CN105886578A - 制备作为用于制备天然调味剂的原材料的imp 发酵液或谷氨酸发酵液的方法 - Google Patents

制备作为用于制备天然调味剂的原材料的imp 发酵液或谷氨酸发酵液的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及制备天然中性调味剂的方法，更具体地，涉及使用通过两步发酵法制备的肌苷‑5’‑单磷酸盐(IMP)发酵液或谷氨酸发酵液来制备天然中性调味剂的方法，所述两步发酵法包括用于真菌发酵的第一发酵步骤和用于细菌发酵的第二发酵步骤，本发明涉及通过该方法制备的天然中性调味剂以及包含该天然中性调味剂的食品组合物。根据本发明的方法制备的天然中性调味剂使用天然原材料制备，因此对于用于人体而言是无害且安全的，并且可以添加到食品以产生纯正且温和的味道并改善食品滋味。

Description

制备作为用于制备天然调味剂的原材料的IMP 发酵液或谷氨 酸发酵液的方法
技术领域
本发明涉及制备天然中性调味剂的方法，更具体地，涉及使用通过两步发酵法制备的肌苷-5’-单磷酸盐(IMP)发酵液或谷氨酸发酵液来制备天然中性调味剂的方法，所述两步发酵法包括用于真菌发酵的第一发酵步骤和用于细菌发酵的第二发酵步骤，本发明涉及通过该方法制备的天然中性调味剂以及包含该天然中性调味剂的食品组合物。
背景技术
氨基酸和肽用作调味剂组分。近年来，以多种方式开发出通过用微生物(例如真菌、杆菌、乳酸菌或酵母)发酵植物蛋白质源(例如大豆、小麦或玉米)并水解发酵产物而提取的包含氨基酸和肽的天然调味材料。
通常，已开发出下述技术，其通过增加植物蛋白质源的水解度来改善提取的味道组分(氨基酸和肽)或者通过增加质量方面的产率来增加价格竞争力。然而，当仅使用植物蛋白质源时，不利之处在于在所得的调味材料中不存在核酸组分，因此调味材料的鲜味强度弱。此外，为了增加调味材料的经济价值，需要调味材料包含谷氨酸和诸如肌苷单磷酸盐(IMP)或鸟苷单磷酸盐(GMP)的核酸。
近年来，为了克服植物蛋白水解产物的上述缺陷，已经广泛使用诸如酵母提取物的天然的含核酸的材料。然而，酵母提取物可能由于其特殊发酵气味造成的异味(off-flavor)和臭味(off-odor)而对加工的食品的固有滋味产生不利影响，并且其核酸含量有限(最大核酸含量：20％)。此外，与诸如谷氨酸单钠(MSG)、核酸IG或水解植物蛋白质(HVP)的常用调味材料相比，在天然加工的食品中使用的植物蛋白物质与酵母提取物的混合物具有低的价格竞争力。
同时，IMP连同GMP是广泛用作食品调味添加剂的物质。当IMP明确与谷氨酸单钠(MSG)一起使用时，其具有改善味道的显著能力。因此，IMP是作为调味物质而受到关注的基于核酸的调味物质。
发酵IMP和GMP以用作调味物质的方法包括降解酵母RNA的方法，以及在制备肌苷和鸟苷之后通过两个步骤(发酵和化学磷酸化)来制备IMP和GMP的方法。然而，近年来，在包括欧洲在内的多个国家中，已经加强了对天然调味剂的标准，并且规程变得更严格，因此，并非仅由天然组分制成而是通过进行化学过程或添加额外的组分而制备的调味剂不被认为是天然调味剂。对此，应使用由细菌直接发酵糖的方法来制备天然核酸组分。
在这样的情形下，本发明人已进行了广泛的尝试以在不进行任何化学过程的情况下制备不含额外的组分的天然调味剂，因此已发现，当使用通过包括用于酵母发酵的第一发酵步骤和用于细菌发酵的第二发酵步骤的两步发酵法产生的IMP或谷氨酸发酵液时，甚至当仅将该发酵液用于后续反应时，可以产生多种有效的滋味，由此完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供制备不含额外的组分的天然中性调味剂的方法，其不进行任何化学方法并使用通过用于真菌发酵的第一发酵步骤和用于细菌发酵的第二发酵步骤制备的肌苷-5'-单磷酸盐(IMP)发酵液或谷氨酸发酵液。
本发明的另一目的是提供通过上述方法制备的天然中性调味剂。
本发明的又一目的是提供包含上述天然中性调味剂的食品组合物。
技术方案
为了实现上述目的，在一个方面，本发明提供了制备天然中性调味剂的方法，所述方法包括步骤：(a)用真菌发酵植物蛋白质源以获 得谷物发酵液；(b)用细菌发酵所述谷物发酵液以制备肌苷-5’-单磷酸盐(IMP)发酵液和谷氨酸发酵液；(c)电渗析所述IMP发酵液；以及(d)将步骤(b)的所述谷氨酸发酵液与步骤(c)的所述IMP发酵液混合。
图1示意地示出本发明的制备天然调味剂的方法。
具体地，谷氨酸发酵液、IMP发酵液和谷物发酵液通过用于真菌发酵的第一发酵步骤和用于细菌发酵的第二发酵步骤制备，并且经历其中反应或处理适于每一调味剂的第三步骤，由此制备每一天然调味剂。
因此，本发明的特征在于用作制备天然调味剂的原材料的天然IMP发酵液和谷氨酸发酵液通过两步发酵法制备，所述两步发酵法包括用于真菌发酵的第一发酵步骤和用于细菌发酵的第二发酵步骤。
