（ｐ ｘ ｎ次元）であり；ｂは切片である。
基準１：
Ｗ・Ｍｉ－ｂ≧１（ＮＰＣグループの被験者について）
および
基準２：
Ｗ・Ｍｉ－ｂ≦１（非ＮＰＣグループの被験者について）
ここで、Ｗは、超平面を決定する係数のｐ次元ベクトルであり；Ｍは、ｐ個の変異体（またはブロックベースの類似度スコア）およびｎ個のサンプルを有する行列（ｐ ｘ ｎ次元）であり；ｂは切片である。
２つの基準（つまり基準１および２）は、次のように記述することもできる：
Ｙｉ（Ｗ ＊ Ｍｉ－ｂ）≧１（基準３）
ここで、Ｙｉは－１（非ＮＰＣ）または１（ＮＰＣ）のいずれかである。
Ｙｉ（Ｗ ＊ Ｍｉ－ｂ）≧１（基準３）
ここで、Ｙｉは－１（非ＮＰＣ）または１（ＮＰＣ）のいずれかである。
基準１と２との間のマージン距離（Ｄ）は：
Ｄは、基準３に従って
最小化することによって最大化される。
この原理に基づいて、分類子のパラメーター（Ｗおよびｂ）を決定できる。したがって、トレーニングされたパラメーター（Ｗおよびｂ）を用いて実装された、トレーニングされた分類子を使用して、テストサンプルのＮＰＣリスクスコアを計算できる。
1つの例示的な例では、ＮＰＣリスクスコアは、ウィルスゲノムにわたるＳＮＶサイトの固定セットでのＥＢＶ遺伝子型の加重和として（バイナリロジスティック回帰モデルの説明変数として）計算される。この例では、トレーニングセット内のＮＰＣサンプルおよび非ＮＰＣサンプルからのＥＢＶ ＳＮＶプロファイルの違いを分析することにより、ＮＰＣ関連ＳＮＶのセットが同定される。ＥＢＶゲノムにわたる各変異体とＮＰＣ症例との関連は、たとえばフィッシャーの直接確率検定を用いて分析できる。それから、例えば、偽発見率（ＦＤＲ）を５％に制御して、重要なＳＮＶの固定セットを取得できる。テストサンプルのＮＰＣリスクスコアは、既知のＮＰＣおよび非ＮＰＣ被験者由来の血漿ＤＮＡサンプルからの配列決定データを含むトレーニングセットから同定された重要なＳＮＶサイトのこの特定のセットに対するＥＢＶ遺伝子型によって決定できる。あるケースでは、血漿ＥＢＶ ＤＮＡ分子の濃度が低くなり得るため、配列決定されたＥＢＶ ＤＮＡリードによるＥＢＶゲノム全体のカバーが不完全になり得る。スコアは、血漿ＥＢＶ ＤＮＡリードによってカバーされるＳＮＶサイト全体の遺伝子型パターンによって（たとえば、利用可能な遺伝子型情報によって）決定されるように定式化できる。ＮＰＣリスクスコアを導き出すために、サンプル内の血漿ＥＢＶ ＤＮＡリードによってカバーされる重要なＳＮＶサイトのサブセットが最初に同定され、次いで、各サイトでの遺伝子型の重み付け（効果サイズ）が、重要なＳＮＶサイトのサブセット内で決定され得る。次のようなロジスティック回帰モデルを構築して、ＮＰＣの各ＳＮＶサイトでのリスク遺伝子型の効果サイズの情報を与えることができる：
これは次のように書き直すことができる：
ここで、ｎは、重要なＳＮＶサイトの数であり；β０およびβｋは、最尤推定量で決定できる係数であり；Ｐは、ＥＢＶ陽性患者がＮＰＣを有する確率であり；変数Ｘｋは、ゲノム位置ｋのＳＮＶサイトを表す。Ｘｋは、ＥＢＶ参照ゲノムと同一のサンプルに変異体が存在する場合、－１としてコード化できる。サンプルに代替変異体が存在する場合、Ｘｋは１としてコード化できる。分析された変異サイトがサンプルでカバーされていない場合、Ｘｋは０としてコード化できる。したがって、係数β０およびβｋは、例えば、Pythonの「ロジスティック回帰」関数を用いて推定できる。これは、トレーニングデータセット内のＮＰＣサンプルおよび非ＮＰＣサンプルの間の各サイトでの遺伝子型パターンを分析することで実現できる。したがって、テストサンプルのＮＰＣリスクスコアは、トレーニングモデルから推定された対応する係数β０およびβｋによって重み付けされた、ＳＮＶサイトでの独自の遺伝子型に基づいて導き出すことができる。
生物学的サンプル
本明細書で提供される方法で使用される生物学的サンプルは、生きているまたは死んだ対象に由来する任意の組織または材料を含み得る。生物学的サンプルは無細胞サンプルであり得る。生物学的サンプルは、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはそのフラグメントを含み得る。サンプル中の核酸は無細胞核酸であり得る。サンプルは、液体サンプルまたは固体サンプル（例えば、細胞または組織サンプル）であり得る。生物学的サンプルは、血液、血漿、血清、尿、口腔リンス液、鼻洗浄液、鼻ブラシサンプル、膣液、水疱からの液(fluid from a hydrocele)（例えば、精巣）、膣洗浄液、胸膜液、腹水、脳脊髄液、唾液、汗、涙、痰、気管支肺胞洗浄液(bronchoalveolar lavage fluid)、乳頭からの排出液(discharge fluid from the nipple)、体のさまざまな部分（甲状腺、乳房など）からの吸引液など体液(bodily fluid)であり得る。糞便サンプルも使用できる。様々な例では、無細胞ＤＮＡ（例えば、遠心分離プロトコルを介して得られた血漿サンプル）が濃縮された生物学的サンプル中のＤＮＡの大部分は、無細胞であり得る（例えば、ＤＮＡの５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％を超える部分が無細胞であり得る）。生物学的サンプルは、組織または細胞構造を物理的に破壊するように処理することができ（例えば、遠心分離および／または細胞溶解）、したがって、細胞内成分を、分析用のサンプルを調製するために用いられる酵素、緩衝液、塩、界面活性剤などをさらに含み得る溶液に放出する。
本明細書で提供される方法で使用される生物学的サンプルは、生きているまたは死んだ対象に由来する任意の組織または材料を含み得る。生物学的サンプルは無細胞サンプルであり得る。生物学的サンプルは、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはそのフラグメントを含み得る。サンプル中の核酸は無細胞核酸であり得る。サンプルは、液体サンプルまたは固体サンプル（例えば、細胞または組織サンプル）であり得る。生物学的サンプルは、血液、血漿、血清、尿、口腔リンス液、鼻洗浄液、鼻ブラシサンプル、膣液、水疱からの液(fluid from a hydrocele)（例えば、精巣）、膣洗浄液、胸膜液、腹水、脳脊髄液、唾液、汗、涙、痰、気管支肺胞洗浄液(bronchoalveolar lavage fluid)、乳頭からの排出液(discharge fluid from the nipple)、体のさまざまな部分（甲状腺、乳房など）からの吸引液など体液(bodily fluid)であり得る。糞便サンプルも使用できる。様々な例では、無細胞ＤＮＡ（例えば、遠心分離プロトコルを介して得られた血漿サンプル）が濃縮された生物学的サンプル中のＤＮＡの大部分は、無細胞であり得る（例えば、ＤＮＡの５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％を超える部分が無細胞であり得る）。生物学的サンプルは、組織または細胞構造を物理的に破壊するように処理することができ（例えば、遠心分離および／または細胞溶解）、したがって、細胞内成分を、分析用のサンプルを調製するために用いられる酵素、緩衝液、塩、界面活性剤などをさらに含み得る溶液に放出する。
本明細書で提供される方法およびシステムは、生物学的サンプル中の核酸分子を分析するために用いることができる。核酸分子は、細胞性核酸分子、無細胞核酸分子またはその両方であり得る。本明細書で提供される方法により用いられる無細胞核酸は、生物学的サンプル中の細胞の外側の核酸分子であり得る。無細胞核酸分子は、血液、唾液、精液および尿などのさまざまな体液に存在し得る。無細胞ＤＮＡ分子は、健康状態および／または病気、例えばウィルス感染や腫瘍の成長によって引き起こされ得るさまざまな組織での細胞死により生成され得る。無細胞核酸分子は、病原体統合イベント(pathogen integration events)の結果として生成された配列を含み得る。
本明細書で提供される方法で用いられる無細胞核酸分子、例えば無細胞ＤＮＡは、血漿、尿、唾液または血清中に存在することができる。無細胞ＤＮＡは、短いフラグメントの形態で自然に発生することができる。無細胞ＤＮＡのフラグメント化とは、無細胞ＤＮＡ分子が生成または放出されるときに、高分子量ＤＮＡ（細胞の核内のＤＮＡなど）が切断、破壊、または消化されて短いフラグメントになるプロセスを指し得る。本明細書で提供される方法およびシステムは、場合によっては、細胞性核酸分子、例えば、腫瘍組織からの細胞ＤＮＡ、または患者が白血病、リンパ腫もしくは骨髄腫を有する場合の白血球からの細胞ＤＮＡを分析するために使用することができる。腫瘍組織から採取されたサンプルは、本開示のいくつかの例に従って、アッセイおよび分析の対象となり得る。
被験者（対象）
本明細書で提供される方法およびシステムは、被験者、例えば生物、例えば宿主生物からのサンプルを分析するために用いることができる。被験者は、癌患者、癌のリスクのある患者、または癌の家族もしくは個人の癌の病歴を有する患者などの任意のヒト患者であり得る。あるケースでは、被験者は癌治療の特定の段階にある。あるケースでは、被験者は癌を患っている、または癌を患っていると疑われる状態であり得る。あるケースでは、被験者が癌を患っているかどうかは不明である。
本明細書で提供される方法およびシステムは、被験者、例えば生物、例えば宿主生物からのサンプルを分析するために用いることができる。被験者は、癌患者、癌のリスクのある患者、または癌の家族もしくは個人の癌の病歴を有する患者などの任意のヒト患者であり得る。あるケースでは、被験者は癌治療の特定の段階にある。あるケースでは、被験者は癌を患っている、または癌を患っていると疑われる状態であり得る。あるケースでは、被験者が癌を患っているかどうかは不明である。
あるケースでは、本明細書で提供されるスクリーニングアッセイの結果に応じて、被験者は、病原体関連障害の治療を受けるか、または受けない。一例では、第１のスクリーニングアッセイが、被験者が病原体関連障害を発症するリスクが高いことを示す陽性結果を示すが、該被験者は、後続の診断検査によって病原体関連障害（例えば、ＥＢＶ関連ＮＰＣ）を有さないと診断される。この場合、被験者は、医学的治療、例えばこれらに限定されないが、治療薬（例えば、化学療法）、放射線療法、外科手術またはそれらの任意の組み合わせによる治療を受けない。別の例では、被験者は、病原体関連障害（例えば、ＨＰＶ関連子宮頸癌）を発症するリスクが高いとスクリーニングされ、さらに障害を有すると診断される。結果として、被験者は、障害の医学的治療、例えばこれらに限定されないが、外科手術、化学療法、放射線療法、標的療法、免疫療法、またはそれらの任意の組み合わせなどを受け得る。
本明細書で提供される方法およびシステムを適用できうる病原体関連障害は、増殖性障害、例えば癌を含み得る。障害は、ウィルス、細菌または真菌などの病原体に関連するか、またはそれらによって引き起こされ得る。本明細書に記載の障害に関連し得るウィルスは、ＥＢＶ、カポジ肉腫関連ヘルペスウィルス（ＫＳＨＶ）、ＨＰＶ（例えばこれらに限定されないが、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３４、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８および７０）（Burd et al. Clin Microbiol Rev 2003：16：1-17）、メルケル細胞ポリオーマウィルス（ＭＣＰＶ）、ＨＢＶ、ＨＣＶおよびヒトＴリンパ球向性ウィルス－１ （ＨＴＬＶ１）を含み得る。該当する病原体関連癌は、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、免疫抑制関連リンパ腫(immunosuppression-related lymphoma)、Ｔ細胞リンパ腫およびＮＫ細胞リンパ腫；ＥＢＶに関連し得る鼻咽頭または胃の癌腫を含み得る。該当する病原体関連癌は、ＫＳＨＶに関連し得る原発性滲出液リンパ腫またはカポジ肉腫を含み得る。該当する病原体関連癌は、頸部癌、頭頸部癌、またはＨＰＶに関連し得る肛門性器管癌を含み得る。該当する病原体関連癌は、ＭＣＰＶに関連するメルケル細胞癌を含み得る。該当する病原体関連癌は、ＨＢＶまたはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に関連し得るＨＣＣを含み得る。該当する病原体関連癌は、ＨＴＬＶ１に関連し得る成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫を含み得る。
被験者は、任意の種類の癌または腫瘍を有し得、または任意の種類の癌または腫瘍を発症するリスクを有し得る。ある例では、被験者は、鼻咽頭癌または鼻腔の癌を有し得る。別の例では、被験者は、中咽頭癌または口腔癌を有し得る。癌の非限定的な例として、これらに限定されないが、副腎癌、肛門癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、血液癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、気管支癌、心血管系の癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、消化器系の癌、内分泌系の癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、胆嚢癌、消化器腫瘍、肝細胞癌、腎臓癌、造血器悪性腫瘍、喉頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、筋系癌、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄腫、鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経系癌、リンパ系癌、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、前立腺癌、直腸癌、腎骨盤癌、生殖器系癌、呼吸器系癌、肉腫、唾液腺癌、骨格系癌、皮膚癌、小腸癌、胃癌、精巣癌、喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、腫瘍、尿路癌、子宮癌、膣癌、または外陰癌が挙げられる。リンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、もしくは原発性中枢神経系リンパ腫）、またはＴ細胞リンパ腫（例えば、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫もしくは末梢Ｔ細胞リンパ腫）を含む任意の種類のリンパ腫であり得る。白血病は、急性白血病または慢性白血病を含む任意のタイプの白血病であり得る。白血病の種類は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、急性未分化白血病、または慢性リンパ性白血病を含む。あるケースでは、癌患者は特定の種類の癌を有していない。場合によっては、患者は乳癌ではない癌を有し得る。
