CN105861656A

CN105861656A - 一种检测人类白细胞hla-b*27基因的试剂盒及方法

Info

Publication number: CN105861656A
Application number: CN201610221951.0A
Authority: CN
Inventors: 田峰; 何健
Original assignee: BEIJING LAWKE CLINICAL LABORATORY Co Ltd
Current assignee: BEIJING LAWKE CLINICAL LABORATORY Co Ltd
Priority date: 2016-04-11
Filing date: 2016-04-11
Publication date: 2016-08-17

Abstract

本申请公开了一种用于检测人类白细胞抗原HLA‑B*27的试剂盒及检测方法，其中所述试剂盒包括：用于扩增包含HLA‑B*27基因二号外显子第142位碱基的核酸序列的扩增反应预混液和含有核酸限制性内切酶HpyCH4III的消化反应预混液，其中所述核酸序列为包含HLA‑B*27基因的第142号碱基前后至少10个碱基的序列。发明在PCR技术的基础上结合限制性内切酶技术，避开对退火温度等条件的依赖，从而提供了更廉价、且更准确的HLA‑B*27定量检测技术，大幅度降低检测结果中的假阳性和假阴性。

Description

一种检测人类白细胞HLA-B*27基因的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及检测人类白细胞HLA-B*27等位基因的检测方法及其试剂盒。

背景技术

HLA(human leukocyte antigen)，即人类白细胞抗原，又称人类主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)，是人体重要的免疫遗传体系，在免疫系统中主要负责细胞之间的相互识别。HLA分为三大类，分别称为Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类，其中Ⅰ类HLA基因又有三个位点，即HLA-A*、HLA-B*和HLA-C*。HLA-B27基因即人类HLA-I类分子B位点上的等位基因，位于第6号染色体上，编码分子质量为43KD的糖蛋白。HLA-B27基因表达在机体所有的有核细胞表面，尤其是淋巴细胞表面更为丰富。

HLA在免疫系统中作用重要，所以HLA的异常导致免疫功能的异常。临床发现HLA-B*27抗原呈阳性与强直性脊椎炎有高度相关性。超过90％的强直性脊椎炎患者其HLA-B*27抗原表达为阳性。而强直性脊椎炎由于其症状与许多疾病相似，因而仅从症状上难以确诊。因此HLA-B*27的检测可作为辅助诊断的指标之一，在此类疾病的确诊中有着重要意义。不仅如此，在脊椎性关节病这一类疾病中，除了强直性脊椎炎以外还有许多其它疾病，例如Reiter综合症(阳性率70％-90％)、银屑病性关节炎(阳性率50％-60％)、急性前葡萄膜炎(40％-50％)和溃疡性结肠炎伴关节病(5％-10％)等许多严重危害人类健康的脊柱性关节病也都与HLA-B*27抗原的表达有着或多或少的相关性，因此HLA-B*27的检测在这些疾病的诊断中同样是非常有价值的指标之一。

分子诊断是应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术，分子诊断是当代医学发展的重要前沿领域之一，其核心技术是基因诊断。常规的分子诊断技术包括：聚合酶链式反应(PCR)、DNA测序(DNA sequencing)、荧光原位杂交技术(FISH)、DNA印迹技术(DNAblotting)、单核苷酸多态性(SNP)、连接酶链反应(LCR)、基因芯片技术(gene chip)等。其中，PCR产品占据目前分子诊断的主要市场。PCR产品具有灵敏度高、特异性强、诊断窗口期短等优点，因而应用范围广，可进行定性、定量检测，为早期诊断、早期治疗、安全用血提供了有效的帮助。

