CN105866297B

CN105866297B - 一种泊马度胺有关物质的高效液相色谱分析方法

Info

Publication number: CN105866297B
Application number: CN201610475929.9A
Authority: CN
Inventors: 吴标; 李晓梅; 施伶俐; 崔红晓
Original assignee: HEFEI JIUNUO MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HEFEI JIUNUO MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2016-06-24
Filing date: 2016-06-24
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2036-06-24
Also published as: CN105866297A

Abstract

本发明公开了一种泊马度胺有关物质的高效液相色谱分析方法，该方法采用反相色谱柱及紫外检测器，以乙腈‑水‑磷酸为流动相，进行梯度洗脱。本方法可同时分析泊马度胺原料及其制剂中的所有已知杂质，并且可通过加校正因子的主成分自身对照法有效控制各已知杂质含量，各杂质峰之间及主峰与相邻杂质峰之间的分离度均大于1.5，主峰与各杂质峰峰纯度均为1.0。本发明为泊马度胺原料及其制剂的质量控制分析提供了简易、可靠的分析方法。

Description

一种泊马度胺有关物质的高效液相色谱分析方法

一、技术领域

本发明涉及一种化学药物纯度的分析方法，具体地说是一种泊马度胺有关物质的高效液相色谱分析方法。

二、背景技术

泊马度胺(Macitentan)，化学名为(RS)-4-氨基-2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-异吲哚啉-1,3-二酮，化学结构式如下：

泊马度胺是由美国塞尔基因(Celgene)公司研制开发的继沙利度胺和来那度胺之后的第三个免疫调节剂类药物，适用于既往接受过至少两种药物治疗[包括来那度胺(lenalidomide)和硼替佐米(bortezomib)]且最近治疗进行中或治疗完成60天内疾病进展的多发性骨髓瘤患者。

泊马度胺的通用合成方法在专利US2007004920及US5635517中已公开，根据合成工艺分析，其杂质主要来源于合成过程中引入的反应原料(杂质G、杂质F或杂质H)、合成中间体(杂质B)、反应副产物(杂质A、杂质C、杂质I)及降解杂质(杂质C、杂质D、杂质E)，其中杂质F或杂质H为酸酐结构，不稳定，实际检测的是其水解杂质3-硝基邻苯二甲酸或3-氨基邻苯二甲酸；泊马度胺降解杂质与其结构中哌啶酮和邻苯二甲酰亚胺结构稳定性有关，其中哌啶酮结构在酸或碱中易开环生成杂质D或杂质E，邻苯二甲酰亚胺结构上的氨基易氧化生成杂质C；杂质A为工艺杂质，结构与泊马度胺类似，实验证明该杂质结晶难除，并且由于生产工艺的原因，现有的市售原料(杂质F或杂质H)均会引入邻苯二甲酸酐或邻苯二甲酸，因此，在泊马度胺合成中的杂质A的生成不可避免。另外，发明人通过试验发现泊马度胺中可检出的有关物质主要为杂质A、杂质B及杂质C。

专利CN201310683222.3公开了一种测定泊马度胺及其有关物质的方法，仅研究了工艺杂质杂质B、杂质G、杂质F、杂质H、杂质I，未对杂质A、杂质C、杂质D、杂质E进行定位，方法局限性明显。专利CN201510182078.4公开的高效液相色谱检测分离泊马度胺有关物质的方法未对杂质A、杂质E、杂质I、杂质J进行定位，应用范围受限。

目前建立在全面杂质谱分析基础上的泊马度胺原料及其制剂分析方法还没有相关的文献报道。

三、发明内容

本发明针对现有文献对泊马度胺原料及其制剂杂质鉴定研究的缺失，目的在于提供一种泊马度胺有关物质的高效液相色谱分析方法。本发明通过工艺试制、强制降解试验对泊马度胺杂质进行富集、分离提纯，鉴定了9个主要已知杂质，并且对杂质进行了溯源归属，包括泊马度胺反应原料(杂质G、杂质F或杂质H)、合成中间体(杂质B)、反应副产物(杂质A、杂质C、杂质I、杂质J)及降解杂质(杂质C、杂质D、杂质E)。

发明人曾试图通过等度洗脱分离各已知杂质，但在保证各杂质达到基线分离的情况下色谱保留时间大于2h，耗时，不实用。因此，改用梯度洗脱法，经对流动相组成及比例的优化筛选，确定本发明的分析方法。同时按中国药典2015年版四部通则<0512>(高效液相色谱法)及通则<9101>(药品质量标准分析方法验证指导原则)的定义和验证方法，进行专属性验证，结果表明该方法可同时分析泊马度胺原料及其制剂中的所有已知杂质，并且可通过外标法和自身对照法有效控制各已知杂质含量，各杂质峰之间及主峰与相邻杂质峰之间的分离度均大于1.5，主峰与各杂质峰峰纯度均为1.0。