癌の例として、固形腫瘍を引き起こさない癌のみならず固形腫瘍を引き起こす癌も含む。さらに、本明細書で言及される癌のいずれも、原発性癌（例えば、それが最初に成長し始めた体の部分にちなんで名付けられた癌）、または二次性もしくは転移性癌（例えば、体の別の部分から発生した癌）であり得る。
本明細書に記載のいずれかの方法によって診断された被験者は、任意の年齢であり得、成人、乳児または子供であり得る。あるケースでは、被験者は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９歳、またはその範囲内（例えば、２～２０歳、２０～４０歳もしくは４０～９０歳）である。恩恵を受けることができる特定のクラスの患者は、４０歳以上の患者であり得る。恩恵を受けることができる別の特定のクラスの患者は、小児患者であり得る。さらに、本明細書に記載の方法または組成物のいずれかによって診断された被験者は、男性または女性であり得る。
ある実施態様では、本開示の方法は、被験者における腫瘍または癌を検出することができ、腫瘍または癌は疾患の地理的パターンを有する。ある例では、被験者は、中国南部（例えば、香港ＳＡＲ）で蔓延しているＥＢＶ関連癌（例えば、鼻咽頭癌）を有し得る。別の例では、被験者は、米国および西ヨーロッパで蔓延し得るＨＰＶ関連の癌（例えば、中咽頭癌）を有し得る。さらに別の例では、被験者は、日本南部、カリブ海、中央アフリカ、南アメリカの一部、および米国南東部の一部の移民グループに蔓延し得るＨＴＬＶ－１関連の癌（例えば、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫）を有し得る。
本明細書に開示される方法のいずれも、実験動物もしくは農場の動物、または本明細書に開示される生物に由来する細胞サンプルなどの非ヒト対象に対して実施することもできる。非ヒト対象の非限定的な例として、犬、ヤギ、ギニアブタ、ハムスター、マウス、ブタ、非ヒト霊長類（例えば、ゴリラ、類人猿、オランウータン、キツネザル、またはヒヒ）、ラット、羊、牛、またはゼブラフィッシュが挙げられる。
コンピュータシステム
本明細書に開示される方法のいずれも、１つ以上のコンピュータシステムによって実施および／または制御することができる。ある例では、本明細書に開示される方法の任意のステップは、１つ以上のコンピュータシステムによって全体的に、個別にまたは順次に実施および／または制御され得る。本明細書で言及されるコンピュータシステムのいずれも、任意の適切な数のサブシステムを利用することができる。ある実施態様では、コンピュータシステムが、単一のコンピュータ装置を含み、ここでは、サブシステムはコンピュータ装置の構成要素であり得る。他の実施態様では、コンピュータシステムが、複数のコンピュータ装置を含み得、それぞれがサブシステムであり、内部構成要素を備える。コンピュータシステムは、デスクトップおよびラップトップコンピュータ、タブレット、携帯電話、ならびにその他のモバイルデバイスを含むことができる。
本明細書に開示される方法のいずれも、１つ以上のコンピュータシステムによって実施および／または制御することができる。ある例では、本明細書に開示される方法の任意のステップは、１つ以上のコンピュータシステムによって全体的に、個別にまたは順次に実施および／または制御され得る。本明細書で言及されるコンピュータシステムのいずれも、任意の適切な数のサブシステムを利用することができる。ある実施態様では、コンピュータシステムが、単一のコンピュータ装置を含み、ここでは、サブシステムはコンピュータ装置の構成要素であり得る。他の実施態様では、コンピュータシステムが、複数のコンピュータ装置を含み得、それぞれがサブシステムであり、内部構成要素を備える。コンピュータシステムは、デスクトップおよびラップトップコンピュータ、タブレット、携帯電話、ならびにその他のモバイルデバイスを含むことができる。
サブシステムは、システムバスを介して相互接続できる。付加的なサブシステムは、プリンター、キーボード、ストレージデバイス、およびディスプレイアダプタに結合されたモニターを含む。Ｉ／Ｏコントローラに結合する周辺機器および入力／出力（Ｉ／Ｏ）デバイスは、入力／出力（Ｉ／Ｏ）ポート（例えばＵＳＢ、ＦｉｒｅＷｉｒｅ（登録商標））など、当技術分野で知られている任意の数のつなぎによってコンピュータシステムに接続できる。例えば、Ｉ／Ｏポートまたは外部インターフェース（イーサネット、ｗｉ－ｆｉなど）を使用して、コンピュータシステムをインターネット、マウス入力デバイスまたはスキャナーなどのワイドエリアネットワークに接続できる。システムバスを介した相互接続により、中央処理装置(central processor)が各サブシステムと通信し、システムメモリまたは記憶デバイス（ハードドライブなどの固定ディスクもしくは光ディスクなど）からの複数の命令の実行、ならびにサブシステム間の情報交換を制御することを可能にする。システムメモリおよび／または記憶デバイスは、コンピュータ可読媒体を具体化することができる。別のサブシステムは、カメラ、マイクロフォン、加速度計などのデータ収集デバイスである。本明細書に記載されているデータはいずれも、あるコンポーネントから別のコンポーネントに出力することができ、ユーザーに出力することができる。
コンピュータシステムは、例えば、外部インターフェースまたは内部インターフェースによって一緒に接続された、複数の同一のコンポーネントまたはサブシステムを含み得る。ある実施形態では、コンピュータシステム、サブシステムまたは装置は、ネットワークを介して通信することができる。かかる場合、１台のコンピュータをクライアントと見なし、別のコンピュータをサーバーと見なすことができ、それぞれを同一のコンピュータシステムの一部とすることができる。
本開示は、病原体関連障害のリスクを層別化するための開示の方法を実装するようにプログラムされたコンピュータ制御システムを提供する。図２１は、無細胞核酸分子またはそのシーケンスリードを分析し、障害のリスクに関連する他の要因を分析し、リスクを評価し、または本明細書に記載されているリスクを示すレポートを生成するようにプログラム、さもなくば構成されたコンピュータシステム１１０１を示す。コンピュータシステム１１０１は、例えば、生物学的サンプルからの核酸分子の配列決定を制御すること、本明細書に記載されているような配列決定データのバイオインフォマティクス分析の様々なステップを実施すること、データ収集、分析と結果のレポート、およびデータ管理を統合することなど、本開示で提供される方法の様々な態様を実装および／または統制することができる。コンピュータシステム１１０１は、ユーザーの電子デバイス、または電子デバイスに対して遠隔に配置されたコンピュータシステムであり得る。電子デバイスは、モバイル電子デバイスであり得る。
コンピュータシステム１１０１は、中央処理装置ユニット（ＣＰＵ、本明細書では「プロセッサ」および「コンピュータプロセッサ」でもある）１１０５を含み、これは、シングルコアまたはマルチコアプロセッサ、または並列処理のための複数のプロセッサであり得る。コンピュータシステム１１０１はまた、メモリまたはメモリ位置１１１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶ユニット１１１５（例えば、ハードディスク）、１つ以上の他のシステムと通信するための通信インターフェース１１２０（例えば、ネットワークアダプタ）、ならびにキャッシュ(cache)、他のメモリ、データ記憶および／または電子ディスプレイアダプタのような周辺機器デバイス１１２５も含む。メモリ１１１０、記憶ユニット１１１５、インターフェース１１２０、および周辺機器デバイス１１２５は、マザーボードなどの通信バス（実線）を介してＣＰＵ１１０５と通信している。記憶ユニット１１１５は、データを記憶するためのデータ記憶ユニット（またはデータリポジトリ）であり得る。コンピュータシステム１１０１は、通信インターフェース１１２０を補助として、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）１１３０に作動式に結合することができる。ネットワーク１１３０は、あるケースでは、電気通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク１１３０は、１つ以上のコンピュータサーバーを含み得、これはクラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にする。ネットワーク１１３０は、あるケースでは、コンピュータシステム１１０１を補助として、ピア・ツー・ピア(peer-to-peer)ネットワークを実行することができ、これにより、コンピュータシステム１１０１に結合されたデバイスがクライアントまたはサーバーとして挙動することが可能になる。
ＣＰＵ１１０５は、一連の機械可読命令を実行することができ、これは、プログラムまたはソフトウェアで具体化され得る。命令は、メモリ１１１０などのメモリ位置に記憶され得る。命令は、ＣＰＵ１１０５に対して向けることができ、これは、その後に本開示の方法を実装するようにＣＰＵ１１０５をプログラムか、さもなくば構成することができる。ＣＰＵ１１０５によって実施される操作の例として、フェッチ、デコード、実行、およびライトバックが挙げられる。
ＣＰＵ１１０５は、集積回路などの回路の一部であり得る。システム１１０１の１つ以上の他の構成要素は、回路に含まれ得る。あるケースでは、回路は特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。
記憶ユニット１１１５は、ドライバ、ライブラリおよび保存されたプログラムなどのファイルを格納することができる。記憶ユニット１１１５は、ユーザーデータ、例えば、ユーザープリファレンスおよびユーザープログラムを格納することができる。コンピュータシステム１１０１は、あるケースでは、イントラネットまたはインターネットを介してコンピュータシステム１１０１と通信しているリモートサーバー上に配置されるなど、コンピュータシステム１１０１の外部にある１つ以上の付加的なデータ記憶ユニットを含み得る。
コンピュータシステム１１０１は、ネットワーク１１３０を介して１つ以上のリモートコンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム１１０１は、ユーザーのリモートコンピュータシステム（例えば、コンピュータシステム１１０１から送信されたサンプル分析の結果を受信して表示するアプリケーションがインストールされたスマートフォン）と通信することができる。リモートコンピュータシステムの例として、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートまたはタブレットＰＣ（例：Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ、Ａｎｄｒｏｉｄ対応デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、またはパーソナルデジタルアシスタントが挙げられる。ユーザーは、ネットワーク１１３０を介してコンピュータシステム１１０１にアクセスすることができる。
本明細書に記載の方法は、例えば、メモリ１１１０または電子記憶ユニット１１１５などのコンピュータシステム１１０１の電子記憶位置に記憶された機械（例えば、コンピュータプロセッサ）実行可能コードによって実装することができる。機械実行可能コードまたは機械可読コードは、ソフトウェアの形式で提供され得る。使用の間、コードはプロセッサ１１０５によって実行され得る。あるケースでは、コードは、記憶ユニット１１１５から取り出され、プロセッサ１１０５による即時アクセスのためにメモリ１１１０に記憶され得る。状況によっては、電子記憶ユニット１１１５があらかじめ排除され得、機械実行可能命令がメモリ１１１０に記憶される。
コードは、コードを実行するように適合されたプロセッサを有する機械で使用するために事前にコンパイルおよび構成するか、または実行時にコンパイルすることができる。コードは、コードをプリコンパイル済みまたはコンパイル済みの様式で実行できるように選択され得るプログラミング言語で提供され得る。
コンピュータシステム１１０１など、本明細書で提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングにおいて具体化することができる。テクノロジーのさまざまな態様は、通常、機械（またはプロセッサ）実行可能コードおよび／または機械可読媒体のタイプで実行または具体化される関連データの形式における「製品」または「製造品」と考えてもよい。機械実行可能なコードは、メモリ（例えば、読み取り専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクなどの電子記憶デバイスに記憶することができる。「記憶」タイプの媒体は、コンピュータ、プロセッサなどの有形メモリのいずれかまたはすべて、または、ソフトウェアプログラミングのためにいつでも非一時的なストレージを提供し得る様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどの有形メモリの関連モジュールを含み得る。ソフトウェアの全部または一部は、インターネットまたは他のさまざまな電気通信ネットワークを介して通信される場合がある。そのような通信は、例えば、１つのコンピュータまたはプロセッサから別のコンピュータへの、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのロードを可能にし得る。したがって、ソフトウェア要素を搭載する可能性のある別のタイプの媒体は、有線および光の固定電話ネットワーク、およびさまざまなエアリンクを介するローカルデバイス間の物理インターフェースを通して使用されるような、光、電気および電磁波を含む。線または無線リンク、光リンクなど、そのような波を運ぶ物理的要素も、ソフトウェアを搭載した媒体と考えることができる。本明細書で使用される場合、非一時的で有形の「記憶」媒体に限定されない限り、コンピュータまたは機械の「読み取り可能媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサに命令を提供することに関与する任意の媒体を指す。
