CN105832760A - 香菇多糖在制备预防1型糖尿病药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了香菇多糖在制备预防1型糖尿病药物中的用途。香菇多糖在制备预防1型糖尿病的药物中的应用。香菇多糖在制备辅助治疗1型糖尿病的药物中的应用。本发明申请人通过运用香菇多糖腹腔注射自发1型糖尿病的NOD鼠，观察香菇多糖通过调节机体免疫对NOD鼠发病的影响。本发明所述香菇多糖通过提高NOD鼠脾脏、胰腺淋巴结中CD25⁺Foxp3⁺T细胞(Treg)的数量、抑制CD3⁺CD8⁺细胞毒性T细胞(CTL)的活化，降低促炎细胞因子分泌，进而减弱NOD鼠胰岛炎的发生，提高血清胰岛素水平，维持血糖趋于正常水平，最终显著降低NOD鼠1型糖尿病的发病，提高NOD鼠的存活率。

Description

香菇多糖在制备预防1型糖尿病药物中的用途

技术领域

本发明属于医药领域，涉及香菇多糖的用途，具体涉及香菇多糖在制备预防1型糖尿病的药物中的用途。

背景技术

糖尿病(Diabetes mellitus,DM)已成为现代社会严重影响人类健康的常见病和多发病。2010年，国际糖尿病联盟(IDF)的报告指出全球糖尿病患者已高达2.46亿，预计到2025年糖尿病患者将增至3.88亿。在我国，糖尿病患者已接近9240万，其中2型糖尿病占90％～95％，1型糖尿病的患病率也以2％～5％的速度增长。

虽然1型糖尿病和2型糖尿病都是遗传因素和环境因素相互作用的结果，但两者存在本质区别。首先，二者发病机制的不同：1型糖尿病主要是在遗传缺陷和不良环境因素共同作用下，由T淋巴细胞介导的器官特异性自身免疫性疾病，主要由于免疫系统的异常，引起CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞对胰岛的浸润，引发胰岛炎损伤胰岛β细胞，使胰岛素分泌绝对减少，引起体内胰岛素绝对缺乏，导致血糖持续升高。简言之，1型糖尿病是由于胰岛β细胞损伤不能分泌胰岛素，该病多发生于青少年。与1型糖尿病相比，2型糖尿病的发病具有更大的遗传易感性，在不良环境因素刺激下出现胰岛素分泌模式的改变和其分泌胰岛素的生物学活性减低，主要表现为进餐后胰岛素第一时相分泌消失或延迟，第二时相分泌峰值降低，胰岛素原的含量明显高于正常人。2型糖尿病所造成的胰岛素缺乏为相对缺乏且伴有不同程度的胰岛素抵抗，这一特点就决定了它是属于不断发展的进行性疾病。根据其发病阶段的不同，可以由显著的胰岛素抵抗伴胰岛素相对不足，到明显的胰岛素绝对不足伴胰岛素抵抗。2型糖尿病发病的核心因素是胰岛素抵抗，即：胰岛素敏感的末梢组织(如：肝脏、肌肉、脂肪)对胰岛素的敏感性降低，它可贯穿整个发病的全过程，而1型糖尿病却不然。此外，虽然2型糖尿病的晚期也可造成胰岛素的绝对缺乏，但这只是功能上的完全衰竭，它与1型糖尿病所致胰岛功能的完全衰竭在本质上是截然不同的。简言之，2型糖尿病是胰岛β细胞正常，但胰岛素发挥的作用减弱，即发生了胰岛素抵抗，该病多发生在肥胖人群、中老年人群。其次，二者治疗手段及所用药物的不同：1型糖尿病胰岛素分泌缺乏，必须依赖胰岛素治疗维持生命；2型糖尿病主要有饮食控制、运动疗法降低体重、口服降血糖药及胰岛素治疗。其中，降血糖药主要有双胍类药物、磺脲类药物、噻唑烷二酮类药物、苯甲酸盐生物类药物及α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物等。1型糖尿病的最初形式为胰岛炎，此阶段大部分β细胞仍然是完好的，当大部分胰岛β细胞遭到破坏后就会出现明显的临床症状。因此，进行有效的早期干预，预防1型糖尿病的发病在理论上是可行的。