用于真菌发酵的第一发酵步骤是使用蛋白质源产生肽和氨基酸的步骤。当仅进行用于真菌发酵的第一发酵步骤时，可以产生大量的肽和氨基酸，因此可以产生可用作调味剂的谷氨酸。然而，不利之处在于不能产生可给予鲜味的诸如IMP或鸟苷单磷酸盐(GMP)的核酸物质。此外，问题在于，当使用植物蛋白质源时，其仅经历蛋白水解过程，因此可以产生的肽和氨基酸取决于蛋白质源中的蛋白质的浓度或含量。例如，当使用豆类时，产生的发酵液中的谷氨酸的含量会小于10％，而当使用小麦面筋时，产生的发酵液中的谷氨酸的含量会小于15％。
同时，用于细菌发酵的第二发酵步骤是制备核酸和谷氨酸发酵液的步骤。当仅进行用于细菌发酵的第二发酵步骤时，可以有效地产生核酸和谷氨酸，但不足之处在于以小于1％的浓度产生其他氨基酸和肽的含量，因此使用细菌的发酵液不能用作调味剂，尽管其具有良好的鲜味。换言之，不足之处在于，为了将仅通过细菌发酵获得的发酵液用作调味剂，需要向发酵液添加额外的组分，以使发酵液可以应用于食品。
因此，本发明人已经开发出在不添加任何额外的组分并且不进行任何化学过程的情况下，通过仅使用制备的发酵液来制备天然调味剂并同时克服真菌发酵法和细菌发酵法的缺点的方法。
为了使用两步发酵法制备核酸和谷氨酸发酵液，需要多种矿物盐、氨基酸和维生素以及碳源和氮源。特别地，在现有技术中，将酵母提取物或水解植物蛋白质(HVP)用作氮源，但在该情况下，不足之处在于所得的发酵液具有异味和臭味，并且产率略低。此外，所得的培养液中调味组分的含量以及整体滋味根据用于细菌发酵的各种材料而显著不同。因此，在本发明中，通过真菌发酵(第一发酵步骤)获得并可包含多种氨基酸和肽的谷物发酵液(谷物蛋白水解产物)在用作氮源的同时用作用于细菌发酵的第二发酵步骤所用的底物。
在使用细菌制备核酸或MSG的常规方法中，仅高度重视提高培养液中核酸和MSG的浓度及其产率。这种提高有效地增加了鲜味，但在一些情况下，其对所得的调味物质的滋味有不利影响。然而，通过使用本发明的3个步骤制备的多种天然调味剂的有利之处在于可以通过控制作为鲜味组分的IMP和谷氨酸以及各种氨基酸、糖、有机酸和无机离子等的浓度来改善滋味。
本文中，将描述本发明的用于制备天然调味剂的方法的每一步骤。
本发明的方法的步骤(a)是用真菌发酵植物蛋白质源以获得谷物发酵液的步骤。
在步骤(a)中，使用植物蛋白质源进行真菌发酵，由此获得包含多种氨基酸和肽并包含诸如谷氨酰胺的组分的谷物发酵液，所述诸如谷氨酰胺的组分可以在用于细菌发酵的第二发酵步骤中用作氮源。具体地，使用谷物材料作为底物来培养真菌以制备含蛋白酶的细胞培养液，其随后被添加到植物蛋白质源，然后进行水解，由此制备谷物蛋白水解产物。然后，过滤该谷物蛋白水解产物，并从其中去除细胞，由此制备谷物发酵液。谷物蛋白水解产物可以具有2％(w/v)以上的总氮含量，从而提供用于细菌发酵的第二发酵步骤所用的氮源。
作为植物蛋白质源，可以在本发明中使用本领域已知的任何材料，只要其可以用真菌发酵即可。植物蛋白质源的实例包括但不限于大豆、玉米、稻米、小麦面筋等。同时，当使用小麦面筋时，其可以有利地增加细菌发酵的产率，因为其包含大量的谷氨酰胺。因此，小麦面筋可以优选地用作植物蛋白质源。
作为真菌，在本发明中可以使用任何真菌，只要它们能够发酵植物蛋白质源以制备本发明的谷物发酵液即可。用于本发明的真菌可以优选为曲霉属(Aspergillus sp.)微生物，并且更优选为米曲霉(Aspergillus orizae)或酱油曲霉(Aspergillus sojae)微生物，但不限于此。
在本发明的实例中，使用在登记号10-1191010的韩国专利(对应于第WO2011-046249号PCT国际公开)中描述的酱油曲霉CJCC_080124P(KCCM11026P)来进行用于真菌发酵的第一发酵步骤。
如本文所用，术语“谷物发酵液”是指通过用真菌发酵植物蛋白质源(谷物)而获得的产物。谷物发酵液可以用作用于细菌发酵的第二发酵步骤所用的底物，并且还可以用于通过使谷物发酵液经历过滤和在发酵后的细胞去除过程来制备调味剂的最终步骤。因此，谷物发酵液可以用于上文所述的两个用途。
步骤(b)是用细菌发酵在步骤(a)中获得的谷物发酵液以制备IMP发酵液和谷氨酸发酵液的步骤。具体地，在用于真菌发酵的第一发酵步骤中获得的谷物发酵液用作用于细菌发酵的底物，并且可以通过使谷物发酵液在补充有碳源的培养基中经历细菌发酵来制备IMP发酵液和谷氨酸发酵液。
可以通过本领域已知的一般细菌培养方法来进行细菌发酵，并且优选地，其可以由三个步骤组成：烧瓶培养、放大培养和主要培养(main culture)。具体地，使用初代培养基和继代培养基来进行烧瓶培养和扩增培养，从而实现扩大，其后使用步骤(a)的谷物发酵液作为主要培养基中的底物并同时连续供给额外的糖来进行细菌发酵，由此获得IMP发酵液和谷氨酸发酵液。
用于细菌发酵的培养基可以包括诸如葡萄糖、果糖等的碳源。特别地，用于制备谷氨酸发酵液的培养基可以包含作为碳源的粗糖。培养基可以包括多种矿物盐、维生素和氨基酸等，并且培养基的组成可以根据作为IMP发酵液或谷氨酸发酵液的所需发酵产物而变化。