ゆえに、コンピュータ実行可能コードなどの機械可読媒体は、多くの形態をとることができ、これらに限定されないが有形記憶媒体、搬送波媒体、または物理的伝送媒体を含む。揮発性記憶媒体は、例えば、図面に示されるデータベースなどを実装するために使用され得るような任意のコンピュータなどの記憶デバイスのいずれかなどの光または磁気ディスクを含む。揮発性記憶媒体は、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどの動的(dynamic)メモリを含む。有形伝送媒体は同軸ケーブルを含み；コンピュータシステム内のバスを含むワイヤを含む、銅線および光ファイバーである。搬送波伝送媒体は、電気信号もしくは電磁信号、または無線周波数（ＲＦ）および赤外線（ＩＲ）データ通信中に生成されるような音響波または光波の形をとることがある。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態は、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、その他の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤまたはＤＶＤ－ＲＯＭ、その他の光学媒体、パンチカード紙テープ、穴のパターンのあるその他の物理記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ－ＥＰＲＯＭ、その他のメモリチップまたはカートリッジ、データまたは命令を伝送する搬送波、そのような搬送波を伝送するケーブルまたはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび/またはデータを読み取ることができるその他の媒体を含む。これらの形態のコンピュータ可読媒体の多くは、実行のために１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスをプロセッサに搬送することに関与し得る。
コンピュータシステム１１０１は、例えば、これに限定されないが病原体統合プロファイルのグラフィック表示、病原体統合ブレークポイントのゲノム位置、病理の分類（例えば、疾患または癌のタイプおよび癌のレベル）、ならびに病理の分類に基づく予防措置の治療提案または推奨などのサンプル分析の結果を提供するためのユーザーインターフェース（ＵＩ）１１４０を含む電子ディスプレイ１１３５を含むか、またはそれと通信することができる。ＵＩの例として、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）およびＷＥＢベースのユーザーインターフェースが含まれるが、これらに限定はされない。
本開示の方法およびシステムは、１つ以上のアルゴリズムによって実装することができる。アルゴリズムは、中央処理装置ユニット１１０５による実行時にソフトウェアによって実装することができる。アルゴリズムは、例えば、サンプルからの核酸分子の配列決定、配列決定データの直接収集、配列決定データの分析、ブロックベースの変異パターン分析の実施、リスクの評価、またはリスクを示すレポートの生成を制御することができる。
あるケースでは、図２２に示されるように、サンプル１２０２は、ヒト対象などの対象１２０１から取得され得る。サンプル１２０２は、アッセイを実施するなど、本明細書に記載される１つ以上の方法に供され得る。あるケースでは、アッセイは、ハイブリダイゼーション、増幅、配列決定、ラベリング、後成的に塩基を修飾すること、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。方法からの１つ以上の結果をプロセッサ１２０４に入力することができる。サンプル同定、被験者識別、サンプルタイプ、参照または他の情報などの１つ以上の入力パラメーターをプロセッサ１２０４に入力することができる。アッセイからの１つ以上の測定基準(metrics)を、プロセッサが病理の分類（例えば診断）または治療の推奨事項などの結果を生成し得るように、プロセッサ１２０４に入力することができる。プロセッサは、結果、入力パラメーター、測定基準、参照、またはそれらの任意の組み合わせを、視覚的ディスプレイまたはグラフィカルユーザーインターフェースなどのディスプレイ１２０５に送信し得る。プロセッサ１２０４は、（ｉ）結果、入力パラメーター、測定基準、またはそれらの任意の組み合わせをサーバー１２０７に送信することができ、（ｉｉ）結果、入力パラメーター、測定基準、またはそれらの任意の組み合わせをサーバー１２０７から受信することができ、（iii）またはそれらの組み合わせができる。
本開示の態様は、ハードウェア（例えば、特定用途向け集積回路またはフィールドプログラマブルゲートアレイ）を使用して、および／またはモジュール式または統合方式で一般にプログラム可能なプロセッサを備えたコンピュータソフトウェアを使用して、制御ロジックの形態で実装することができる。本明細書で使用される場合、プロセッサは、シングルコアプロセッサ、同じ集積チップ上のマルチコアプロセッサ、または単一の回路基板上のまたはネットワーク化された複数の処理装置ユニットを含む。本明細書で提供される開示および教示に基づいて、当業者は、ハードウェア、およびハードウェアとソフトウェアとの組み合わせを使用して本明細書で説明される実施形態を実装する他の方法および／または方法を知り、真価を認めるであろう。
本出願において説明されているソフトウェアコンポーネントまたは機能はいずれも、Ｊａｖａ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ－Ｃ、Ｓｗｉｆｔ、または従来の手法やオブジェクト指向手法などを用いたＰｅｒｌやＰｙｔｈｏｎなどのスクリプト言語などの適切なコンピュータ言語を用いてプロセッサによって実行されるソフトウェアコードとして実装できる。ソフトウェアコードは、記憶および／または伝送のための一連の命令またはコマンドとしてコンピュータ可読媒体に記憶することができる。適切な非一時的なコンピュータ可読媒体は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、ハードドライブもしくはフロッピーディスクなどの磁気媒体、またはコンパクトディスク（ＣＤ）もしくはＤＶＤ（デジタル多用途ディスク）などの光学媒体、フラッシュメモリなどを含み得る。コンピュータ可読媒体は、そのような記憶デバイスまたは伝送デバイスの任意の組み合わせであり得る。
このようなプログラムは、インターネットを含むさまざまなプロトコルに準拠した有線、光および／または無線ネットワークを介した伝送に適合した搬送信号を使用してエンコードおよび伝送することもできる。したがって、コンピュータ可読媒体は、そのようなプログラムでエンコードされたデータ信号を使用して作成することができる。プログラムコードでエンコードされたコンピュータ可読媒体は、互換性のあるデバイスと一緒にパッケージ化するか、他のデバイスとは別に提供することができる（例えば、インターネットダウンロードを介して）。そのようなコンピュータ可読媒体はいずれも、単一のコンピュータ製品（例えば、ハードドライブ、ＣＤまたはコンピュータシステム全体）上またはその中に存在することができ、およびシステムまたはネットワーク内の異なるコンピュータ製品上またはその中に存在することができる。コンピュータシステムは、本明細書に記載の結果のいずれかをユーザーに提供するためのモニター、プリンター、または他の適切なディスプレイを含み得る。
本明細書に記載の方法のいずれも、ステップを実施するように構成され得る１つ以上のプロセッサを含むコンピュータシステムを用いて全体的または部分的に実施することができる。したがって、実施形態は、異なる構成要素が各々のステップまたは各々のステップのグループを実施する、本明細書に記載の方法のいずれかのステップを実施するように構成されたコンピュータシステムに向けることができる。番号付きのステップとして提示されているが、本明細書の方法のステップは、同時にまたは異なる順序で実施することができる。さらに、これらのステップの一部は、他の方法の他のステップの一部と共に使用できる。また、ステップのすべてまたは一部を任意に選ぶことができる。さらに、任意の方法の任意のステップは、モジュール、ユニット、回路またはこれらのステップを実施するための他のアプローチによって実施することができる。
他の実施態様
本明細書で使用されるセクション見出しは、組織化の目的のみであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
本明細書で使用されるセクション見出しは、組織化の目的のみであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、主題、および配列決定技術に限定されず、したがって、変化し得ることが理解されたい。また、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明することを目的としており、本明細書で説明される方法および組成物の範囲を限定することを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。本開示のいくつかの実施形態が本明細書に示され、説明されてきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。多くの変形、変更および置換が、本開示から逸脱することなく、当業者に発生するであろう。本開示を実施する際に、本明細書に記載の本開示の実施形態に対する様々な代替案を使用できることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの同等物は、それによってカバーされることが意図されている。
実例のための例示的なアプリケーションを参照し、いくつかの態様が説明される。特に明記しない限り、任意の実施形態を他の任意の実施形態と組み合わせることができる。本明細書に記載されている特徴の完全な理解を提供するために、多数の特定の詳細、関係、および方法が示されていることを理解されたい。しかしながら、当業者は、本明細書に記載の特徴が、１つ以上の特定の詳細がなくても、または他の方法によって実施できることを容易に認識するであろう。一部の行為は異なる順序で、および/または他の行為または事象と同時に発生する可能性があるため、本明細書に記載されている特徴は、行為または事象の図示された順序によって限定されない。さらに、本明細書に記載の特徴に従った方法論を実施するために、図示されたすべての行為または事象が必要とされるわけではない。
以下の実施例は、本開示のいくつかの実施形態をさらに説明するために提供されているが、開示の範囲を限定することを意図するものではない；それらの例示的な性質により、当業者に知られている他の手順、方法論または技術を代替的に使用してもよいことが理解されるであろう。
［実施例１． ４年間で２０，０００人を超える被験者のコホートでのＮＰＣスクリーニング］
この実施例は、約４年間で２０，０００人を超える被験者のコホートで実施された大規模なスクリーニング研究について説明する。図１は、この研究の設計の図を示す。スクリーニングの最初のラウンドでは、血漿ＥＢＶ ＤＮＡ分析を用いて、４０～６２歳の２０，０００人以上の男性がＮＰＣについてスクリーニングした。検出可能血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する被験者を、中央値４週間後に第２の血液サンプルセットで再テストした。この取決めは、ＮＰＣ患者と、ＮＰＣは有さないが検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する患者とを識別することを目的とした。以前の研究では、ＮＰＣのない被験者における血漿ＥＢＶ ＤＮＡの存在は、通常、一時的の現象であることが示された。これら個人の３分の２では、血漿ＥＢＶ ＤＮＡは中央値２週間後に検出できなくなる。血漿ＥＢＶ ＤＮＡの結果が持続的に陽性である被験者を、ＮＰＣの存在を確認または除外するために、鼻内視鏡検査および鼻咽頭の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）でさらに調査された。この取決めに基づいて、３４例のＮＰＣが同定した。
この実施例は、約４年間で２０，０００人を超える被験者のコホートで実施された大規模なスクリーニング研究について説明する。図１は、この研究の設計の図を示す。スクリーニングの最初のラウンドでは、血漿ＥＢＶ ＤＮＡ分析を用いて、４０～６２歳の２０，０００人以上の男性がＮＰＣについてスクリーニングした。検出可能血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する被験者を、中央値４週間後に第２の血液サンプルセットで再テストした。この取決めは、ＮＰＣ患者と、ＮＰＣは有さないが検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する患者とを識別することを目的とした。以前の研究では、ＮＰＣのない被験者における血漿ＥＢＶ ＤＮＡの存在は、通常、一時的の現象であることが示された。これら個人の３分の２では、血漿ＥＢＶ ＤＮＡは中央値２週間後に検出できなくなる。血漿ＥＢＶ ＤＮＡの結果が持続的に陽性である被験者を、ＮＰＣの存在を確認または除外するために、鼻内視鏡検査および鼻咽頭の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）でさらに調査された。この取決めに基づいて、３４例のＮＰＣが同定した。
その後、コホートでのＮＰＣスクリーニングの別のラウンド（第２ラウンド）を、スクリーニングの最初のラウンドから中央値４年後に実施した。ＮＰＣスクリーニングの第２ラウンドでは、テスト結果が陽性だった被験者を、スクリーニングの第１ラウンドと同様に約４週間後に再テストする。４週間にわたる２回の連続的なテストで陽性の結果であった被験者を、鼻内視鏡検査およびＭＲＩでさらに調査する。スクリーニングの第２ラウンドを２０１７年に開始した。合計８，３３５人の被験者が２０１８年９月１５日までに第２ラウンドのスクリーニングを完了した。７８４人（９．４％）の被験者が血漿ＥＢＶ ＤＮＡに陽性であった。４週間後の再テストでは、２３０人（２．７％）の被験者が、依然として検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有していた。表１は、ＮＰＣスクリーニングの両方のラウンドにおけるテスト結果をまとめたものである。
表1に示すように、第２ラウンドのＮＰＣスクリーニングで血漿ＥＢＶ ＤＮＡが検出される確率は、第１ラウンドのスクリーニングでの血漿ＥＢＶ ＤＮＡのステータスと相関していた。スクリーニングの第１ラウンドで陰性、一時的に陽性、および持続的に陽性の血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する被験者は、第２ラウンドのスクリーニングの最初の分析で検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する確率が８％、２１％、および５７％であった。さらに、４週間で血漿ＥＢＶ ＤＮＡが持続的に陽性になる機会は、３つのグループを通して２％から２５％に徐々に増加した。