所述峰纯度是指采用配有相应分析软件的光二极管阵列检测器，采集、记录、分析经色谱柱分离组份的光谱数据，自动生成的表征特定分离组份对应的光谱特征一致性的加权值。

本发明泊马度胺有关物质的高效液相色谱分析方法，采用反相色谱柱及紫外检测器，是以乙腈-水-磷酸的混合溶液为流动相，进行梯度洗脱，包括如下步骤：

(1)样品配制：取泊马度胺原料或制剂粉末，用体积比为50∶50∶0.1的乙腈-水-磷酸溶液(磷酸的体积以质量浓度85％的磷酸溶液计，乙腈为色谱纯)超声溶解，过滤或者离心，配制成浓度为0.1-0.5mg/ml的泊马度胺溶液；

(2)色谱条件设置：采用反相C18柱，柱温设置在20-50℃；以体积比为5∶90-98∶0.05-0.15的乙腈-水-磷酸混合液为流动相A，以体积比为25∶70-80∶0.05-0.15的乙腈-水-磷酸混合液为流动相B，进行梯度洗脱；流速为0.5-2.0ml/min；检测波长为220-270nm；洗脱液由流动相A和流动相B构成；

(3)检测：取步骤(1)配制的泊马度胺溶液，进样10-50μl，记录色谱图。

步骤(2)中反相C18柱选自Agilent C18(150×4.6mm，5μm)、Apollo C18(150×4.6mm，5μm)或Luna C18(150×4.6mm，5μm)，优选Agilent C18(150×4.6mm，5μm)。

步骤(2)中所述流动相A中乙腈、水和磷酸按体积比优选为5∶90-95∶0.05-0.15，最优为5∶95∶0.1；流动相B中乙腈、水和磷酸按体积比优选为25∶70-75∶0.05-0.15，最优为25∶75∶0.1。所述磷酸的质量浓度为85％。

步骤(2)中梯度洗脱程序为：0-2min流动相A占洗脱液的体积百分比为100％，2min-15min流动相A占洗脱液的体积百分比由100％逐步递减至0％，15min-60min流动相A占洗脱液的体积百分比为0，60min-61min流动相A占洗脱液的体积百分比由0逐步递增至100％，61min-70min流动相A占洗脱液的体积百分比为100％。

更优的洗脱程序为：0-2min流动相A占洗脱液的体积百分比为100％，2min-15min流动相A占洗脱液的体积百分比由100％逐步递减至0％，15min-40min流动相A占洗脱液的体积百分比为0，40min-41min流动相A占洗脱液的体积百分比由0逐步递增至100％，41min-50min流动相A占洗脱液的体积百分比为100％。

步骤(2)中流速为0.5-1.5ml/min；检测波长为220-250nm。

步骤(3)中进样量为20μl。

采用本发明方法可有效地控制泊马度胺原料及制剂中的有关物质，9个已知杂质均能在一张图谱上分析出来，各杂质峰之间及主峰与相邻杂质峰之间的分离度均大于1.5，主峰与各杂质峰峰纯度均为1.0。分析过程见实施例1，典型色谱图见图1，计算结果见表1。

表1泊马度胺与各已知杂质色谱分离参数结果

采用本发明方法能够分析泊马度胺在各种复杂环境下的降解杂质，方法专属性强。按中国药典2015年版四部通则<0512>(高效液相色谱法)及通则<9101>(药品质量标准分析方法验证指导原则)的定义和验证方法，将泊马度胺原料或制剂粉末分别用酸、碱、高温、氧化、光照破坏，制得破坏样品，按本发明方法分别采集各破坏样品色谱图，分析过程见实施例2，典型色谱图见图2-7。结果表明该方法能够分析经酸、碱、高温、氧化、光照破坏的样品，主峰与各杂质峰均能达到基线分离，主峰纯度均为1.0。

采用本发明方法能对各已知杂质进行定量分析。按中国药典2015年版四部通则<0512>(高效液相色谱法)及通则<9101>(药品质量标准分析方法验证指导原则)的定义和验证方法，采用杂质对照法对泊马度胺9个已知杂质的检测限、定量限进行检测，结果表明该方法对各杂质的响应值高，能有效控制各已知杂质，结果见表2。

