CN105854035B - 一种单链抗体修饰的靶向微泡超声造影剂的制备方法 - Google Patents
一种单链抗体修饰的靶向微泡超声造影剂的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105854035B CN105854035B CN201610190220.4A CN201610190220A CN105854035B CN 105854035 B CN105854035 B CN 105854035B CN 201610190220 A CN201610190220 A CN 201610190220A CN 105854035 B CN105854035 B CN 105854035B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- preparation
- chain antibody
- contrast agent
- antibody
- liposome
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 230000004048 modification Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 88
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims abstract description 36
- 230000010358 mechanical oscillation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 18
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 12
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 claims description 10
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 8
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 5
- 230000000887 hydrating effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 2
- 230000036571 hydration Effects 0.000 claims description 2
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 2
- SORGEQQSQGNZFI-UHFFFAOYSA-N [azido(phenoxy)phosphoryl]oxybenzene Chemical compound C=1C=CC=CC=1OP(=O)(N=[N+]=[N-])OC1=CC=CC=C1 SORGEQQSQGNZFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 241001358279 Malaya Species 0.000 claims 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 17
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 abstract description 14
- 239000002961 echo contrast media Substances 0.000 abstract description 9
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 abstract description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 28
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 17
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 14
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 12
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 12
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 10
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 9
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 4
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 4
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 3
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 3
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N n-pentane Natural products CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 2
- VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N Isobutene Chemical compound CC(C)=C VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GQPLMRYTRLFLPF-UHFFFAOYSA-N Nitrous Oxide Chemical compound [O-][N+]#N GQPLMRYTRLFLPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 2