本明細書に記載のスクリーニングによって同定されたＮＰＣ患者は、ＮＰＣスクリーニングを受けなかった過去のコホートの患者よりもはるかに早い段階の分布を示した。あった。早期疾患（ステージＩおよびＩＩ）のパーセンテージはそれぞれ７０％および２０％であった。この病期分布の変化により、ハザード比が０．１の患者の無増悪生存期間が大幅に改善された。表２に要約されているのは、第１および第２ラウンドのスクリーニングの両方におけるＮＰＣ症例の病期分布である。第２ラウンドで８，３３５人の被験者をスクリーニングした後、１３人の新しいＮＰＣの症例を同定した。早期疾患を有する患者のパーセンテージは、第１および第２ラウンドのスクリーニングでそれぞれ７１％および６９％であった。早期疾患の患者のパーセンテージに有意差はなかった（Ｐ＝０．９３、カイ二乗検定）。
表３に要約されているように、第１ラウンドのスクリーニングで一時的および持続的に検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する被験者は、第1ラウンドで血漿ＥＢＶ ＤＮＡが検出されなかったものと比較して、第1ラウンドの４年後に実施された第２ラウンドのスクリーニングでＮＰＣが検出されるリスクがより高かった。これら２つのグループの相対リスク値はそれぞれ７．２および１９．７である。
これらの結果は、血漿ＥＢＶ ＤＮＡ分析が、ＮＰＣ保有性の現在の状態のスクリーニングだけでなく、将来臨床的に観察可能なＮＰＣのリスクを予測するのにも役立つことを示唆している。この知見の実用的な１つの用途は、以前の例でスクリーニングされた被験者の血漿ＥＢＶ ＤＮＡ状態に基づいてスクリーニングを繰り返す間隔を調整できることである。例えば、ベースラインで血漿ＥＢＶ ＤＮＡが検出可能であるが、ＮＰＣが同定できない被験者は、血漿ＥＢＶ ＤＮＡが検出できない被験者と比較して、より短い間隔で再スクリーニングできる。また、実例として、スクリーニングを繰り返す間隔は、検出不可能、一時的に検出可能、および持続的に検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する被験者について、各々４年、２年および１年であり得る。
［実施例２．血漿ＥＢＶ ＤＮＡの検出可能性に基づくＮＰＣスクリーニング］
この実施例は、被験者の血漿中のＥＢＶ ＤＮＡの検出可能性に基づいて被験者用に設計されたＮＰＣスクリーニングレジメンについて説明する。図２は、本明細書に記載されるレジメンの概略図を示す。
この実施例は、被験者の血漿中のＥＢＶ ＤＮＡの検出可能性に基づいて被験者用に設計されたＮＰＣスクリーニングレジメンについて説明する。図２は、本明細書に記載されるレジメンの概略図を示す。
レジメンによると、スクリーニングの初期の例で血漿ＥＢＶ ＤＮＡが検出できない被験者は、今後４年間でＥＢＶ ＤＮＡが検出できない被験者のＮＰＣのリスクが比較的低いことから、４年後に再スクリーニングされる。次のスクリーニングで血漿ＥＢＶ ＤＮＡが陰性の場合、次のスクリーニングの間隔は４年である。ただし、1回のスクリーニングでＥＢＶ ＤＮＡが検出されたが、ＮＰＣが検出されなかった場合は、次のスクリーニングが１年後に調整される。血漿ＥＢＶ ＤＮＡが４年間陰性のままである場合、スクリーニングの間隔は４年に戻される。特定のスクリーニングプログラムに用いられる実際の時間間隔も、医療経済上の考慮事項（スクリーニングの費用など）、被験者の嗜好性（例えば、スクリーニング間隔より頻繁であることが、特定の被験者のライフスタイルにとってより混乱を生じさせる場合）および他の臨床パラメーター（例えば、個人の遺伝子型、ＮＰＣの家族歴、食歴、民族的起源（例えば広東人））に応じて調整される。
［実施例３．無細胞ＥＢＶ ＤＮＡ分子の変異パターン分析］
この実施例において、捕捉濃縮を伴うターゲットシーケンシングを用いて、ＮＰＣ被験者、検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する非ＮＰＣ被験者、およびプレＮＰＣ被験者の循環中の無細胞ウィルスＤＮＡ分子を分析した（詳細は次のセクションで）。捕捉プローブは、ＥＢＶゲノム全体をカバーするように設計された。同分析において、約３，０００のヒト一塩基多型（ＳＮＰ）サイトおよびヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ＳＮＰをターゲットとするプローブも含まれていた。
この実施例において、捕捉濃縮を伴うターゲットシーケンシングを用いて、ＮＰＣ被験者、検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する非ＮＰＣ被験者、およびプレＮＰＣ被験者の循環中の無細胞ウィルスＤＮＡ分子を分析した（詳細は次のセクションで）。捕捉プローブは、ＥＢＶゲノム全体をカバーするように設計された。同分析において、約３，０００のヒト一塩基多型（ＳＮＰ）サイトおよびヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ＳＮＰをターゲットとするプローブも含まれていた。
この実施例において、１３人のＮＰＣ患者および１６人の検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する非ＮＰＣ被験者の血漿ＥＢＶ ＤＮＡを分析した。１３人のＮＰＣ患者は症候性であり、プリンスオブウェールズ(Prince of Wales)病院の臨床腫瘍学部か、もしくは耳鼻咽喉科のいずれかから採用した。１６人の非ＮＰＣ被験者は、実施例1で説明された２０，０００人を超える被験者のＮＰＣスクリーニングコホートからのものであった。
この分析では、特別に設計された捕捉プローブによる捕捉濃縮を伴うターゲットシーケンシングを使用した。分析した各血漿サンプルについて、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄＫｉｔを用いて４ｍＬの血漿からＤＮＡを抽出した。いずれのケースでも、抽出されたすべてのＤＮＡは、ＴｒｕＳｅｑ Ｎａｎｏ ＤＮＡライブラリ調製キット（Illumina社）を用いたシーケンスライブラリの調製に使用した。バーコーディングは、特殊な分子識別子（ＵＭＩ）シーケンスを組み込んだデュアルインデックスシステム（ｘＧｅｎデュアルインデックスＵＭＩアダプター、Integrated DNA Technologies社）を用いて実施した。８サイクルのＰＣＲ増幅は、ＴｒｕＳｅｑ Ｎａｎｏ Ｋｉｔ（Illumina社）を用いて、アダプターをライゲーションしたサンプルで実施した。次いで、増幅産物は、上述したウィルスおよびヒトゲノム領域をカバーするカスタム設計のプローブを用いて、ｍｙＢａｉｔカスタムキャプチャーパネルシステム（Arbor Biosciences社）によって捕捉した。ターゲットの捕捉後、捕捉された産物は１４サイクルのＰＣＲによって濃縮し、ＤＮＡライブラリを生成した。ＤＮＡライブラリはＮｅｘｔＳｅｑプラットフォーム（Illumina社）で配列決定した。配列決定の運転ごとに、ペアエンドモードを使用して、特有のサンプルバーコードを有する１０のサンプルを配列決定した。各ＤＮＡフラグメントは、２つの末端のそれぞれから配列決定された７１のヌクレオチドである。配列決定後、シーケンスリードは、ヒトゲノム全体（ｈｇ１９）、ＥＢＶゲノム全体（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＪ５０７７９９．２）、ＨＢＶゲノム全体、およびＨＰＶゲノム全体からなる人工的に組み合わされた参照配列にマッピングする。アラインメントはＳＯＡＰ２（Bioinformatics 2009; 25：1966-7）を使用して行い、６００ｂｐ以下のインサートサイズで正しい方向に読み取られるたびに最大２つのミスマッチを許容した。組み合わされたゲノム配列の特有の位置にマッピングしたシーケンスリードは、ダウンストリーム分析に使用する。全く同じ特有の分子識別子を有するすべての重複フラグメントは、フィルタリングされる。
アラインメントの結果に基づいて、配列決定されたリードとＥＢＶ参照ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＪ５０７７９９.２）との間で、一塩基多型（ＳＮＶ）を含むがこれに限定されないヌクレオチドの相違を同定した。１３人のＮＰＣ被験者からの４４のサンプル、検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する１６人の非ＮＰＣ被験者、および４人のプレＮＰＣ被験者のうち、中央値１１１６ ＳＮＶ（四分位範囲（ＩＱＲ）：９０２－１２１６）を同定した。これらの血漿サンプルでは、ＥＢＶゲノムのいくつかのヌクレオチド位置で２つの異なる対立遺伝子を観察した。この観察結果は、シーケンスエラーまたは腫瘍の不均一性の存在が原因であり得る。わずか２６の位置の中央値（ＩＱＲ：２０－３５）は、血漿ＥＢＶ ＤＮＡに２以上の対立遺伝子を有した。
図３に示される系統樹分析では、ＮＰＣ被験者は共にクラスター化し、非ＮＰＣ被験者から分離した。これらの結果は、ＮＰＣと非ＮＰＣとの被験者間で異なるＥＢＶ変異体プロファイルがあることを示唆した。ゆえに、血漿ＥＢＶ ＤＮＡのＥＢＶ変異体プロファイル分析を用いることで、スクリーニングのコンテキストでＮＰＣと非ＮＰＣとの被験者を識別することができる。３人の非ＮＰＣ被験者（ＡＣ１０６、ＡＰ０８０、およびＦＦ１５９）は、４週間間隔で収集された、２つの連続的に収集、分析されたサンプルを有していた。同じ個人からの２つのサンプルを一緒にクラスター化し、非常に類似した変異体を共有していることを示した。
系統樹分析はまた、Hui et al（（Hui et al. Int J Cancer 2019, doi.org / 10.1002 / ijc.32049）による研究で報告された２９の変異体を除外したＥＢＶ変異体に基づき、１３人のＮＰＣ患者および検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する１６人の非ＮＰＣ被験者の同一のグループでも実施した。図４に示すように、ＮＰＣ被験者もまた共にクラスター化し、非ＮＰＣ被験者から分離した。
スクリーニングの第１ラウンド（実施例１に記載されている通り）で血漿ＥＢＶ ＤＮＡに対して持続的に陽性であったが、内視鏡検査およびＭＲＩで検出可能なＮＰＣを有さなかった４人の被験者は、その後、ＮＰＣを有すると診断された。彼らのすべて（ＢＢ０９６、ＤＮ０５４、ＦＫ０１５およびＨＢ１２１）は、スクリーニングの第１ラウンドの３年後にＮＰＣを有していると診断された。彼らすべては、耳鼻咽喉科クリニックでの追跡中のスクリーニングの第１ラウンドの１年後に収集された１つの追加血漿サンプルを有していた。これら４人の被験者のそれぞれについて、スクリーニングの第１ラウンドおよび１年後に収集された２つのサンプルをＥＢＶ変異体について分析した。図５に示すように、プレＮＰＣの被験者からのサンプルはＮＰＣサンプルと共にクラスター化し、ＮＰＣに関連するＥＢＶ変異体は、実際に癌が発生する以前に存在することを示した。これは、ＮＰＣ関連のＥＢＶ変異体を有する個人は将来、ＮＰＣを発症するリスクが高いことを示唆している。系統樹分析はまた、Hui et al（（Hui et al. Int J Cancer 2019, doi.org / 10.1002 / ijc.32049）による研究で報告された２９の変異体を除外したＥＢＶ変異体に基づき、ＮＰＣ患者、非ＮＰＣ被験者およびプレＮＰＣ患者の同一のグループでも実施した。図６に示すように、プレＮＰＣの被験者からのサンプルをやはりＮＰＣサンプルと共にクラスター化し、ＥＢＶ変異体の分析により、将来のＮＰＣのリスクを予測できることをさらに示唆していた。
［実施例４．ブロックベースの変異パターン分析］
この実施例は、例示的なブロックベースのバリアントパターン分析アプローチの作動原理および、実施例３で説明したサンプル内のＥＢＶ変異体パターンの分析へのその適用を説明する。
この実施例は、例示的なブロックベースのバリアントパターン分析アプローチの作動原理および、実施例３で説明したサンプル内のＥＢＶ変異体パターンの分析へのその適用を説明する。
図７は、ブロックベースの変異パターン分析の原理を図示している。ブロックベースの分析を使用して、さまざまなサンプルの血漿ＥＢＶ ＤＮＡ配列決定から導き出されたＥＢＶ ＤＮＡ変異パターンの、参照ゲノムに対する類似性を評価し、またここで、公開データベース（Kwok et al. J Virol2014; 88：10662-72、Li et al. Nat Comm 2017; 8：14121）で利用可能なＮＰＣ配列決定データが参照として使用される。ブロックベースの分析では、ＥＢＶゲノムをサイズが５００ｂｐのビン（合計３４４ビン）に分割し、各ビンの変異パターンと参照セットの２４個のＮＰＣサンプルとの類似性を比較した。例として、１つの特定のビン内に８つの変異サイトがある場合、テストサンプルのこのビン内のこれらのサイトの対立遺伝子を分析し、２４の参照サンプルの同じサイトの対立遺伝子と比較する。類似性指数は、参照サンプルとまったく同じ対立遺伝子を有する割合に基づいて導き出される。例えば、テストサンプルが１つの参照サンプルについて８つの変異サイトのうち７つにまったく同じ対立遺伝子を有する場合、そのビンの類似性指数はその参照サンプルについて７／８になる。また、２４の参照サンプルと比較してみると、テストサンプルのそのビンには２４の類似性指数がある。そのビンの２４の類似性指数に基づいて、参照サンプルについて変異パターンの全体的な類似性を表すビンスコアを計算する。例えば、類似性指数のカットオフを０．９に設定する場合、ビンスコアは、カットオフよりも高い指数を有するビンの割合をカウントする。ゆえに、０．９を超えるのが２４の類似性指数のうち２つしかない場合、ビンスコアは２／２４である。ビンスコアが高いほど、テストサンプルの変異パターンが参照サンプルセットに類似していく。
図８は、１３のＮＰＣ、１６の非ＮＰＣおよび４のプレＮＰＣサンプルのＥＢＶ ＤＮＡ変異パターンのブロックベースの分析を示す。４人のプレＮＰＣ被験者のそれぞれについて、２つの時点からのサンプルを分析したため、合計８つの被験体を得た。ＥＢＶゲノムの３４４ビンのビンスコアは、これらのサンプルから導き出した。これらサンプルのビンスコアに基づいて、教師なし(unsupervised)クラスタリング分析を実施した。ＮＰＣサンプル（黒）を共にクラスター化し、および非ＮＰＣサンプル（ドットでマークされた）を共にクラスター化した。プレＮＰＣの被験者のＥＢＶ変異プロファイルを、ＮＰＣ被験者のプロファイルと一緒にクラスター化した。とりわけ、これら４人のプレＮＰＣの被験者の変異プロファイルについては、ＮＰＣ発症の数年前に収集されたベースラインサンプルの分析を通じて取得した。