表2泊马度胺已知杂质定量分析验证参数结果

名称	定量限(μg/ml)	检测限(μg/ml)	校正因子
				泊马度胺	0.0033	0.011	/
杂质A	0.0015	0.005	0.67
				杂质B	0.010	0.0030	0.96
杂质C	0.0061	0.0023	1.08
				杂质D	0.0063	0.0032	0.92
杂质E	0.0375	0.0134	0.97
				杂质F	0.0128	0.0053	1.11
杂质G	0.0522	0.0261	1.03
				杂质H	0.0278	0.0086	1.08
杂质I	0.0175	0.0069	0.91

本发明首次对泊马度胺原料及其制剂杂质进行溯源归属，鉴定了9个已知杂质，为泊马度胺原料及其制剂有关物质研究提供了可靠的杂质谱参考，具有较大的积极进步效果和实际应用价值。

四、附图说明

图1是实施例1泊马度胺与已知杂质的混合色谱图。

图2是实施例2酸破坏色谱图。

图3是实施例2碱破坏色谱图。

图4是实施例2高温破坏色谱图。

图5是实施例2氧化破坏色谱图。

图6是实施例2光照破坏色谱图。

图7是实施例2泊马度胺胶囊(1mg)未破坏样品色谱图。

图8是实施例3泊马度胺有关物质色谱图。

采用本发明分析方法定位已知杂质(杂质A-I，图1)，主峰与各杂质峰均能达到基线分离。采用本发明分析方法泊马度胺及其胶囊有关物质，结果泊马度胺原料仅检出微量杂质A、杂质B和杂质C(保留时间依次为：19.614min、20.446min、18.427min，图8)，泊马度胺胶囊则检出微量杂质A和杂质C(保留时间依次为：19.727min、18.455min，图7)。采用本发明分析方法考察泊马度胺制剂样品在酸、碱、高温、光照、氧化等因素影响下的降解产物，与降解前样品比较，结果表明本品对高温、光较稳定，高温破坏检出微量杂质A、杂质B和杂质C(保留时间依次为：19.744min、20.580min、18.492min，图4)，光破坏检出微量杂质A、杂质B和杂质C(保留时间依次为：19.743min、20.620min、18.517min，图6)；本品在酸、碱、氧化条件下不稳定，其中酸破坏检出杂质D(保留时间：6.164min)和5个未知杂质(图2)，碱破坏检出杂质B(保留时间：20.528min)、杂质C(保留时间：18.489min)、杂质D(保留时间：6.149min)和5个未知杂质(图3)，氧化破坏检出杂质A(保留时间：19.798min)、杂质B(保留时间：20.102min)、杂质F(保留时间：13.111min)、杂质I(保留时间：17.215min)和8个未知杂质(图5)。

五、具体实施方式

实施例1：

检测仪器与色谱条件：

高效液相色谱仪：LC-10AD泵，SPD-M10A检测器

色谱柱：Agilent C18(150×4.6mm，5μm)；流动相A：体积比为5∶95∶0.1的乙腈-水-磷酸溶液；流动相B：体积比为25∶75∶0.1的乙腈-水-磷酸溶液；检测波长：226nm；流速：1.0ml/min；进样量：20μl。

实验步骤：

(1)样品配制：

取泊马度胺、已知杂质A-I各适量，加体积比50∶50∶0.1的乙腈-水-磷酸溶液超声溶解并定量稀释至适宜浓度的混合溶液，摇匀，作为样品溶液。

(2)梯度洗脱程序设置：

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	100	0
2	100	0
			15	0	100
60	0	100
			61	100	0
70	100	0

(3)检测：取上述样品溶液，分别进样20μl，分别记录色谱图。

典型色谱图见图1。

实施例2：

检测仪器与色谱条件：

高效液相色谱仪：LC-10AD泵，SPD-M10A检测器

色谱柱：Agilent C18(150×4.6mm，5μm)；流动相A：同实施例1，流动相B：同实施例1；流速：1.0ml/min；检测波长：226nm；进样体积：20μl。

(1)样品配制：

酸破坏：取泊马度胺胶囊内容物，研细，取细粉适量(约相当于含泊马度胺20mg)，置100ml量瓶中，加1mol/L盐酸溶液4ml，置100℃水浴1小时，取出放冷，加1mol/L氢氧化钠溶液4ml中和，加体积比50∶50∶0.1的乙腈-水-磷酸溶液适量超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，作为酸破坏样品；

碱破坏：取泊马度胺胶囊内容物，研细，取细粉适量(约相当于含泊马度胺20mg)，置100ml量瓶中，加0.1mol/L的碳酸钠溶液4ml，室温放置2小时，加0.2mol/L盐酸溶液4ml中和，加体积比50∶50∶0.1的乙腈-水-磷酸溶液适量超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，作为碱破坏样品；