例如，当要制备IMP发酵液时，主要培养基可以包含葡萄糖、果糖、硫酸镁、磷酸、氢氧化钾和谷物发酵液。优选地，基于培养基的总体积，主要培养基可以包含4.4重量％至5.2重量％的葡萄糖、3.7 重量％至4.3重量％的果糖、1.3重量％至1.7重量％的硫酸镁、2.0重量％至2.4重量％的磷酸、1.4重量％至1.8重量％的氢氧化钾和0.5重量％至0.9重量％的谷物发酵液。此外，当要制备谷氨酸发酵液时，主要培养基可以包含葡萄糖、果糖、粗糖、甜菜碱、硫酸镁、磷酸钾和磷酸，并且优选地，基于培养基的总重量，主要培养基可以包含0.5重量％至0.7重量％的葡萄糖、0.9重量％至1.1重量％的果糖、4.5重量％至5.5重量％的粗糖、0.005重量％至0.015重量％的甜菜碱、0.3重量％至0.5重量％的硫酸镁、0.8重量％至1.0重量％的磷酸钾和0.2重量％至0.4重量％的磷酸。
此外，若需要，培养基可以包含少量的其他组分，例如硫酸铁、硫酸锰、硫酸铜、硫酸锌、CAPA、NCA(烟酰胺)、生物素、氯化钙、硫胺素、维生素C等。包含这些组分的每一种培养基的典型实例示于表5至8及9至12中。
由于步骤(a)的真菌发酵，植物蛋白质源因此分解成氨基酸和肽，并且从蛋白质源中洗脱出诸如钙离子、镁离子和磷酸根离子的无机离子以及维生素。通过真菌发酵制备的氨基酸包括谷氨酰胺、半胱氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等，并且可以用作步骤(b)的细菌发酵中的氮源。特别地，高浓度的谷氨酰胺是嘌呤生物合成的必要组分，并且可以作为用于产生高含量的IMP和谷氨酸的主要促进剂。此外，洗脱的无机离子和维生素可以有助于细菌发酵中细菌细胞的生长。在本发明的实例中，示出当通过真菌发酵而获得的产物用作营养源时，细菌细胞的增殖和生长变得更迅速(图4)。这进一步证明了本发明的两步法的优势。
如本文所用，术语“细菌”是指可以发酵在步骤(a)中获得的谷物发酵液以产生IMP发酵液和谷氨酸发酵液的任何细菌。为了制备本发明的天然调味剂，可以使用非基因改造(non-GMO)菌株。用于本发明的细菌可以是本领域已知具有通过发酵产生IMP和谷氨酸的能力的任何细菌。例如，当要制备IMP发酵液时，可以使用芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)或埃希杆菌属(Escherichia sp.)微生物，并且当要制备谷氨酸发酵液时，可以使用棒状杆菌属、细杆 菌属(Microbacterium sp.)、芽孢杆菌属、链霉菌属(Streptomyces sp.)、青霉菌属(Penicillium sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)、沙雷菌属(Serratia sp.)、念珠菌属(Candida sp.)、克雷伯杆菌属(Klebsiella sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、泛生菌属(Pantoea sp.)或肠杆菌属(Enterobacter sp.)微生物。更优选地，用于本发明的细菌可以是棒状杆菌属微生物。最优选地，可以使用产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)来制备IMP发酵液，并且可以使用谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)来制备谷氨酸发酵液。此外，作为细菌，可以使用先前专利文献中公开并已知具有产生IMP和谷氨酸的能力的各种细菌。例如，可以使用第10-2007-000507号韩国专利公开(对应于第WO2005-095627号PCT国际专利公开)所披露的芽孢杆菌属或埃希杆菌属细菌来制备IMP发酵液，并且可以使用第10-2000-0029174号专利公开(对应于第7247459号美国专利)中披露的肠杆菌属或克雷伯杆菌属来制备谷氨酸发酵液。
在本发明的实例中，为了制备IMP发酵液，使用登记号10-0397321的韩国专利(对应于第WO2002-051984号WO国际专利公开)中描述的产氨棒状杆菌CJIP009(KCCM-10226)，并且为了制备谷氨酸发酵液，使用登记号10-0264740的韩国专利中描述的谷氨酸棒状杆菌(乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum))CJ971010(KFCC 11039)。
通过步骤(b)的细菌发酵而获得的发酵液具有约150g/L的固体含量。本发明的特征在于通过细菌发酵而获得的IMP和/或谷氨酸发酵液用于天然调味剂制备方法而不向其添加任何额外的组分，发酵液应包含大量的作为所需组分的IMP和谷氨酸。
因此，通过用于真菌发酵的第一发酵步骤和用于细菌发酵的第二发酵步骤而制备的IMP发酵液中的固体可以优选具有30％以上的IMP含量，更优选50％以上，但不限于此。因此，IMP发酵液中IMP的浓度可以优选为50g/L至150g/L，更优选为70g/L至130g/L。