香菇多糖(Lentinan,LNT)是从优质香菇子实体中提取的有效活性成分，LNT中的活性成分是具有分支的β—(1—3)—D—葡聚糖，主链由β—(1—3)—连接的葡萄糖基组成，沿主链随机分布着由β—(1—6)连接的葡萄糖基，呈梳状结构。香菇多糖的分子式为(C₆H₁₀O₅)n，分子量为40～80万。近年来，越来越多的临床和基础研究证实，香菇多糖具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、调节免疫等方面的功能。研究显示，在体内，香菇多糖可通过增强机体的免疫功能发挥抗肿瘤活性。且与其他抗肿瘤药物相比，香菇多糖具有良好的抗疲劳作用，几乎无任何副作用，对胃癌、直肠癌、鼻咽癌、乳腺癌和慢性粒细胞白血病等有抑制和防止术后微转移的作用。在体外，香菇多糖还可增强脱氧胸腺嘧啶核苷的抗艾滋病毒的活性。然而，香菇多糖能否用于预防1型糖尿病并未见有学者提及。

王慧铭等人在《香菇多糖对小鼠降血糖作用及其机理的研究》及《香菇多糖对高血糖大鼠降血糖作用及其机理的研究》中虽公开了在实验期内香菇多糖对注射四氧嘧啶(120mg/kg)建立糖尿病动物模型的小鼠和大鼠有显著的降血糖、改善糖耐量、增加体内肝糖原的作用，其作用是通过调节糖代谢、促进肝糖原合成、减少肝糖原分解引起的而非通过胰岛素的作用。同时该文章也公开了在试验期内，高血糖小鼠和大鼠的胰岛素水平没有明显的改变，说明香菇多糖没有明显的促进胰岛素分泌或使遭四氧嘧啶破坏的胰岛β细胞复活的作用，故本试验结果对指导非胰岛素依赖型糖尿病患者(即2型糖尿病)的临床治疗具有重大意义，而对1型糖尿病患者的治疗作用有待进一步深入研究。由于该文章的研究对象为注射四氧嘧啶(120mg/kg)建立糖尿病动物模型的小鼠和大鼠，根据其研究结论，得知该模型为2型糖尿病动物模型，而1型糖尿病和2型糖尿病的致病机理明显不同。因此，本领域技术人员根据其记载无法获知香菇多糖是否对1型糖尿病同样有效。

非肥胖型糖尿病(non-obese diabetic,NOD)小鼠是一种广泛用于1型糖尿病研究的啮齿类动物模型，其出现自发性糖尿病的临床特征、病理形态学和免疫学的表现与人类1型糖尿病极为相似。该品系小鼠通常于4～5周龄开始出现胰腺炎，进行性破坏胰岛β细胞，于12周龄时出现明显的糖尿病症状，至30周龄时雌性小鼠累计发病率可达到80％，而雄性小鼠则不到20％。因此，该发明以4～5周龄的雌性NOD鼠为研究对象，便于更好的了解香菇多糖对1型糖尿病发病的预防作用。