図９は、Hui et al（（Hui et al. Int J Cancer 2019, doi.org / 10.1002 / ijc.32049）による研究で報告された２９の変異体を除外したＥＢＶ変異体に基づき、１３人のＮＰＣ、１６人の非ＮＰＣおよび４人のプレＮＰＣ被験者の同一のグループのＥＢＶ ＤＮＡ変異体のブロックベースの分析を示す。同様に、ＮＰＣサンプル（黒）のクラスタリングを観察した。また、プレＮＰＣ被験者のＥＢＶ変異体プロファイルを、ＮＰＣ被験者のプロファイルと一緒にクラスター化した。プレＮＰＣのサンプルおよびＮＰＣサンプルのクラスタリングは、変異分析がＮＰＣの将来的な発症を予測できることを示す。要約すると、実施例３および実施例４のデータによって、募集時にＮＰＣを有さなかったが後に癌を発症した被験者は、他のＮＰＣ患者からのものと同様のベースライン血液サンプルにおいてＥＢＶ変異パターンを有したことが明らかとなる。
［実施例５．数学的モデルを用いたＮＰＣのリスク予測］
この実施例は、変異パターンの分析を用いて検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する被験者の将来的なＮＰＣ発症のリスクを予測するための分類モデルの構築、および該分類モデルを用いたテスト結果を説明する。
この実施例は、変異パターンの分析を用いて検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する被験者の将来的なＮＰＣ発症のリスクを予測するための分類モデルの構築、および該分類モデルを用いたテスト結果を説明する。
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）アルゴリズムを使用して、実施例４で説明したように、ＮＰＣを有さない１８人の被験者および８人のＮＰＣ患者のトレーニングデータセットを用いた分類子を構築した。テストデータセットは、５人のＮＰＣ患者、ＮＰＣを有さない５人の被験者、および実施例４で説明されたように、サンプル収集時に内視鏡検査およびＭＲＩによって検出可能なＮＰＣがなかったが、その後ＮＰＣ（プレＮＰＣとラベル付け）と診断された４人の被験者から収集された８つのサンプルからなった。
ＳＶＭ分析の方法は次のとおりである：
ｎ個のサンプルを含むトレーニングデータセットが与えられたとき：
（Ｍ１, Ｙ１）, …, （Ｍｎ, Ｙｎ）
ここで、ＹｉはサンプルｉのＮＰＣステータスを示す。Ｙｉは、ＮＰＣ患者からのサンプルの場合は１、またはＮＰＣを有さない被験者からのサンプルの場合は－１である；Ｍｉは、サンプルｉのウィルス変異パターンを含むｐ次元ベクトルである。例えば、ＭｉはＮＰＣに関連した２９の変異サイトのような一連の変異サイトとなり得る。あるいは、Ｍｉは、ＮＰＣを有することが既知である被験者に存在する参照ＥＢＶ変異体に関して、一連のブロックベースの変異体類似性スコア（たとえば、５００ｂｐの重複しないウィンドウ）となり得る。
ｎ個のサンプルを含むトレーニングデータセットが与えられたとき：
（Ｍ１, Ｙ１）, …, （Ｍｎ, Ｙｎ）
ここで、ＹｉはサンプルｉのＮＰＣステータスを示す。Ｙｉは、ＮＰＣ患者からのサンプルの場合は１、またはＮＰＣを有さない被験者からのサンプルの場合は－１である；Ｍｉは、サンプルｉのウィルス変異パターンを含むｐ次元ベクトルである。例えば、ＭｉはＮＰＣに関連した２９の変異サイトのような一連の変異サイトとなり得る。あるいは、Ｍｉは、ＮＰＣを有することが既知である被験者に存在する参照ＥＢＶ変異体に関して、一連のブロックベースの変異体類似性スコア（たとえば、５００ｂｐの重複しないウィンドウ）となり得る。
以下を満たす係数のセット（ｐ次元ベクトルを有するＷ）を求めることにより、トレーニングデータセット内で非ＮＰＣグループおよびＮＰＣグループを可能な限り正確に分離する「超平面」を同定できる：
基準１：
Ｗ・Ｍｉ－ｂ≧１（ＮＰＣグループの被験者について）
および
基準２：
Ｗ・Ｍｉ－ｂ≦１（非ＮＰＣグループの被験者について）
ここで、Ｗは、超平面を決定する係数のｐ次元ベクトルであり；Ｍは、ｐ個の変異体（またはブロックベースの類似度スコア）およびｎ個のサンプルを有する行列（ｐ ｘ ｎ次元）であり；ｂは切片である。
基準１：
Ｗ・Ｍｉ－ｂ≧１（ＮＰＣグループの被験者について）
および
基準２：
Ｗ・Ｍｉ－ｂ≦１（非ＮＰＣグループの被験者について）
ここで、Ｗは、超平面を決定する係数のｐ次元ベクトルであり；Ｍは、ｐ個の変異体（またはブロックベースの類似度スコア）およびｎ個のサンプルを有する行列（ｐ ｘ ｎ次元）であり；ｂは切片である。
２つの基準（つまり基準１および２）は、次のように記述することもできる：
Ｙｉ（Ｗ ＊ Ｍｉ－ｂ）≧１（基準３）
ここで、Ｙｉは－１（非ＮＰＣ）または１（ＮＰＣ）のいずれかである。
Ｙｉ（Ｗ ＊ Ｍｉ－ｂ）≧１（基準３）
ここで、Ｙｉは－１（非ＮＰＣ）または１（ＮＰＣ）のいずれかである。
基準１と２との間のマージン距離（Ｄ）は：
Ｄは、基準３に従って
最小化することによって最大化される。
この原理に基づいて、分類子のパラメーター（Ｗおよびｂ）を決定した。次いで、トレーニングされたパラメーター（Ｗおよびｂ）を用いて、各テストサンプルのＮＰＣ
リスクスコアを計算した。
リスクスコアを計算した。
図１０Ａは、ブロックベースの変異分析を用いた全ＥＢＶ変異体の分析に基づいてトレーニングされた分類子を使用して計算されたＮＰＣリスクスコアを示す。この分析では、実施例４で説明したように、ビンスコアを計算するためにＥＢＶゲノムを５００ｂｐの３４４ブロックに分割した。ビンスコアは、機械学習の特徴と見なされた。ＮＰＣサンプルのＮＰＣリスクスコアは、非ＮＰＣ被験者から収集されたサンプルのスコアよりも有意に高かった（平均ＮＰＣリスクスコア：０．１５対０．５３、ｐ値＜０．０１、スチューデントのｔ検定）。同様に、ＮＰＣリスクスコアは、ＮＰＣを有さない被験者と比較して、プレＮＰＣ被験者から収集されたサンプルで有意に高かった（平均リスクスコア：０．５８対０．１５、ｐ値＜０．０１、スチューデントのｔ検定）。０．３２のカットオフを使用して、ＮＰＣ患者およびプレＮＰＣ被験者からのサンプルを、１００％の感度および１００％の特異性でＮＰＣを有さないサンプルと識別することができた。
図１０Ｂは、Hui et al（（Hui et al. Int J Cancer 2019, doi.org / 10.1002 / ijc.32049）による研究で報告された２９の変異体の分析に基づいてトレーニングされた分類子を使用して計算されたＮＰＣリスクスコアを示す。ＮＰＣサンプルのＮＰＣリスクスコアは、非ＮＰＣ被験者から収集されたサンプルのスコアよりも有意に高かった（平均ＮＰＣリスクスコア：０．８９対０．１８、ｐ値＜０．０１、スチューデントのｔ検定）。同様に、ＮＰＣリスクスコアは、ＮＰＣを有さない被験者と比較して、プレＮＰＣ被験者から収集されたサンプルで有意に高かった（平均リスクスコア：０．５７対０．１８、ｐ値＜０．０２、スチューデントのｔ検定）。０．６のカットオフを使用して、ＮＰＣ患者およびプレＮＰＣ被験者からのサンプルを、７４％の感度および１００％の特異性でＮＰＣを有さないサンプルと識別することができた。
図１０Ｃは、Hui et al（（Hui et al. Int J Cancer 2019, doi.org / 10.1002 / ijc.32049）によってＮＰＣに関連すると以前に報告された２９のバリアントを除く、ブロックベースの変異分析を用いた全ＥＢＶ変異体の分析に基づいてトレーニングされた分類子を使用して計算されたＮＰＣリスクスコアを示す。ＮＰＣサンプルのＮＰＣリスクスコアは、非ＮＰＣ被験者から収集されたサンプルのスコアよりも有意に高かった（平均ＮＰＣリスクスコア：０．５８対０．１５、ｐ値＜０．０１、スチューデントのｔ検定）。同様に、ＮＰＣリスクスコアは、ＮＰＣを有さない被験者と比較して、プレＮＰＣ被験者から収集されたサンプルで有意に高かった（平均リスクスコア：０．５３対０．１５、ｐ値＜０．０１、スチューデントのｔ検定）。０．３１のカットオフを使用して、ＮＰＣ患者およびその後ＮＰＣを発症した患者からのサンプルを、１００％の感度および１００％の特異性でＮＰＣを有さないサンプルと識別することができた。これらの結果は、以前に報告された２９のＥＢＶ変異体を分析から除外しても、この分析の精度に悪影響を及ぼさないことを示している。
［実施例６．バイサルファイトシーケンシングによる血漿ＥＢＶ ＤＮＡのメチル化状態の分析］
この実施例は、血漿ＥＢＶ ＤＮＡのメチル化状態に基づいて、ＮＰＣ患者および検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する非ＮＰＣ被験者を識別するためのバイサルファイトシーケンシングの使用を示す。
この実施例は、血漿ＥＢＶ ＤＮＡのメチル化状態に基づいて、ＮＰＣ患者および検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する非ＮＰＣ被験者を識別するためのバイサルファイトシーケンシングの使用を示す。
ＮＰＣ患者およびＮＰＣを有さない被験者の血漿中のＥＢＶ ＤＮＡのメチル化レベルを、バイサルファイトシーケンシングを使用して決定した。バイサルファイト変換は、メチル化されていないシトシンをウラシルに変化させることができる。メチル化されたシトシンは、バイサルファイトによって変化できず、シトシンとして残ることができる。配列決定中に、ウラシルはチミンとして決定することができる。配列決定後、シトシンがチミンに変化しているかどうかをチェックすることにより、任意のＣｐＧジヌクレオチドコンテキストでのシトシンのメチル化状態を決定できる。
血漿ＥＢＶ ＤＮＡのメチル化レベルを、１０人のＮＰＣ患者および癌ではないが血漿中に検出可能なＥＢＶ ＤＮＡを有する４０人の被験者（非ＮＰＣ被験者）で決定した。４０人の非ＮＰＣ被験者については、４週間後にそれぞれから別の血液サンプルを収集した。彼らのうち２０人は、血漿ＥＢＶ ＤＮＡに対して陰性になり、彼らは一時的に陽性の血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有するとラベルされる。彼らのうち２０人は、血漿ＥＢＶ ＤＮＡに対して陽性のままであり、彼らは持続的に陽性の血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有するとラベルされる。
図１１に示すように、ＥＢＶ ＤＮＡメチル化レベルは、一時的に陽性の血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する非癌被験者（ｐ値＜０．０１、スチューデントのｔ検定）および持続的に陽性の血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する非癌被験者（ｐ値＜０．０１、スチューデントのｔ検定）と比較して、ＮＰＣ患者で有意に高かった。これらの結果は、血漿ＥＢＶ ＤＮＡのメチル化の分析が、ＮＰＣの患者と、ＮＰＣを有さないが検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する被験者とを識別するのに役立ち得ることを示唆している。
［実施例７．メチル化感受性制限酵素を用いた血漿ＥＢＶ ＤＮＡのメチル化状態の分析］
この実施例は、ＮＰＣ患者およびＮＰＣを有さないが検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する被験者の識別のための血漿ＥＢＶ ＤＮＡのメチル化感受性制限酵素分析の使用を実証する、インシリコシミュレーション実験を説明する。
この実施例は、ＮＰＣ患者およびＮＰＣを有さないが検出可能な血漿ＥＢＶ ＤＮＡを有する被験者の識別のための血漿ＥＢＶ ＤＮＡのメチル化感受性制限酵素分析の使用を実証する、インシリコシミュレーション実験を説明する。
血漿ＤＮＡのバイサルファイトシーケンシングを、非ＮＰＣ被験者およびＮＰＣ患者からのサンプルにより実施した。２対象の血漿ＤＮＡ中において３４７，５１６および６，２７１，０１２ ＥＢＶ ＤＮＡフラグメントがそれぞれ得られた。それらの血漿ＥＢＶ ＤＮＡのメチル化レベルは、各々４８．９％および８６．３％であった。血漿ＥＢＶ ＤＮＡ分子の約半分が、少なくとも１つの「ＣＣＧＧ」モチーフを含有することが決定された。
血漿ＥＢＶ ＤＮＡの制限酵素消化をシミュレートするために、バイサルファイトシーケンシングの結果から推測される「ＣＣＧＧ」シーケンスコンテキストでのメチル化状態に応じて、血漿ＥＢＶ ＤＮＡ分子のインシリコ消化を実施した。したがって、図１４に示すように、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩによるインシリコ消化がある場合とない場合の血漿ＥＢＶ ＤＮＡのシミュレートされたサイズプロファイルが得られた。酵素消化がない場合、非ＮＰＣ被験者の血漿ＥＢＶ ＤＮＡのサイズ分布は、ＮＰＣ被験者のそれの左側にあり、これは、サイズ分布が非ＮＰＣ被験者の方が短かったことを示している。フラグメントサイズのこの違いは、酵素消化なしと比較して酵素消化ありの非ＮＰＣ被験者では、５０ｂｐ未満の短いＤＮＡの存在量が有意に増加したという点において、酵素消化ありのサイズ分布プロファイルでも観察された。ＮＰＣ患者については、５０ｂｐ未満のＤＮＡ分子の割合は、酵素消化があるサンプルおよびないサンプルで、各々５．８７％および０．８４％であった。ただし、非ＮＰＣ被験者については、５０ｂｐ未満のＤＮＡ分子の割合は、酵素消化があるサンプルおよびないサンプルで、各々２２．２４％および４．９９％であった。酵素消化における５０ｂｐ未満のＤＮＡの割合の増加は、ＮＰＣ患者および非ＮＰＣ被験者で各々１７．２％および５．０％であった。図１５は、ＮＰＣ患者および非ＮＰＣ被験者についてのメチル化感受性制限酵素消化がある場合とない場合の血漿ＥＢＶ ＤＮＡの累積サイズプロファイルを示している。酵素消化の程度の違いは、サイズに対する累積度数曲線を用いるとより簡単に理解できる。酵素消化がある場合とない場合との２つの曲線間のギャップは、消化の程度を反映している。ギャップが大きいほど、血漿ＥＢＶ ＤＮＡに対して行われる酵素消化の程度が大きくなり、これは、血漿ＥＢＶ ＤＮＡのメチル化レベルが低いことを示している。図に示すように、ＮＰＣ患者と比較して非ＮＰＣ被験者の方が、より大きなギャップであった。ＮＰＣ患者および非ＮＰＣ被験者について、酵素消化なしと酵素消化ありとの曲線間の最大距離は各々８．１および１８．３であり；ＮＰＣ患者および非ＮＰＣ被験者について、２つの曲線の間の面積は、各々２３９５および９４２．９であった。
［実施例８．無細胞ＥＢＶ ＤＮＡ分子のＳＮＶプロファイル分析］
