CN105821113A - 鉴定气单胞菌属的试剂盒和方法 - Google Patents

鉴定气单胞菌属的试剂盒和方法 Download PDF

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CN105821113A CN201610147284.6A CN201610147284A CN105821113A CN 105821113 A CN105821113 A CN 105821113A CN 201610147284 A CN201610147284 A CN 201610147284A CN 105821113 A CN105821113 A CN 105821113A
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Abstract

本发明提供了鉴定气单胞菌属的试剂盒和方法，具体地，本发明提供了一种用于鉴定气单胞菌属的试剂盒，包括以下鉴定组分：(i)第一鉴别培养基或用于配制所述第一鉴别培养基的试剂，所述的第一鉴别培养基为克氏双糖铁琼脂斜面培养基(KIA)；(ii)第二鉴别培养基或用于配制所述第二鉴别培养基的试剂，所述的第二鉴别培养基为AHM培养基；和(iii)第三鉴别培养基或用于配制所述第三鉴别培养基的试剂，所述的第三鉴别培养基为葡萄糖发酵培养基。用本发明的试剂盒对气单胞菌属进行鉴定，不仅可显著降低假阳性和假阴性结果，还可以提高菌株鉴定的敏感性和特异性。

Description

鉴定气单胞菌属的试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及细菌鉴定领域，具体地，涉及鉴定气单胞菌属的试剂盒和方法。
背景技术
气单胞菌属是一种重要的食源性、水源性病原体，在食物链和自然界广泛存在，至今已经发现超过30个种，可导致人类食源性疾病及肠道外感染，以及水栖、鱼介(壳)类动物患病死亡，造成比较沉重的人类疾病负担及养殖业经济损失。在我国，目前仅制定了嗜水气单胞菌的检测方法(GB/T18652-2002)，而对气单胞菌属的标准检测鉴定方法尚未建立。部分地区制定了方法不一的气单胞菌初筛技术方法，但是存在对某些生化不典型菌株(如乳糖阳性或甘露醇阴性等)的错误鉴定。国外专业实验室通过基因测序的方法鉴定气单胞菌，但该技术需依赖分子诊断实验室的仪器配置，这对大多数国内基层实验室来说存在软件或硬件不足。基于目前全球食品安全和国内持续上升的食源性疾病防控形势，众多相关领域的实验室，包括临床、公共卫生、质检、出入境和动物兽医等实验室对各领域的筛检样品中可疑气单胞菌需要有更加专业的认识和鉴别能力，以及更加简便、精确的鉴定方法，才能避免错误的鉴定，从而在多源头有效的控制气单胞菌疫情的传播和扩散。
因此，本领域迫切需要开发一种改良的简易鉴定气单胞菌属的方法，以满足临床、公共卫生和动物兽医学实验室在常规工作中用于快速鉴别气单胞菌属的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种改良的简易鉴定气单胞菌属的方法，以满足临床、公共卫生和动物兽医学实验室在常规工作中用于快速鉴别气单胞菌属的需求。
本发明的另一目的是提供鉴定气单胞菌属的试剂盒。
本发明第一方面提供了一种用于鉴定气单胞菌属的试剂盒，包括以下鉴定组分：
(i)第一鉴别培养基或用于配制所述第一鉴别培养基的试剂，所述的第一鉴别培养基为克氏双糖铁琼脂斜面培养基(KIA)；
(ii)第二鉴别培养基或用于配制所述第二鉴别培养基的试剂，所述的第二鉴别培养基为AHM培养基；和