发明内容

本发明的目的在于提供香菇多糖的一种新用途，具体来说是所述香菇多糖作为预防1型糖尿病药物的用途。

本发明的另一个目的是提供一种预防1型糖尿病的新药物。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

香菇多糖在制备预防1型糖尿病的药物中的应用。

香菇多糖在制备辅助治疗1型糖尿病的药物中的应用。

一种预防1型糖尿病的药物组合物，含有香菇多糖作为有效成分，还含有药学上允许的辅料。

一种辅助治疗1型糖尿病的药物或保健品，含有香菇多糖。

其中，香菇多糖可以在市场上购得，也可以自制，优选地，所述香菇多糖是在江苏永健医药科技有限公司购买得到的。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种香菇多糖在预防1型糖尿病中的用途。本发明申请人通过运用非肥胖自发1型糖尿病NOD小鼠模型，观察香菇多糖通过调节机体免疫对小鼠1型糖尿病发病及存活率的影响，本发明所述香菇多糖通过提高NOD鼠脾脏、胰腺淋巴结中CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞(Treg)的数量、降低CD3⁺CD8⁺细胞毒性T细胞(CTL)的数量，抑制促炎细胞因子分泌，进而缓解NOD鼠胰岛炎的发生，提高血清胰岛素水平，维持血糖趋于正常水平，最终显著降低NOD鼠1型糖尿病的发病，提高NOD鼠的存活率。

附图说明

图1显示腹腔注射PBS或香菇多糖20周后，检测NOD鼠血浆葡萄糖水平。

图2显示用PBS或香菇多糖腹腔注射NOD鼠20周后，检测小鼠1型糖尿病的发病。

图3显示腹腔注射PBS或香菇多糖30周后，检测小鼠的存活率。

图4显示腹腔注射PBS或香菇多糖20周后，检测小鼠血清胰岛素水平。

图5显示给药20周后，检测同注射PBS组对比，香菇多糖对NOD鼠胰岛炎发生的影响。

图6显示经上述处理小鼠后，ELISA检测各组小鼠血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-12和IFN-γ的含量。

图7显示经上述处理小鼠后，ELISA检测各组小鼠血清中抑炎细胞因子TGF-β1、IL-2和IL-10的含量。

图8显示经上述处理NOD小鼠后，各组小鼠脾脏中CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞的数量；其中A图为流式细胞仪检测结果图，B图为对应的柱状统计图。

图9显示经上述处理NOD小鼠后，各组小鼠脾脏中CD3⁺CD8⁺CTL细胞的数量；其中A图为流式细胞仪检测结果图，B图为对应的柱状统计图。

图10显示经上述处理NOD小鼠后，各组小鼠胰腺淋巴结中CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞的数量；其中A图为流式细胞仪检测结果图，B图为对应的柱状统计图。

图11显示经上述处理NOD小鼠后，各组小鼠胰腺淋巴结中CD3⁺CD8⁺CTL细胞的数量；其中A图为流式细胞仪检测结果图，B图为对应的柱状统计图。

图12显示分选正常NOD小鼠的脾脏T淋巴细胞，体外用不同浓度香菇多糖刺激，流式检测各组CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞的数量；其中A图为流式细胞仪检测结果图，B图为对应的柱状统计图。

图13显示分选正常NOD小鼠的脾脏T淋巴细胞，体外用不同浓度香菇多糖刺激，流式检测各组CD3⁺CD8⁺CTL细胞的数量；其中A图为流式细胞仪检测结果图，B图为对应的柱状统计图。

图14显示提取正常NOD小鼠胰腺淋巴结中的淋巴细胞，体外用不同浓度香菇多糖刺激，流式检测各组CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞的数量；其中A图为流式细胞仪检测结果图，B图为对应的柱状统计图。

图15显示提取正常NOD小鼠胰腺淋巴结中的淋巴细胞，体外用不同浓度香菇多糖刺激，流式检测各组CD3⁺CD8⁺CTL细胞的数量；其中A图为流式细胞仪检测结果图，B图为对应的柱状统计图。

图16显示体外用不同浓度香菇多糖刺激脾脏T淋巴细胞后，细胞培液中促炎细胞因子TNF-α(A)和抑炎细胞因子TGF-β1(B)的含量。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1香菇多糖对NOD鼠1型糖尿病发病的影响。