此外，因为通过用于真菌发酵的第一发酵步骤产生的产物包含氨基酸，所以与IMP相比，可以以高浓度和高产率获得谷氨酸。制备的谷氨酸发酵液中的固体可以优选具有50％以上的谷氨酸含量，优选 60％以上，但不限于此。因此，谷氨酸发酵液中谷氨酸的浓度可以优选为75g/L至150g/L，更优选为90g/L至130g/L。
由于上述发酵液中IMP和谷氨酸的高含量，因此当通过诸如干燥的方法来粉化发酵液时，可以将其适当地添加到食品。
如本文所用，术语“调味剂”是指为了改善食品滋味而添加的物质。调味剂可以根据其组分而分类成各种调味剂。调味剂的具体实例包括中性调味剂、牛肉调味剂、鸡肉调味剂、猪肉调味剂和厚味(kokumi)调味剂。可以使用通过本发明的两步发酵法制备的IMP发酵液和谷氨酸发酵液来制备每一种调味剂。其中，术语“中性调味剂”是指通过使鲜味最大化并使其他滋味最小化而给出温和且纯正的味道的调味剂。例如，已经报道诸如卡诺拉(canola)油或葡萄籽油的油类具有中性滋味。
因为本发明的发酵液的特征在于其用于天然调味剂制备方法而不添加任何额外的组分并且不经历额外的诸如纯化的化学过程，因此为了将发酵液直接包含在食品如加工过的食品中，所有的培养基组分应是食品级材料。因此，在发酵期间添加的所有培养基组分优选为食品级材料。在本发明的实例中，为了将食品级材料用作培养基组分，用泛酸钙(calcium panthothenate，CAPA)来替代β-丙氨酸，然而，已表明可以制备IMP浓度为70g/L以上的IMP发酵液。因此，用于本发明的细菌发酵的培养基可以优选包含CAPA。
可以通过包括步骤(a)和(b)的两步发酵法来制备IMP发酵液和谷氨酸发酵液中的每一种，并且所制备的发酵液可以最终进行用于反应的第三步骤，并且可以用于制备各种调味剂的方法。基于IMP发酵液和谷氨酸发酵液，可以通过使用不同的原材料、或稍微改变培养基组成、或控制在混合发酵液过程中或在下文公开的反应或电渗析过程中的过程条件(包括温度、压力和时间)，从而制备各种天然调味剂，例如中性调味剂以及用于牛肉、鸡肉、猪肉、厚味等的调味剂。在制备的天然调味剂中，可以向食品添加适于每一食品用途的调味剂以给予最佳味道。
步骤(c)是电渗析IMP发酵液以具有适于中性调味剂的物理性质 的步骤。因为IMP发酵液由于其发酵过程而包括硫酸、氨以及诸如Mg和Mn的各种金属离子，所述IMP发酵液具有不适于意欲具有纯正味道的中性调味剂的异味和臭味。因此，电渗析步骤去除异味和臭味以从中性调味剂消除令人不愉快的味道或苦味，并且能使中性调味剂具有更纯正且更温和的味道，并且可以导致具有适于中性调味剂的物理性质。另外且非必要的，电渗析步骤还可以使得与IMP发酵液相比具有相对更低的异味和臭味的谷氨酸发酵液具有更纯正的味道。
在本发明的实例中，使用电渗析过程来制备中性调味剂，并且将所制备的调味剂的感官属性与无电渗析过程而制备的样品的感官属性进行比较。因此，表明所制备的调味剂的金属味强度、苦味、令人不愉快的强度及暗黑色均降低，因此所制备的调味剂具有纯正且温和的滋味，并且调味剂的总体偏好增加(图5)。
如本文所用，术语“电渗析(ED)”是指将离子组分与溶液分离的过程。其在理论上基于物质传递原理，其中通过向电场施加的电压而使溶液中的离子组分选择性穿过阳离子交换树脂膜和阴离子交换树脂膜。其是最常与逆渗透和超滤过程一起使用的膜过程。因为电渗析过程不能视为化学过程，因此其可以出于本发明的目的而用于天然调味剂制备方法。出于本发明的目的，可以通过电渗析过程来去除发酵液中的离子，例如金属离子、特别是单价和二价的阳离子和阴离子，由此去除臭味。
使用活性炭处理是通过脱色和除臭而去除异味和臭味的公知方法。然而，使用活性炭的处理的缺点在于活性炭可以通过物理吸收而导致脱色和除臭，但不能滤除所有离子组分。因此，在本发明中，可以通过电渗析过程来制备具有更纯正且更温和的味道的天然中性调味剂，由此去除异味和臭味。
同时，步骤(c)可以还包括在电渗析过程之前用活性炭处理发酵液的步骤。此外，电渗析过程可以在离心或过滤经活性炭处理的发酵液之后进行。在用活性炭处理发酵液之后，其可以进一步被作为过滤助剂的硅藻土处理。此外，在用活性炭处理发酵液之前，其可以经历加热发酵液以诱导细胞溶解的预处理过程，从而增加随后进行的过滤过 程的产率。加热过程可以优选在70℃至90℃下进行，并且加热时间可以优选为15分钟或更久，更优选为15分钟至60分钟。
步骤(d)是混合从先前步骤获得的谷氨酸发酵液和IMP发酵液以制备天然中性调味剂的步骤。此外，步骤(d)可以还包括与谷物发酵液混合的步骤。
在步骤(d)，可以通过将经由本发明的制备方法的IMP发酵液和谷氨酸发酵液混合来最终制备天然中性调味剂。在本文中，IMP发酵液和谷氨酸发酵液的混合比可以优选为0.2:1至5:1，更优选为0.5:1至2:1，最优选为1:1，但不限于此。此外，混合的发酵液可以进一步与谷物发酵液混合。