目前市场上已有PCR技术或定量PCR技术，例如荧光定量PCR用于HLA-B*27的检测。检测HLA-B*27的PCR技术是基于引物碱基差异来区分不同的HLA-B*27基因型。一般情况下，在引物的3’端只有1-2个碱基差异和(或)引物中间的1-2个碱基差异，这种差异需要在十分严格的反应温度和反应体系中才能正确区分不同的基因型，而实际检测中轻微的误差就可导致假阳性或假阴性的结果。现在常规的检测HLA-B*27的定量PCR技术则是通过荧光探针的中端有1-2个碱基差异来区分不同的基因型，这种差异对反应体系要求不高，但对探针的退火温度有一定要求，所以其检测结果的准确度也会受到实际检测中的一些可变因素，例如荧光定量PCR仪的温度控制的准确性、稳定性等影响而产生假性结果。因此，仍存在开发准确性更高，成本更低廉的检测方法的需要。

发明内容

为此，本发明在PCR技术的基础上结合限制性内切酶技术，避开对反应温度、退火温度等条件的高度依赖，提供了更廉价、且更准确的HLA-B*27定量检测技术，大幅度降低检测结果中的假阳性和假阴性。

本发明是基于HLA-B*27突变型基因在二号外显子上第142号碱基发生改变(即，由A变成C)，这个改变恰好生成一个新的限制性内切酶HpyCH4III识别位点因而利用该位点可准确无误地检测出B27基因的阳性突变。

总的来说，本发明中的检测方法是先将包含HLA-B*27基因二号外显子上第142号碱基的一段基因区域扩增出来，然后利用特定的限制性内切酶，即HpyCH4III，对扩增产物进行消化，阳性突变型基因将产生消化片段，而野生型基因(阴性)不会产生消化片段。随后可利用诸如琼脂糖凝胶电泳等方法容易地判断出HLA-B*27基因的型别(阴性或阳性)。

因此，本发明一方面的目的是提供一种人类白细胞抗原HLA-B*27检测试剂盒，所述试剂盒包括：用于扩增包含HLA-B*27基因二号外显子第142位碱基的核酸序列的扩增反应预混液，和含有核酸限制性内切酶HpyCH4III的消化反应预混液，其中所述核酸序列为包含HLA-B*27基因的第142号碱基前后至少10个碱基的序列。

根据一种实施方式，所述核酸序列具有约25～约500个碱基；优选具有约50～500个碱基；更优选具有约100～300个碱基。根据优选的实施方式，所述核酸序列中，在所述第142号碱基之前的序列所包含的碱基数与在所述第142号碱基之后的序列所包含的碱基数相差至少10个碱基；优选相差至少50个碱基，例如相差50～300个碱基；更优选相差100～150个碱基。根据一种实施方式，用本发明的试剂盒获得消化后的核酸序列后，优选随后用凝胶电泳的方法检测经消化的核酸序列，因为凝胶电泳方法简便易行，结果也明显可以区分阴性和阳性的情况。为了使电泳的结果更易于判断，优选所述核酸序列具有约100～300个碱基，且在所述第142号碱基之前的序列所包含的碱基数与在所述第142号碱基之后的序列所包含的碱基数相差100～150个碱基。

当然，本领域其他检测核酸序列的方法均可用于检测消化后的序列。

根据一种实施方式，本发明试剂盒可使用任何能够扩增所述核酸序列的方法。优选为PCR扩增方法，其中优选采用热启动Taq DNA聚合酶。当然也可采用其他合适的DNA聚合酶。此外，所述扩增预混液还包括为进行PCR扩增所需的其他常规试剂，例如常规用于PCR反应的PCR反应缓冲液、镁离子、dNTPs以及适宜的扩增引物对。

用于本发明试剂盒的引物对可根据要扩增的核酸序列进行设计，本领域技术人员能够根据具体序列进行合理设计。

根据一种具体的实施方式，所述核酸序列包含HLA-B*27基因第142号碱基的265bp序列，该序列仅比二号外显子少数个碱基，基本可看作整条二号外显子。因此一种替代的实施方式可以是扩增整个二号外显子。

