CN105829336A - α-螺旋细胞穿透肽多聚体、其产生方法及其用途 - Google Patents

α-螺旋细胞穿透肽多聚体、其产生方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及α?螺旋细胞穿透肽多聚体，其制备方法及其用途，且具体地，涉及包含多个两向肽的肽多聚体，用于制备所述肽多聚体的方法，包含所述肽多聚体作为有效成分的用于预防或治疗HIV的组合物和包含所述肽多聚体和生物活性物质的用于将所述活性物质递送入细胞的组合物。

Description

α-螺旋细胞穿透肽多聚体、其产生方法及其用途
技术领域
本发明涉及α-螺旋细胞穿透肽多聚体，其制备方法及其用途，且更具体地，涉及包含多个两性肽的肽多聚体，用于制备所述肽多聚体的方法、包含所述肽多聚体作为活性成分用于预防或治疗HIV的组合物和包含所述肽多聚体和生物活性物质用于细胞内递送所述生物活性物质的组合物。
背景技术
抗微生物肽(AMP)是从宿主的原发免疫反应产生以保护宿主免于外部入侵的病原体的天然肽。其主要损伤入侵病原体的细胞膜由此控制入侵的病原体。然而，一些证据最近表明此类抗微生物肽可通过抗微生物肽损伤细胞膜的机制之外的机制控制入侵的病原体。也就是说，这些抗微生物肽可通过结合于病原体中它们的靶标来控制细菌以阻断病原体的功能。一般地，抗微生物肽携带与DNA或DNA的负电荷结合的正电荷，表明病原体的DNA或RNA具有作为靶标的潜力。已显示其中抗微生物肽穿透线粒体(其为病原体中的细胞器)以诱导细胞死亡由此控制病原体的机制也是可能的。这是因为线粒体的表面带有负离子。
如上文表明，抗微生物肽不通过破坏病原体的膜杀伤病原体，而可通过与细胞中的其他靶标结合来杀伤病原体。这也可通过如下事实来证明：具有穿透细胞的能力的细胞穿透肽(CPP)区别于能够杀伤病原体的抗微生物肽。天然存在的细胞穿透肽主要在病毒中发现。由于其应使用宿主细胞的全部功能用于病毒生存，因此这些肽为具有细胞穿透能力而非细胞杀伤能力的肽。其典型的实例包括TAT肽、Rev肽等，其帮助病毒穿透细胞而不杀伤宿主。源自触角蛋白(Antennapedia protein)的穿透肽是包含16个氨基酸且具有优异的细胞穿透能力的典型细胞穿透肽(韩国专利No.1095841)。与抗微生物肽相似，所述穿透肽具有的特性为其富集带正电的精氨酸/赖氨酸(图1)。
细胞穿透肽氨基酸组成最独特的特性在于其富集了碱性氨基酸如精氨酸和赖氨酸。由于包含由酰胺键连接的7或9个连续精氨酸残基的肽也用作细胞穿透肽，这些正电荷对于带负电荷的细胞表面的识别是必需的。此外，出于尽管携带相同的正电荷，但精氨酸残基比赖氨酸残基更丰富的事实，可以看出胍基相比简单的氨基是更容易处理负电荷的官能团。
这样的细胞穿透肽应具有低于抗微生物肽的理论上可忽略的细胞毒性。由于这种细胞穿透肽的低细胞毒性，研究了可将多种物质(其需要细胞内递送)与细胞穿透肽连接以将这些物质引入细胞的方法。寡核苷酸如DNA或RNAi或能够导致生物改变或细胞毒性的化合物(抗癌药)或特异性蛋白也可用作与细胞穿透肽连接并导入细胞的负载(图2)。
细胞穿透肽穿透细胞的机制主要分为两种方法，其中之一是涉及需要热量的胞吞作用和直接穿透的方法。已知所述机制取决于每种细胞穿透肽的特征而变化或使用两种方法的组合使细胞穿透肽进入细胞。
可出现的是具有细胞穿透能力同时不具有细胞毒性的细胞穿透肽不能够获得，因为细胞穿透能力和无细胞毒性是矛盾的条件。由于此事实，多种细胞穿透肽还具有抗微生物肽的特征。尽管细胞穿透肽是具有最大化的进入细胞的能力而不损伤细胞的肽，但细胞膜可由于这些细胞穿透肽破裂，且带正电的细胞穿透肽可与带负电的细胞内物质如DNA或RNA相遇，由此引起细胞毒性。
细胞穿透肽的形态学特性与抗微生物肽的那些相似。为穿透细胞膜，细胞穿透肽应具有带正电荷的亲水性基团以识别带负电的细胞膜，且还应能够在膜条件中形成α-螺旋形状同时识别存在于细胞膜中的疏水性分子。由于这些原因，细胞穿透肽和抗微生物肽应具有两性(疏水性和亲水性)特征。因此，许多细胞穿透肽是α-螺旋肽，其典型实例为α-螺旋细胞穿透肽如穿膜肽(penetratin)和HIV Tat。然而，即使当这些肽在最低可能浓度(微摩尔级)使用时也可显示合意的细胞穿透效果，且因此需要开发即使以纳摩尔浓度使用时也显示合意的细胞穿透能力的肽。
在此背景下，本发明人已发现，当包含亲水性和疏水性氨基酸的两性肽在一个或多个特定的氨基酸位置含有接头时，肽的细胞穿透能力可显著增加，由此完成本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供可有效递送入细胞同时在细胞中显示减少的细胞毒性的包含α-螺旋细胞穿透两性肽的肽多聚体、其制备方法和其用于预防或治疗HIV及细胞内递送生物活性物质的用途。
技术方案
为实现上述目的，本发明提供包含多个同质或异质α-螺旋两性肽的肽多聚体。
本发明还提供用于制备肽多聚体的方法，其包括下列步骤：
构建包含亲水性和疏水性氨基酸的α-螺旋肽；
选择多种同质或异质的α-螺旋肽；和
在选自下组的一个或多个氨基酸位置连接多个所选的α-螺旋肽：i、i+3、i+4、i+7、i+8、i+10和i+11(其中i是整数)。
本发明还提供用于预防或治疗HIV的组合物，其包含上述α-螺旋肽多聚体作为活性成分。
本发明还提供用于细胞内递送生物活性物质的组合物，其包含权利要求1-18任一项的肽多聚体及所述生物活性物质。
附图简述
图1是包含多个精氨酸或赖氨酸残基的已知细胞穿透肽的列表。
图2是显示将细胞穿透肽递送入细胞的机制的示意图。
图3显示根据本发明实施方案的两性α-螺旋肽单体或二聚体。
图4显示根据本发明实施方案的肽的细胞穿透能力的分析结果。每个误差条代表标准偏差(n＝3)，且***和n.s.分别指示p<0.001和与对照无显著差异。
图4a显示与HeLa细胞温育12小时后LK-1(▲)、LK-2(■)、LK-3(●)、LK-4(◆)和R9(▼)在不同肽浓度的FACS结果。
图4b显示用FITC-标记的LK-3(10nM)处理的HeLa细胞的CLSM(共聚焦激光扫描显微术)图像，其中将核用Hoechst 33442(蓝色)染色；