本发明的混合步骤可以还包括浓缩发酵液并干燥浓缩物以制备粉末的步骤。将发酵液制备成粉末的步骤可以在混合发酵液之前或之后进行，并且可以优选在混合发酵液之前进行。干燥可以优选通过喷射干燥或真空干燥来实现。发酵液可以被最终制备成适于向食品添加的粉末或糊。
在另一方面，本发明提供了通过本发明的制备方法制备的天然中性调味剂。在又一方面，本发明还提供了包含天然中性调味剂的食品组合物。
通过本发明的制备方法制备的天然中性调味剂具有纯正且温和的味道，因此可以添加到合适的食品以使食品味道最大化，并还可以施用到动物食品。例如，天然中性调味剂可以添加到零食调料(snack seasonings)、高汤、市售调味剂、调味品等，以产生纯正的滋味。
有益效果
根据本发明的方法制备的天然中性调味剂使用天然原材料制备，因此对于用于人体而言是无害且安全的，并且可以添加到食品以产生纯正且温和的味道并改善食品的滋味。
附图说明
图1是示出制备天然调味剂的总体方法的示意图。
图2示出酸-水解AMP的过程，其为了用本发明的天然食品级材料替代腺嘌呤。
图3示出用于得到CAPA以用天然食品级材料替代β-丙氨酸的代谢途径。
图4示出在添加通过本发明的真菌发酵而降解的植物蛋白质作为营养源的情况中以及在不添加植物蛋白质的情况中的细菌细胞的增殖程度。
图5示出在电渗析过程之前和之后评价感官属性的结果。
图6示出比较本发明的中性调味剂与酵母提取物之间的感官属性的结果。
具体实施方式
在下文中，参考实施例进一步详细地描述本发明。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施例仅用于例示目的，并且不旨在限制本发明的范围。
实施例1：植物蛋白质源的真菌发酵
对于初始真菌培养，在20℃至35℃的温度下，使用曲霉属微生物作为真菌菌株来培养包含诸如大豆、玉米、稻米或小麦的谷物材料的底物24小时至72小时，由此制备包含高浓度的蛋白酶的真菌培养液。然后，将诸如大豆、玉米、稻米或小麦的植物蛋白质源与水混合至25％至35％的高浓度，并灭菌，并且向无盐状态的灭菌的植物蛋白质源添加上文制备的含高浓度蛋白酶的真菌培养液，以水解该植物蛋白质源。此处，基于灭菌的底物溶液，以10％至100％的量添加真菌培养液，并且在40℃至50℃下降解底物48小时至96小时以制备谷物蛋白水解产物。
具体地，使用登记号10-1191010的韩国专利(对应于第WO 2011-046249号PCT国际公开)中描述的酱油曲霉CJCC_080124P(KCCM11026P)进行烧瓶培养和扩增培养，然后使用脱脂大豆来制备真菌培养液，并且水解作为底物的小麦面筋，由此制备谷物蛋白水解 产物。更具体地，将200ml初代培养物分散在1L烧瓶中并灭菌，并且在烧瓶中以1.7×1010个真菌细胞/400ml的密度接种200ml的真菌细胞，并在30℃和100rpm下培养7小时。然后，向250L发酵罐添加继代培养物，并灭菌，在其中接种600ml的初代培养液，并在30℃和70rpm下培养24小时。接下来，向5吨制备罐添加主要培养基，并在90℃加热30分钟，在将其转移到8吨发酵罐中之后，向其添加100L水和2L消泡剂。然后，在主要培养基中接种144L继代培养液，然后在30℃和700rpm下培养48小时，由此制备真菌培养液。最终，向5吨制备罐添加用于底物水解的原材料，并在55℃加热1小时，之后将其转移到20吨发酵罐中，并向其添加100L水和2L消泡剂，然后灭菌。然后，在底物中接种5760L的真菌培养液，并在45℃和30rpm下培养96小时，由此制备谷物蛋白水解产物。用于制备谷物蛋白水解产物的培养基的组成示于下文表1至4中。
[表1]
用于真菌发酵的初代培养物
培养基组分 单位 量 ％
葡萄糖 g 6 3
KH2PO4 g 6 3
酵母提取物 g 6 3
水 ml 182
[表2]
用于真菌发酵的继代培养物
培养基组分 单位 量 ％
葡萄糖 kg 1.44 1
KH2PO4 kg 1.44 1
酵母提取物 kg 1.44 1
水 kg 138.6
[表3]
用于真菌发酵的主要培养基
培养基组分 单位 量 ％
脱脂大豆 kg 103.68 1.9
KH2PO4 kg 57.6 1
水 kg 5352
[表4]
用于底物水解的原材料
原材料 单位 量
小麦面筋 kg 2650
水 L 7500
通过压滤机过滤上述制备的谷物蛋白水解产物以去除真菌细胞，由此制备总氮含量为2％(w/v)以上且水解度为50％以上的谷物发酵液。同时，将谷物发酵液制备成用于二次细菌发酵的培养基。
实施例2：细菌发酵
为了使用谷物发酵液制备IMP发酵液和谷氨酸发酵液，向实施例1中制备的谷物发酵液添加诸如葡萄糖或果糖的碳源，诸如Fe、Mg、Mn和Zn的矿物盐以及维生素，然后灭菌，由此制备用于细菌发酵的培养基。制备用于制备IMP发酵液和谷氨酸发酵液的培养基，并且对于每一发酵液，制备用于烧瓶培养(初代培养)、扩增培养(继代培养)和主要培养的培养基。
2-1：IMP发酵液的制备
使用登记号10-0397321的韩国专利(对应于第WO2002-051984号WO国际专利公开)中描述的产氨棒状杆菌CJIP009(KCCM-10226)，制备IMP浓度为70g/L以上的IMP发酵液。
