CN105902592A - 从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法。是将臭灵丹原料经过75‑100％乙醇提取，减压回收，得流浸膏备用。将浓缩物喷雾干燥，过80目筛得臭灵丹浸膏粉；或将臭灵丹的流浸膏经硅胶拌样吸附，挥干溶剂，再经超临界CO2流体萃取，得到臭灵丹萃取物；或将上述备用流浸膏经过大孔树脂柱，以乙醇‑水洗脱，得到臭灵丹二醇和臭灵丹酸富集的流份，减压浓缩到1/10体积，用等体积的乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯部分即得产品。

Description

从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法
技术领域
本发明属于天然药物化学领域，具体涉及一种从臭灵丹中提取、富集倍半萜类的工艺方法。
背景技术
臭灵丹(Laggerapterodonta(DC.)Benth.)系菊科[Compositae]翼齿六棱菊的地上干燥部分，具有清热解毒、抗菌消炎的功效，在民间广泛应用于风热感冒、止咳祛痰等疾病。现在据药理报道臭灵丹具有抗微生物、抗肿瘤、抗病毒、抗炎等活性，而临床中主要应用于治疗急性上呼吸道感染高热、治疗扁桃体炎、治疗流行性腮腺炎和止咳等。
倍半萜是一类由15个碳组成骨架的萜类化合物,广泛分布于自然界中,骨架结构不同,生理活性也多种多样，如抗疟活性成分黄花蒿中青蒿素、抗肿瘤生理活性成分吉马酮和莪术二酮、抑制人类B型肝炎表面抗原作用的云木香中倍半萜内酯化合物木香烯内酯和去氢香内酯等。据文献检索，臭灵丹中不仅含有黄酮类功能性成分，还含有倍半萜类功能性性成分。其中以臭灵丹中倍半萜类化合物含量最高的是臭灵丹二醇和臭灵丹酸。臭灵丹二醇和臭灵丹酸对金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、枯草芽胞杆菌、草分支杆菌和环状芽胞杆菌均呈现明显的抑菌活性。臭灵丹酸可抑制口腔上皮鳞癌(KB)细胞株、人肺腺癌(A549)细胞株和人恶性黑素瘤(SK-MEL)细胞株，20μg/ml时对三种细胞的抑制率分别为5.0％、1.6％、6.8％；当臭灵丹酸浓度为30μg/ml和10μg/ml时对人脑瘤细胞(TJ-905)的抑制率分别为16.0％、15.6％，显示出一定的抗肿瘤活性；臭灵丹酸对小鼠淋巴细胞增殖转化具有一定的抑制作用。冬青酸25mg/ml对金黄色葡萄球菌、乙型链球菌、甲型链球菌有一定抑菌作用,是臭灵丹中抗菌有效成分之一；冬青酸可抑制口腔上皮鳞癌(KB)细胞株、人肺腺癌(A549)细胞株和人恶性黑素瘤(SK-MEL)细胞株，当浓度为20μg/ml时对三种细胞的抑制率分别为7.0％、23.6％、10.3％。除了以上三个化合物外，臭灵丹中lβ-羟基-臭灵丹酸、2α,3β-二羟基-臭灵丹酸、臭灵丹三醇乙、臭灵丹酮酸A等倍半萜类化合物也具有一定的生物活性。
本发明发现臭灵丹具有抗病毒活性，主要活性部分在脂溶性的倍半萜部位。目前，现有技术中未见有富集臭灵丹中的倍半萜类成分成熟工艺的报道。
发明内容
本发明目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供从臭灵丹中提取、富集倍半萜类化合物的方法。本方法用超临界和树脂处理的方法富集臭灵丹中的倍半萜类成分。萃取过程中能耗低、无污染、效率高，工艺操作简单。大孔树脂法对设备要求不高，成本低，工艺操作简单。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法，该方法包括如下步骤：将臭灵丹经过75-100％乙醇提取，减压回收，得流浸膏，流浸膏经硅胶拌样吸附，得臭灵丹醇提物-硅胶吸附物，待溶剂挥干至无乙醇味；或将流浸膏喷雾干燥，过80目筛得臭灵丹浸膏粉；将上述臭灵丹醇提物-硅胶吸附物，加入超临界CO2萃取斧中，在萃取压力25Mpa、温度45℃条件下，超临界CO2萃取，解析，得臭灵丹萃取物，萃取物用旋转蒸发仪减压蒸干溶剂，再在0.075MPa压力下抽半小时，得倍半萜类化合物；或者将流浸膏水溶解后经大孔树脂柱吸附，用乙醇-水梯度洗脱，得到臭灵丹二醇和臭灵丹酸富集的流份，再减压浓缩到1/10体积，用等体积的乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯部分得臭灵丹倍半萜类成分。