６３人のＮＰＣおよび８８人の非ＮＰＣ被験者の血漿ＤＮＡ配列決定データを含むトレーニングデータセットにおいて、２つのグループ間のＥＢＶ ＳＮＶプロファイルの違いを分析した。ＥＢＶゲノムにわたりＳＮＶを識別することを同定した。ＮＰＣリスクスコアを、これらのＳＮＶサイトの遺伝子型パターンから導き出すことになっており、その後、３１のＮＰＣサンプルおよび４０の非ＮＰＣサンプルのテストセットにおいて分析した。この実施例では、ＥＢＶゲノム全体で合計６６１の重要なＳＮＶを、トレーニングセットから同定した（図１６Ｄ）。テストセットでは、ＮＰＣ血漿サンプルは、ＮＰＣリスクスコアが高いことが示され；ＮＰＣ関連ＥＢＶ ＳＮＶプロファイルが存在し得た。非ＮＰＣサンプル間で、ＮＰＣリスクスコアは幅広く存在していた。非ＮＰＣ被験者は、多様なＥＢＶ ＳＮＶプロファイルを有することができる。
６３人のＮＰＣおよび８８人の非ＮＰＣ被験者の血漿ＤＮＡ配列決定データを含むトレーニングデータセットにおいて、２つのグループ間のＥＢＶ ＳＮＶプロファイルの違いを分析した。ＥＢＶゲノムにわたりＳＮＶを識別することを同定した。ＮＰＣリスクスコアを、これらのＳＮＶサイトの遺伝子型パターンから導き出すことになっており、その後、３１のＮＰＣサンプルおよび４０の非ＮＰＣサンプルのテストセットにおいて分析した。この実施例では、ＥＢＶゲノム全体で合計６６１の重要なＳＮＶを、トレーニングセットから同定した（図１６Ｄ）。テストセットでは、ＮＰＣ血漿サンプルは、ＮＰＣリスクスコアが高いことが示され；ＮＰＣ関連ＥＢＶ ＳＮＶプロファイルが存在し得た。非ＮＰＣサンプル間で、ＮＰＣリスクスコアは幅広く存在していた。非ＮＰＣ被験者は、多様なＥＢＶ ＳＮＶプロファイルを有することができる。
材料および方法。
研究参加者および設計。
本研究は、Lam et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018; 115：E5115-E5124で以前に報告されたＮＰＣおよび非ＮＰＣ血漿サンプルの配列決定データセットのサブセット（トレーニングセットとして）、およびＮＰＣおよび非ＮＰＣの両方の被験者からの新たに配列決定された血漿ＤＮＡサンプル（テストセットとして）の分析を包含した。
トレーニングデータセットは、Lam et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018; 115：E5115-E5124に記載されている過去の将来的に見込みのあるＮＰＣスクリーニング研究において、スクリーニングで検出されたＮＰＣ患者および非ＮＰＣ被験者の両方からの血漿サンプルを含んだ。これらの非ＮＰＣ被験者は、リアルタイムＰＣＲベースのアッセイによって検出可能なレベルの血漿ＥＢＶ ＤＮＡを保有していた。このデータセットは、独立したコホートからの症候性ＮＰＣ患者のサンプルも含んでいた。ＮＰＣリスクスコア予測のトレーニングモデルを構築するために、全サンプルのＥＢＶ単離株からのＥＢＶ遺伝子型情報を、研究した。この研究では、別の３１人の症候性ＮＰＣ患者および４０人の非ＮＰＣ被験者の血漿サンプルを、テストセットとして機能するターゲットキャプチャーシーケンスの対象とした。これら３１人の症候性ＮＰＣ患者は、香港のプリンスオブウェールズ病院の臨床腫瘍学科から採用された。非ＮＰＣ被験者も、前述のＮＰＣスクリーニングコホート（２０，０００人以上の被験者を含む）からのものであり、そこからランダムに選択された。これらのＮＰＣおよび非ＮＰＣサンプルからのＥＢＶ遺伝子型の変動を分析し、トレーニングモデルに基づいてそれらのＮＰＣリスクスコアを導き出した。トレーニングセットおよびテストセットにおけるすべてのＮＰＣサンプルおよび非ＮＰＣサンプルは、重複していなかった。
ターゲットキャプチャーシーケンス
血漿サンプルのターゲットキャプチャーシーケンスを、捕捉プローブシステム（ｍｙＢａｉｔｓカスタム捕捉パネル、Arbor Biosciences）を介して血漿ＤＮＡライブラリからＥＢＶ ＤＮＡ分子を濃縮して実施した。ＥＢＶ捕捉プローブを、ウィルスゲノム全体をカバーするように設計した。３，０００のヒト一塩基多型（ＳＮＰ）サイトをターゲットとするプローブも参照用に含まれている。ＥＢＶプローブと常染色体ＤＮＡプローブとのモル比を１００：１の比率で含むプローブ混合物を、各捕捉反応で使用した。１０の血漿サンプルからのＤＮＡライブラリを、各サンプルからの同量のＤＮＡライブラリを用いながら、１回の捕捉反応で多重化した。現在のトレーニングセットとして使用された以前に報告されたケースを含む、すべてのケースの配列決定統計は、表４Ａおよび４Ｂに記載されている。
ＥＢＶ変異体呼び出し
シーケンスされたリードは、Li H et al. Bioinformatics. 2010; 26：589-95に記載されているＢＷＡアライナ(aligner)を使用してヒト（ｈｇ１９）およびＥＢＶ参照ゲノム（ＡＪ５０７７９９．２）にアラインメントされ、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＥＢＶゲノムサイト上の参照ウィルスゲノムとは異なる代替対立遺伝子が検出された場合に、ＥＢＶ一塩基多型（ＳＮＶ）を、Li H et al. Bioinformatics. 2009; 25：2078-9に記載されているように、Ｓａｍｔｏｏｌｓで同定し、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２以上のタイプの対立遺伝子が検出されたＳＮＶサイト（マイナーな対立遺伝子頻度カットオフが５％に設定されている）を、その後のＮＰＣリスクスコア分析のために除外した。
ＮＰＣリスクスコア
この実施例において、ＮＰＣリスクスコアは、ウィルスゲノムにわたるＳＮＶサイトの固定セットでのＥＢＶ遺伝子型の加重総和（バイナリロジスティック回帰モデルの説明変数として）であった。ＮＰＣ関連ＳＮＶのセットを、トレーニングセットのＮＰＣおよび非ＮＰＣサンプルからのＥＢＶ ＳＮＶプロファイルの相違を分析することによって最初に同定した。フィッシャーの直接確率検定を使用して、ＮＰＣ症例に対するＥＢＶゲノムにわたる各変異体の関連を分析した。次いで、偽発見率（ＦＤＲ）を５％に制御して、有意なＳＮＶの固定セットを取得した。
テストサンプルのＮＰＣリスクスコアは、トレーニングセットから同定された重要なＳＮＶサイトのこの特定のセットに対するＥＢＶ遺伝子型によって決定することができる。前述のように、血漿ＥＢＶ ＤＮＡ分子の濃度が低いため、配列決定されたＥＢＶ ＤＮＡリードによる手段では、ＥＢＶゲノム全体のカバレッジが不完全となる可能性がある。したがって、スコアは、血漿ＥＢＶ ＤＮＡリードによってカバーされたそれらのＳＮＶサイトにわたる遺伝子型パターンによって決定されるように定式化した（例えば、利用可能な遺伝子型情報を用いて）（図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃ）。ＮＰＣリスクスコアを導き出すために、重要なＳＮＶサイトのサブセットを最初に同定し、テストサンプルの血漿ＥＢＶ ＤＮＡリードによってカバーした。次いで、各サイトでの遺伝子型の重み付け（効果サイズ）を、重要なＳＮＶサイトのサブセット内で決定した。トレーニングデータセット内のＮＰＣサンプルおよび非ＮＰＣサンプル間の各サイトでの遺伝子型パターンを分析することによって、これを実行した（図１６Ｂ）。これに基づいて、ロジスティック回帰モデルを構築し、ＮＰＣの各ＳＮＶサイトでのリスク遺伝子型の効果サイズの情報を与ええた。ロジスティックモデルは次のように記述された：
これは次のように書き直すことができる：
ここで、ｎは、重要なＳＮＶサイトの数であり；β０およびβｋは、最尤推定量で決定できる係数であり；Ｐは、ＥＢＶ陽性患者がＮＰＣを有する確率であり；変数Ｘｋは、ゲノム位置ｋのＳＮＶサイトを表す。Ｘｋは、ＥＢＶ参照ゲノムと同一のサンプルに変異体が存在する場合、－１としてコード化される。サンプルに代替変異体が存在する場合、Ｘｋは１としてコード化される。分析された変異サイトがサンプルでカバーされていない場合、Ｘｋは０としてコード化される。'ロジスティック回帰'関数（ペナルティ＝'１２'、Ｃ＝ １、ソルバー＝'saga'、max_iter＝５０００、およびrandom_state＝０）をＰｙｔｈｏｎで使用して、係数β０およびβｋを推定した。トレーニングデータセット内のＮＰＣサンプルおよび非ＮＰＣサンプル間の各サイトでの遺伝子型パターンを分析することによって、これを実行した。行列（ｃ＋ｄ）×ｎをＰｙｔｈｏｎに入力した、ここで、ｃはＮＰＣサンプルの数、ｄはトレーニングセット内の非ＮＰＣサンプルの数、およびｎは遺伝子型変異の数である。各行はサンプルを表し（０はＮＰＣを有さない患者、１はＮＰＣを有す患者）、各列は変異を表した。それにより、係数（β０およびβｋ）を推定できる。次いで、テストサンプルのＮＰＣリスクスコアを、ＳＮＶサイトでのそれ自身の遺伝子型に基づいて導き出し、トレーニングモデルから推定された対応する係数β０およびβｋによって重み付けした（図１６Ｃ）。
結果
ＮＰＣリスクスコアトレーニングモデルの構築
上記のように、以前に報告されたＮＰＣおよび非ＮＰＣサンプルの血漿ＥＢＶ ＤＮＡ配列決定データを、ＮＰＣリスクスコアトレーニングモデルの開発のために使用した。漿サンプル中のＥＢＶ ＤＮＡを濃縮するために、ターゲットキャプチャーシーケンスを実施していた。ＮＰＣおよび非ＮＰＣサンプルからのＥＢＶ単離株のウィルスＳＮＶプロファイルをここで研究した。このデータセットから、配列決定されたＥＢＶ ＤＮＡリードによってＥＢＶゲノム全体のカバレッジの少なくとも３０％を有するＮＰＣおよび非ＮＰＣの症例を選択した。このカットオフが選択されたのは、トレーニングデータセット内の９５％を超えるＮＰＣサンプルが、カットオフよりも大きいウイルスゲノムカバレッジを有していたためである（表４Ａおよび４Ｂ）。年齢や性別を含む、これらの選択されたＮＰＣおよび非ＮＰＣ被験者の人口統計、およびＮＰＣ患者の癌の病期情報（第８回ＡＪＣＣ版）を表５に示す。これらの選択されたＮＰＣおよび非ＮＰＣサンプルの配列決定統計は、（表４Ａおよび４Ｂ）に記載されている。
これら６３のＮＰＣサンプルおよび８８の非ＮＰＣサンプルのＥＢＶ ＳＮＶプロファイルを分析した。全サンプルのＥＢＶゲノム全体のシーケンス深度の中央値は２倍であった（四分位範囲（ＩＱＲ）、１．０倍～９．２倍）。ＮＰＣサンプルから同定されたＥＢＶ ＳＮＶの平均数は８００（ＩＱＲ、６６２～９５８）であり、非ＮＰＣサンプル間のＳＮＶの平均数は５３９（範囲、３６３～６５６）であった。合計で、全サンプルで同定されたのは５６７８のさまざまなＳＮＶであった。ＥＢＶゲノムにわたるこれらのＳＮＶの分布を図１６に示した。
トレーニングセットのＮＰＣサンプルに対する各ウィルスＳＮＶの関連も、フィッシャーの直接確率検定により研究した。偽発見率（ＦＤＲ）を０．０５に制御することにより、調整されたｐ値を有するＮＰＣに関連する合計６６１の重要なＳＮＶを同定した。これらの６６１のＳＮＶのゲノム位置を表６に示す。続いて、ＮＰＣおよび非ＮＰＣ被験者の血漿サンプルのテストセットのＮＰＣリスクスコアを、これら６６１のＳＮＶサイトの遺伝子型パターンに基づいて導き出した。
ＮＰＣリスクスコアトレーニングモデルの評価
リーブワンアウトアプローチを使用してトレーニングセット内のサンプルのＮＰＣリスクスコアを分析するために、トレーニングモデルを評価した。リーブワンアウトアプローチにおいて、トレーニングモデルの構築およびＮＰＣリスクスコアの導出の原則は、該方法で説明したものと同じであった。トレーニングセットの１つのサンプルを除くすべてをトレーニングモデルの構築に使用し、除外されたサンプルをＮＰＣリスクスコアについて分析できる。リーブワンアウトアプローチにおいて、ＮＰＣグループの中央値ＮＰＣリスクスコアは０．９９（ＩＱＲ、０．９８～１．０）であり、非ＮＰＣグループの中央値は０．０１（ＩＱＲ、０．００～０．８９）であった（図１７Ａ）。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を使用して、ＮＰＣリスクスコアによるＮＰＣサンプルと非ＮＰＣサンプルとの識別を評価した。曲線値の下の面積は０．９１であった（図１７Ｂ）。
テストセットにおけるＮＰＣリスクスコア分析
ターゲットキャプチャーシーケンスを、別の３１人のＮＰＣ患者および４５人の非ＮＰＣ被験者の血漿サンプルで実施した。それらの中で、３１のＮＰＣサンプルおよび４０の非ＮＰＣサンプルはすべて、配列決定されたＥＢＶ ＤＮＡリードによるＥＢＶゲノムのカバレッジの少なくとも３０％以上を有した。これらＮＰＣおよび非ＮＰＣ被験者の臨床的特徴を表７に要約する。この一連のテストサンプルの配列決定統計もまた、表４Ａおよび４Ｂに記載する。
開発されたトレーニングモデルに基づいて、３１のＮＰＣサンプルおよび４０の非ＮＰＣサンプルのテストセットのＮＰＣリスクスコアを分析した。サンプルのＮＰＣリスクスコアは、トレーニングセットから同定された６６１の重要なＳＮＶ位置にわたるその変異パターンによって決定できる。ＥＢＶゲノムのカバレッジが不完全である可能性があるため、配列決定されたＥＢＶ ＤＮＡリードによってカバーされ、対応する対立遺伝子情報を有するＳＮＶサイトのみをＮＰＣリスクスコア分析に含めることができる（図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃ）。
ＮＰＣグループの中央値ＮＰＣリスクスコアは、０．９９９（ＩＱＲ、０．９９６～０．９９９）であり、非ＮＰＣグループのそれは、０．５５７（ＩＱＲ、０．０００～０．９９６）であった（図１８Ａ）。同様に、これら３１のＮＰＣサンプルの中で、高いＮＰＣリスクスコアが認められた。テストセットのＮＰＣサンプルは、トレーニングセットのＮＰＣサンプルと同様のＥＢＶ ＳＮＶプロファイルを共有できる。ＮＰＣリスクスコアによるＮＰＣサンプルおよび非ＮＰＣサンプルの識別はまた、ＲＯＣ曲線分析によっても評価した。曲線値の下の面積は０．８３であった（図１８Ｂ）。
テストセットにおける高リスク変異サイトにわたる遺伝子型パターンの分析
ＥＢＥＲ（ＥＢＶでエンコードされたｓｍａｌｌ ＲＮＡ）領域には、高リスクＮＰＣ関連ＥＢＶ変異体が存在する。ＥＢＥＲ領域では、２３の重要なＳＮＶがHui et al.によって報告されてきた。ＮＰＣリスク予測の同様のアプローチが３１のＮＰＣサンプルおよび４０の非ＮＰＣサンプルのテストセットで採用されたが、ＥＢＥＲ領域で報告された２３のＳＮＶの遺伝子型パターンのみに基づいて分析された。
テストセットでは、７１のＮＰＣおよび非ＮＰＣサンプルのうち３１（４４％）が、２３のＳＮＶサイトすべてをカバーするＥＢＶ ＤＮＡリードを有していた。表８に示すように、これら２３のＳＮＶサイトのそれぞれについて、ＳＮＶサイトをカバーするリードを含む利用可能な遺伝子型情報を有していたのはサンプルの一部のみであった（つまり、２３のＳＮＶサイトすべてがサンプルの血漿ＥＢＶ ＤＮＡリードでカバーされたわけではなかった）。ＮＰＣサンプル中の２３のＳＮＶサイトそれぞれでの高リスク遺伝子型のパーセンテージは、８６％～９７％の範囲である。非ＮＰＣサンプル中の高リスク遺伝子型のパーセンテージは、３５％～５２％の範囲である。分析されたＮＰＣおよび非ＮＰＣサンプルの数は、利用可能な遺伝子型情報を含むサンプルに及ぶ（例えば、ＳＮＶサイトをカバーするＥＢＶ ＤＮＡリードを含む）。テストセット（３１のＮＰＣサンプルおよび４０の非ＮＰＣサンプル）には、ＳＮＶサイトをカバーするリード、およびその対応するサイトで利用可能な遺伝子型情報を有するサンプルは一部のみであった。ＮＰＣサンプルと非ＮＰＣサンプルとの識別もまた、ＲＯＣ曲線分析によってＥＢＥＲ領域の２３のＳＮＶの遺伝子型パターンを分析することによってのみ評価した。曲線下の面積は０．７２であった（図１９Ａおよび１９Ｂ）。この値は、ＥＢＶゲノム全体にわたる遺伝子型パターンの分析から得られた値（０．８３）よりも低かった。ＥＢＶゲノム全体にわたる遺伝子型パターンの分析は、固定されたウィルスゲノム領域にわたる分析よりもＮＰＣサンプルと非ＮＰＣサンプルとの識別をより良く達成することができる。
同様に、ＢＡＬＦ２（ＢａｍＨＩ Ａ左フレーム－２）遺伝子の３つの高リスクＳＮＶも報告されている（Xu et al. Nat Genet. 2019; 51：1131－6）。テストセットでは、７１のサンプルのうち５５（７８％）に、３つのＳＮＶすべてをカバーするＥＢＶ ＤＮＡリードがあった。これらの３つのＳＮＶサイトのそれぞれについて、テストセット内のサンプルの一部のみが、利用可能な遺伝子型情報を含むＳＮＶサイトをカバーするリードを有していた（表９）。ＮＰＣサンプル中の３つのＳＮＶサイトそれぞれでの高リスク遺伝子型のパーセンテージは８６％～９３％の範囲である。非ＮＰＣサンプル中の高リスク遺伝子型のパーセンテージは４７％～６５％の範囲である。ＢＡＬＦ２遺伝子で３つの報告されたＳＮＶ（１つのＮＰＣサンプルおよび３つの非ＮＰＣサンプル）のいずれかをカバーするＥＢＶ ＤＮＡリードがないケースが４例あり、これらのケースは分析できなかった。ＮＰＣリスク予測の同様のアプローチを、テストセットからの残りの３０のＮＰＣおよび３７の非ＮＰＣサンプルで採用し、ＢＡＬＦ２領域で報告された３つのＳＮＶの遺伝子型パターンのみを分析した。ＮＰＣサンプルと非ＮＰＣサンプルとの識別はまた、ＲＯＣ曲線分析によっても評価された。曲線下の面積は０．７７であった（図２０Ａおよび２０Ｂ）。この値は、ＥＢＶゲノム全体にわたる遺伝子型パターンの分析から得られた値（０．８３）よりも低かった。ＥＢＶゲノム全体にわたる遺伝子型パターンの分析は、固定されたウィルスゲノム領域にわたる分析よりもＮＰＣサンプルと非ＮＰＣサンプルとの識別をより良く達成することができる。
この実施例で説明するＮＰＣリスクスコア分析では、ＥＢＶゲノム上の６６１の重要なＳＮＶのセット内でランダムに選択されたＳＮＶの浮動数(floating number)にわたる遺伝子型パターンに基づくＮＰＣリスク予測が可能である（表６）。ＮＰＣリスクスコア分析に使用されるＳＮＶサイトの浮動数は、ＳＮＶサイトが配列決定されたＥＢＶ ＤＮＡリードによってカバーされ、対応する対立遺伝子情報を有するかどうかによって決定できる。６６１の重要なＳＮＶのセットのダウンサンプリングを実施し、サンプルのＮＰＣ予測のパフォーマンスを、ダウンサンプリングされたＳＮＶのセット内のＳＮＶの浮動数により同じアプローチを使用してテストセットにおいて分析した。ダウンサンプリング分析では、６６１の重要なＳＮＶからある特定の数（２３、２５、１００、２００または５００など）のＳＮＶがランダムに選択された。次いで、テストサンプルの場合、ＥＢＶ ＤＮＡシーケンスリードでカバーされたダウンサンプリングされたＳＮＶのセット内のＳＮＶサイトを同定した。それから、カバーされ、ダウンサンプリングされたＳＮＶサイトのトレーニングセットにおいて、ＮＰＣサンプルおよび非ＮＰＣサンプルの遺伝子型パターンを用いてモデルをトレーニングすることにより、ＮＰＣリスクスコアトレーニングモデルを取得した。該トレーニングを通じて、トレーニングモデルについて各サイトでの遺伝子型の重み付けを決定した。そして、これらのカバーされ、かつ、ダウンサンプリングされたＳＮＶサイトにわたるそれ自身の遺伝子型パターンを、同様にダウンサンプリングされたＳＮＶサイトに重み付けされたＮＰＣリスクスコアトレーニングモデルに適用することによって、テストサンプルのＮＰＣリスクスコアを導き出した。様々な数のＳＮＶサイトを伴ったＮＰＣリスクスコアトレーニングモデルの予測パフォーマンスを表１０に要約する。所定の数のＳＮＶサイトについて、ＳＮＶをランダムに選択してダウンサンプリングを１０回実施し、表１０の曲線値の下の面積は、１０回のランダムダウンサンプリングの平均結果である。ＥＢＶゲノム全体にわたるＳＮＶのセットは、２３にダウンサンプリングされた、これは、ＥＢＥＲ領域で報告されたＳＮＶの数と同じである。ＮＰＣサンプルと非ＮＰＣサンプルとの識別を、ＲＯＣ曲線分析によって評価した。曲線値の下の面積は０．７８であった。この値は、ＥＢＥＲ領域で報告された２３のＳＮＶの遺伝子型パターンの分析による値（０．７２）よりも高かった。
この研究は、血漿ＤＮＡ配列決定によるＥＢＶ遺伝子型情報の分析を報告する。ペアエンドシーケンシングを通じて、血漿ＥＢＶ ＤＮＡを保有するＮＰＣ被験者と非ＮＰＣ被験者との間で、数やサイズを含む血漿ＥＢＶ ＤＮＡ分子の分子特性の識別を同定した。血漿ＥＢＶ ＤＮＡのこのようなカウントおよびサイズベースの分析を組み込むことで、現在のＰＣＲベースのプロトコルの陽性予測値をほぼ２倍にすることができ、これが第２世代の配列決定ベースのスクリーニングテストの基礎を形成することができる。ＮＰＣおよび非ＮＰＣ被験者からの血漿サンプルの配列決定により、ＥＢＶ遺伝子型情報を付加的に得ることができ、その潜在的な臨床的有用性を高めることができる。
ＮＰＣリスクスコアは、単一の遺伝子マーカーではなく、ウィルスゲノムワイドマーカーによって決定するために使用できる。ここで、リスクスコアは、ＥＢＶゲノムにわたるＳＮＶサイトの識別を通した変異パターンに基づいて導き出された。ＥＢＶ遺伝子型情報の血漿配列決定は、低濃度のＥＢＶ ＤＮＡ分子を有する血漿サンプルの配列決定を包含し得、したがって、ＥＢＶゲノムのカバレッジが不完全な結果になる。あるケースでは、情報価値のあるＳＮＶサイトが、どのＥＢＶ ＤＮＡリードでもカバーされていない可能性があり、またあるケースでは、個人が高リスクのＥＢＶ株タイプを有しているかどうかを判断することができない可能性がある。このことは、ＥＢＥＲ遺伝子で報告された２３のＳＮＶサイトそれぞれについて、テストセット内の分析された７１サンプルのうち一部のみでしかサイトをカバーするリードを有していなかったという結果によってサポートされている。テストセットにおけるＮＰＣサンプルは、ＮＰＣリスクスコアが高いことが示された、これは、ＮＰＣ関連ＥＢＶ ＳＮＶプロファイルの存在を示し得る。ここでは、血漿サンプル中のＥＢＶ ＤＮＡ分子の濃縮に捕捉プローブ法を採用した。アンプリコンシーケンスアプローチを使用し、遺伝子型情報の高リスク変異領域をターゲットにできるＥＢＶ ＤＮＡフラグメントを濃縮することもできる。
ＥＢＥＲ遺伝子およびＢＡＬＦ２遺伝子の最近報告された高リスク変異サイトのテストセットにおける、ＮＰＣおよび非ＮＰＣサンプルの遺伝子型パターンをここで分析した。ＮＰＣおよび非ＮＰＣサンプルにおける高リスク遺伝子型の分布は、細胞サンプル、すなわちＮＰＣ腫瘍組織および正常な対照被験者の唾液サンプルを分析した２つの研究の結果と一致する。現在の研究を含む３つの研究はすべて、中国南部の同じかまたは隣接する地域で実施されたため、正常な対照被験者間のＥＢＶ遺伝子型の分布が類似している可能性がある。これは、血漿サンプルの配列決定を通じたＥＢＶジェノタイピング分析の実現可能性の証拠を提供するものである。
スクリーニングのコンテキストで血漿サンプルからＥＢＶ ＳＮＶをプロファイリングすることには臨床的有用性があり得る。前述のように、スクリーニング集団の約５％は、血漿中にＥＢＶ ＤＮＡを保有することができるが、ＮＰＣを有してはいない（偽陽性グループ）。ここでのデータは、これらの非ＮＰＣ被験者が、多様なＥＢＶ ＳＮＶプロファイルを包含し得る変動性のＮＰＣリスクスコアを有していることを明らかにした。将来的なＮＰＣ発症のリスクが異なる、異質な個人グループが存在する可能性があり得る。高リスクのＥＢＶ株を保有している人の中には、ＮＰＣの将来のリスクがより高くなる人も存在し得る。ＮＰＣリスクスコアを使用して、ウィルスゲノムワイドなＳＮＶプロファイルに基づいて、これらの非ＮＰＣ被験者をさまざまなリスクグループに層別化することができる。一例では、ＮＰＣリスクスコアが高い被験者については、より頻繁なスクリーニングの根拠となり得る。
ＮＰＣ患者および非ＮＰＣ被験者からのＥＢＶ遺伝子型情報を、血漿サンプルの配列決定分析を通じて分析した。以前の研究は、集団レベルでのＮＰＣに関連する高リスク変異を同定することに焦点を当てていたが、この研究は、ウィルス遺伝子型分析の臨床応用に関する洞察を提供する。かかる分析を使用して、彼らが保有するＥＢＶ遺伝子型を特性づけることにより、個々に対して癌のリスク情報を与えることができる。
本開示の好ましい実施形態が本明細書に示され、説明されてきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。多くの変形、変更および置換が、本開示から逸脱することなく、当業者に発生するであろう。本開示を実施する際に、本明細書に記載の本開示の実施形態に対する様々な代替案を使用できることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの同等物は、それによってカバーされることが意図されている。
Claims (79)
- 被験者における病原体関連障害をスクリーニングする方法であって、
前記被験者の生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の特性を決定することを含む、第１の時点で実施される第１のアッセイからのデータを受け取るステップであって、前記病原体からの前記無細胞核酸分子の前記特性が、量、メチル化状態、変異パターン、フラグメントサイズ、または前記生物学的サンプル中の前記被験者からの無細胞核酸分子と比較した相対的存在量を含み、かつ、前記特性が、前記被験者が前記病原体関連障害を発症するリスクを示す受け取るステップと、
前記特性に基づいて、前記被験者における前記病原体関連障害をスクリーニングするために第２のアッセイが実施される第２の時点を決定するステップであって、前記第１の時点および前記第２の時点との間の間隔が、前記リスクと逆相関する、決定するステップと、を含む、スクリーニングする方法。 - 被験者における病原体関連障害を予後診断する方法であって、
前記被験者の生物学的サンプル中の病原体からの無細胞核酸分子の特性を決定することを含む、第１のアッセイからのデータを受け取るステップであって、前記病原体からの前記無細胞核酸分子の前記特性が、量、メチル化状態、変異パターン、フラグメントサイズ、または前記生物学的サンプル中の前記被験者からの無細胞核酸分子と比較した相対的存在量を含む、受け取るステップと、
前記病原体由来の前記無細胞核酸分子の前記特性、ならびに前記被験者の年齢、前記被験者の喫煙習慣、前記被験者の病原体関連障害の家族歴、前記被験者の遺伝子型因子、前記被験者の民族性、もしくは前記被験者の食歴の１つ以上の要因に基づいて、前記被験者が、前記病原体関連障害を発症するリスクを示すレポートを作成するステップと、
を含む、予後診断する方法。 - 前記第１のアッセイの結果が、前記病原体関連障害の前記被験者の医学的治療という結果をもたらさない、請求項１に記載の方法。
- 前記医学的治療が、治療薬による治療、放射線療法または外科的治療を含む、請求項３に記載の方法。
- 前記被験者が、偽陽性率が１％未満である臨床診断検査によって前記第２の時点の決定前に、前記病原体関連障害を有さないと診断される、請求項１、３または４のいずれかに記載の方法。
- 前記臨床診断検査が、身体検査、侵襲的生検、内視鏡検査、磁気共鳴画像法、陽放射断層撮影法、コンピュータ断層撮影法、またはＸ線画像法を含む、請求項５に記載の方法。
- 前記臨床診断検査が、組織学的分析、細胞学的分析、または細胞核酸分析を含む侵襲的生検を含む、請求項５に記載の方法。
- 前記間隔が、少なくとも約２か月、４か月、６か月、８か月、１０か月、または１２か月である、請求項１，３または７のいずれかに記載の方法。
- 前記間隔が、少なくとも約１２ヶ月である、請求項８に記載の方法。
- 前記第１のアッセイを実施することをさらに含む、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
- 前記第１のアッセイを実施することが、
（ｉ）前記被験者から第１の生物学的サンプルを取得することと、
（ｉｉ）前記第１の生物学的サンプル中の前記病原体から、第１の量の無細胞核酸分子を測定することと、
を含む、請求項１０に記載の方法。 - 前記第１の量の測定が、前記第１の生物学的サンプル中の前記病原体から、前記無細胞核酸分子のコピー数を測定することを含む、請求項１１に記載の方法。
- 前記測定が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
- 前記測定が、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
- 前記第１の量が、前記第１の生物学的サンプル中の前記病原体から、前記無細胞核酸分子の第１のパーセンテージを測定することを含む、請求項１１に記載の方法。
- 前記第１のアッセイが、
（ｉｉｉ）前記第１の量が閾値を超える場合、前記被験者から第２の生物学的サンプルを取得すること、および該第２の生物学的サンプル中の前記病原体から、第２の量の無細胞核酸分子を測定することをさらに含む、請求項１１～１５のいずれかに記載の方法。 - 前記第２の生物学的サンプルが、前記第１の生物学的サンプルから約４週間後に取得される、請求項１６に記載の方法。
- 前記第１の時点と前記第２の時点との間の前記間隔が、前記第２の量が前記閾値を下回る場合の間隔と比較して、前記第１の量および前記第２のコピー数の両方が前記閾値を上回る場合の方がより短い、請求項１６または１７に記載の方法。
- 前記第１の時点と前記第２の時点との間の前記間隔が、前記第１の量が前記閾値を上回る場合の間隔と比較して、前記第１の量が前記閾値を下回る場合の方がより長い、請求項１６～１８のいずれかに記載の方法。
- 前記第１の時点と前記第２の時点との間の前記間隔が、前記第１の量および前記第２の量の両方が前記閾値を上回る場合、約１年である、請求項１６～１９のいずれかに記載の方法。
- 前記第１の時点と前記第２の時点との間の前記間隔が、前記第２の量が前記閾値を下回る場合、約２年である、請求項１６～２０のいずれかに記載の方法。
- 前記第１の時点と前記第２の時点との間の前記間隔が、前記第１の量が前記閾値を下回る場合、約４年である、請求項１６～２１のいずれかに記載の方法。
- 前記第１のアッセイが、
前記生物学的サンプル中の前記病原体から、前記無細胞核酸分子のメチル化状態を決定することを含む、請求項１０に記載の方法。 - 前記メチル化状態の決定が、前記生物学的サンプル中の前記無細胞核酸分子をメチル化感受性制限酵素またはバイサルファイトで処理することを含む、請求項２３に記載の方法。
- 前記メチル化状態の決定が、前記被験者の前記生物学的サンプル中の無細胞核酸のメチル化認識配列決定を実施することを含む、請求項２３に記載の方法。
- 前記メチル化認識配列決定が、メチル化されていないシトシンのウラシルへのバイサルファイト変換を含む、請求項２５に記載の方法。
- 前記メチル化認識配列決定が、メチル化感受性制限酵素による処理を含む、請求項２５に記載の方法。
- 前記第１のアッセイが、
前記生物学的サンプル中の前記病原体から、前記無細胞核酸分子のフラグメントサイズ分布を決定することを含む、請求項１０に記載の方法。 - 前記フラグメントサイズ分布の決定が、前記生物学的サンプル中の無細胞核酸分子の配列決定を実施することと、前記病原体の前記参照ゲノムにマッピングされたシーケンスリードに基づいて、前記生物学的サンプル中の前記病原体から、前記無細胞核酸分子のフラグメントサイズを決定することと、を含む、請求項２８に記載の方法。
- 前記第１のアッセイが、
前記生物学的サンプル中の前記病原体から、前記無細胞核酸分子の変異パターンを決定することを含む、請求項１０に記載の方法。 - 前記変異パターンの決定が、前記生物学的サンプル中の無細胞核酸分子の配列決定を実施することと、前記病原体の前記参照ゲノムにマッピングされたシーケンスリードに基づいて、前記生物学的サンプル中の前記病原体から、前記無細胞核酸分子の前記変異パターンを決定することと、を含む、請求項３０に記載の方法。
- 前記病原体からの前記無細胞核酸分子の前記変異パターンが、一塩基変異を含む、請求項３０または３１に記載の方法。
- 前記変異パターンの同定が、
前記病原体の前記参照ゲノムにマッピングされた前記シーケンスリードと、前記病原体の障害関連参照ゲノムとの間の類似性レベルの決定を含む、請求項３２に記載の方法。 - 前記病原体の前記障害関連参照ゲノムが、病変組織で同定された前記病原体のゲノムを含む、請求項３３に記載の方法。
- 前記類似性レベルの決定が、
前記病原体の前記参照ゲノムを、複数のビンに分離することと、
前記病原体の前記障害関連参照ゲノムに対する前記複数のビンのそれぞれの類似性指数を決定することであって、前記類似性指数が、前記病原体の前記参照ゲノムにマッピングされた前記シーケンスリードの少なくとも１つが、前記病原体の前記障害関連参照ゲノムと同じヌクレオチド変異体を有する、各々のビンの中の変異サイトの割合と相関する、決定することと、を含む類似性レベルの決定である、請求項３３または３４の方法。 - 前記病原体の前記障害関連参照ゲノムが、前記病原体の複数の障害関連参照ゲノムを含み、かつ、前記類似性レベルの決定が、
前記病原体の前記複数の障害関連参照ゲノムのそれぞれに対して、前記複数のビンのそれぞれについて各々、類似性指数を決定することと、
前記各々のビン内の前記各々の類似性指数が、カットオフ値を上回る前記複数の障害関連参照ゲノムの比率に基づいて、前記複数のビンのそれぞれについてビンスコアを決定することと、を含む、請求項３５の記載の方法。 - 前記複数のビンの長さがそれぞれ、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ｂｐである、請求項３５または３６に記載の方法。
- 前記第１のアッセイが、前記生物学的サンプル中の前記病原体からの前記無細胞核酸分子の、前記メチル化状態か、前記フラグメントサイズ分布か、または前記変異パターンか、を決定することを含む、請求項１０～３７のいずれかに記載の方法。
- 前記生物学的サンプル中の前記病原体からの前記無細胞核酸分子の前記特性を含む、データ入力に適用される分類子を使用して、前記被験者が前記病原体関連障害を発症するリスクスコアを計算することを含むものであって、前記分類子が、前記生物学的サンプル中の前記病原体からの前記無細胞核酸分子の前記特性を含む前記データ入力に関数を適用するように構成され、前記被験者が前記障害を発症する前記リスクを評価する前記リスクスコアを含む出力を生成する、計算することをさらに含む、請求項１～３８のいずれかに記載の方法。
- 前記分類子が、ラベル付けされたデータセットでトレーニングされる、請求項３９に記載の方法。
- 前記第２の時点で前記第２のアッセイを実施することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記第２のアッセイが、前記第１のアッセイと同一である、請求項４１に記載の方法。
- 前記第２のアッセイが、前記被験者からの無細胞核酸分子のアッセイ、前記被験者の侵襲的生検、前記被験者の内視鏡検査、または前記被験者の磁気共鳴画像検査を含む、請求項４１に記載の方法。
- 被験者の生物学的サンプルから核酸分子を分析する方法であって、
コンピュータシステムにおいて、前記被験者の前記生物学的サンプルから無細胞核酸分子のシーケンスリードを取得するステップであって、前記生物学的サンプルが、前記被験者からの、および潜在的に病原体からの無細胞核酸分子を含む、取得するステップと、
前記コンピュータシステムにおいて、前記無細胞核酸分子の前記シーケンスリードを、前記病原体の参照ゲノムにアラインさせるステップと、
前記コンピュータシステムにおいて、前記病原体からの前記無細胞核酸分子の変異パターンを同定するステップであって、前記変異パターンが、前記病原体の前記参照ゲノム上の複数の変異サイトのそれぞれで、前記病原体の前記参照ゲノムにマッピングされた前記シーケンスリードのヌクレオチド変異体を特性化し、前記複数の変異サイトが、前記病原体の前記参照ゲノムにわたり少なくとも３０のサイトを含み、かつ、前記変異パターンが、前記被験者における病原体関連障害の状態、またはそのリスクを示す、同定するステップと、
を含む、分析する方法。 - 前記複数の変異サイトが、前記病原体の前記参照ゲノムにわたって、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、または少なくとも１２００のサイトを含む、請求項４４に記載の方法。
- 前記複数の変異サイトが、前記病原体の前記参照ゲノムにわたって少なくとも６００のサイトを含む、請求項４４に記載の方法。
- 前記複数の変異サイトが、前記病原体の前記参照ゲノムにわたって約６６０のサイトを含む、請求項４４に記載の方法。
- 前記複数の変異サイトが、前記病原体の前記参照ゲノムにわたって少なくとも１０００のサイトを含む、請求項４４に記載の方法。
- 前記複数の変異サイトが、前記病原体の前記参照ゲノムにわたって約１１００のサイトを含む、請求項４４に記載の方法。
- 前記複数の変異サイトが、前記病原体の前記参照ゲノムにマッピングされた前記シーケンスリードが、前記病原体の前記参照ゲノムとは異なるヌクレオチド変異を有するすべてのサイトからなる、請求項４４に記載の方法。
- 前記シーケンスリードのアラインが、前記病原体の前記参照ゲノムにマッピングされた前記シーケンスリードと、前記病原体の前記参照ゲノムとの間で、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１塩基の最大ミスマッチを許容するように構成されている、請求項４４～５０のいずれかに記載の方法。
- 前記シーケンスリードのアラインが、前記病原体の前記参照ゲノムにマッピングされた前記シーケンスリードと、前記病原体の前記参照ゲノムとの間で、２塩基の最大ミスマッチを許容するように構成されている、請求項４４～５０のいずれかに記載の方法。
- 前記病原体の前記参照ゲノムにマッピングされた前記シーケンスリードの前記変異パターンに基づいて、前記被験者における前記病原体関連障害を、診断、予後診断またはモニタリングすることをさらに含む、請求項４４～５２のいずれかに記載の方法。
- 前記病原体からの前記無細胞核酸分子の前記変異パターンが、一塩基変異を含む、請求項４４～５３のいずれかに記載の方法。
- 前記変異パターンの同定が、
前記病原体の前記参照ゲノムにマッピングされた前記シーケンスリードと、前記病原体の障害関連参照ゲノムとの間の類似性レベルを決定することを含む、請求項４４～５４のいずれかに記載の方法。 - 前記病原体の前記障害関連参照ゲノムが、病変組織で同定された前記病原体のゲノムを含む、請求項５５に記載の方法。
- 前記類似性レベルの決定が、
前記病原体の前記参照ゲノムを複数のビンに分離することと、
前記病原体の前記障害関連参照ゲノムに対する、前記複数のビンのそれぞれの類似性指数を決定することであって、前記類似性指数が、前記病原体の前記参照ゲノムにマッピングされた前記シーケンスリードの少なくとも１つが、前記病原体の前記障害関連参照ゲノムと同じヌクレオチド変異を有する、前記各々のビン内の変異サイトの割合と相関する、決定することと、を含む、請求項５５または５６に記載の方法。 - 前記病原体の前記障害関連参照ゲノムが、前記病原体の複数の障害関連参照ゲノムを含み、かつ、前記類似性レベルの決定が、
前記病原体の前記複数の障害関連参照ゲノムそれぞれに対して、前記複数のビンのそれぞれについて各々の類似性指数を決定することと、
前記各々のビン内の前記各々の類似性指数が、カットオフ値を上回る前記複数の障害関連参照ゲノムの比率に基づいて、前記複数のビンそれぞれのビンスコアを決定することと、を含む、請求項５７に記載の方法。 - 前記カットオフ値が約０.９である、請求項５８に記載の方法。
- 前記複数のビンの長さがそれぞれ、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ｂｐである、請求項５７～５９のいずれかに記載の方法。
- 前記病原体からの前記無細胞核酸分子の前記変異パターンを含むデータ入力に適用された分類子を使用して、前記被験者が前期病原体関連障害を発症するリスクスコアを計算することであって、前記分類子が、前記病原体からの前記無細胞核酸分子の前記変異パターンを含むデータ入力に関数を適用するように構成され、前記被験者が前記障害を発症する前記リスクを評価する前記リスクスコアを含む出力を生成する、計算することをさらに含む、請求項４４～６０のいずれかに記載の方法。
- 前記分類子が、ラベル付けされたデータセットでトレーニングされる、請求項６１に記載の方法。
- 前記分類子が、ナイーブベイズモデル、ロジスティック回帰、ランダムフォレスト、ディシジョンツリー、勾配ブースティングツリー、ニューラルネットワーク、深層学習、線形／カーネルサポートベクターマシン（ＳＶＭ）、線形／非線形回帰、または線形判別分析を使用した数学モデルを含む、請求項６１または６２に記載の方法。
- 前記病原体がウィルスである、請求項４４～６３のいずれかに記載の方法。
- 前記ウィルスが、エプスタイン・バール・ウィルス（ＥＢＶ）である、請求項６４に記載の方法
- 前記病原体関連障害が、鼻咽頭癌、ＮＫ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、移植後リンパ増殖性疾患、またはホジキンリンパ腫を含む、請求項６５に記載の方法。
- 前記病原体からの前記無細胞核酸分子の前記変異パターンが、ＥＢＶ参照ゲノム（ＡＪ５０７７９９．２）に関連する表６に記載されているゲノムサイトから選択される少なくとも３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、または６００のサイトを含む、前記複数の変異サイトのそれぞれで前記病原体の前記参照ゲノムにマッピングされた前記シーケンスコードのヌクレオチド変異体を特性化する、請求項６５または６６に記載の方法。
- 前記複数の変異サイトが、ＥＢＶ参照ゲノム（ＡＪ５０７７９９．２）に関連する表６に記載されているゲノムサイトを含む、請求項６７に記載の方法。
- 前記病原体からの前記無細胞核酸分子の前記変異パターンが、ＥＢＶ参照ゲノム（ＡＪ５０７７９９．２）に関連する表６に記載されているゲノムサイトからランダムに選択された、前記複数の変異サイトのそれぞれで前記病原体の前記参照ゲノムにマッピングされた、前記シーケンスコードのヌクレオチド変異体を特性化する、請求項６５または６６に記載の方法。
- 前記病原体からの前記無細胞核酸分子の前記変異パターンが、ＥＢＶ参照ゲノム（ＡＪ５０７７９９．２）に関連する表６に記載されているゲノムサイトからランダムに選択される、少なくとも３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、または６００のサイトを含む、前記複数の変異サイトのそれぞれで前記病原体の前記参照ゲノムにマッピングされた前記シーケンスコードのヌクレオチド変異体を特性化する、請求項６５または６６に記載の方法。
- 前記ウィルスが、ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）である、請求項６４に記載の方法。
- 前記病原体関連障害が、子宮頸癌、中咽頭癌または頭頸部癌を含む、請求項７１に記載の方法。
- 前記ウィルスが、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）である、請求項６４に記載の方法。
- 前記病原体関連障害が、肝硬変または肝細胞癌（ＨＣＣ）を含む、請求項７３に記載の方法。
- 前記変異パターンが、前記被験者における病原体関連障害の状態を示し、かつ、前記病原性関連障害の前記状態が、前記被験者における前記病原性関連障害の存在、前記被験者における腫瘍組織の量、前記被験者における腫瘍組織のサイズ、前記被験者における腫瘍の病期、前記被験者における腫瘍負荷、または前記被験者における腫瘍転移の存在を含む、請求項４４～７４のいずれかに記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、バフィーコート、膣液、膣洗浄液、唾液、口腔リンス液、鼻洗浄液、鼻ブラシサンプル、および それらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４４～７５のいずれかに記載の方法。
- １つ以上のコンピュータプロセッサによる実行によって、請求項１～７６のいずれかの方法を実装する機械実行可能コードを含む非一時的なコンピュータ可読媒体。
- コンピュータシステムを制御して請求項１～７６のいずれかの方法のオペレーションを実施するための複数の命令を記憶する、非一時的なコンピュータ可読媒体を含むコンピュータ製品。
- 請求項７８に記載のコンピュータ製品と、
前記コンピュータ可読媒体に記憶された命令を実行するための１つ以上のプロセッサと、を含むシステム。
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