(iii)第三鉴别培养基或用于配制所述第三鉴别培养基的试剂，所述的第三鉴别培养基为葡萄糖发酵培养基。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：
(iv)第四鉴别培养基或用于配制所述第四鉴别培养基的试剂，所述的第四鉴别培养基为含低浓度氯化钠的蛋白胨培养基，其中所述的低浓度指培养基中氯化钠的浓度为0-1wt％，按第四鉴别培养基的总重量计；和
(v)第五鉴别培养基或用于配制所述第五鉴别培养基的试剂，所述的第五鉴别培养基为含高浓度氯化钠的蛋白胨培养基，其中所述的高浓度指培养基中氯化钠的浓度为5-10wt％，按第五鉴别培养基的总重量计。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括：
(iv)第四鉴别培养基或用于配制所述第四鉴别培养基的试剂，所述的第四鉴别培养基为不含氯化钠的蛋白胨培养基，即所述的培养基中氯化钠的浓度为0wt％，按第四鉴别培养基的总重量计；和
(v)第五鉴别培养基或用于配制所述第五鉴别培养基的试剂，所述的第五鉴别培养基为含高浓度氯化钠的蛋白胨培养基，其中所述的高浓度指培养基中氯化钠的浓度为6wt％，按第五鉴别培养基的总重量计。
在另一优选例中，所述克氏双糖铁琼脂斜面培养基(KIA)包括：乳糖、葡萄糖、氯化钠、柠檬酸铁铵、硫代硫酸钠、琼脂、酚红、和蒸馏水。
在另一优选例中，所述AHM培养基包括：蛋白胨、酵母浸膏、色氨酸、L-鸟氨酸、甘露醇、肌醇、硫代硫酸钠、柠檬酸铁铵、琼脂、溴甲酚紫、和蒸馏水。
在另一优选例中，所述葡萄糖发酵培养基包括：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钠、溴麝香草酚蓝溶液、葡萄糖、和蒸馏水。
在另一优选例中，所述第一鉴别培养基、第二鉴别培养基、第三鉴别培养基、第四鉴别培养基、第五鉴别培养基为已经配好的或未配好的。
在另一优选例中，所述AHM培养基为半固体培养基。
在另一优选例中，所述葡萄糖发酵培养基为液体培养基。
在另一优选例中，所述蛋白胨培养基为液体培养基。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于鉴定气单胞菌属。
在另一优选例中，所述的标签或说明书还记载了本发明第三方面中所述的鉴定气单胞菌属的方法。
本发明第二方面提供了一种培养基组合的用途，用于制备鉴定气单胞菌属的试剂盒，其中所述的培养基组合包括：
(i)第一鉴别培养基，所述的第一鉴别培养基为克氏双糖铁琼脂斜面培养基(KIA)；
(ii)第二鉴别培养基，所述的第二鉴别培养基为AHM培养基；和
(iii)第三鉴别培养基，所述的第三鉴别培养基为葡萄糖发酵培养基。
本发明第三方面提供了一种非诊断性的鉴定气单胞菌属的方法，包括步骤：
(a)提供一待鉴定的微生物样本；
(b)将所述的微生物接种于鉴别培养基，并观察所述微生物样本在各鉴别培养基中的生长情况，
其中，所述的鉴别培养基包括：
(i)第一鉴别培养基，所述的第一鉴别培养基为克氏双糖铁琼脂斜面培养基(KIA)；
(ii)第二鉴别培养基，所述的第二鉴别培养基为AHM培养基；和
(iii)第三鉴别培养基，所述的第三鉴别培养基为葡萄糖发酵培养基；
(c)基于上一步骤中观察到的生长情况确定所述微生物样本的生化模式M，并将并所述生化模式M与气单胞菌属评定标准进行比较，从而确定所述样本是否属于气单胞菌属。
在另一优选例中，所述的鉴别培养基还包括：
(iv)第四鉴别培养基，所述的第四鉴别培养基为含低浓度氯化钠的蛋白胨培养基，其中所述的低浓度指培养基中氯化钠的浓度为0-1wt％，按第四鉴别培养基的总重量计；和