如所述的从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法，其中所述倍半萜类成分是以臭灵丹二醇和臭灵丹酸为含量指标，含量25％-52％，流浸膏在60℃下测，密度为1.22。
如所述的从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法，其中所述的臭灵丹醇提物-硅胶拌样吸附量比为1∶1。
如所述的从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法，其中所述超临界CO2萃取采用先在压力25MPa下萃取2h；再加入夹带剂无水乙醇萃取1h，得有效萃取物，浸膏质量g与夹带剂体积ml比为10:1。
如所述的从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法，其中所述解析是在压力5-10MPa、温度45℃下进行。
如所述的从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法，其中所述大孔树脂为苯乙烯型大孔树脂，孔径9-11nm，比表面积550-600m2/g；所述的臭灵丹-大孔树脂拌样吸附量比为1∶1。
如所述的从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法，其中所述乙醇-水梯度洗脱中的乙醇浓度为40％、60％、80％、100％。
本发明同时提供一种从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法，取臭灵丹经过75-100％乙醇提取，减压回收，得流浸膏，流浸膏喷雾干燥，过80目筛得臭灵丹浸膏粉，加入超临界萃取斧中，在萃取压力25Mpa、温度45℃条件下，超临界CO2萃取，先在压力25MPa下,萃取2h；再加入夹带剂无水乙醇萃取1h，得有效萃取物，在压力5-10MPa、温度45℃下解析，得超临界萃取物，用旋转蒸发仪减压蒸干溶剂，再在0.075MPa压力下抽半小时即得倍半萜类成分，以臭灵丹二醇和臭灵丹酸为含量指标，经气相检测测出倍半萜类含量。
本发明另外还提供了如下从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法，取臭灵丹叶，95％乙醇加热回流，回流3次，每次4h,所得浸膏与硅胶拌样吸附，吸附量比为1∶1，待溶剂挥干至无醇味，加入超临界萃取斧中，在萃取压力25Mpa、温度45℃条件下，超临界CO2萃取先在压力25MPa下,萃取2h；再加入夹带剂无水乙醇30ml萃取1h，得有效萃取物，在压力5-10MPa、温度45℃下解析，用旋转蒸发仪减压蒸干溶剂，再在0.075MPa压力下抽半小时即得倍半萜类成分，经气相检测，以臭灵丹二醇和臭灵丹酸为含量指标，测得倍半萜类含量。
本发明还提供了另一种从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法，取臭灵丹全草，90％乙醇加热回流，加热回流两次，每次4h,减压回收溶剂得臭灵丹醇提物，取臭灵丹提提物浸膏，水溶解后经大孔树脂柱层析，乙醇-水40％、60％、80％、100％梯度洗脱，分别得到40％，60％,80％，100％的洗脱部分，并检测得到臭灵丹二醇和臭灵丹酸富集的流份即60％和80％的部分，弃去40％和100％的部分，再减压浓缩到1/10体积，浓缩物出现白色浑浊物时，用等体积的乙酸乙酯萃取，再浓缩乙酸乙酯部分即得臭灵丹倍半萜类成分。
与现有技术相比，本发明的优势是:本发明用超临界和树脂处理的方法富集臭灵丹中的倍半萜类成分。超临界流体是处于临界温度和临界压力以上的流体，密度接近液体,粘度和扩散系数则接近气体,具有良好的溶解性和传递特性；超临界流体萃取技术正是利用超临界流体在超临界状态下对有机物有特殊增加的溶解度,而低于临界状态下对有机物基本不溶解的特性,将超临界流体不断在萃取釜和分离釜间循环,从而有效地将需要分离提取的组分分离出。超临界CO2流体萃取技术与传统的提取工艺相比，具有高效、无溶剂残留、选择性强、操作条件温和等特点，是近年来食品工业新兴的一种萃取和分离技术,广泛应用于啤酒花及咖啡因,香精,色素以及脂类物质等食品和天然产物研究方面。应用超临界CO2流体萃取技术可以有选择性萃取出极性大小、沸点高低、分子量大小的化合物。而臭灵丹中倍半萜类属于脂溶性化合物，分子量小所以用这个方法萃取出。树脂处理方法可以快速洗脱大极性的杂质，富集脂溶性的倍半萜类成分，在工业化生产中应用广泛。本发明采用超临界CO2萃取技术和大孔树脂富集倍半萜，萃取过程中能耗低、无污染、效率高，工艺操作简单。大孔树脂法对设备要求不高，成本低，工艺操作简单。