具体地，将使用NaOH调节至pH 7.2的50ml初代培养物分散在 500-ml烧瓶中，并在121℃灭菌15分钟，在将细菌菌株接种到培养基中之后，在32℃和200rpm下培养22小时至28小时。然后，将2.1L继代培养物分散在5-L罐中，灭菌并冷却，之后在其中接种300ml初代培养液，并在将pH调节至7.2的同时在32℃和900rpm下于2L空气中培养27小时至30小时。接下来，将8.5L主要培养基分散在30-L罐中，灭菌并冷却，之后在其中接种1500ml继代培养液，并在任何时间将pH调节至7.2并供给额外的糖(包括葡萄糖和果糖的混合物)的同时在32℃和400rpm下于5L空气中培养5天至6天。在供给最后的额外的糖之后，进行培养7小时或更久，从而会完全消耗糖。用于制备IMP发酵液的培养基的组成示于下文表5至8中。
[表5]
用于制备IMP发酵液的初代培养物
培养基组分 单位 量 ％
葡萄糖 g 10 1
谷物发酵液 g 35 3.5
NaCl g 2.5 0.25
培养基体积 ml 1000
[表6]
用于制备IMP发酵液的继代培养物
[表7]
用于制备IMP发酵液的主要培养基
培养基组分 单位 量 ％
H3PO4(85％) g 22.21 2.2
KOH(85％) g 15.86 1.6
谷物发酵液 g 7 0.7
CuSO45H2O mg 12.2
FeSO47H2O mg 36.5
ZnSO47H2O mg 36.5
MnSO47H2O mg 109.6
L-半胱氨酸盐酸盐 mg 40.4
CAPA mg 34.7
NCA mg 34.9
生物素 mg 0.15
CaCl22H2O mg 182.6
硫胺素 mg 23.5
MgSO47H2O g 14.61 1.5
葡萄糖 g 48.21 4.8
果糖 g 40.22 4
培养基体积 ml 1000
[表8]
用于制备IMP发酵液的额外的糖
培养基组分 单位 量 ％
葡萄糖 g 358.97 35.9
果糖 g 299.58 30
NCA mg 772 0.08
CAPA mg 936.6 0.09
H3PO4(85％) g 55.68 5.6
NaOH(100％) g 13.5 1.4
培养基体积 ml 1000
2-2：谷氨酸发酵液的制备
使用登记号10-0264740的韩国专利所述的谷氨酸棒状杆菌(乳酸发酵短杆菌)CJ971010(KFCC 11039)，制备谷氨酸浓度为90g/L以上的谷氨酸发酵液。
具体地，将30ml的初代培养物分散在250-ml烧瓶中并灭菌，并且在培养基中接种细菌菌株并培养5小时至8小时。然后，将1.4L的继代培养物分散在5-L罐中，灭菌并冷却，然后在其中接种20ml初代培养液，并培养20小时至28小时。然后，将9.2L主要培养基分散在30-L罐中，灭菌并冷却，其后在其中接种800ml的继代培养液，并在任何时间供给额外的糖的同时培养36至45小时，。
在供给最后的额外的糖之后，进行培养7小时或更久，从而会完全消耗糖。用于制备谷氨酸发酵液的培养基的组成示于下文表9至12中。
[表9]
用于制备谷氨酸发酵液的初代培养物
[表10]
用于制备谷氨酸发酵液的继代培养物
[表11]
用于制备谷氨酸发酵液的主要培养基
[表12]
用于制备谷氨酸发酵液的额外的糖
为了使用用于制备IMP发酵液的培养基制备IMP发酵液并将IMP发酵液用作向食品添加的调味剂，应用食品级材料替代多个培养基组分，从而满足食品添加剂的需求。因此，用食品级材料替代细胞生长所必须的腺嘌呤和β-丙氨酸。
首先，通过酸-水解AMP以分裂与核糖的β-N-糖苷键，由此释放腺嘌呤，从而制备腺嘌呤。已表明，当使用上述制备的腺嘌呤进行培养时，可以制备IMP浓度为70g/L以上的IMP发酵液(图2)。
然后，由于检查了产氨棒状杆菌的代谢途径，因此预期会用泛酸钙(CAPA)替代β-丙氨酸。因此，使用CAPA替代β-丙氨酸来进行培养，由此，已表明可以制备IMP浓度为70g/L以上的IMP发酵液(图3)。
实施例3：在真菌发酵产物用于细菌发酵的情况中的细胞生长速率的检查
为了确认连续进行用于真菌发酵的第一发酵步骤和用于细菌发酵的第二发酵步骤的情况的优势，检查在添加通过第一真菌发酵步骤降解的植物蛋白质作为营养源的情况中以及在不添加植物蛋白质的情况中的细菌细胞的生长速率和增殖程度。
因此，如可从图4所见的，与不添加植物蛋白质的情况相比，在添加通过第一真菌发酵步骤降解的植物蛋白质作为营养源的情况中，细菌细胞高速率地并大量地增殖。
实施例4：谷氨酸发酵液的调味特性根据碳源种类而变化的检查
可以用于谷氨酸发酵的碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖蜜、粗糖等。尽管一些其他培养基组分根据碳源种类而变化，但所得的发酵液的谷氨酸浓度不会显著依赖于碳源种类。然而，发酵液的滋味根据碳源的种类而显著改变，并且为了开发中性调味剂，所得的发酵液优选具有更纯正的滋味。蔗糖蜜由于其中包含多种无机离子而成为在微生物发酵方面的优异培养基组分，但不足之处在于其用作中性调味剂的价值是低的，因为培养基自身的颜色过深并且由焦糖化产生的滋味保留在所得的培养液中。