实验动物：4-5周龄雌性NOD小鼠及饲料，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(苏)2011-0003。动物随机分笼饲养，食水自由。

实验药品：香菇多糖购自江苏永健医药科技有限公司，阴性对照为PBS。

实验步骤：

1)4周龄雌性NOD小鼠进入南京医科大学实验动物中心，在清洁环境中饲养，温度(21±2)℃，湿度(35±2)％，12h:12h昼夜间断照明，自由进食饮水，饮用水为实验动物中心制备的蒸馏水。

2)经适应性饲养一周，随机分3组，每组15只，隔天腹腔分别注射PBS(香菇多糖对照组，按0.03ml/30g体重注射)、低剂量香菇多糖(1mg/kg体重，香菇多糖溶于PBS)、高剂量香菇多糖(5mg/kg体重，香菇多糖溶于PBS)。

3)每周测定血糖，持续20周。测量方法为：取尾静脉血1滴，用血糖试纸及快速血糖仪测定随机血糖。以血糖浓度≥11.1mmol/L且持续一周以上诊断为糖尿病。

4)待小鼠周龄为30周龄，一部分小鼠摘眼球法取全血，4℃，5000×g离心10min，血清置-80℃保存备做指标测定；剩余小鼠继续注射PBS和香菇多糖，30周后检测其存活率。

5)取步骤4)的血清10μl，参考试剂盒说明书采用ELISA法测定血胰岛素水平。

6)小鼠死后立即取出脾脏和胰腺淋巴结，PBS清洗，待后续提取淋巴细胞。

7)小鼠死后立即取出胰腺，PBS清洗，用4％多聚甲醛液固定24h，80％乙醇保存。随后，经石蜡包埋、透明后切片，进行苏木素-伊红(H-E)染色。倒置显微镜观察胰岛病理改变。分别计数5-8只小鼠的胰岛数目，进行胰岛炎分级计数。分级采用国际标准：胰岛周围无淋巴细胞浸润，为0级；胰岛周围有淋巴细胞浸润，但未进入胰岛内部，为1级；淋巴细胞浸润至胰岛内，但浸润程度﹤50％者为2级；淋巴细胞浸润至胰岛内，但浸润程度﹥50％者为3级；淋巴细胞完全占据整个胰岛者为4级。

统计学分析：本实验所有数据均采用均值±标准差(±s)表示，组间差异性分析采用t检验，以P<0.05作为统计学差异参考标准。

实验结果：

1)如图1所示，从香菇多糖注射第14周起，PBS对照组NOD鼠的随机血糖水平明显高于香菇多糖低剂量组和高剂量组(P*<0.05)，可见NOD小鼠在用香菇多糖长期注射后，血浆葡萄糖水平明显降低。

2)给药0-20周期间，通过检测随机血糖水平，检测了三组NOD鼠糖尿病的发病率(随机血糖≥11.1mmol/L且持续1周则认为发病)，结果如图2所示，同PBS对照组相比，高、低剂量的香菇多糖都明显的降低了NOD鼠1型糖尿病的发病，且高剂量的香菇多糖作用更加显著。(P*<0.05)

3)给药30周后，统计三组NOD鼠的存活率，结果如图3所示，同PBS对照组相比，高、低剂量的香菇多糖明显提高了NOD鼠的存活率，且高剂量的香菇多糖作用更好。(P*<0.05；P^#<0.05)

4)在鼠30周龄时采血测定血清胰岛素的结果如图4显示，同PBS对照组相比，高、低剂量的香菇多糖处理都可显著提高NOD鼠血清胰岛素水平，且高剂量的香菇多糖处理对β细胞的分泌功能保护作用更显著。(P*<0.05；P**<0.01)