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N Propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- -1 cycloalkanes Hydrocarbon Chemical class 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 230000026030 halogenation Effects 0.000 description 2
- 238000005658 halogenation reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- NNPPMTNAJDCUHE-UHFFFAOYSA-N isobutane Chemical compound CC(C)C NNPPMTNAJDCUHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N isopentane Chemical compound CCC(C)C QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002101 nanobubble Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 238000012285 ultrasound imaging Methods 0.000 description 2
- NNRFRJQMBSBXGO-CIUDSAMLSA-N (3s)-3-[[2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]acetyl]amino]-4-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NNRFRJQMBSBXGO-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]-n-(3-methoxypropyl)acetamide Chemical compound S1C(N(C(=O)CCl)CCCOC)=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=C1 KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- PMPVIKIVABFJJI-UHFFFAOYSA-N Cyclobutane Chemical compound C1CCC1 PMPVIKIVABFJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000829980 Homo sapiens Ral guanine nucleotide dissociation stimulator Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102100023320 Ral guanine nucleotide dissociation stimulator Human genes 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000001273 butane Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N dimethyl butane Natural products CCCC(C)C AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000003682 fluorination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005732 intercellular adhesion Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 239000001282 iso-butane Substances 0.000 description 1
- 235000013847 iso-butane Nutrition 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N n-butane Chemical compound CCCC IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001272 nitrous oxide Substances 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000913 palmityl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- RGSFGYAAUTVSQA-UHFFFAOYSA-N pentamethylene Natural products C1CCCC1 RGSFGYAAUTVSQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004817 pentamethylene group Chemical group [H]C([H])([*:2])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[*:1] 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/22—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations
- A61K49/222—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, liposomes
- A61K49/223—Microbubbles, hollow microspheres, free gas bubbles, gas microspheres
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/22—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations
- A61K49/221—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations characterised by the targeting agent or modifying agent linked to the acoustically-active agent
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Acoustics & Sound (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明属于医学领域，涉及一种单链抗体修饰的靶向脂质微泡超声造影剂及其制备方法。所述的制备方法为先制备马来酰亚胺化的脂质体；以还原剂打开抗体的二硫键形成暴露巯基的单链抗体；再将单链抗体链接于脂质体表面形成靶向脂质体；最后通过机械振荡法制备靶向微泡超声造影剂。本发明所公开的方法能有效提高靶向微泡超声造影剂的产出率，在本发明报道及相关的靶向微泡超声造影剂产业化过程中具有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及超声分子影像学和生物医学工程领域，具体地涉及一种单链抗体修饰的脂质微泡超声造影剂的制备方法。
技术背景
超声分子影像即是将靶向微泡造影剂作为分子探针，以超声造影为成像模式，对活体生物化学过程进行细胞和分子水平上的定性和定量研究的分子影像学方法，可超声诊断的准确性和敏感性，在心血管、炎症性、肿瘤等疾病领域具有重要的应用前景。其中，靶向的超声分子探针是超声分子影像技术的关键。目前文献报道的超声分子探针以微泡超声造影剂为主：将特异性的配体(抗体、多肽、核酸片段、小分子等)连接在微泡造影剂表面，造影剂进入血循环后与靶部位受体分子特异性结合并积聚，使目标组织在超声成像中得到特异性的“标记”增强，实现在分子水平对靶点进行选择性成像。
对于靶向微泡超声造影剂，目前连接配体的方式有三种：
第一，生物素-亲和素法。该方法利用生物素分别修饰微泡超声造影剂和抗体，再以亲和素将二者链接形成靶向微泡。由于具有免疫原性，该类型靶向微泡难以进入临床，仅适用于基础性实验研究。
第二，共价连接法。此法将PEG-磷脂的活化羧基与配体分子(多肽)的氨基结合形成酰胺键。该方法安全稳定，但制备过程相对复杂。
第三种方法为硫醇-马来酰亚胺法。用还原剂打开双链抗体链接的二硫键，形成巯基暴露的单链抗体后，直接链接于马来酰亚胺基修饰的脂质微泡上形成靶向微泡。该方法简单直接，既不改变抗体的抗原识别位点(Fab段)，保留抗体对靶点的识别能力，又不需对抗体进行特别修饰，是目前最有应用前景的链接方式。
然而，脂质微泡单层磷脂膜包裹气体的结构并不稳定，在水溶液中容易聚集融合及破裂，而应力作用(如血液循环、离心分离等)能加速微泡的破坏。传统制备靶向微泡的方法为先制备微泡，再链接抗体，需要对样品进行多次离心(去除反应过程中的过量材料和中间产物)，容易引起微泡大量破坏，影响最终靶向微泡的产出率。
事实上，先链接配体，再制备微泡的方法并非首次出现。如专利号为CN101637613.B的中国专利。该专利公开了先通过多肽的氨基与合成脂质羧基通过酰胺键链接，再制备微泡，获得靶向脂质微泡造影剂。然而，用于作为靶向功能的多肽一般为短肽，分子量一般低于3kDa，先链接多肽并不会影响微泡的形成。相比于多肽，抗体的分子量则150kDa-1000kDa，为多肽的几十上百倍。链接的配体分子量越大，对微泡形成的干扰越大。因此，此前无人采用先链接抗体，在制备微泡的方法。
为了克服上述缺点，提高靶向抗体产出率，减少微泡不稳定性造成的损失，现对传统制备靶向微泡的硫醇-马来酰亚胺法进行改进，改变抗体的连接工艺，提高靶向微泡的制备效能。此前，在靶向脂质微泡造影剂的制备领域，从未出现过先链接抗体在制备微泡的制备方式。
发明内容
本发明的目的在于针对现有靶向超声造影剂产出效率低的缺陷，提出一种基于硫醇-马来酰亚胺法，链接抗体的改良方法，制备出高产出率的靶向微泡超声造影剂。
本发明的另一目的在于提供上述靶向微泡超声造影剂的制备方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供了一种单链抗体修饰的靶向微泡超声造影剂的制备方法，具体包括如下步骤：
S1.以磷脂成分为膜材料，通过薄膜-水化法制备马来酰亚胺化的脂质体，具体如下：
S11.将磷脂粉末在加热条件下(40～80℃)完全溶解在氯仿中。
S12.将S11制备的溶液旋转蒸发至氯仿完全挥发。旋蒸温度为25～80℃，转速为60～240rpm，利用负压蒸发将氯仿完全挥发，在圆底烧瓶中形成磷脂薄膜。
S13.在S12制备的磷脂薄膜中加入水化液，在摇床中恒温水化，获得脂质体溶液。
所述的水化液为双蒸水、氯化钠溶液或PBS，优选地，氯化钠溶液的浓度为0.9％。
作为一个选优是实施方法，步骤S13获得脂质体溶液需用孔径为400nm的水性针头滤器(Polyethersulfone，聚醚砜膜)过滤除杂。
步骤S11中的磷脂含有DSPE-PEG2000-maleimide(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺)，或者优选地还含有DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、DPPA(二棕榈酰磷脂酸)中的一种或两种；进一步优选地，为DPPC、DPPA、DSPE-PEG2000-maleimid三者组合。