因此，粗糖用于替代蔗糖蜜来制备用于制备中性调味剂的谷氨酸发酵液，并且检查培养液的滋味特性的由此引起的变化。此处，当用粗糖替代蔗糖蜜时，向培养基额外地添加在蔗糖蜜中包含的主要无机离子和维生素。因此，可以看出，当用粗糖替代蔗糖蜜时，去除异味，因此呈现适于制备中性调味剂的滋味特性(表13)。此外，使用粗糖制备的谷氨酸发酵液还包含高浓度(96g/L以上)的谷氨酸，其是适于制备中性调味剂的谷氨酸浓度。
[表13]
培养液的滋味特性随蔗糖蜜与粗糖之比的变化
蔗糖蜜(100％) 蔗糖蜜+粗糖(5:5) 粗糖(100％)
中性 - + ++
异味 + - --
实施例5：中性调味剂的制备
使用在实施例2中制备的谷氨酸发酵液和IMP发酵液，制备中性调味剂。
具体地，为了增加要随后进行的过滤过程的产率，将每一发酵液在70℃至90℃加热15分钟以上，从而诱导细胞溶解。这种预处理过程可以将过滤产率增加至85％以上。然后，为了从谷氨酸发酵液和IMP发酵液去除异味和臭味，基于发酵液的体积，以1％(w/v)至3％(w/v)的量添加活性炭，随后在50℃至70℃下用活性炭处理发酵液2 小时至24小时。在用活性炭处理之后，向发酵液添加作为过滤助剂的1％(w/v)至3％(w/v)的硅藻土，随后通过压滤机来过滤发酵液。
用活性炭处理的滤液经历电渗析以去除包括Ca、Fe、K、Mg和NH4离子的单价和二价离子，从而去除由氨和金属离子导致的异味，由此制备中性调味剂。
当发酵液以5L/hr.m2至20L/hr.m2的流量经历电渗析时，诸如Ca、Fe、K、Mg和Mn离子的单价和二价离子降低了30％至60％。在进行电渗析过程之前和之后的发酵液的组分的含量在以下表14中示出。如其中可见的，发酵液中无机离子的含量在电渗析过程之后降低，而发酵味道具有更纯正且更温和的滋味。
最终，将精盐和麦芽糖糊精添加到通过上述培养和过滤过程获得的滤液中，并且通过喷射干燥来粉化混合物，由此制备本发明的天然调味剂。
[表14]
实施例6：由电渗析过程导致的感官属性的评价
为了验证上文所制备的本发明的中性调味剂的味道，进行感官属性的评价。
通过电渗析去除无机离子的样品以及未经历电渗析的样品各自被粉化，然后由小组来评价样品的感官属性。小组是专业训练的，从而他们会对感官属性是敏感的，并且向小组提供相同浓度的样品以评价每一样品的感官属性和强度。
因此，如图5所示，鲜味的强度在电渗析过程之前与之后基本不 变，但对于电渗析过程之前的发酵液，在感官属性中作为不利因素的金属味、苦味、令人不愉快感和暗黑色均是高的，因此发酵液的纯正度和总体偏好是低的。然而，对于经历电渗析过程的发酵液，金属味的强度、苦味、令人不愉快的强度以及暗黑色均是低的，因此滋味和颜色的偏好均是高的，并且纯正度和总体偏好是高的。因此，可以看出，当进行电渗析过程时，与电渗析过程之前相比，可以制备具有更纯正的滋味且具有改善的偏好的中性调味剂。
实施例7：感官属性与酵母提取物的比较
为了检查本发明的中性调味剂的调味效果，将其感官属性与酵母提取物的感官属性进行比较，酵母提取物是近年来最广泛且在多方面使用的天然调味剂之一。
在一些情况下，酵母提取物有利地用于加工食品，但在大部分情况下，其在加工食品中的用途是受限的，因为其怪味损害了加工食品的滋味平衡，这归因于由其怪异发酵气味(称为酵母提取物味)产生的异味和臭味。
因此，开发出简易食品模型，并且分别向其添加酵母提取物和本发明的中性调味剂，之后，通过由研究者(n＝45)组成的小组来评价感官属性。
因此，如图6所示，在施用酵母提取物的小组中，酵母味的强度是高的，酵母提取物的偏好是低的，并且出现将酵母提取物认为是异味和臭味的趋势。因此，表明在本发明的天然调味剂中的整体味道的偏好是相对高的。
这些结果表明从本发明的中性调味剂中有效地去除了由无机离子产生的异味和臭味，因此当施用于食品时，该中性调味剂产生良好的滋味。
另外，使用修正定量描述分析，由9名受训练的小组成员来比较本发明的中性调味剂和酵母提取物的感官属性。具体地，将小组成员训练6小时，感官属性重复测量三次，并且向小组成员同时提供6种样品并由小组成员随机摄取。以16-分(0-15)等级来评价总计16种属 性。所评价的16种属性是6种香味属性、5种味道属性、3种滋味属性和2种口感属性。在摄取样品之后，用速食米饭或水将其冲洗掉，并且摄取下一个样品。向小组成员提供在陶瓷杯中容纳的70ml的每一样品，并且进行统计学分析(平均值，MANOVA，PCA)。