根据上述具体实施方式，用于扩增上述265bp序列的引物对为：

引物B27F1:5’-TCCCACTCCATGAGGTATTTC-3’；

引物B27R1:5’-CCTCGCTCTGGTTGTAGTAG-3’。

根据一种实施方式，所述核酸限制性内切酶HpyCH4III的含量为0.5～5U/μl，优选为1.5～3U/μl，更优选为1.5～2U/μl，最优选为1.5U/μl。

根据一种优选的实施方式，所述消化反应预混液还包括消化反应缓冲液。所述消化反应缓冲液为用所述核酸限制性内切酶HpyCH4III对扩增后的核酸序列进行酶切反应的常规缓冲液。例如所述缓冲液可含有30～40mM的Tris-乙酸(pH 7.9)，12～25mM醋酸镁，100～120mM醋酸钾，0.2mg/ml BSA，但不限于此。

根据一种实施方式，本发明的试剂盒进一步包括所述核酸序列的阴性对照序列和阳性对照序列，其中所述阴性对照序列为野生型的所述核酸序列，所述阳性对照序列为上述突变型的所述核酸序列在HpyCH4III识别位点被酶切后的两段核酸序列，也就是所述阳性对照序列为所述HLA-B*27基因二号外显子第142位碱基发生A到C突变的突变型的所述核酸序列被酶切后的两段核酸序列，即69个碱基的片段和196个碱基的片段。

本发明的第二方面提供一种检测人类白细胞抗原HLA-B*27基因型别的方法。所述方法包括：

提取样品中基因组DNA；

扩增包含HLA-B*27基因二号外显子的第142号碱基的核酸序列；

用核酸限制性内切酶HpyCH4III消化所扩增的核酸序列；和

检测经消化的核酸序列，

其中所述核酸序列为包含HLA-B*27基因的第142号碱基前后至少10个碱基的序列。

根据一种实施方式，所述核酸序列具有约25～约500个碱基；优选具有约50～500个碱基；更优选具有约100～300个碱基。根据优选的实施方式，所述核酸序列中，在所述第142号碱基之前的序列所包含的碱基数与在所述第142号碱基之后的序列所包含的碱基数相差至少10个碱基；优选相差至少50个碱基，例如相差50～300个碱基；更优选相差100～150个碱基。

与上述相同，当采用凝胶电泳检测方法进行最终检测时，优选所述核酸序列具有约100～300个碱基，且在所述第142号碱基之前的序列所包含的碱基数与在所述第142号碱基之后的序列所包含的碱基数相差100～150个碱基。

根据本发明，所述样品可以是静脉外周血或空腔脱落细胞。可使用任何合适的方法来提取样品中的基因组DNA。例如可用任何市售的基因组提取试剂盒来提取基因组DNA，并按要求质检。

将提取的DNA配制成具有适当浓度的溶液。优选地，将基因组DNA溶于水或适当的缓冲液(如TE)中，使浓度在10ng/μl到100ng/μl之间。过高的DNA浓度需要适当稀释。优选的浓度范围是30～50ng/μl。溶液中基因组DNA的纯度为OD260/OD280介于1.6-1.8之间。

根据本发明一种实施方式，所述扩增可以采用任何适宜的扩增方法。扩增方法是本领域技术人员所熟悉并可适当选择的。

被扩增的所述核酸序列以及用于扩增的预混合液如前所述。

根据本发明一个示例性的实施方式，可采用如下的PCR扩增程序进行扩增，但不限于此：

步骤1：95度3分钟， 1个循环；

步骤2：95度15秒，58度15秒，72度45秒， 32个循环；和

步骤3：72度3分钟， 1个循环。

根据本发明的实施方式，对扩增后的核酸序列进行定量，使其浓度在100-500ng/μl之间。取适量，如1μl的溶液，可选地进行适当稀释，用适当浓度的所述核酸限制性内切酶HpyCH4III(例如，按如上所述的浓度配制在适当的缓冲液中)进行消化。在约37℃下消化约1小时。

根据本发明的实施方式，可采用任何适宜的方法对消化后的DNA进行检测，优选采用凝胶电泳法进行检测。当然也可根据具体需要或现有条件采用任何其他合适的方法。

根据优选的实施方式，本发明的方法可包括提供所述被测核酸序列的如上所述的阳性标准样品和阴性标准样品的步骤，并作为对照与消化后的样品一同检测。这样在用诸如电泳法等方法检测所述消化后的样品时，可更清楚地与标准样品进行对比，方便确定所述基因类型。

本发明的检测方法及试剂盒的使用对实验室设备要求低，仅需要常规的PCR仪、紫外分光光度计、离心机、电泳仪等即可。而此类仪器均是普通分子生物学(检测)实验室常备仪器。与荧光定量PCR技术及测序技术相比，不需要价格昂贵的荧光定量PCR仪或测序仪等设备。试剂盒的组成试剂多为常规易得试剂，成本下降近50％。特别是用本发明的试剂盒检测获得的结果不但大大提高了准确性，而且可以区分纯合阳性和杂合阳性，而目前采用荧光定量PCR技术并不作此区分，因为否则其试剂成本还需再增加约50％。

附图说明

图1为根据本发明实施例1的试剂盒对阴性、纯和阳性和杂合阳性基因进行检测的电泳参照图。

图2为根据本发明实施例1采用的核酸序列的阳性突变型，其中A为人类白细胞抗原HLA-B*27第二号外显子阳性突变型序列；B为A所示片段经核酸限制性内切酶HpyCH4III消化后的电泳图，其中“M”泳道是DNA分子量标准，左侧有其条带大小标示；“阳性”泳道是经HpyCH4III消化的阳性对照DNA片段，由69bp和196bp两条DNA片段组成。

图3为根据本发明实施例1采用的核酸序列的阴性野生型。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1 试剂盒

本实施例的试剂盒包括以下试剂：

1、经HpyCH4III消化的阳性对照DNA片段(如图2B所示)

2、阴性对照DNA片段(如图3所示)

3、2×PCR反应预混液，所述PCR反应预混液组成为：

热启动Taq DNA聚合酶，0.05units/μl

TAPS(N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸缓冲液，pH9.3，25℃)，50mM

KCl，100mM

MgCl₂，4mM

DTT，0.2mM

dNTPs：dATP、dCTP、dGTP和dTTP各0.4mM

(在本实施例中以上组分均购于日本TAKARA公司)。

引物B27F1:5’-TCCCACTCCATGAGGTATTTC-3’；

引物B27R1:5’-CCTCGCTCTGGTTGTAGTAG-3’；

各1μM。

4、2×消化反应预混液，所述消化反应预混液的组成为：

核酸限制性内切酶HpyCH4III，1.5U/μl

Tris-乙酸缓冲液(pH 7.9)，40mM

醋酸镁，20mM

醋酸钾，120mM

BSA，0.2mg/ml

(在本实施例中以上组分购于NewEngland Biolabs(NEB)公司)。

5、试剂盒使用说明

本试剂盒中仅包含上述4种试剂，检测中所用到的DNA提取试剂和琼脂糖凝胶电泳试剂自备，不同厂家试剂对本试剂盒检测结果的准确性和稳定性没有影响。

具体使用方法如下：

1)本试剂盒可以检测静脉外周血和空腔脱落细胞，样本经过基因组DNA提取后，要求基因组DNA溶于水中或TE缓冲液中，浓度大于10ng/μl，小于100ng/μl，基因组DNA纯度为OD260/OD280介于1.6-1.8之间。

2)PCR扩增程序程序

步骤1	95度3分钟	1个循环
			步骤2	95度15秒，58度15秒，72度45秒	32个循环
步骤3	72度3分钟	1个循环

3)消化反应条件：37℃，反应1小时。

4)琼脂糖凝胶电泳检测参数

电泳使用0.5×TBE缓冲液，2％的琼脂糖凝胶，消化后的产物取10μl加入2μl电泳上样缓冲液后进行电泳，按4V/cm的电场强度，电泳30分钟。

5)结果判读

阴性样品为265bp单一电泳条带，纯合阳性样品结果为69bp、196bp两条电泳条带，杂合阳性样品结果为69bp、196bp、265bp三条电泳条带(请见图1所示参照图)。如果检测结果不符合判读标准，则可能是试剂过期或操作错误，需重新检测。

实施例2 临床检测

对临床上200例强直性脊柱炎或其他脊柱疾病患者和250例普通人群的外周血液样本同时使用实施例1的试剂盒、商购某荧光定量PCR检测试剂盒和DNA测序方法分别对HLA-B*27进行检测。

样品处理：使用基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，货号DP348)提取基因组DNA，并按要求质检。

然后分别对提取的基因组DNA样品进行检测：

1、实施例1试剂盒的检测方法如下：

取2μl以上提取的基因组DNA加入到7.5μl 2×PCR反应预混液中，再补加5.5μl纯水，混匀后按所提供PCR反应程序进行反应。

对扩增产物进行定量，定量结果所有样本均在100-150ng/μl之间，根据定量结果取1μg扩增产物，并补充纯水至15μl，加入15μl的2×消化反应预混液，37℃下消化1小时。

取10μl消化产物按实施例1的要求进行电泳检测。将电泳结果与参照图比较，判断检测结果。

2、商购荧光定量PCR检测试剂盒按说明书进行检测。

3、采用DNA测序仪(ABI公司的3730XL型号测序仪)进行测序。

检测结果如下表所示。结果发现本技术与测序技术的检测结果完全相同，而商用荧光定量PCR检测试剂盒的检测结果则有1例假阴性。

Claims

1.一种用于检测人类白细胞抗原HLA-B*27基因的试剂盒，所述试剂盒包括：

用于扩增包含HLA-B*27基因二号外显子第142位碱基的核酸序列的扩增反应预混液；和

含有核酸限制性内切酶HpyCH4III的消化反应预混液，

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述核酸序列具有25～500个碱基；优选具有50～500个碱基；更优选具有100～300个碱基。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述核酸序列中，在所述第142号碱基之前的序列所包含的碱基数与在所述第142号碱基之后的序列所包含的碱基数相差至少10个碱基；优选相差至少50个碱基；更优选相差100～150个碱基。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述核酸限制性内切酶HpyCH4III的含量为0.5～5U/μl，优选为1.5～3U/μl，更优选为1.5～2U/μl，最优选为1.5U/μl。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，进一步包括所述核酸序列的阴性对照序列和阳性对照序列，其中所述阴性对照序列为野生型的所述核酸序列，所述阳性对照序列为所述第142位碱基发生突变的突变型的所述核酸序列在HpyCH4III识别位点被酶切后的两段核酸序列。

6.一种检测人类白细胞抗原HLA-B*27基因型别的方法，所述方法包括：

提取样品中基因组DNA；

扩增包含HLA-B*27基因二号外显子的第142号碱基的核酸序列；

用核酸限制性内切酶HpyCH4III消化所扩增的核酸序列；和

检测经消化的核酸序列，

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述样品是静脉外周血或空腔脱落细胞。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述核酸序列具有25～500个碱基；优选具有50～500个碱基；更优选具有100～300个碱基。

9.根据权利要求6所述的方法，其中所述核酸序列中，在所述第142号碱基之前的序列所包含的碱基数与在所述第142号碱基之后的序列所包含的碱基数相差至少10个碱基；优选相差至少50个碱基；更优选相差100～150个碱基。

10.根据权利要求6所述的方法，其中所述核酸限制性内切酶HpyCH4III的含量为0.5～5U/μl，优选为1.5～3U/μl，更优选为1.5～2U/μl，最优选为1.5U/μl。