优先地，DPPC、DPPA、DSPE-PEG2000-maleimide的质量分数比为7:1:1～3；进一步地，更为优选DPPC、DPPA、DSPE-PEG2000-maleimide质量分数比为7:1:2。
步骤S13中的摇床温度为37～65℃，摇床转速为60～180rpm，水化时间为0.5～2h。
S2.以还原剂MEA为主要试剂，打开链接于抗体双链分子间二硫键，制备单链的抗体分子。
具体地，步骤S2中所述单链抗体是参考由文献[Chen G,Chen W,Wu Z,Yuan R,LiH,Gao J,Shuai X.MRI-visible polymeric vector bearing CD3single chain antibodyfor gene delivery to T cells for immunosuppression.Biomaterials.2009；30(10):1962-1970.]所报道的方法，先将抗体用含0.5M EDTA的PBS溶液稀释至浓度为0.2μg/μL；将MEA溶于含0.5M EDTA的PBS溶液中，使MEA的浓度为1.5M；将上述两种溶液以1:10的体积比混合，在37℃水浴锅中孵育90min。随后将溶液用含0.5M EDTA的PBS溶液超滤洗涤三次，获得单链抗体。
步骤S2中所述的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、天然抗体片段、重组抗体片段和多特异性抗体中的任意一种，并且要具有双链结构的抗体。抗体没有进行还原前，抗体重链和轻链通过二硫键链接在一起，还原后，二硫键打开，暴露巯基。暴露的巯基的单链抗体需马上进行下一步反应，防止打开的二硫键又重新结合，形成双链抗体。
该方法制备的单链抗体分子既保留了抗原识别位点Fab段，而且含暴露的活性巯基
S3.在S1得到的马来酰亚胺化脂质体与S2获得的单链抗体分子孵育，从而获得单链抗体修饰的靶向脂质体；具体包括如下步骤：
S31.将S1制得的马来酰亚胺化脂质体溶液与S2制备的单链抗体共同孵育。
S32.用超滤管以PBS超滤离心洗涤三次，加入PBS重悬并定容为后获得靶向脂质体。
步骤S31中，马来酰亚胺化脂质体溶液与单链抗体的质量百分比为100～1000:1；优选质量比250:1。孵育时间为1～24h，孵育温度为4～37℃；优选地，孵育时间为8h，孵育温度为4℃。
步骤S31中，孵育时无需向反应液中添加其他的试剂，在室温下也可进行孵育，操作步骤简单。
步骤S32中，超滤管的分子量为1,000,000MWOC，超滤离心转速为1000～4000rpm，温度为4～25℃，每次超滤时间为0.5～2h。
优选地，步骤S32中，超滤离心转速为3000rpm，温度为4℃，每次超滤时间为1h。
S4.向S3获得的靶向脂质体通入气体，然后进行高速机械振荡制备微泡混悬液，随后离心分离微泡，并以PBS重悬(此步骤重复3次)，即可获得靶向微泡超声造影剂。
步骤S4中所述气体可以包括，例如，空气；氮气；氧气；二氧化碳；氢气；氧化亚氮；稀有气体或惰性气体；低分子量烃，如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、异丁烷、戊烷或异戊烷)、环烷烃(例如环丁烷或环戊烷)、烯烃(例如丙烯、丁烯或异丁烯)或炔烃(例如乙炔)；卤化气体，如氟化气体，例如卤化、氟化或全氟化低分子量烃；或任意这些前述物质的混合物中的一种。
优选氟化气体，尤其是全氟化气体，例如CF4、C2F6、C3F8、C4F8和C4F10。
在本发明优选的实施例中，通入的气体为C3F8。
步骤S4中高速机械振荡可以是超声振荡或机械剪切，可采用的仪器有机械剪切机、超声仪，银汞调和器等；进一步地，振荡频率为40～80Hz，优选67Hz；振荡时间为10～100s，优选35～65s；更优选为45s；
步骤S4中的离心分离微泡的转速为500～3000rpm，离心时间为1～20min。更优选地，离心分离微泡的转速为2000rpm，离心时间为5min。
在制备以抗体为配体的靶向超声微泡造影剂，先链接抗体，再制备微泡的方法为首次出现。但在制备以多肽为配体的靶向超声微泡造影剂时，已存在先链接多肽，再制备微泡的方法，如专利号为CN 101637613B和CN 103230605A的中国专利。然而，靶向多肽一般为短肽，如：KGDS(赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸)、RGDS(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸)或RGDyk(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-丝氨酸-赖氨酸)。多肽的分子量较小，一般低于3kDa，而抗体的分子量则为多肽的上百倍(单克隆抗体150-180kDa，多克隆抗体700-1000kDa)，且抗体还具有三级结构，较短肽结构复杂。分子量越大，对微泡的粒径、脂质体和微泡的结构影响也越大。因此，此前，在采用抗体制备靶向微泡造影剂时，无人采用先链接抗体在制备微泡的方法。
经本研究发现，在本发明的条件下，先链接抗体再制备微泡，可获得高产和高质的靶向脂质微泡造影剂。以多肽作为靶向配体时，多肽的氨基与磷脂的羧基结合成酰胺键时，需添加缩合剂和催化剂，而在本方案中，以单链抗体作为靶向配体，单链抗体有暴露的活性巯基，能直接与脂质体表面的马来酰亚胺基反应，反应过程及条件简单，无需添加催化剂等，也不需对抗体进行额外的修饰。
本方案中，震荡时间直接影响靶向脂质微泡的浓度。当震荡时间低于35s时，难于形成较高浓度的MBICAM-1。当震荡时间为35～65s时，MBICAM-1的浓度可以达到107bubbles/mL以上；尤其是当震荡时间超过45s后，MBICAM-1的产出率呈较高的稳定状态，，制备出的靶向微泡大小适宜，粒径分布均一(见图五)。
相比于以抗体作为靶向配体的传统制备方法，本发明方法的有益效果是：
传统的靶向微泡超声造影剂的制备方法都是将离心除杂(未结合的抗体、中间反应小分子等)程序放在靶向微泡制备后的阶段，导致微泡受到大量破坏。本发明的方法将离心除杂程序都放在中间产物相对稳定的靶向脂质体制备步骤，且最大程度减少微泡离心次数。本发明的离心次数为3次，传统方法为至少6次。通过改良抗体连接的方法，本发明靶向微泡的最终产出率高于传统方法的4-5倍。