5)检测30周龄的NOD鼠胰腺组织切片，结果如图5所示，PBS对照组胰岛炎程度极其严重，淋巴细胞几乎完全占据了整个胰岛，经统计发现，只有～5％的胰岛无淋巴细胞浸润(0级)；而低剂量香菇多糖处理组淋巴细胞浸润程度达到50％，经统计发现，～30％的胰岛无淋巴细胞浸润(0级)，高剂量香菇多糖处理组只有胰岛周围有淋巴细胞浸润，经统计发现，～40％的胰岛无淋巴细胞浸润(0级)。以上各差别均有统计学意义(P**<0.01，P***<0.001)。

从以上实验结果可以看出，本发明所述香菇多糖能够明显提高NOD鼠血胰岛素水平、显著降低随机血糖水平、抑制小鼠胰岛炎的发生、明显延缓NOD鼠的发病并提高了其存活率，香菇多糖对于预防1型糖尿病的发生有很好的效果。

实施例2香菇多糖对NOD鼠血清中促炎和抑炎细胞因子水平的影响。

根据试剂盒说明书，运用ELISA方法检测实施例1小鼠血清中促炎和抑炎细胞因子的水平，比较PBS对照组和香菇多糖实验组之间的差异。具体步骤为：

1)分别将血清样本和不同浓度的标准品(100μl/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育90min(空白对照孔除外)；

2)甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μl，静置30s后甩尽液体，在吸水纸上拍干，该步骤重复4次；

3)加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育60min(空白对照孔除外)；

4)按照步骤2)洗板4次；

5)加入酶结合物工作液(100μl/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育30min(空白对照孔除外)；

6)按照步骤2)洗板4次；

7)加入显色剂100μl/孔，避光，37℃孵育10-20min；

8)加入终止液100μl/孔，混匀后即刻测量OD450值(5min内)。

结果见图6，发现同PBS对照组相比，香菇多糖处理组可显著降低NOD鼠血清中炎性细胞因子TNF-α、IL-12和IFN-γ的水平，且高剂量的香菇多糖下调TNF-α和IL-12水平的程度更加显著。而且，从图7可以发现，同PBS处理组相比，香菇多糖处理后，NOD鼠血清中抑炎细胞因子TGF-β1、IL-2和IL-10的水平明显增加，这些结果提示，香菇多糖可能通过调节机体免疫影响NOD鼠糖尿病的发生。

实施例3香菇多糖对NOD鼠脾脏及胰腺淋巴结CD25⁺Foxp3⁺Treg、CD3⁺CD8⁺CTL的影响。

运用流式检测的方法分析实施例1小鼠脾脏和胰腺淋巴结中CD25⁺Foxp3⁺Treg和CD3⁺CD8⁺CTL细胞的数量，比较PBS和香菇多糖实验组之间的差异。具体步骤如下：

1)将3组清洗干净的新鲜小鼠脾脏或胰腺淋巴结放在盛有RPMI-1640细胞培养液的平皿里，用玻璃匀浆器压磨脾脏或胰腺淋巴结，过滤后倒入刻度离心管中，加培养液至6ml；

2)室温下1500rpm/min，离心5min；

3)弃上清液，下层细胞加Tris-NH₄Cl(pH7.0)，振荡2min，使红细胞裂解破坏；

4)加含0.5％BSA的PBS(pH 7.0)至6ml，室温下1500rpm/min，离心5min；

5)弃上清液，再加RPMI-1640液洗涤，同上离心，共洗涤3次。

6)弃去洗涤液，台盼蓝检测细胞活力，调整细胞浓度至1×10⁶/mL。

7)向每管中加入不同荧光标记的抗小鼠CD3、CD4、CD25、Foxp3或CD8单抗0.25μg，室温避光孵育30min。

8)用含0.5％BSA的PBS(pH 7.0)重复洗涤2次，最后加入含0.5％BSA的PBS(pH 7.0)至0.3ml，制成单个核细胞悬液。取1×10⁶个细胞上流式细胞仪，进行淋巴细胞亚群计数。