附图说明：
图1为HPLC-MS臭灵丹醇提取物BPC离子流图，
图1A为HPLC-MS臭灵丹醇提取物254nm下的紫外吸收图，
图1B为峰9、10、11、12.，
图1C为峰2C22H40O10ESI+，
图1D为峰2C22H40O10ESI-，
图1E为峰3C25H24O12ESI+，
图1F为峰3C25H24O12ESI-。
图中，峰1C21H38O8[M+HCOO-]463.2558(463.2549)臭灵丹苷E
峰4C21H38O7[M+Na]+425.2509(425.2510),[M+HCOO]-447.2610(447.2600)臭灵丹苷D
峰5C18H16O8[M+H]+361.0914(361.0918),[M-H]-359.0813(359.0772)
峰6C18H16O8[M+H]+361.0929(361.0918),[M-H]-359.0783(359.0772)
峰7C19H18O8[M+H]+375.1071(375.1074),[M-H]-373.0950(373.0929)，金腰素乙
峰8C18H16O7[M+H]+345.0944(345.0969),[M-H]-343.0808(343.0823),喷杜素
峰9C20H20O8[M+H]+389.1250(389.1231),洋艾素
峰10C19H18O7[M+H]+359.1113(359.1125),-hydroxyl-3,4',6,7-tetramethoxylnavone
峰11C15H22O2[M+H]+235.1671(235.1693),[M-H]-233.1547(233.1547),臭灵丹酸。
图2为HPLC-MS超临界提取物BPC离子流图，图2A为254nm下的紫外吸收图，图2B为峰3、5、6、7。
图中，峰1C20H32O6[M+Na]+391.2165(391.2091),[M+HCOO]-413.2191(413.2181)
峰2C18H16O8[M+H]+361.0934(361.0918),[M-H]-359.0786(359.0772)
峰3C19H18O8[M+H]+375.1065(375.1074),[M-H]-373.0948(373.0929),金腰素乙
峰4C18H16O7[M+H]+345.0962(345.0969),[M-H]-343.0833(343.0823),喷杜素
峰5C20H20O8[M+H]+389.1224(389.1231),洋艾素
峰6C19H18O7[M+H]+359.1117(359.1125),5-hydroxyl-3,4',6,7-tetramethoxylnavone
峰7C15H22O2[M+H]+235.1657(235.1693),[M-H]-233.1555(233.1547),臭灵丹酸。
图3为灵丹草浸膏粉气相色谱图；
图4为灵丹草浸膏粉超临界萃取物气相色谱图；
图5为灵丹草叶醇提物气相色谱图；
图6为灵丹草叶超临界萃取物气相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1：
将臭灵丹叶16.6kg,经过75-100％乙醇提取，减压回收，得流浸膏1.678kg..将流浸膏喷雾干燥，过80目筛得臭灵丹浸膏粉1.171kg。取臭灵丹浸膏粉1.5kg，拌硅胶后加入超临界萃取斧中，在萃取压力25Mpa、温度45℃条件下，超临界CO2萃取先在压力25MPa下,萃取2h；再加入夹带剂无水乙醇150ml萃取1h，得有效萃取物，解析，得超临界萃取物，用旋转蒸发仪减压蒸干溶剂，再在0.075MPa压力下抽半小时即得产品54g，经气相检测以臭灵丹二醇和臭灵丹酸为含量指标，测得倍半萜类含量得28.34％，萃取率75％。经气相检测以臭灵丹二醇为含量指标，用外标法计算，得臭灵丹浸膏粉、臭灵丹超临界萃取物中臭灵丹二醇含量分别为0.50％，11.62％，相对于臭灵丹浸膏粉萃取率为83.37％。臭灵丹浸膏粉气相色谱图，臭灵丹浸膏粉超临界萃取物气相色谱图详见图3、图4。