同时本发明方法制备的单链抗体修饰微泡超声造影剂，还具有以下优势：
1.因单链抗体分子量比双链抗体小，链接单链抗体后前后，微泡粒径无明显改变，能减少抗体对脂质体或微泡结构、性能的影响；在本发明的一实施例中，链接抗体前后微泡的粒径分别为1076.1±118.5nm，1183.7±106.8nm，二者差别无统计学意义(P>0.05)。
2.单链抗体有暴露的活性巯基，能直接与脂质体表面的马来酰亚胺基反应，反应过程及条件简单，不需要对抗体进行额外的修饰。
3.单链抗体保留双链抗体的抗原识别位点Fab段，保证了微泡超声造影剂的靶向特异性。
4.即使在低浓度的情况下，也可以保持高效的成像效果。
5.抗体与脂质体的链接率高，为99％以上，且微泡稳定高。
附图说明
图1.共聚焦显微镜观察本发明“新方法”和“传统方法”制备的靶向微泡超声造影剂的单链抗体链接情况。其中DiI表示红色荧光标记的微泡，FITC表示绿色荧光二抗标记的单链抗体。(比例尺：20μm)
图2.流式细胞计数法定量分析“新方法”和“传统方法”制备靶向微泡超声造影剂的单链抗体链接率：(A)绿色荧光二抗标记靶向微泡的分布；(B)两种方法链接单链抗体的阳性率。
图3.不同方法对靶向微泡超声造影剂终产物浓度的检测
(A)“新方法”制备的靶向微泡超声造影剂的镜下形态；
(B)“传统方法”制备的靶向微泡超声造影剂的镜下形态。(比例尺：20μm)
(C)终产物的大体外观，其中左侧EP管为“新方法”，右侧EP管为“传统方法”；
(D)两种方法制备靶向微泡的终产物浓度定量结果。
图4体外超声造影成像观察不同方法制备靶向微泡超声造影剂在稀释1000倍后的成像效能，其中对照组为未连接单链抗体的非靶向微泡超声造影剂。
图5不同的振荡时间对微泡浓度的影响：
(A)不同振荡时间制备靶向微泡终产物的大体外观。
(B)不同振荡时间制备靶向微泡终产物浓度的定量分析。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
为了叙述方便，本发明所述先制备靶向脂质体再制备靶向微泡超声造影剂的方法简称为“新方法”；传统先制备微泡超声造影剂再链接抗体的方法简称为“传统方法”。
实施例1：以新方法制备靶向微泡超声造影剂
按7:1:2的质量分数比称量磷脂粉末DPPC、DPPA、DSPE-PEG2000-maleimide共20mg并置于小烧杯中，加入氯仿4mL。在水浴锅中加热到50℃，用玻棒搅拌至磷脂完全溶解；随后将磷脂氯仿溶液转移至容积为50mL的圆底烧瓶中。在旋转蒸发仪上(水浴温度为50℃、转速为120rpm)将氯仿完全挥发，在圆底烧瓶底部形成磷脂薄膜。在圆底烧瓶中加入水化液(PBS)，用保鲜膜与橡皮筋封口，在60℃、120rpm的恒温摇床中水化45min，获得脂质体溶液。用孔径为400nm的水性针头滤器(Polyethersulfone，聚醚砜膜)过滤后即可获得马来酰亚胺化的脂质体(mal-liposome)。
以文献[Chen G,Chen W，Wu Z,Yuan R,Li H,Gao J,Shuai X.MRI-visiblepolymeric vector bearing CD3 single chain antibody for gene delivery to Tcells for immunosuppression.Biomaterials.2009；30(10):1962-1970.]所报道的方法制备单链抗体(single chain antibody，scAb)。具体地：将10μL浓度为1μg/μL的兔抗大鼠ICAM-1(intercellular adhersion molecule-1，细胞间粘附因子-1)多克隆抗体以40μLPBS稀释，然后加入10μL 0.5M的EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸)溶液，定义为溶液A。将60mg MEA溶解于500μL PBS中，并加入10μL 0.5M的EDTA，定义为溶液B。将溶液A和溶液B混合，37℃水浴孵育90min。用浓度为10mM的EDTA的PBS溶液超滤3次(超滤管分子量为100,000，转速为3000rpm，每次超滤时间为8min)，获得ICAM-1的scAb，简称scICAM-1。
将上述步骤中获得的scICAM-1与mal-liposome在容积为5mL的离心管中于4℃冰箱中孵育过夜。次日用PBS超滤离心洗涤三次(超滤管分子量为1,000,000，转速为3000rpm，每次超滤时间为1h)，用PBS重悬并定容为0.5mL及获得scICAM-1标记的脂质体，简称liposomeICAM-1。将0.5mL liposomeICAM-1转移至容积为1.5mL的EP管中，用10mL注射器抽取C3F8，将EP管中的空气置换成C3F8。随后将EP管置于银汞调和器中，以67Hz的频率振荡45s形成乳白色液体。室温下静置10min后，以2000rpm的速度离心10min，使EP管中的溶液分为上下两层。其中上层为乳白色的靶向微泡，下层为半透明的过量材料、磷脂碎片等。用长针吸取下层半透明溶液，然后加入0.5mL PBS重悬乳白液。重复上述方法三次，即可获得scICAM-1标记的靶向微泡超声造影剂，简称MBICAM-1。
以动态光散射法检测链接scICAM-1前MB的粒径为1076.1±118.5nm，链接scICAM-1后MBICAM-1的粒径为1183.7±106.8nm，二者差别无统计学意义(P>0.05)。
对比例：以传统方法制备靶向微泡超声造影剂
先制备微泡超声造影剂(简称MB)，后连接scICAM-1的“传统方法”制备MBICAM-1。
现将“传统方法”-简述如下：取上述方法(实施例1)中制备mal-liposome 0.5mL置于EP管中，并进行机械振荡形成马来酰亚胺化的MB，简称mal-MB。制备scICAM-1的步骤同“新方法”。将0.5mL mal-MB与10μg scICAM-1混合，在37℃水浴窝中恒温孵育90min。用PBS对样品离心洗涤三次(2000rpm，每次10min)，即获得传统方法制备的MBICAM-1。