高温破坏：取泊马度胺胶囊内容物，研细，于150℃加热5小时，取细粉适量(约相当于含泊马度胺20mg)，置100ml量瓶中，加体积比50∶50∶0.1的乙腈-水-磷酸溶液适量超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，作为高温破坏样品；

氧化破坏：取泊马度胺胶囊内容物，研细，取细粉适量(约相当于含泊马度胺20mg)，置100ml量瓶中，加30％过氧化氢溶液4ml，置100℃水浴1小时，取出放冷，加体积比50∶50∶0.1的乙腈-水-磷酸溶液适量超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，作为氧化破坏样品；

光破坏：取泊马度胺胶囊内容物，研细，取细粉适量(约相当于含泊马度胺20mg)，置100ml量瓶中，加体积比50∶50∶0.1的乙腈-水-磷酸溶液适量超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，置强光(冷白色荧光灯+近紫外灯)下照射72小时，摇匀，过滤，作为光破坏样品；

未破坏：取泊马度胺胶囊内容物，研细，取细粉适量(约相当于含泊马度胺20mg)，置100ml量瓶中，加体积比50∶50∶0.1的乙腈-水-磷酸溶液适量超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，作为未坏样品。

(2)梯度洗脱程序设置：同实施例1。

(3)检测：取上述各样品溶液，分别进样20μl，分别记录色谱图。

典型色谱图见图2-7。

实施例3：

检测仪器与色谱条件：

高效液相色谱仪：UltiMate 3000泵，UltiMate 3000紫外检测器

实验步骤：

(1)样品配制：取泊马度胺20mg，置100ml量瓶中，用体积比50∶50∶0.1的乙腈-水-磷酸溶液超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。

(2)梯度洗脱程序设置：

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	100	0
2	100	0
			15	0	100
40	0	100
			41	100	0
50	100	0

(3)检测：取上述各样品溶液，进样20μl，记录色谱图。

典型色谱图见图8。

Claims

1.一种泊马度胺有关物质的高效液相色谱分析方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)样品配制：取泊马度胺原料或制剂粉末，用体积比为50∶50∶0.1的乙腈-水-磷酸溶液超声溶解，过滤或者离心，配制成浓度为0.1-0.5mg/ml的泊马度胺溶液；

(2)色谱条件设置：采用反相C18柱，柱温设置在20-50℃；以体积比为5∶90-95∶0.05-0.15的乙腈-水-磷酸混合液为流动相A，以体积比为25∶70-75∶0.05-0.15的乙腈-水-磷酸混合液为流动相B，进行梯度洗脱；流速为0.5-2.0ml/min；检测波长为220-270nm；洗脱液由流动相A和流动相B构成；

步骤(2)中反相C18柱选自150×4.6mm、5μm的Agilent C18，或150×4.6mm、5μm的Apollo C18，或150×4.6mm、5μm的Luna C18；

步骤(2)中梯度洗脱程序为：0-2min流动相A占洗脱液的体积百分比为100％，2min-15min流动相A占洗脱液的体积百分比由100％逐步递减至0％，15min-60min流动相A占洗脱液的体积百分比为0，60min-61min流动相A占洗脱液的体积百分比由0逐步递增至100％，61min-70min流动相A占洗脱液的体积百分比为100％；

(3)检测：取步骤(1)配制的泊马度胺溶液，进样10-50μl，记录色谱图；

所述有关物质包括杂质G、杂质F、杂质H、杂质B、杂质A、杂质C、杂质I、杂质D及杂质E，结构式如下：

2.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于：

步骤(2)中反相C18柱为150×4.6mm、5μm的Agilent C18。

3.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于：

步骤(2)中所述流动相A中乙腈、水和磷酸按体积比为5∶95∶0.1；流动相B中乙腈、水和磷酸按体积比为25∶75∶0.1。

4.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于：

步骤(2)中梯度洗脱程序为：0-2min流动相A占洗脱液的体积百分比为100％，2min-15min流动相A占洗脱液的体积百分比由100％逐步递减至0％，15min-40min流动相A占洗脱液的体积百分比为0，40min-41min流动相A占洗脱液的体积百分比由0逐步递增至100％，41min-50min流动相A占洗脱液的体积百分比为100％。

5.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于：

步骤(2)中流速为0.5-1.5ml/min；检测波长为220-250nm。

6.根据权利要求1所述的高效液相色谱分析方法，其特征在于：

步骤(3)中进样量为20μl。