因此，对于本发明的天然调味剂，与酵母提取物相比，强烈感受到焦糖味、酸味和黄精茶(Solomon's seal tea)味，因此天然调味剂具有美味和酸味。此外，对于中性调味剂，感受不到推测是由培养基组分产生的煮土豆味或香味，并且视为发酵气味的煮豆气味与酵母提取物相比是显著低的。此外，本发明的天然中性调味剂与由其他公司制造的其他调味剂相比具有显著高的口腔包覆强度，表明甚至少量使用时，天然中性调味剂可以容易地表现出口腔包覆感。具体地，通过本发明的天然中性调味剂的与谷氨酸相关的单独特性，鲜味强度是非常高的，并且烧焦的谷物香气或味道(黄精茶)是强的，而且通过本发明的天然中性调味剂的与IMP相关的单独特性，鲜味强度与酵母提取物类似，焦糖香气是强的，并且中性调味剂具有酸味。此外，可以看出，酵母提取物具有煮土豆香气或滋味或者煮豆气味。

Claims (29)

1.制备肌苷-5’-单磷酸盐(IMP)发酵液或谷氨酸发酵液的方法，其包括：
(a)用真菌发酵植物蛋白质源以获得谷物发酵液；以及
(b)用细菌发酵所述谷物发酵液。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述IMP发酵液或所述谷氨酸发酵液是用于制备天然调味剂的原材料。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述植物蛋白质源选自大豆、玉米、稻米、小麦和小麦面筋。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述真菌是曲霉属(Aspergillus sp.)微生物。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述曲霉属微生物是酱油曲霉(Aspergillussojae)。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌是棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)微生物。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述棒状杆菌属微生物是产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述棒状杆菌属微生物是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
9.如权利要求1所述的方法，其中用于制备所述IMP发酵液或所述谷氨酸发酵液的细菌发酵所用的培养基组合物包含食品级材料。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述细菌发酵所用的培养基组合物包含泛酸钙(CAPA)。
11.如权利要求1所述的方法，其中用于制备所述IMP发酵液的细菌发酵所用的培养基包含葡萄糖、果糖、硫酸镁、磷酸、氢氧化钾和谷物发酵液。
12.如权利要求1所述的方法，其中用于制备所述谷氨酸发酵液的细菌发酵所用的培养基包含葡萄糖、果糖、粗糖、甜菜碱、硫酸镁、磷酸钾和磷酸。
13.如权利要求1所述的方法，其中用于制备所述谷氨酸发酵液的细菌发酵所用的培养基中的碳源是粗糖。
14.如权利要求1所述的方法，其中在制备的IMP发酵液中IMP的浓度为50g/L至150g/L。
15.如权利要求1所述的方法，其中在制备的IMP发酵液的固体中IMP的含量为30重量％以上。
16.如权利要求1所述的方法，其中在制备的谷氨酸发酵液中谷氨酸的浓度为75g/L至150g/L。
17.如权利要求1所述的方法，其中在制备的谷氨酸发酵液的固体中谷氨酸的含量为50重量％以上。
18.如权利要求1所述的方法，其还包括(c)用活性炭处理通过所述细菌发酵而获得的发酵液。
19.如权利要求18所述的方法，其还包括在用活性炭处理所述发酵液之后，离心或过滤经处理的发酵液。
20.如权利要求18所述的方法，其还包括在用活性炭处理所述发酵液之前，在70℃至90℃的温度下加热所述发酵液15分钟至60分钟以诱导细胞溶解。
21.IMP发酵液，其通过权利要求1至11、14、15和18至20中任一项所述的方法制备。
22.谷氨酸发酵液，其通过权利要求1至10、12、13和16至20中任一项所述的方法制备。
23.制备天然调味剂的方法，其包括：
(a)用真菌发酵植物蛋白质源以获得谷物发酵液；以及
(b)用细菌发酵所述谷物发酵液以制备IMP发酵液或谷氨酸发酵液。
24.如权利要求23所述的方法，其还包括(c)混合两种或更多种选自以下的发酵液：步骤(a)的所述谷物发酵液，以及步骤(b)的所述IMP发酵液和所述谷氨酸发酵液。
25.如权利要求23或24所述的方法，其中在不添加任何额外的组分的情况下仅使用所述发酵液来制备所述天然调味剂。
26.如权利要求23或24所述的方法，其中在不使所述发酵液经历额外的化学过程的情况下使用所述发酵液来制备所述天然调味剂。
27.如权利要求24所述的方法，其还包括在步骤(c)之前，电渗析所述IMP发酵液或所述谷氨酸发酵液。
28.天然调味剂，其通过权利要求23所述的方法制备。
29.食品组合物，其包含权利要求28所述的天然调味剂。
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