综上所述，“新方法”制备过程中MBICAM-1对MB离心次数为3次，而“传统方法”则需要对MB进行离心6次。“新方法”最大程度的减少了MB的离心次数，显著地增强了MB的产出率。
实施例2：微泡链接单链抗体效能检测
本实施例通过激光共聚焦显微镜和定量的流式细胞技术法分别从定性和定量两个层面观察“新方法”制备MBICAM-1的基本效能及与“传统方法”制备MBICAM-1比较的优势。具体方法如下：在制备MBICAM-1以磷脂形成脂质薄膜的时候加入0.5mg疏水性的红色荧光染料DiI，用于标记MB超声造影剂；在形成MBICAM-1后，将MBICAM-1与绿色荧光染料FITC标记的驴抗兔荧光二抗孵育，离心洗涤后获得MB被标记为红色荧光、scICAM-1被标记为绿色荧光的MBICAM-1。
利用激光共聚焦显微镜分别观察两种方法制备MBICAM-1红色荧光标记的MB表面链接绿色荧光二抗标记scICAM-1的情况。激光共聚焦显微镜观察结果如附图1所示，几乎所有红色荧光标记的MB表面均链接有绿色荧光二抗标记的scICAM-1，提示无论“新方法”还是“传统方法”，scICAM-1的链接效能都很高。流式细胞计数法定量观察绿色荧光二抗标记MBICAM-1的情况如附图2所示，“新方法”scICAM-1的链接率为(99.9±5.4)％，而“传统方法”制备MBICAM-1的scICAM-1链接率为(99.0±5.4)％，二者差别无统计学意义(P>0.05)。
实施例3：靶向微泡超声造影剂浓度及超声成像能力检测
本实施例通过检测“新方法”和“传统方法”制备MBICAM-1的最终产出率，突出说明本发明“新方法”制备靶向微泡超声造影剂的优势。具体方法如下：①直接大体观察两种方法制备MBICAM-1的终产物。结果如附图3A所示，两种方法制备的MBICAM-1在EP管中均呈分层的乳白色液体，由于MB为中空的微气泡结构，静止后(约15min)MB上浮引起溶液分层(上层MB浓度高呈乳白色，下层MB浓度低呈半透明)。无论上层乳白色液体还是下层半透明液体，“新方法”制备的MBICAM-1浓度均高于“传统方法”。②在普通明场显微镜下(400×)观察两种方法制备的MBICAM-1，结果发现“新方法”制备的MBICAM-1(附图3B)粒径大小与“传统方法”(附图3C)相当。根据发明人课题组前期报道的方法[Yin T,Wang P,Zheng R,Zheng B,Cheng D,ZhangX,Shuai X.Nanobubbles for enhanced ultrasound imaging of tumors.Int JNanomedicine.2012；7:895-904.]对MBICAM-1进行定量分析，结果显示(附图3D)“新方法”所制备的MBICAM-1浓度为(3.1±0.5)×107个/mL，明显高于“传统方法”的(0.7±0.3)×107个/mL(P＜0.001)，证实“新方法”制备MBICAM-1的产出率为“传统方法”的4～5倍。
本实施例还通过体外超声造影成像的方法进一步说明“新方法”制备靶向超声造影剂产出率高的优势。具体实施方法如下：两种方法制备所得的MBICAM-1用0.9％生理盐水稀释1000倍，然后置于特质的2％琼脂糖模具中进行超声造影成像。本实施例使用GE LOGIQE9临床超声诊断系统及ML6-15线阵探头进行超声造影成像，结果如附图4所示，“传统方法”制备的MBICAM-1在稀释1000倍后的成像效能远不如未连接scICAM-1的MB，而“新方法”所制备的MBICAM-1稀释1000倍后的超声成像能力与MB相当，提示新方法并不会降低MB的浓度导致成像效能的下降。
实施例4：不同的振荡时间对靶向脂质微泡的影响
为了证明不同振荡时间对靶向脂质微泡浓度的影响，分别选用不同的振荡时间制备MBICAM-1，其余步骤与实施例1相同。不同的振荡时间制备出的MBICAM-1，根据发明人课题组前期报道的方法[Yin T,Wang P,Zheng R,Zheng B,Cheng D,Zhang X,ShuaiX.Nanobubbles for enhanced ultrasound imaging of tumors.Int JNanomedicine.2012；7:895-904.]对MBICAM-1进行定量分析。实验结果如图5所示。
由图5可知，震荡时间直接影响靶向脂质微泡的浓度。即使采用“新方法”制备MBICAM-1，当震荡时间低于35s时，也难于形成较高浓度的MBICAM-1。当震荡时间为35～65s时，MBICAM-1的浓度可以达到107bubbles/mL以上，尤其是当震荡时间为45s时，浓度最高，在此时间点，制备出的靶向微泡大小适宜，粒径分布均一，抗体结合率高。
Claims (26)
1.一种单链抗体修饰的靶向微泡超声造影剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.制备马来酰亚胺化脂质体悬浮液；
S2.通过还原法制备单链抗体；
S3.将马来酰亚胺化脂质体与单链抗体共同孵育制备靶向脂质体；
S4.向靶向脂质体通入气体，振荡，随后离心分离微泡，制备靶向微泡超声造影剂；
所述步骤S4中离心分离微泡的转速为500～3000rpm，离心时间为1～20min。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1采用薄膜-水化法准备马来亚酰胺脂质体，包括以下步骤：
S11.将氯仿和磷脂粉末加热混匀；
S12.将S11中制备的溶液旋转蒸发至氯仿完全挥发，形成磷脂薄膜；
S13.在S12制备的磷脂薄膜中加入水化液，恒温摇床水化，得到马来酰亚胺化脂质体溶液；所述的水化液选自双蒸水、氯化钠溶液或PBS。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2包括以下步骤：
S21.将双链抗体与EDTA溶液混合；
S22.在步骤S21所得溶液中加入2-巯基乙胺，充分混合后在37℃水浴90min；
S23.将S22所得溶液用含EDTA的PBS超滤洗涤三次获得单链抗体。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3包括以下步骤：
S31.将S1制得的马来酰亚胺化脂质体溶液与S2制备的单链抗体共同孵育；