结果如图8和10所示，同PBS对照组相比，高、低剂量的香菇多糖都可显著提高NOD鼠脾脏(图8)和胰腺淋巴结(图10)中CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞的数量；同样地，从图9和11发现，香菇多糖的处理降低了小鼠脾脏(图9)和胰腺淋巴结(图11)中CD3⁺CD8⁺CTL细胞的量。这些结果说明，香菇多糖可能通过提高小鼠外周淋巴器官脾脏及胰腺淋巴结中CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞的含量，从而抑制CD3⁺CD8⁺毒性T细胞对β细胞的杀伤作用。

实施例4体外检测香菇多糖对NOD鼠脾脏及胰腺淋巴结CD25⁺Foxp3⁺Treg、CD3⁺CD8⁺CTL细胞活力的影响。

为了进一步分析香菇多糖调节CD25⁺Foxp3⁺Treg、CD3⁺CD8⁺CTL细胞的作用，我们提取了正常NOD鼠脾脏和胰腺淋巴结中的淋巴细胞，运用香菇多糖体外刺激24h。具体步骤如下：

1)根据实施例3的步骤分离正常NOD鼠脾脏和胰腺淋巴结中的单个核细胞。

2)向单个核细胞悬液中加入适量抗小鼠CD3单抗，吹打混匀，4℃避光孵育30min。用含0.5％BSA的PBS(pH 7.0)洗涤1次，再加入体积为CD3抗体一半的免疫磁珠，4℃避光孵育60min。

3)用含0.5％BSA的PBS(pH 7.0)洗涤1次，随后将细胞悬液吸入位于磁极中的磁力柱内，静置5min，细胞悬液通过磁力柱，这时留在磁力柱上的细胞为CD3阳性的细胞群，经过柱子流下来的细胞悬液中的细胞为CD3阴性细胞群。

4)将磁力柱脱离磁极，用含0.5％BSA的PBS清洗磁力柱，获得的T淋巴细胞加入RPMI-1640细胞培养液，台盼蓝进行活细胞计数，调整细胞浓度至1×10⁶/mL。

5)将分选出的T淋巴细胞种板，向细胞培养液中加入不同浓度的香菇多糖，刺激24h后，孵育适量抗小鼠CD3、CD4、CD25、Foxp3或CD8的荧光单抗，流式细胞仪检测各类细胞的数量。

结果如图12和14所示，香菇多糖可浓度依赖性的增加脾脏(图12)和胰腺淋巴结(图14)中CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞的数量；从图13和15我们也发现，随着不同浓度香菇多糖的处理，脾脏(图13)和胰腺淋巴结(图15)中CD3⁺CD8⁺CTL细胞的数量呈现一个浓度依赖性的降低。这些结果进一步提示我们，香菇多糖可能通过提高NOD鼠脾脏和胰腺淋巴结中CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞量、抑制小鼠脾脏和胰腺淋巴结中CD3⁺CD8⁺毒性T细胞的数量，降低对β细胞的杀伤作用。

实施例5体外用不同浓度香菇多糖刺激正常NOD鼠脾脏T淋巴细胞，检测细胞培液中细胞因子的含量。

按照实施例2的步骤，根据试剂盒说明书运用ELISA方法检测实施例4细胞培养液中促炎和抑炎细胞因子的水平。结果如图16所示，香菇多糖可浓度依赖性的抑制脾脏T淋巴细胞培液中炎性细胞因子TNF-α的分泌，增加细胞培液中抑炎细胞因子TGF-β1的分泌。

Claims (4)

1.香菇多糖在制备预防1型糖尿病的药物中的应用。

2.香菇多糖在制备辅助治疗1型糖尿病的药物中的应用。

3.一种预防1型糖尿病的药物组合物，其特征在于含有香菇多糖作为有效成分，还含有药学上允许的辅料。

4.一种辅助治疗1型糖尿病的药物或保健品，其特征在于含有香菇多糖。