实施例2：
取臭灵丹叶2kg，95％乙醇加热回流，回流3次，每次4h,所得浸膏与硅胶拌样吸附，吸附量比为1∶1，待溶剂挥干至无醇味，加入超临界萃取斧中，在萃取压力25Mpa、温度45℃条件下，超临界CO2萃取先在压力25MPa下,萃取2h；再加入夹带剂无水乙醇30ml萃取1h，得有效萃取物，解析，用旋转蒸发仪减压蒸干溶剂，再在0.075MPa压力下抽半小时即得产品85g，经气相检测以臭灵丹二醇和臭灵丹酸为含量指标，测得倍半萜类含量得51.78％，对于醇提物萃取率75％。
以臭灵丹二醇为含量指标，臭灵丹叶、臭灵丹叶醇提物和臭灵丹叶超临界萃取物经气相检测，用外标法计算，得臭灵丹叶、臭灵丹叶醇提物和臭灵丹叶超临界萃取物中臭灵丹二醇含量分别为1.19％，5.71％和13.31％，相对于醇提物萃取率为66.11％。臭灵丹叶醇提物气相色谱图，臭灵丹叶超临界萃取物气相色谱图详见图5、图6。
实施例3：
取臭灵丹全草地上部分150g，90％乙醇加热回流，加热回流两次，每次4h,减压回收溶剂得臭灵丹醇提物，取臭灵丹醇提物10g与大孔树脂拌样吸附，经大孔树脂柱，乙醇-水(40％、60％、80％、100％)梯度洗脱，分别得到40％，60％,80％，100％的洗脱部分，并检测得到臭灵丹二醇和臭灵丹酸富集的流份(60％和80％的部分)，弃去40％和100％的部分，再减压浓缩到1/10体积(浓缩物出现白色浑浊物)，用等体积的乙酸乙酯萃取，再浓缩乙酸乙酯部分即得臭灵丹倍半萜类的成分。
以臭灵丹二醇为含量指标，臭灵丹醇提物、60％乙醇大孔树脂洗脱物和80％乙醇大孔树脂洗脱物经气相检测，用外标法计算，得臭灵丹醇提物、60％乙醇大孔树脂洗脱物和80％乙醇大孔树脂洗脱物臭灵丹二醇含量分别为4.73％、33.00％，14.79％，对于臭灵丹醇提物、60％乙醇大孔树脂洗脱物和80％乙醇大孔树脂洗脱物相对于臭灵丹醇提物洗脱率分别为60.54％、30.18％。臭灵丹醇提物气相色谱图、臭灵丹60％乙醇大孔树脂洗脱物气相色谱图和臭灵丹80％大孔树脂洗脱物气相色谱图详见附图。
实施例4：
取臭灵丹乙醇提取物流浸膏和流浸膏拌硅胶后经超临界萃取物各取2.04mg，分别以1.0ml甲醇超声溶解再以0.22um的滤膜过滤后进行LC-MS分析。
色谱纯乙腈购自德国默克公司，超纯水由默克MingCheTM-D 24UV设备制备，色谱纯甲酸购自上海阿拉丁试剂公司，分析纯甲醇购自天津大茂化学试剂厂。
液相色谱仪为岛津LCMS-IT-TOF仪，控制器型号为CBM-20A，泵型号为LC-30AD，自动进样器型号为SIL-30AC，柱温箱型号为CTO-20AC，脱气装置型号为DGU-20A5，二极管阵列检测器为SPD-M20A。色谱柱为赛默飞C18柱(100×2.1mm×1.9um)，紫外检测波长范围为190-400nm。流动相A：甲酸/水(0.05/100，v/v,)，B：甲酸/乙腈(0.05/100，v/v)。流速为0.2ml/min，梯度洗脱条件为0-12min，20％-100％B；12-14min，100％B；14-16min，100-20％B；16-20min，20％B。柱温30℃。
质谱仪为岛津LCMS–IT–TOF仪，离子源为ESI源，三氟乙酸钠校正，电喷雾正负离子同时检测，在自动模式下检测三级质谱。分析条件如下：喷雾电压为4.50kV或-3.50kV；检测电压为1.65kV；旋转式真空泵压力为71.0Pa；干燥气压力为110.0kPa；喷雾气为氮气，流速为1.5L/min；曲形裂解器(CDL)温度为200℃；加热模块温度为200℃；离子捕获时间为10ms；母离子选择范围为m/z±3.0Da；裂解能量(CID)为50％；裂解气位氩气，扫描范围为m/z 100–1000。Shimadzu Composition Formula Predictor软件用于预测分子式。分析结果见表1、表2。
表1臭灵丹醇提取物测定结果主要峰的相对含量
表2超临界萃取物测定结果主要峰的相对含量

Claims (10)

1.从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：将臭灵丹经75-100％乙醇提取，减压回收，得流浸膏，流浸膏经硅胶拌样吸附，得臭灵丹醇提物-硅胶吸附物，待溶剂挥干至无乙醇味；或将流浸膏喷雾干燥，过80目筛得臭灵丹浸膏粉；上述臭灵丹醇提物-硅胶吸附物或臭灵丹浸膏粉加入超临界CO2萃取斧中，在萃取压力25Mpa、温度45℃条件下，超临界CO2萃取，解析，得臭灵丹萃取物，萃取物用旋转蒸发仪减压蒸干溶剂，再在0.075MPa压力下抽半小时，得倍半萜类化合物；或者将流浸膏水溶后经大孔树脂柱吸附，乙醇-水梯度洗脱，得到臭灵丹二醇和臭灵丹酸富集的流份，再减压浓缩到1/10体积，用等体积的乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯部分得臭灵丹倍半萜类成分。
2.如权利要求1所述的从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法，其特征在于所述倍半萜类成分是以臭灵丹二醇和臭灵丹酸为含量指标，含量25％-52％，流浸膏在60℃下检测密度为1.22。
3.如权利要求1所述的从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法，其特征在于所述的臭灵丹醇提物-硅胶拌样吸附量比为1∶1。
4.如权利要求1所述的从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法，其特征在于所述超临界CO2萃取采用先在压力25MPa下萃取2h；再加入夹带剂无水乙醇萃取1h，得有效萃取物，浸膏质量g与夹带剂体积ml比为10:1。
5.如权利要求1所述的从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法，其特征在于所述解析是在压力5-10MPa、温度45℃下进行。
6.如权利要求1所述的从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法，其特征在于所述大孔树脂为苯乙烯型大孔树脂，孔径9-11nm，比表面积550-600m2/g；所述的臭灵丹-大孔树脂拌样吸附量比为1∶1，待溶剂挥干至无乙醇味。
7.如权利要求1所述的从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法，其特征在于所述乙醇-水梯度洗脱中的乙醇浓度为40％、60％、80％、100％。
8.从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法，取臭灵丹经过75-100％乙醇提取，减压回收，得流浸膏，流浸膏喷雾干燥，过80目筛得臭灵丹浸膏粉，加入超临界萃取斧中，在萃取压力25Mpa、温度45℃条件下，超临界CO2萃取，先在压力25MPa下,萃取2h；再加入夹带剂无水乙醇萃取1h，得有效萃取物，在压力5-10MPa、温度45℃下解析，得超临界萃取物，用旋转蒸发仪减压蒸干溶剂，再在0.075MPa压力下抽半小时即得倍半萜类成分，以臭灵丹二醇和臭灵丹酸为含量指标，经气相检测测出倍半萜类含量。
9.从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法，取臭灵丹叶，95％乙醇加热回流，回流3次，每次4h,所得浸膏与硅胶拌样吸附，吸附量比为1∶1，待溶剂挥干至无醇味，加入超临界萃取斧中，在萃取压力25Mpa、温度45℃条件下，超临界CO2萃取先在压力25MPa下,萃取2h；再加入夹带剂无水乙醇30ml萃取1h，得有效萃取物，在压力5-10MPa、温度45℃下解析，用旋转蒸发仪减压蒸干溶剂，再在0.075MPa压力下抽半小时即得倍半萜类成分，经气相检测，以臭灵丹二醇和臭灵丹酸为含量指标，测得倍半萜类含量。
10.从臭灵丹中提取倍半萜类成分的方法，取臭灵丹全草，90％乙醇加热回流，加热回流提取两次，每次4h,减压回收溶剂得臭灵丹醇提物，取臭灵丹醇提物与大孔树脂拌样吸附，待溶剂挥干至无乙醇味，经大孔树脂柱，乙醇-水40％、60％、80％、100％梯度洗脱，分别得到40％，60％,80％，100％的洗脱部分，并检测得到臭灵丹二醇和臭灵丹酸富集的流份即60％和80％的部分，弃去40％和100％的部分，再减压浓缩到1/10体积，浓缩物出现白色浑浊物时，用等体积的乙酸乙酯萃取，再浓缩乙酸乙酯部分即得臭灵丹倍半萜类成分。
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