S32.加PBS超滤离心洗涤三次，加PBS重悬定容获得靶向脂质体。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4具体如下：
向S3制备的靶向脂质体通入气体，进行高速机械振荡，随后离心分离微泡，以PBS重悬，即可获得靶向微泡超声造影剂。
6.如权利要求2所述方法，其特征在于步骤S11中所述的磷脂含有DSPE-PEG2000-maleimide。
7.如权利要求6所述方法，其特征在于步骤S11中所述的磷脂还含有DPPC、DPPA中的一种或两种。
8.如权利要求2所述方法，其特征在于步骤S11中所述的磷脂为DPPC、DPPA、DSPE-PEG2000-maleimid三者组合。
9.如权利要求8所述方法，其特征在于所述的DPPC、DPPA、DSPE-PEG2000-maleimide的质量分数比为7:1:1～3。
10.如权利要求8所述方法，其特征在于所述的DPPC、DPPA、DSPE-PEG2000-maleimide的质量分数比为7:1:2。
11.权利要求2所述方法，其特征在于步骤S13中的摇床温度为37～65℃，摇床转速为60～180rpm，水化时间为0.5～2h。
12.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤S31中，马来酰亚胺化脂质体与单链抗体的质量分数比为100～1000:1。
13.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤S31中，马来酰亚胺化脂质体与单链抗体的质量分数比为250:1。
14.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤S32中，超滤离心转速为1000～4000rpm。
15.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤S32中，超滤离心转速为3000rpm。
16.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤S32中，超滤离心温度为4～25℃。
17.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤S32中，超滤离心温度为4℃。
18.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤S32中，每次超滤时间为0.5～2h。
19.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤S32中，每次超滤时间为1h。
20.如权利要求1所述方法，其特征在于步骤S4中机械振荡频率为40～80Hz。
21.如权利要求1所述方法，其特征在于步骤S4中机械振荡频率为67Hz。
22.如权利要求1所述方法，其特征在于步骤S4中机械振荡时间为10～100s。
23.如权利要求1所述方法，其特征在于步骤S4中机械振荡时间为35～65s。
24.如权利要求1所述方法，其特征在于步骤S4中机械振荡时间为45s。
25.如权利要求1所述方法，其特征在于步骤S4中离心分离微泡的转速为2000rpm。
26.如权利要求1所述方法，其特征在于步骤S4中离心分离微泡的离心时间为5min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610190220.4A CN105854035B (zh) | 2016-03-29 | 2016-03-29 | 一种单链抗体修饰的靶向微泡超声造影剂的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610190220.4A CN105854035B (zh) | 2016-03-29 | 2016-03-29 | 一种单链抗体修饰的靶向微泡超声造影剂的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105854035A CN105854035A (zh) | 2016-08-17 |
| CN105854035B true CN105854035B (zh) | 2019-08-02 |
Family
ID=56627042
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610190220.4A Active CN105854035B (zh) | 2016-03-29 | 2016-03-29 | 一种单链抗体修饰的靶向微泡超声造影剂的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105854035B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106581698A (zh) * | 2016-12-21 | 2017-04-26 | 中国人民解放军总医院 | 用于动脉粥样硬化不稳定斑块识别的超声荧光双模态纳米探针的制备方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100402092C (zh) * | 2005-06-07 | 2008-07-16 | 西安交通大学 | 血栓诊断和/或治疗用含气干粉活性剂及其制备工艺 |
| CN101015701A (zh) * | 2007-03-12 | 2007-08-15 | 东南大学 | 在体反应式微气泡超声造影剂及其制备方法 |
| GB201223332D0 (en) * | 2012-12-21 | 2013-02-06 | Yeh James S | Microparticle compositions |
| CN103394102B (zh) * | 2013-05-22 | 2018-08-07 | 博信生物科技股份有限公司 | 一种脂质微/奈米气泡、及其优化的制备方法及制备装置 |
| CN105727320B (zh) * | 2016-01-30 | 2018-10-19 | 山西大学 | 检测小细胞肺癌的靶向纳米微泡及其制备方法和应用 |