图4c显示在10nM的胞吞作用抑制条件下根据本发明的肽的相对细胞穿透能力；
图4d显示在500nM的胞吞作用抑制条件下根据本发明的肽的相对细胞穿透能力-对照(白色)、渥曼青霉素(wortmannin)(灰色)、阿米洛利(amiloride)(深灰色)和4℃(黑色)；
图5显示使用根据本发明实施方案的肽测量递送入细胞的RNAi量的结果。
图6显示指示根据本发明实施方案的肽的细胞内递送机制的共聚焦显微术照片(图6中的Ac意为乙酰基)。
图6a显示500nM FITC(异硫氰酸荧光素)-标记的单体肽(37℃，24小时)(左侧)和用50μg/mL渥曼青霉素处理的500nM FITC-标记的单体肽(37℃，24小时)(右侧)；
图6b显示500nM Ac-FITC二聚体(37℃，24小时)(左侧)和使用50μg/mL渥曼青霉素处理的500nM Ao-FITC二聚体(37℃，24小时)(右侧)；
图6c显示用15μg/mL阿米洛利处理的500nM FITC-标记的单体肽(37℃，24小时)(左侧)和500nM FITC单体肽(4℃，2小时)(右侧)；
图6d显示用15μg/mL阿米洛利处理的500nM Ac-FITC二聚体肽(37℃，24小时)(左侧)和500nM Ac-FITC二聚体肽(4℃，2小时)(右侧)；
图6e显示500nM Ac-dimal-FITC二聚体肽(37℃,24小时)(左侧)和使用50μg/mL渥曼青霉素处理的500nM Ac-dimal-FITC二聚体肽(37℃,24小时)(右侧)；
图6f显示用15μg/mL阿米洛利处理的500nM Ac-dimal-FITC二聚体肽(37℃,24小时)(左侧)和500nM Ac-dimal-FITC二聚体肽(4℃,2小时)(右侧)。
图7显示根据本发明实施方案的肽的细胞毒性测试结果。
图8显示在HeLa细胞中以10nM和100nM肽浓度通过根据本发明的肽的Tat-介导的转录延伸的抑制-对照(白色)、10nM(灰色)和100nM(深灰色)：
a)TAR-luc/β-肌动蛋白的相对mRNA表达；
b)TAR-luc/18S rRNA的相对mRNA表达；
c)TAR-luc/TAR的相对mRNA表达。
每个误差条代表标准偏差(n＝3)，且(*)、(**)、(***)和n.s.分别为0.01≤p<0.1、0.001≤p<0.01、p<0.001和与对照无显著差异。
图9显示在HeLa细胞中通过根据本发明的肽的荧光素酶活性的抑制且图9中的每个误差条代表标准偏差(n＝3)：
a)通过LK-1抑制的荧光素酶活性；
b)通过LK-2抑制的荧光素酶活性；
c)通过LK-3抑制的荧光素酶活性；
d)通过LK-4抑制的荧光素酶活性。
图10显示在RAW 264.7细胞中测量LK肽IC50值的结果。
图11显示在T-类淋巴母细胞(T-lymphoblastoid cells)(MOLT-4/CCR5)中通过根据本发明的肽的HIV-1 p24抗原产生的抑制，且图11中的每个误差条代表标准偏差(n＝3)：
a)通过LK-3的HIV-1 p24抗原产生的抑制；
b)通过LK-4的HIV-1 p24抗原产生的抑制。
图12显示通过MTT测定法分析肽的细胞毒性的结果：
a)HeLa细胞；
b)RAW 264.7细胞。
图13显示实施LDH测定法以分析肽去稳定化细胞膜的程度的结果：
a)HeLa细胞；
b)RAW 264.7细胞。
图14显示根据pTat的表达水平检查LK肽抑制能力的减少的结果。
图15显示通过HPLC测量二聚体D肽和单体D肽的稳定性的结果：a)25％人血清/RPMI 1640中的20M二硫化物二聚体D；b)25％人血清/RPMI1640中20M的肽2。
图16显示通过HPLC测量LK-4肽的稳定性的结果：25％人血清/RPMI1640中20M的LK-4。
图17显示在0.5mM GSH存在下(其为体内还原条件)通过HPLC的肽二聚体D和扭结D的稳定性：a)0.5mM还原形式的谷胱甘肽/RPMI 1640中20M的二硫化物二聚体D。b)0.5mM还原形式的谷胱甘肽/RPMI 1640中20M的扭结肽。蓝色(1)，0小时；红色(2)，5小时；红色(2)，5小时；粉色(4)，15小时。
图18显示测量以平行或反向平行的方式连接的肽二聚体溶血活性的结果。
图19显示其中LK二聚体中一些Leu残基用Ala取代的结构的螺旋轮图。
图20显示图19中所示的二聚体的细胞穿透能力的结果。
图21是显示具有Lys至Glu取代(K2，K4→E2，E4)的肽结构的螺旋轮图。
图22显示测量图21的肽对于HeLa细胞的细胞穿透能力的结果。
图23显示测量通常包含SEQ ID NO:1的肽对于HeLa细胞的细胞穿透能力的结果。
图24显示具有不同长度的肽对于HeLa细胞的细胞穿透能力的结果。
用于实施本发明的最佳方式
一方面，本发明涉及包含多种同质性或异质性α-螺旋两性肽的肽多聚体。
本发明的肽可为新型细胞穿透肽，其形状在细胞内递送之前和之后变化，且因此可具有优异的细胞穿透能力同时在细胞中展示减少的细胞毒性。为此，使用了能够最大地扩增细胞穿透肽中存在的α-螺旋形状的方法和使用特殊细胞质环境使得此α-螺旋可在细胞质中容易消失的方法。
通过本发明，开发了其中合成具有人工增加的α-螺旋含量的肽的方法。当用合成的肽处理细胞时，肽的细胞内穿透能力将由于高α-螺旋含量而增加，且α-螺旋将在细胞中去除以最小化肽的毒性。
常规的细胞穿透肽在这方面存在问题，由于它们具有与抗微生物肽相似的结构特性，当它们穿透细胞时，它们与其细胞内靶标结合以引起细胞毒性。这是由于在通过细胞膜前细胞穿透肽的形状与它们穿透入细胞后的形状相似。因此，本发明人提供了在穿透入细胞之前和之后形状可极大改变的肽。
甚至在大多数的情况中α-螺旋肽在100％水溶液中维持低α-螺旋含量，且大多数肽在水性细胞质中具有50％或更少的低α-螺旋含量。根据本发明的两性肽或包含所述肽的二聚体在细胞外环境中维持高α-螺旋含量，但所述肽结构可在细胞外和细胞内环境中在其中高α-螺旋含量在细胞质中被破坏的条件下变化。也就是说，可生成打开-关闭开关，其中α-螺旋开关在细胞外环境或细胞膜中关闭并在细胞质中打开。在这种情况中，可归因于肽的α-螺旋的多种细胞毒性可在细胞质中最小化。如果肽具有高α-螺旋含量，则其将不会由多种肽酶降解，但将生成随机的形状同时以α-螺旋形状平衡，且具有随机形状的肽将容易地由多种肽酶的作用降解，且因此其细胞毒性可被最小化。因此，当α-螺旋含量在细胞外环境中最大化以最大化细胞穿透能力且在细胞质中去除时，归因于α-螺旋的细胞毒性可被最小化。满足这些条件的肽作为细胞穿透肽是最适合的。
作为用于增加细胞穿透能力的方法，可增加两性肽的α-螺旋含量。可使用如下方法，其中α-螺旋含量通过共价键合α-螺旋的上部和下部分支而急剧增加，且通过该方法，还可增加肽的细胞穿透能力。考虑到这一点，为增加α-螺旋含量，多种两性肽可具有位于选自下组的一个或多个氨基酸位置的接头：例如i、i+3、i+4、i+7、i+8、i+10和i+11(其中i是整数)。该接头可优选位于选自下组的两个或多个氨基酸位置：i、i+3、i+4、i+7、i+8、i+10和i+11(其中i是整数)。此处，多个两性肽可彼此平行连接同时维持N-末端至C-末端方向。可替换地，多个肽的一部分可以N-末端至C-末端方向连接，且其他部分可以反向平行方式以C-末端至N-末端方向连接。显示通过平行或反向平行方式连接肽获得的肽多聚体显示相同的活性(图18)。通过包含此接头的肽多聚体，可维持α-螺旋含量。
与此相关的是，韩国专利公开(Laid-Open Publication)No.2013-0057012和美国国专利公开No.2010-0292164公开了使用二硫键以在两个肽之间连接。然而，没有如本发明所述的实例，其中α-螺旋含量通过将接头定位于两个或多个氨基酸位置以制备多聚体。根据本发明的肽多聚体中肽的α-螺旋含量在细胞穿透前(例如在其中三氟乙醇和缓冲剂以1:1比率混合的细胞膜条件中)可为80％，优选至少85％，更优选多至100％。
在一个实施方案中，肽的氨基酸并无具体限制，只要其能够维持α-螺旋结构同时显示两性特征。例如，亲水性氨基酸可以是选自下组的一个或多个：精氨酸、赖氨酸和组氨酸，且疏水性氨基酸可以是选自下组的一个或多个：亮氨酸、缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和异亮氨酸。
所述肽可包含例如5-50个氨基酸，优选10-60个氨基酸，更优选7-23个氨基酸，其可形成作为稳定的二级结构的α-螺旋结构。可见，根据本发明的肽依赖于其长度显示细胞穿透能力。例如，可见包含少于7个氨基酸的肽显示显著增加的穿透能力，甚至在纳摩尔浓度，且具体地，包含16-23个氨基酸的肽在10nM或更低的浓度都显示细胞穿透能力(图24)。
为将亲水性氨基酸的氨基收集至α-螺旋的一侧，可将1-3个亲水性氨基酸交替排列，且其余序列可包含1-3个交替排列的疏水性氨基酸。例如，1-3个亲水性氨基酸可与1-3个疏水性氨基酸交替排列，且因此所述两性肽可包含7氨基酸序列，其中两性肽的i+3和i+4位置的至少一个具有与i位置的氨基酸有相同极性的氨基酸。优选地，所述两性肽可包含一个或多个7氨基酸序列，其中一个或两个亲水性氨基酸与一个或两个疏水性氨基酸交替排列。此处，如果i是亲水性氨基酸，则i+3和i+4位置的至少一个应为亲水性氨基酸，且如果i是亲水性氨基酸，则i+3和i+4位置的至少一个应为疏水性氨基酸。
上述具有7氨基酸的序列可包含例如由下式所示的一个或多个氨基酸序列：
其中X是亲水性氨基酸且Y是疏水性氨基酸。
本文中，两性肽可以25％或更多的量包含能够展示最高疏水性的疏水性氨基酸，例如选自下组的一个或多个残基：亮氨酸、色氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和异亮氨酸，且所述肽可通过由这些疏水性氨基酸形成的疏水性穿透细胞。本发明人使用丙氨酸(A)取代疏水性氨基酸亮氨酸(L)，且作为结果发现如果疏水性氨基酸不以25％或更多的疏水性氨基酸定位，则所述肽不显示合意的细胞穿透效果(图19和20)。
此外，两性肽可以33％或更多的量包含选自下组的一个或多个带正电的亲水性氨基酸残基：精氨酸、赖氨酸和组氨酸。如果所述两性肽以33％或更多的量包含带正电的亲水性氨基酸，则其可通常确保合意的细胞穿透能力。以少于33％的量(亲水性氨基酸的约1/3)包含带正电的亲水性氨基酸的肽(其中带正电的氨基酸用至少两个带负电的氨基酸取代)甚至在1μM的高浓度很难穿透细胞，因为其不确保净电荷对于细胞穿透是足够的。本发明人发现，当带正电的赖氨酸(K)残基中的赖氨酸(K)残基1和3用谷氨酸(E)取代时，以33％或更少的量包含带正电的亲水性氨基酸的肽不显示合意的细胞穿透效果，甚至在100nM的浓度，但当将肽制备为二聚体时，细胞穿透能力可增加约100倍(图21和22)。
在一个实施方案中，两性肽可包含由下列SEQ ID NO:11所示的序列：
KLLKLLK(SEQ ID NO:11)。
本文中，(LK)n的氨基酸可额外地结合于SEQ ID NO:11的序列的右端，且(LK)m的氨基酸可额外地结合SEQ ID NO:11的序列的左端，其中n和m可各自独立地为0-2的整数。具体地，两性肽可以是由SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列LKKLLKLLKKLLKL或由SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列KLLKLLKKLLKLLK。
接头可包含在肽之间连接的任何键从而显示根据本发明的合意的特性。例如，接头可包含共价键。共价键无具体限制，只要其为可增加α-螺旋含量而不抑制肽的功能的共价键。例如，所述共价键可为选自下组的一个或多个：半胱氨酸之间的二硫键/二硫骨、马来酰亚胺键、酯键、硫醚键和由点击反应(click reaction)形成的键。
为保持肽的稳定的α-螺旋，尝试了使用共价键将肽的i位置与i+3、i+4、i+7、i+8、i+10或i+11位置键合，且多种类型的接头化合物可用于键合。然而，尽管可使用这些接头化合物增加α-螺旋含量，所述接头化合物和肽由于它们形成更稳定的键而具有它们在正常细胞质条件中不容易降解的缺点。如果α-螺旋不破坏，则肽可显示强的细胞毒性。由于此原因，应排除无目标地增加α-螺旋含量的技术。
考虑到这一点，本发明人发现通过由两个或多个二硫键连接两性α-螺旋肽获得的肽多聚体可以纳摩尔或更少与shRNA形成强键合同时具有接近100％的α-螺旋含量。此α-螺旋含量与单体肽的低α-螺旋含量(水中约10％)进行比较，且其结合亲和力也为单体肽的约100-1000倍。通过此高α-螺旋含量，所述肽的细胞穿透能力可增加，且所述肽可与发夹形状的RNAi或shRNA强结合，并因此可为用于将RNAi递送入细胞的划时代的(epoch-making)结构。
在现有技术中，使用了采用人工合成的接头化合物增加肽的α-螺旋含量的方法，但在本发明中，可从半胱氨酸获得的二硫键可用于增加肽的α-螺旋含量并还可最小化肽的细胞毒性。
本发明人发现，通过在肽的i位置和i+7位置用半胱氨酸取代疏水性氨基酸并通过二硫键连接肽获得的多聚体显示高α-螺旋含量且还显示强亲和力，其对于发夹形状的RNA靶标对应于与纳摩尔相应的kd值。
如果两性肽通过二硫键彼此连接，则可在两性肽的氨基酸之间并入半胱氨酸，从而肽可通过半胱氨酸之间的二硫键连接。
本文中，肽可包含由下式所示的一个或多个氨基酸序列：
CYYXXYXCYYXXYXZW(1)
XYYCXYXXYYCXYXZW(2)
XYYXCYXXYYXCYXZW(3)
XYYXXYCXYYXXYCZW(4)；和
XYYXXYXCYYXXYXCW(5)
其中X、Z和W为疏水性氨基酸，Y是亲水性氨基酸且C是半胱氨酸。
具体地，所述肽可具有选自下组的至少一个序列：下表1中所示的SEQ IDNO:1-10。
表1
SEQ ID NO. 序列
SEQ ID NO:1 CKKLLKLCKKLLKLAG
SEQ ID NO:2 LKKCLKLLKKCLKLAG
SEQ ID NO:3 LKKLCKLLKKLCKLAG
SEQ ID NO:4 LKKLLKCLKKLLKCAG
SEQ ID NO:5 LKKLLKLCKKLLKLCG
SEQ ID NO:6 CRRLLRLCRRLLRLAG
SEQ ID NO:7 LRRCLRLLRRCLRLAG
SEQ ID NO:8 LRRLCRLLRRLCRLAG
SEQ ID NO:9 LRRLLRCLRRLLRCAG
SEQ ID NO:10 LRRLLRLCRRLLRLCG
在满足上表1中所示的氨基酸序列的肽中，根据本发明的肽可具有由SEQ ID NO:3或8所示的氨基酸序列。
具有由SEQ ID NO:3或8所示的氨基酸序列的肽包含疏水性氨基酸亮氨酸和亲水性氨基酸赖氨酸或精氨酸。所述肽通过这些亲水性和疏水性氨基酸展示两性特征并通过α-螺旋结构具有细胞穿透能力。
根据本发明的肽多聚体包含同质性或异质性α-螺旋肽。其可为通过连接多个同质性肽获得的同质性肽多聚体，或可为异质性肽多聚体，其包含具有优异的细胞内递送能力的递送肽和能够充当细胞内靶标的配体的异质性肽。
多聚体可为其中具有多种功能的肽彼此连接同时保持肽的合意的功能的形式。例如，多聚体可为二聚体、三聚体、四聚体或五聚体。优选地，其可为二聚体。
在另一方面，本发明涉及用于制备肽多聚体的方法，其包括下列步骤：构建包含亲水性和疏水性氨基酸的α-螺旋肽；选择多个同质或异质的α-螺旋肽；并在选自下组的一个或多个氨基酸位置连接多个所选的α-螺旋肽：i、i+3、i+4、i+7、i+8、i+10和i+11(其中i是整数)。如上文所述的根据本发明的每种元素可同样应用于制备肽多聚体的方法。
在另一方面，本发明涉及用于预防或治疗HIV的组合物，其包含α-螺旋肽多聚体作为活性成分。本发明人已发现，根据本发明的肽多聚体显示对于shRNA(短发夹RNA)的强结合亲和力，所述shRNA称为TAR(转录活化区)，其位于LTR(长末端重复)，参与导入HIV-1(人免疫缺陷病毒-1)的宿主的基因组的有效转录)。此外，本发明人已发现，通过由其中含有的半胱氨酸-半胱氨酸共价键连接具有SEQ ID NO:3的序列的肽形成的二聚体也显示对于称为TAR的shRNA的非常强的结合亲和力。
进一步研究了此关联性，且作为结果，发现了根据本发明的肽多聚体可特别地充当Tat-TAR相互作用的抑制剂以抑制HIV-1复制。此外，根据本发明的肽多聚体具有优异的细胞穿透能力，且因此可充当针对HIV转录的细胞内抑制剂。
基于此事实，在另一方面，本发明涉及用于预防或治疗HIV的组合物，其包含α-螺旋细胞穿透肽多聚体作为活性成分。
TAR RNA和病毒Tat蛋白之间的上述相互作用活化病毒基因的转录。作为结果，此相互作用可成为用于开发用于治疗由HIV-1引起的疾病的物质的靶标。即使此可能性是已知的，用于抑制Tat与TAR RNA的结合的药剂并不存在。这是由于甚至能够穿透细胞的低分子化合物不能有效与TAR RNA结合，且大分子很难穿透细胞，即使它们可抑制Tat与TAR RNA的结合。
考虑到这一点，本发明人已发现，α-螺旋细胞穿透肽多聚体可穿透细胞以与TAR RNA结合，由此直接抑制TAR RNA与Tat之间的结合以由此抑制HIV-1基因的转录。
根据本发明的组合物可用于治疗HIV感染的患者或实际上或潜在地暴露于HIV的患者，但不限于此。例如，在确定患者用HIV注射后，即患者的血液在输血、器官移植、体液交换、意外的针刺或手术过程中暴露于HIV后，根据本发明的组合物可有效用于治疗HIV感染。
此外，根据本发明的α-螺旋细胞穿透肽多聚体还可用作在线粒体的表面上识别Bcl2/Bax蛋白以诱导癌细胞的细胞凋亡的肽。
本发明的组合物可进一步包含一个或多个药物上可接受的载剂。药物上可接受的载剂应与活性成分兼容，且可为选自如下的一者:生理盐水、无菌水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、缓冲盐水、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇和其两种或多种的混合物。如果需要，所述组合物可包含其他常规的添加剂如抗氧化剂、缓冲剂或抑菌剂。此外，稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂可额外地添加至组合物以制备可注射制剂如水溶液、悬液和乳液。具体地，所述组合物优选作为冻干制剂提供。为制备冻干制剂，可使用本发明所属技术领域中已知的常规方法，且还可添加用于冻干的稳定剂。此外，组合物可优选通过本领域已知的合适方法或通过Remington'sPharmaceutical Science,Mack Publishing Company,Easton PA中公开的方法根据疾病或组分配制。
本发明组合物中的活性成分的量和用于施用组合物的方法可一般地基于患者的病况和疾病的严重性由本领域的技术人员确定。此外，组合物可以多种形式配制，包括粉末、片剂、胶囊、液体、可注射溶液、软膏和糖浆制剂，且可通过使用单位剂型或多剂量容器例如密封的安瓿或小瓶提供。
本发明的组合物可口服或肠胃外施用。根据本发明的组合物可例如口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、硬膜内、心内、经皮、皮下、腹膜内、直肠内、舌下或局部施用，但不限于此。根据本发明组合物的剂量可取决于患者的体重、年龄、性别、健康状况和饮食、施用时间、施用模式、排泄率和疾病的严重性等变化，且可由本领域的技术人员容易确定。此外，对于临床施用，本发明的组合物可使用已知的技术制备为合适的制剂。
此外，本发明涉及用于生物活性成分的细胞内递送的组合物，其包含α-螺旋细胞穿透肽多聚体和与所述肽多聚体结合的生物活性物质。
根据本发明的肽多聚体的细胞穿透能力可比常规的细胞穿透肽的至少10倍高。具体地，常规的细胞穿透肽以至少微摩尔浓度使用以将负载递送入细胞，而根据本发明的细胞穿透肽多聚体甚至当以等于所使用的常规细胞穿透肽最小浓度的约1/10的浓度使用时，可确保合意的细胞穿透能力。而且，发现如果将生物活性物质例如RNAi寡核苷酸分子递送入细胞，本发明的肽多聚体显示合意的细胞穿透能力，甚至当其以纳摩尔范围的浓度使用时。
如上文所述，根据本发明，以非常低的浓度(具体地，几十纳摩尔或更低的浓度)使用细胞穿透肽多聚体。因此，甚至当生物活性物质例如RNAi寡核苷酸分子以与现有技术中所使用的相比非常低的浓度使用时，其可呈现合意的效果。细胞穿透肽的低浓度和生物活性物质的低浓度可为可最小化细胞毒性的足够的条件。
当根据本发明的细胞穿透肽多聚体穿透其为还原环境的细胞质时，多聚体中的共价键可破裂以形成单体肽。如果肽多聚体中的共价键在细胞中持续保持，所述肽多聚体可呈现高细胞毒性，因为其一般具有优异的与DNA或RNA结合的能力。然而，共价键在细胞质中破裂的肽多聚体可容易由细胞中的多种蛋白酶水解，因为其化学稳定性显著减少同时其α-螺旋含量也迅速减少。
因此，根据本发明的细胞穿透肽多聚体呈现优异的递送入细胞的能力，且可实现理想的效果，甚至当生物活性物质以低浓度使用时。此外，其可在细胞中降解从而其细胞毒性可最小化。
生物活性物质，一种负载，可为与细胞跨膜域结合从而递送入细胞以由此调节体内任何生理现象的物质。例如，生物活性物质可为DNA、RNA、siRNA、适体、蛋白、抗体或细胞毒性化合物，但不限于此。
此外，用于调节生物活性或功能或其他递送载剂的物质可额外地与根据本发明的肽多聚体结合。在这种情况中，肽多聚体和用于调节生物活性或功能的物质或其他递送载剂可形成复合结构。所述物质或递送载剂可通过例如非共价键或共价键与多聚体连接。非共价键可为选自下组的一个或多个：例如氢键、静电相互作用、疏水性相互作用、范德华相互作用、π-π相互作用和阳离子-π相互作用。共价键可为可降解键或不可降解键。可降解键可为二硫键、酸可降解键、酯键、酐键，生物可降解键或酶可降解键，但不限于此。不可降解键可为酰胺键或磷酸键，但不限于此。
细胞毒性化合物可通过非共价键如静电键或主客体键(host-guest bond)与肽多聚体连接。例如，细胞毒性化合物可为阿霉素/多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、紫杉醇(paclitaxel)、顺铂、博来霉素、泰素(taxol)、小檗碱(berberine)或姜黄(curcumin)，但不限于此。如果生物活性物质是蛋白或抗体，其可包括与在细胞中某种靶标结合的任何药物，且多聚体可通过与蛋白或抗体的N-末端或C-末端融合而导入。
在一些情况中，针对癌细胞(MCF7)具有药物抗性的甲氨蝶呤可与肽多聚体连接从而其可用作摧毁癌细胞的新型物质。此外，天然为疏水性的生理活性小分子(泰素、小檗碱、姜黄等)可与肽多聚体连接以增加在其所递送的细胞中的浓度。此外，抗体、作为抗体片段的蛋白或蛋白药物可与本发明的二聚体肽连接并递送入细胞，且寡核苷酸药物(siRNA、asDNA、DNA或适体)也可与二聚体肽连接并递送入细胞。
实施例
下文中，将参照实施例更详细地描述本发明。对本领域中的普通技术人员显而易见的是，这些实施例仅为说明目的而不应理解为限制本发明的范围。因此，本发明实际范围会通过所附的权利要求及其等同物限定。
实施例1：肽单体和二聚体的合成
使用固相合成方法和Fmoc化学合成单体LK(LKKLLKLLKKLLKLAG)，单体A(CKKLLKLCKKLLKLAG)、B(LKKCLKLLKKCLKLAG)、C(LKKLCKLLKKLCKLAG)、D(LKKLLKCLKKLLKCAG)和E(LKKLLKLCKKLLKLCG)，其各具有两个半胱氨酸残基，单体AR(LRRLLRLLRRLLRLAG)，其中LK的氨基酸序列中的全部K残基都用R取代，单体RA(CRRLLRLCRRLLRLAG)、RB(LRRCLRLLRRCLRLAG)、RC(LRRLCRLLRRLCRLAG)、RD(LRRLLRCLRRLLRCAG)和RE(LRRLLRLCRRLLRLCG)，其各具有两个半胱氨酸残基，等。具有附接于其的二硫化物的二聚体肽通过在空气氧化条件下氧化纯化的单体肽获得(二聚体A、B、C、D、E、RA、RB、RC、RD和RE)。如图3所示，Dimal肽根据米氏反应(Michael reaction)使用间隔物(spacer)合成。
为观察穿透细胞的特征，还制备了在其N-末端具有FITC标记的肽。合成的肽的分子量通过MALDI-TOF质谱仪如下所述分析。
LK-MS[M+H]+:1861.3(计算的(calcd.)),1862.3(发现的(found)),FITC-标记的LK-MS[M+H]+:2208.4(计算的),2208.0(发现的),C-MS[M+H]+:1841.2(计算的),1840.8(发现的),FITC-标记的C-MS[M+H]+:2188.2(计算的),2188.5(发现的)),二聚体C-MS[M+H]+:3677.4(计算的),3677.9(发现的),FITC-标记的二聚体C-MS(M+H+):4024.4(计算的),4024.1(发现的)),二聚体MS[M+H]+:2381.3(计算的),2381.7(发现的)),FITC-标记的二聚体-MS[M+H]+:4519.5(计算的),4520.1(发现的))。
实施例2：合成的肽的CD(圆二色谱)分析
使用CD(圆二色谱)观察合成的单体、二聚体和Dimal肽的二级结构。具体地，二聚体甚至在水溶液环境中显示接近100％的α-螺旋含量。此α-螺旋含量与单体(在水溶液中30％)非常不同。
认为当二硫键以α-螺旋的一个方向存在于i和i+7位置时，两个共价键可通过结合α-螺旋形状保持高α-螺旋含量。像二聚体肽，Dimal肽也具有高α-含量，因为其使用两个共价键合成。然而，Dimal肽由于分子的柔软度具有低于二聚体肽的α-螺旋含量。
用其为还原环境的DTT(与细胞质环境相似)处理二聚体/Dimal肽。通过此处理，可能的是观察二聚体/Dimal肽在其为还原环境的细胞质中如何变化。观察到二聚体降解为单体，且所述单体具有明显低的α-螺旋含量。然而，Dimal肽甚至当其用DTT处理时保持α-螺旋结构。
实施例3：肽的细胞穿透测试
通过FACS实验在FITC-标记的肽的不同浓度将三种不同的肽的细胞内摄取彼此比较(图4)。在高肽浓度(500nM)，二聚体(LK-3)和单体(LK-1或LK-2)显示了高摄取效率(90％或更多)，其具有极少区别或无区别。然而，在低浓度(10nM)，观察到二聚体(LK-3)显示了高摄取效率，而单体的摄取效率大大减少至少于10％。
具体地，观察到Dimal肽(LK-4)甚至在低浓度被摄取，但其摄取效率比二聚体的(90％或更多)低约10-15％。显示在低浓度和高浓度细胞穿透能力高低顺序为：二聚体>Dimal>单体。
实施例4:使用二聚体的siRNA递送
使用10种二聚体肽(二聚体A、B、C、D、E、RA、RB、RC、RD和RE)和对照肽，实施了实验以检查RNAi(Dy547-标记的)是否容易穿透细胞。作为对照肽，使用了LK、Rev、单体C、扭结C和扭结D。使用了包含0.8μLDharmaFECT的阳性对照。以100nM的浓度使用二聚体肽，并以200nM的浓度使用单体肽，并以50nM的浓度使用RNAi。将每种肽与RNAi混合以制备混合物溶液。将每种混合物溶液添加至HeLa细胞(2.0x103细胞/孔)并温育24小时。接着，用PBS洗涤细胞一次，然后用荧光共聚焦显微镜观察穿透细胞的RNAi的量。
如在图5中可见，递送入细胞的RNAi的量大小顺序为：二聚体RE>二聚体C>二聚体D，但当使用单体肽时，RNAi基本不递送。
实施例5：肽的细胞内穿透机制的分析
使用FITC-标记的肽和共聚焦显微术比较肽的摄取机制(图6)。
单体在低温(ATP-非依赖摄取)或在巨胞饮(macropinocytosis)抑制条件略微递送，这表明单体可通过能量非依赖机制和能量依赖机制两者穿透细胞。明显可见的是，二聚体通过所述两机制也显示优异的细胞穿透能力且具有比单体优异得多的细胞穿透能力。然而，Dimal肽在低温时不具有细胞穿透能力且甚至在巨胞饮抑制条件中基本上不进入细胞，这表明Dimal肽仅进入能量依赖途径。可见单体和二聚体通过其为能量非依赖途径的直接方法进入细胞，且二聚体的二硫键的切割在能量非依赖途径中起重要的作用。
实施例6：肽的细胞毒性测试
通过用肽处理癌细胞并通过MTT测定法分析细胞的活性来检查肽的细胞毒性。作为结果，全部三种肽(单体、二聚体和Dimal)在多至5μM的浓度都未显示细胞毒性。
本发明公开了用于最大化具有细胞穿透能力的α-螺旋肽的α-螺旋含量的方法和通过该方法合成的具有增加的递送或穿透能力的肽。为最大化α-螺旋含量，将两个巯基附接于单体肽，且包含两个二硫键的二聚体肽从单体肽使用空气氧化条件制备。
实施例7：对TAR RNA的结合亲和力和α-螺旋含量的测量
使用具有SEQ ID NO:3的序列的肽，制备了下表2中所示的LK肽。
表2
两性肽二聚体LK-3在每条链中包含两个二硫键且对于TAR RNA具有纳摩尔或更少的亲和力。由于LK-3中的二硫键可在细胞质环境中降解，将可还原单体肽LK-2用作对照。不可还原二聚体LK-4由通过两个N,N'-(1,4-亚苯基)二马来酰亚胺接头连接的肽链组成。在上表2中，LK-3中的二硫键由虚线指示，且LK-4中的N,N'-(1,4-亚苯基)二马来酰亚胺接头由实线指示。
(1)结合亲和力
肽与TAR RNA结合的Kd值(解离常数)通过荧光异向性使用罗丹明-Rev肽作为探针在20℃测量。测量结果指示LK-3和LK-4的亲和力是单体肽(LK-1和LK-2)的100-1000倍。
(2)α-螺旋含量(α-螺旋度)
使用CD(圆二色谱)，第一α-螺旋度值在PBS(pH 7.4)的模拟膜条件中测量，且第二值在相同缓冲剂中于50％TFE中测量。测量结果指示二聚体肽的α-螺旋度比单体肽的高。事实上，显示LK-3和LK-4显示约90％的α-螺旋度。
(3)细胞穿透能力
使用由9个精氨酸残基组成的已知的细胞穿透肽R9将用FITC(异硫氰酸荧光素)标记的LK肽与HeLa细胞(人类宫颈癌细胞系)温育。FACS(荧光激活细胞分选)分析的结果(图4)指示，在分析中使用的全部浓度，FITC阳性细胞的百分比(细胞穿透能力)高低顺序为：R9<LK-1和LK-2<LK-4<LK-3(图4a)。
在高浓度(>500nM)，单体和二聚体肽显示接近100％的细胞穿透率。然而，单体肽在非常低的浓度(10nM)显示仅40％的穿透效率且在100nM仅70％的穿透效率，而二聚体肽具有70-90％的细胞穿透率。对照R9在10nM显示非常低的细胞穿透率。作为结果，可见LK肽的细胞穿透能力通过二聚体的形成大大增加。此外，显示肽二聚体的相当一部分被递送入细胞核(图4b)。
(4)细胞内穿透机制的检查
为了检查在细胞内穿透中使用的机制，在多种胞吞抑制条件下测试LK肽。LK肽在低浓度(10nM)的细胞内穿透通过降低温度至约4℃或通过用胞吞抑制剂(渥曼青霉素或阿米洛利)处理几乎完全抑制。因此，可见LK肽的低浓度由能量依赖的胞吞途径内化并通过巨胞饮或网格蛋白(clathrin)介导的胞吞作用穿透，即使LK肽的活性与这些浓度显著不同(图4c)。在高浓度(500nM)，全部LK肽显示>80％的细胞摄取，且根据不同的机制穿透细胞。可见LK-4(不可还原二聚体)根据与在低浓度时相似的机制进入细胞(图4d)。例如，渥曼青霉素或阿米洛利的细胞内穿透基本上由单体LK-2和二聚体LK-3抑制，且这些肽的内化效率甚至在4℃未变化。因此，可见LK-2和LK-3在高浓度通过其他类型的能量依赖途径(其既非受体介导的胞吞也非巨胞饮)穿透细胞。
500nM的包含马来酰亚胺接头的不可还原LK-4二聚体的细胞内穿透通过降低温度或通过用胞吞抑制剂处理完全抑制。从上述结果，可见肽二聚体在低浓度的能量依赖的细胞内穿透随α-螺旋含量减少而更加促进，而单体肽以能量非依赖的方式(例如，孔洞或毪状物(carpet)形成)穿透细胞。
(5)对Tat-TAR相互作用抑制效果的检查
由于LK二聚体肽可以纳摩尔浓度递送入细胞，检查了LK二聚体肽是否可抑制宿主细胞中的病毒靶标。用包含pLTR-luc、HIV-1 LTR启动子和萤火虫荧光素酶基因的质粒连同包含pTat和HIV-1 Tat基因的质粒转染HeLa细胞，由此在HeLa细胞中构建荧光素酶报告蛋白系统。在此系统中，表达的作为反终止子(anti-terminator)的Tat蛋白与在LTR启动子下的TAR RNA相互作用以增加荧光素酶基因的转录。将LK肽和报告细胞温育12小时，然后通过RT-PCR确定mRNA的相对量(图8)。作为结果，与两看家基因(β-肌动蛋白和18S rRNA)相比，荧光素酶基因的mRNA水平以依赖于肽的量的方式减少(图8a和8b)。此外，为证明LK肽不干扰与转染的质粒DNA的结合和转录，测量了包含转录的全TAR RNA的长荧光素酶基因的转录。显示TAR-luc(长转录物)与TAR(全转录物)的比率和TAR-luc的mRNA与看家基因的mRNA的比率相似。这表明Tat-TAR相互作用在转录水平由LK肽抑制(图8c)。
关于Tat-介导的转录的抑制，单体(LK-1和LK-2)甚至在100nM显示少于50％的抑制性效果，而肽二聚体(LK-3和LK-4)具有较高的细胞穿透能力同时其在10nM显示约50％的抑制性活性且在100nM显示80％的抑制性活性。由于LK-1和LK-2穿透HeLa细胞的能力相似(图4a)，看起来LK-2的较强抑制性效果由对TAR RNA较强的亲和力引起。由于二硫键在还原的细胞质环境中容易降解，内化后LK-3在细胞质中减少以形成仍以纳摩尔亲和力与TARRNA结合的单体LK-2。因此，LK-3的增加的细胞穿透能力是在转录水平能够抑制Tat-TAR相互作用的主要原因。
(6)IC 50 的测量
LK肽的IC50值通过荧光素酶测定法测量，且由高到低顺序为：LK-1(107nM)>LK-2(49.6nM)>LK-4(34.7nM)>LK-3(10.3nM)(图10)。二聚体LK-3的IC50值为单体LK-1的至多1/10(at least 10 times lower than)，且认为这是由于增加的细胞穿透能力且由于当LK-3在细胞质中降解时单体肽的浓度增加两倍或更多所致。LK-3的IC50值与LK-2的解离常数(Kd＝9.6nM)基本相同，表明穿透入细胞膜不再充当针对细胞活性的屏障。由于在其他肽药物中不存在特定的构建，出现Kd和IC50值之间的极大差异。
图10显示在与作为相似的基于细胞的测量系统的RAW 264.7细胞(小鼠单核细胞/巨噬细胞系)中测量LK肽的IC50值的结果。如在图10中可见，LK肽的IC50值为15-150nM。
(7)HIV-1复制的抑制和细胞毒性分析
分析了急性感染的T-类淋巴母细胞(MOLT-4/CCR5)中HIV-1复制的抑制(图11)。HIV-1复制中LK-3和LK-4的IC50值分别为590.1nM和278.5nM，而LK-1的IC50值为>2μM。比HeLa或RAW 264.7细胞中更高的IC50值可部分贡献于减少肽穿透T-类淋巴母细胞的能力。然而，LK-3在比用于HIV-1复制的IC50值高得多的2.56μM或更少的浓度未显示对于宿主细胞显著的细胞毒性。显示LK-4具有略高于LK-3的活性，但对于宿主细胞是细胞毒性的。这指示LK二聚体(特别是LK-3)可用于HIV-1的治疗。
肽的细胞毒性通过MTT测定法分析。分析结果示于图12中。当MTT测定法在用肽处理后24小时实施时，显示肽对于Hela细胞和RAW 264.7细胞两者都不是细胞毒性的，直至其达到约10μM。
(8)细胞膜的去稳定
通过LDH测定法分析了肽去稳定化细胞膜的程度。分析结果示于图13中。参考图13，当在用肽处理后12小时实施LDH测定法时，可见肽对于Hela细胞和RAW 264.7两者基本上都不去稳定化细胞膜，直到其达到约2μM。
由于肽穿透入细胞膜在约10nM的浓度发生，可见肽的细胞内穿透与细胞膜的去稳定化没有直接关联。
显示LK-3(可还原二聚体)和单体在8μM显示轻微的去稳定化，而LK-4(不可还原二聚体)甚至在8μM显示极少或不显示去稳定化。
(9)Tat-TAR相互作用的抑制类型的检查
根据pTat的表达水平分析了LK肽抑制性能力的减少。基于Hela细胞的系统用不同量的pTat质粒转染，通过荧光素酶测量了LK肽的抑制能力。测量的结果示于图14中。图14中每组的细节示于下表3中。
表3
*二聚体：LK-3，单体：LK-2
参考图14，可见LK肽的抑制能力根据pTat的表达水平缓慢减少(92.9％>92.3％>72.3％(在100nM LK-3的情况中)。这间接表明Tat和LK肽的竞争性结合与TAR-荧光素酶的表达具有深度关联。
(10)肽稳定性
肽的稳定性通过HPLC在37℃测量。肽的半衰期通过指数衰减建模计算，且计算的结果示于下表4和图15-17(绘制肽浓度在时间标度中的速率常数)。在图14中，LK-3中的二硫化物接头通过虚线指示，且LK-4中的N,N'-(1,4-亚苯基)二马来酰亚胺接头通过实线表示。扭结肽和LK-3与多种血清蛋白重叠。生命期短，且半衰期在该条件中未确定。引入的全部肽在1小时内消失。在二聚体D中也预期相同的结果。
表4
NC：不可计算；N/A：未确定
测量了肽二聚体D和单体D在体外在人血清中的稳定性，且测量的结果示于图15。参考图15，可见与LK-3相似的二聚体D在25％人血清中显示约9小时的半衰期，这是其单体的半衰期(3小时)的约3倍。这指示通过二硫化物二聚体形成的结构稳定化可抑制由血清中存在的蛋白酶引起的降解。
测试血清中LK-4的稳定性的结果示于图16。包含不同于二硫键的键的LK-4的半衰期在相同条件下测量为2小时。由于LK-4不是在与二聚体D中的相同位置具有二硫键的二聚体，LK-4不能直接与二聚体D比较，但可见肽的稳定性可取决于二聚体形成的位置而变化。
在作为体内还原条件的0.5mM GSH中测试肽二聚体D和扭结D的稳定性的结果示于图17。作为直接显示对肽稳定性的结构效果的实施例，当二聚体形成从而将二硫键稳定定位于结构内时，二聚体还原所花费的时间在相同条件下增加。然而，显示当二硫键在分子中形成从而其相对暴露时，半衰期在1小时内。
本领域的任何技术人员会理解的是，基于本发明的公开内容的多种应用和修饰是可能的而不脱离本发明的范围。
工业实用性
如本文所述，包含位于多个α-螺旋两性肽的一个或多个氨基酸位置的接头的本发明的肽多聚体可具有高细胞穿透能力，因为它具有显著增加的α-螺旋含量。由于此优异的细胞穿透能力，肽多聚体可将多种生物活性物质有效递送入细胞，且其细胞毒性可在细胞内穿透后最小化。因此，本发明的肽多聚体可有效用作用于预防或治疗疾病的作用剂。

Claims (26)

1.一种肽多聚体，其包含多个同质或异质的α-螺旋两性肽。
2.权利要求1的肽多聚体，其中进一步包含位于选自下组的一个或多个氨基酸位置的接头：i、i+3、i+4、i+7、i+8、i+10和i+11(其中i是整数)。
3.权利要求2的肽多聚体，其中所述接头位于选自下组的两个或多个氨基酸位置：i、i+3、i+4、i+7、i+8、i+10和i+11(其中i是整数)。
4.权利要求1的肽多聚体，其中所述两性肽包含选自下组的一个或多个亲水性氨基酸：精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
5.权利要求1的肽多聚体，其中所述两性肽包含选自下组的一个或多个疏水性氨基酸：亮氨酸、缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和异亮氨酸。
6.权利要求1的肽多聚体，其中所述肽包含5-50个氨基酸。
7.权利要求1的肽多聚体，其中所述肽包含7-23个氨基酸。
8.权利要求1的肽多聚体，其中在所述肽中分别排列1-3个亲水性氨基酸和疏水性氨基酸。
9.权利要求1的肽多聚体，其中所述两性肽包含下式所示的7个氨基酸序列中的一个或多个：
其中X是亲水性氨基酸且Y是疏水性氨基酸。
10.权利要求1的肽多聚体，其中所述两性肽中的亲水性氨基酸以33％或更多量包含选自下组的一个或多个带正电荷的氨基酸残基：精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
11.权利要求1的肽多聚体，其中所述两性肽的疏水性氨基酸以25％或更多量包含选自下组的一个或多个残基：亮氨酸、色氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和异亮氨酸。
12.权利要求1的肽多聚体，其中所述两性肽包含下列SEQ ID NO:11所示的序列：
KLLKLLK(SEQ ID NO:11)。
13.权利要求1的肽多聚体，其中所述肽包含下式所示的一个或多个氨基酸序列：
CYYXXYXCYYXXYXZW(1)
XYYCXYXXYYCXYXZW(2)
XYYXCYXXYYXCYXZW(3)
XYYXXYCXYYXXYCZW(4)；和
XYYXXYXCYYXXYXCW(5)
其中X、Z和W是疏水性氨基酸，Y是亲水性氨基酸，且C是半胱氨酸。
14.权利要求13的肽多聚体，其中所述肽包含选自SEQ ID NO:1-10的至少一个序列。
15.权利要求1的肽多聚体，其中所述肽的α-螺旋含量在其中三氟乙醇和缓冲剂以1:1的比率混合的细胞膜条件中为至少80％。
16.权利要求1的肽多聚体，其中所述接头包含在肽之间连接的共价键。
17.权利要求16的肽多聚体，其中所述共价键为选自下组的至少一个：半胱氨酸间的二硫键、马来酰亚胺键、酯键、硫醚键和由点击反应(clickreaction)形成的键。
18.权利要求1的肽多聚体，其中所述多聚体是二聚体、三聚体或四聚体。
19.一种用于制备肽多聚体的方法，其包括下列步骤：
构建包含亲水性和疏水性氨基酸的α-螺旋肽；
选择多个同质或异质的α-螺旋肽；和
在选自下组的一个或多个氨基酸位置连接多个所选的α-螺旋肽：i、i+3、i+4、i+7、i+8、i+10和i+11(其中i是整数)。
20.权利要求19的方法，其中所述多个所选的α-螺旋肽在选自下组的两个或多个氨基酸位置彼此连接：i、i+3、i+4、i+7、i+8、i+10和i+11(其中i是整数)。
21.权利要求19的方法，其中所述多个α-螺旋肽彼此通过在肽之间连接的共价键彼此连接。
22.权利要求21的方法，其中所述共价键为选自下组的至少一个：半胱氨酸间的二硫键、马来酰亚胺键、酯键、硫醚键和由点击反应形成的键。
23.用于预防或治疗HIV的组合物，其包含权利要求1-18任一项的α-螺旋肽多聚体作为活性成分。
24.权利要求23的组合物，其中所述肽多聚体与HIV的TAR(反式激活区)结合。
25.一种用于细胞内递送生物活性物质的组合物，其包含权利要求1-18任一项的肽多聚体和所述生物活性物质。
26.权利要求24的组合物，其中所述生物活性物质是DNA、RNA、siRNA、适体、蛋白质、抗体或低分子化合物。
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