(v)第五鉴别培养基，所述的第五鉴别培养基为含高浓度氯化钠的蛋白胨培养基，其中所述的高浓度指培养基中氯化钠的浓度为5-10wt％，按第五鉴别培养基的总重量计。
在另一优选例中，所述的鉴别培养基还包括：
(iv)第四鉴别培养基，所述的第四鉴别培养基为不含氯化钠的蛋白胨培养基，即所述的低浓度指培养基中氯化钠的浓度为0wt％，按第四鉴别培养基的总重量计；和
(v)第五鉴别培养基，所述的第五鉴别培养基为含高浓度氯化钠的蛋白胨培养基，其中所述的高浓度指培养基中氯化钠的浓度为6wt％，按第五鉴别培养基的总重量计。
在另一优选例中，所述的气单胞菌属评定标准包括以下4种生化模式：
第一生化模式M1：
第一鉴别培养基中，斜面不产酸但底层产酸；
第二鉴别培养基中，表层紫色、底层黄色、动力阳性、硫化氢阴性；
第三鉴别培养基中，产酸产气；
第四鉴别培养基中，溶液浑浊，细菌生长良好；
第五鉴别培养基中，溶液澄清，细菌不生长；
第二生化模式M2：
第一鉴别培养基中，斜面不产酸但底层产酸；
第二鉴别培养基中，不变色；
第三鉴别培养基中，产酸产气；
第四鉴别培养基中，溶液浑浊，细菌生长良好；
第五鉴别培养基中，溶液澄清，细菌不生长；
第三生化模式M3：
第一鉴别培养基中，斜面不产酸但底层产酸；
第二鉴别培养基中，表层紫色、底层黄色、动力阳性、硫化氢阴性；
第三鉴别培养基中，只产酸；
第四鉴别培养基中，溶液浑浊，细菌生长良好；
第五鉴别培养基中，溶液澄清，细菌不生长；
第四生化模式M4：
第一鉴别培养基中，斜面产酸且底层产酸；
第二鉴别培养基中，表层紫色、底层黄色、动力阳性、硫化氢阴性；
第三鉴别培养基中，只产酸。
第四鉴别培养基中，溶液浑浊，细菌生长良好；
第五鉴别培养基中，溶液澄清，细菌不生长；
在另一优选例中，所述生化模式M符合上述M1－M4中任何一种时，则评定所述微生物样本为气单胞菌属细菌。
在另一优选例中，所述生化模式M符合上述M1时，则评定所述微生物样本为有嗜水气单胞菌/维隆气单胞菌温和变种。
在另一优选例中，所述生化模式M符合上述M2时，则评定所述微生物样本为有维隆气单胞菌维隆变种。
在另一优选例中，所述生化模式M符合上述M3时，则评定所述微生物样本为有豚鼠气单胞菌。
在另一优选例中，所述生化模式M符合上述M4时，则评定所述微生物样本为有豚鼠气单胞菌乳糖阳性变种。
在另一优选例中，所述微生物样本来源于临床样本、食品样本、或外环境样本。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人经过长期广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，首次意外地发现，用含有第一鉴别培养基、第二鉴别培养基、第三鉴别培养基，以及任选的第四鉴别培养基和第五鉴别培养基的试剂盒可有效鉴定气单胞菌属，显著降低假阳性和假阴性的结果，并显著提高菌株鉴定的特异性(100％)和敏感性(100％)。在此基础上，本发明人完成了本发明。
试剂盒
本发明提供了一种用于鉴定气单胞菌属的试剂盒，包括以下鉴定组分：
(i)第一鉴别培养基或用于配制所述第一鉴别培养基的试剂，所述的第一鉴别培养基为克氏双糖铁琼脂斜面培养基(KIA)；
(ii)第二鉴别培养基或用于配制所述第二鉴别培养基的试剂，所述的第二鉴别培养基为AHM培养基；和
(iii)第三鉴别培养基或用于配制所述第三鉴别培养基的试剂，所述的第三鉴别培养基为葡萄糖发酵培养基。
在一优选例中，所述的试剂盒还包括：
(iv)第四鉴别培养基或用于配制所述第四鉴别培养基的试剂，所述的第四鉴别培养基为含低浓度氯化钠的蛋白胨培养基，其中所述的低浓度指培养基中氯化钠的浓度为0-1wt％，按第四鉴别培养基的总重量计；和
(v)第五鉴别培养基或用于配制所述第五鉴别培养基的试剂，所述的第五鉴别培养基为含高浓度氯化钠的蛋白胨培养基，其中所述的高浓度指培养基中氯化钠的浓度为5-10wt％，按第五鉴别培养基的总重量计。
在本发明中，本发明的试剂盒中的各个鉴定组分之间的比例，以及各个鉴定组分的含量不受特别限制。
本发明的试剂盒中的各个鉴定组分可购买获得，或用常规方法制备。
本发明的试剂盒可有效鉴定气单胞菌属，显著降低假阳性和假阴性的结果，并显著提高菌株鉴定的特异性(100％)和敏感性(100％)。
本发明的主要优点包括：
(1)通过3个(优选5个)生化反应管组合，可满足临床、公共卫生、环境食品、畜牧动物、兽医实验室在常规工作中气单胞菌属的鉴定的技术需要，省时、省力，易于操作，成本低廉，具有很好的社会和经济效益。
(2)本发明的气单胞菌属鉴定方法可显著降低假阳性和假阴性的结果，显著提高菌株鉴定的特异性(100％)和敏感性(100％)。
(3)本发明的鉴定方法使得气单胞菌的鉴定方法更加标准化、规范化。
(4)本发明的方法更加简便、且准确度高。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
本发明所用的材料如无特别说明，均为市售产品。
实施例1对气单胞菌属的鉴定
1.1准备5个生化反应管，管内的鉴定组分分别如下所示：
(1)克氏双糖铁琼脂斜面培养基(KIA)：乳糖10.0g；葡萄糖1.0g；氯化钠5.0g；柠檬酸铁铵0.5g；硫代硫酸钠0.5g；琼脂12.0g；酚红0.025g；蒸馏水1000.0mL，pH7.4。制法：将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.2％酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到比较高的底层。121℃高压灭菌15min。放置高层斜面，置4℃冰箱保存备用。使用方法：穿刺接种细菌培养物，经36±1℃培养24h，产酸颜色变黄色表示阳性反应，不变色者为阴性反应。
(2)AHM培养基：蛋白胨5.0g；酵母浸膏3.0g；蛋白胨9.0g；色氨酸1g；L-鸟氨酸5.0g；甘露醇1.0g；肌醇10.0g；硫代硫酸钠0.4g；柠檬酸铁铵0.5g；琼脂3.0g；溴甲酚紫0.02g；蒸馏水1000.0mL，pH6.7。制法：将除琼脂和溴甲酚紫以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加入溴甲酚紫，摇匀。分装小试管,每管4mL121℃高压灭菌，15min。置4℃冰箱保存备用。使用方法：穿刺接种细菌培养物，经36±1℃培养24h，表层紫色、底层黄色、动力阳性、硫化氢阴性为阳性反应，不变色者为阴性反应。
(3)0％氯化钠的蛋白胨水(培养基)：蛋白胨2.0g；蒸馏水100.0mL，pH7.7。制法：配制2％的蛋白胨水，校正pH值，待溶解后分装试管。121℃高压灭菌，15min。置4℃冰箱保存备用。使用方法：接种细菌培养物，经36±1℃培养24h，溶液变浑浊表示阳性反应(即细菌生长良好)，溶液澄清者为阴性反应(即细菌不生长)。
(4)6％氯化钠的蛋白胨水(培养基)：蛋白胨2.0g；氯化钠6.0g；蒸馏水100.0mL，pH7.7。制法：配制2％的蛋白胨水，校正pH值，每瓶100.0mL，加入氯化钠6.0g，待溶解后分装试管。121℃高压灭菌，15min。置4℃冰箱保存备用。使用方法：接种细菌培养物，经36℃培养24h，使用方法：接种细菌培养物，经36±1℃培养24h，溶液变浑浊表示阳性反应(即细菌生长良好)，溶液澄清者为阴性反应(即细菌不生长)。
(5)葡萄糖发酵培养基：牛肉膏0.5g；蛋白胨1.0g；氯化钠0.3g；磷酸氢二钠0.2g；0.2％溴麝香草酚蓝溶液1.2mL；葡萄糖1.0g；蒸馏水100.0mL，pH7.6。制法：将牛肉膏、蛋白胨、氯化钠加温溶于水中，校正pH，加入溴麝香草酚蓝溶液后过滤，继续加入葡萄糖，等完全溶解后分装于有一个倒置小管的试管中，每管3.0ml，于115℃高压灭菌，15min。置4℃冰箱保存备用。使用方法：接种细菌培养物，经36±1℃培养24h，溶液颜色变黄表示产酸，小导管内出现气泡表示产气，不变色者为阴性反应。
1.2鉴定方法
在选择性或非选择性培养基中分离得到可疑气单胞菌，其单克隆菌株的新鲜培养物经氧化酶试验鉴定为阳性的菌株，分别被接种于克氏双糖铁琼脂斜面培养基(KIA)、AHM培养基、0％氯化钠的蛋白胨水、6％氯化钠的蛋白胨水、葡萄糖发酵培养基中，36±1℃培养24h后取出观察结果，并依据生化结果报告，判断是否为气单胞菌。
1.3鉴定结果
表1
a：-/+：斜面不产酸、底层产酸；+/+：斜面产酸、底层产酸
b：+：产酸；产酸产气
结果如表1所示。结果表明，该方法除了能够快速准确鉴定典型生化的气单胞菌外，对于生化表型不典型的气单胞菌同样能够达到甄别的效果，从而避免假阳性和假阴性的发生。
实施例2气单胞菌属鉴定的效果验证
对2012-2015年分离到的气单胞菌阳性菌株进行比对验证(其中临床样本分离株254株，食品样本分离株251株，外环境样本分离株44株)，结果如表2所示。结果显示，用本发明的方法鉴定的菌株敏感性为100.00％。
表2气单胞菌阳性菌株比对验证结果
发明人对河弧菌(ATCC33812)、弗尼氏弧菌(ATCC33841)、副溶血性弧菌(ATCC33847)、创伤弧菌(ATCC27562)、类志贺邻单胞菌(ATCC14029)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)等标准菌株菌株进行验证，结果如表3所示。结果显示，用本发明的方法鉴定的菌株特异性为100.00％。
表3非气单胞菌阳性菌株比对验证结果
因此，结果表明，本发明的方法具有显著的菌株敏感性和特异性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种用于鉴定气单胞菌属的试剂盒，其特征在于，包括以下鉴定组分：
(i)第一鉴别培养基或用于配制所述第一鉴别培养基的试剂，所述的第一鉴别培养基为克氏双糖铁琼脂斜面培养基(KIA)；
(ii)第二鉴别培养基或用于配制所述第二鉴别培养基的试剂，所述的第二鉴别培养基为AHM培养基；和
(iii)第三鉴别培养基或用于配制所述第三鉴别培养基的试剂，所述的第三鉴别培养基为葡萄糖发酵培养基。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括：
(iv)第四鉴别培养基或用于配制所述第四鉴别培养基的试剂，所述的第四鉴别培养基为含低浓度氯化钠的蛋白胨培养基，其中所述的低浓度指培养基中氯化钠的浓度为0-1wt％，按第四鉴别培养基的总重量计；和
(v)第五鉴别培养基或用于配制所述第五鉴别培养基的试剂，所述的第五鉴别培养基为含高浓度氯化钠的蛋白胨培养基，其中所述的高浓度指培养基中氯化钠的浓度为5-10wt％，按第五鉴别培养基的总重量计。
3.一种培养基组合的用途，其特征在于，用于制备鉴定气单胞菌属的试剂盒，其中所述的培养基组合包括：
(i)第一鉴别培养基，所述的第一鉴别培养基为克氏双糖铁琼脂斜面培养基(KIA)；
(ii)第二鉴别培养基，所述的第二鉴别培养基为AHM培养基；和
(iii)第三鉴别培养基，所述的第三鉴别培养基为葡萄糖发酵培养基。
4.一种非诊断性的鉴定气单胞菌属的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供一待鉴定的微生物样本；
(b)将所述的微生物接种于鉴别培养基，并观察所述微生物样本在各鉴别培养基中的生长情况，
其中，所述的鉴别培养基包括：
(i)第一鉴别培养基，所述的第一鉴别培养基为克氏双糖铁琼脂斜面培养基(KIA)；
(ii)第二鉴别培养基，所述的第二鉴别培养基为AHM培养基；和
(iii)第三鉴别培养基，所述的第三鉴别培养基为葡萄糖发酵培养基；
(c)基于上一步骤中观察到的生长情况确定所述微生物样本的生化模式M，并将并所述生化模式M与气单胞菌属评定标准进行比较，从而确定所述样本是否属于气单胞菌属。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的鉴别培养基还包括：
(iv)第四鉴别培养基，所述的第四鉴别培养基为含低浓度氯化钠的蛋白胨培养基，其中所述的低浓度指培养基中氯化钠的浓度为0-1wt％，按第四鉴别培养基的总重量计；和
(v)第五鉴别培养基，所述的第五鉴别培养基为含高浓度氯化钠的蛋白胨培养基，其中所述的高浓度指培养基中氯化钠的浓度为5-10wt％，按第五鉴别培养基的总重量计。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的气单胞菌属评定标准包括以下4种生化模式：
第一生化模式M1：
第一鉴别培养基中，斜面不产酸但底层产酸；
第二鉴别培养基中，表层紫色、底层黄色、动力阳性、硫化氢阴性；
第三鉴别培养基中，产酸产气；
第四鉴别培养基中，溶液浑浊，细菌生长良好；
第五鉴别培养基中，溶液澄清，细菌不生长；
第二生化模式M2：
第一鉴别培养基中，斜面不产酸但底层产酸；
第二鉴别培养基中，不变色；
第三鉴别培养基中，产酸产气；
第四鉴别培养基中，溶液浑浊，细菌生长良好；
第五鉴别培养基中，溶液澄清，细菌不生长；
第三生化模式M3：
第一鉴别培养基中，斜面不产酸但底层产酸；
第二鉴别培养基中，表层紫色、底层黄色、动力阳性、硫化氢阴性；
第三鉴别培养基中，只产酸；
第四鉴别培养基中，溶液浑浊，细菌生长良好；
第五鉴别培养基中，溶液澄清，细菌不生长；
第四生化模式M4：
第一鉴别培养基中，斜面产酸且底层产酸；
第二鉴别培养基中，表层紫色、底层黄色、动力阳性、硫化氢阴性；
第三鉴别培养基中，只产酸；
第四鉴别培养基中，溶液浑浊，细菌生长良好；
第五鉴别培养基中，溶液澄清，细菌不生长。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述生化模式M符合上述M1时，则评定所述微生物样本为有嗜水气单胞菌/维隆气单胞菌温和变种。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述生化模式M符合上述M2时，则评定所述微生物样本为有维隆气单胞菌维隆变种。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述生化模式M符合上述M3时，则评定所述微生物样本为有豚鼠气单胞菌。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述生化模式M符合上述M4时，则评定所述微生物样本为有豚鼠气单胞菌乳糖阳性变种。
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