-
2016
- 2016-03-29 CN CN201610190220.4A patent/CN105854035B/zh active Active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Nanobubbles as ultrasound contrast agent for facilitating small cell lung cancer imaging;Jin-Ping Wang et al;《Oncotarget》;20170524;第8卷(第44期);第78153-78162页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105854035A (zh) | 2016-08-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yang et al. | Nanobubble–Affibody: Novel ultrasound contrast agents for targeted molecular ultrasound imaging of tumor | |
| Cametti et al. | The fluorous effect in biomolecular applications | |
| Lucie et al. | Clustering and internalization of integrin αvβ3 with a tetrameric RGD-synthetic peptide | |
| CN100563718C (zh) | 用于反差成像的充气微囊组件 | |
| CN1897978B (zh) | 具有用于反差成像的活性组分的充气微囊组件 | |
| Wang et al. | Platelet membrane-functionalized nanoparticles with improved targeting ability and lower hemorrhagic risk for thrombolysis therapy | |
| CN112957478B (zh) | 一种细胞外囊泡(EVs)表面修饰靶向配体的方法 | |
| CN107920964A (zh) | 融合脂质体包被的多孔硅纳米颗粒 | |
| CN105732996B (zh) | 一种表面改性的聚多巴胺纳米粒子Pickering乳液的制备方法 | |
| CN109568268A (zh) | 胎盘靶向递送系统及其制备方法和应用 | |
| Wheeler et al. | Polyethylene glycol modified phospholipids stabilize emulsions prepared from triacylglycerol | |
| CN113372226B (zh) | 一种脂质分子、脂质纳米粒及其制备方法和应用 | |
| Gan et al. | Protein corona of metal-organic framework nanoparticals: Study on the adsorption behavior of protein and cell interaction | |
| CA2924018A1 (en) | Cell-specific targeting using nanostructured delivery systems | |
| JP5775073B2 (ja) | 両親媒性分子の混合物および融合による細胞膜修飾方法 | |
| Zhu et al. | Construction of ultrasonic nanobubbles carrying CAIX polypeptides to target carcinoma cells derived from various organs | |
| Shi et al. | Microbubbles decorated with dendronized magnetic nanoparticles for biomedical imaging: effective stabilization via fluorous interactions | |
| Domingo et al. | Preparation of PEG-grafted immunomagnetoliposomes entrapping citrate stabilized magnetite particles and their application in CD34+ cell sorting | |
| CN105854035B (zh) | 一种单链抗体修饰的靶向微泡超声造影剂的制备方法 | |
| Bérard et al. | Perfluorocarbon Nanodroplets as Potential Nanocarriers for Brain Delivery Assisted by Focused Ultrasound-Mediated Blood–Brain Barrier Disruption | |
| CN111632154A (zh) | 一种相转变纳米泡、其制备方法及用途 | |
| CN105326792A (zh) | 靶向脂质体包裹水相纳米金复合物的制备方法 | |
| Bona et al. | Multibranched-Based Fluorinated Materials: Tailor-Made Design of 19F-MRI Probes | |
| Rezler et al. | Peptide-mediated targeting of liposomes to tumor cells | |
| CN107648620A (zh) | 携载caix适体的靶向超声纳米泡及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |