CN105821047A - 分离的编码popdc1突变体的核酸及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了POPDC1基因突变体及其应用，具体涉及分离的编码POPDC1突变体的核酸，分离的多肽，筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品的系统，用于筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品的试剂盒，以及构建药物筛选模型的方法。其中，该分离的编码POPDC1突变体的核酸，与SEQ ID NO：1相比，具有c.602C>T突变、c.515G>A突变、c.385C>T突变和c.427A>G突变的至少之一。通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患肢带型肌营养不良症。

Description

分离的编码POPDC1突变体的核酸及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及分离的编码POPDC1突变体的核酸及其应用，更具体地，涉及分离的编码POPDC1突变体的核酸、分离的多肽、筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品的系统、用于筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品的试剂盒、构建体、重组细胞以及构建药物筛选模型的方法。

背景技术

肢带型肌营养不良症(imb-girdlemusculardystrophy，LGMD)，是临床上以肩胛带和骨盆带肌不同程度无力或萎缩为主要特点的一组疾病，是进行性肌营养不良症中除杜氏和贝克型营养不良症(DMD/BMD)外最常见的类型。

LGMD的发病年龄可以差别很大，从幼儿到50岁均有发病，男女均可患病。首发症状常为骨盆带及肩胛带肌肉萎缩，腰椎前凸，运动困难；膝腱反射比踝反射早消失；抬臂困难，出现翼状肩胛：头面颈部肌肉一般不受累，有时可伴腓肠肌假性肥大；病情进展缓慢，平均于发病后20年左右丧失行动能力；肌电图和肌肉活检均显示肌原性损害，肌酸激酶CK、乳酸脱氢酶LDH等血清肌酶常显著增高，但通常低于DMD型的水平，心电图正常。正是由于LGMD的表征十分多变，且有的表征与其他肌肉疾病类似，LGMD的发病率很难统计。普遍认为，LGMD的发病率大致在1/14500和1/123000之间。

在1995年由欧洲神经肌肉病中心工作组根据遗传方式将LGMD分为1型(常染色体显性遗传)和2型(常染色体隐性遗传)，之后由根据不同的基因缺陷分出许多亚型。截止至2012年，已知的共有25个亚型，其中1型有8个亚型(1A-1H)，2型有17个亚型(2A-2Q)。LGMD是一组遗传模式和临床症状具高度异质性的常染色体连锁遗传性肌营养不良，已知涉及到的基因至少有50个。这些位点有些也与心脏有关，包括肌聚糖蛋白、小窝蛋白3、核纤层蛋白A/C和几种肌节蛋白。

由此，肢带型肌营养不良症的早期诊断有待于进一步研究。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种有效筛选肢带型肌营养不良症的生物样品的方法。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：

POPDC1蛋白功能复杂多样，能与许多其他蛋白相互作用，如双孔钾离子通道蛋白TREK-1、小窝蛋白3等。POPDC1在骨骼肌、平滑肌和心肌中皆为高表达；在心脏传导系统的心肌细胞中，其表达量尤为突出。发明人认为从蛋白功能角度考虑，基因POPDC1很可能与肢带型肌营养不良症有关

发明人利用特制的DNA序列探针将全基因组中的外显子区域捕获下来，然后针对每个外显子进行深度测序。并在目标区域测序找到了POPDC1基因c.602C>T突变和c.515G>A突变，这两个突变位点分别引起相应多肽的p.S201F突变和p.R172H突变，上述突变均与肢带型肌营养不良症有关。

因而，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种分离的编码POPDC1突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQIDNO：1相比，具有c.602C>T突变、c.515G>A突变、c.385C>T突变和c.427A>G突变的至少之一。在本发明中，采用本领域通用表示法表示突变。c.602C>T表示cDNA第602位核苷酸由C变成T；c.515G>A表示cDNA第515位核苷酸由G变成A；c.385C>T表示cDNA第385位核苷酸由C变成T；c.427A>G表示cDNA第427位核苷酸由A变成G。发明人惊奇的发现，该突变体与肢带型肌营养不良症的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患肢带型肌营养不良症，根据本发明的实施例，该突变体的核酸进一步丰富了POPDC1基因的致病突变图谱，更深入阐明了肢带型肌营养不良症的分子发病机制，为肢带型肌营养不良症的早期致病基因筛查和干预治疗提供科学依据。

根据本发明的第二方面，本发明还提供了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQIDNO：4相比，所述分离的多肽具有p.S201F突变、p.R172H突变、p.R129W突变和p.R143G突变的至少之一。在本发明中，采用本领域通用表示法表示突变。p.S201F表示蛋白质水平第201位密码子由丝氨酸变成苯丙氨酸；p.R172H表示蛋白质水平第154位密码子由精氨酸变成组氨酸；p.R129W表示蛋白质水平第129位密码子由精氨酸变成色氨酸；p.R143G表示蛋白质水平第143位密码子由精氨酸变成甘氨酸。具体地，致病基因POPDC1上c.602C>T突变，引起多肽p.S201F突变；c.515G>A突变，导致p.R172H突变；c.385C>T突变，引起p.R129W突变；以及c.427A>G突变，导致p.R143G突变。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患肢带型肌营养不良症。

根据本发明的第三方面，本发明还提供了一种筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品的系统。该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于提取所述生物样品中的核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；以及判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于将所述核酸的序列与SEQIDNO：1相比，是否具有c.602C>T突变和c.515G>A突变之一，判断所述生物样品是否易患肢带型肌营养不良症。发明人惊奇地发现，利用该系统可以对肢带型肌营养不良症进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品。

根据本发明的第四方面，本发明还提供了一种用于筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测POPDC1基因突变体的试剂，其中与SEQIDNO：1相比，所述POPDC1基因突变体具有c.602C>T突变和c.515G>A突变的至少之一。由此，利用该试剂盒，可以对POPDC1基因突变体进行高精度的检测，从而对肢带型肌营养不良症进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品。

根据本发明的第五方面，本发明还提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前述的分离的编码POPDC1突变体的核酸。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗肢带型肌营养不良症的药物。

根据本发明的第六方面，本发明还提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过表达前述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗肢带型肌营养不良症的药物。

根据本发明的第七方面，本发明还提供了一种构建药物筛选模型的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使动物的至少一部分细胞表达前述的多肽。根据本发明的一些实施例，利用本发明的动物模型，能够有效地筛选治疗肢带型肌营养不良症的药物。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明实施例的筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，

图1A为根据本发明实施例的筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品的系统的示意图，

图1B为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，

图1C为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；

图2显示了根据本发明实施例的4个家系的家系图；

图3显示了根据本发明实施例的POPDC1的突变体与心肌蛋白功能的关系，其中

图3A为根据本发明实施例的利用蛋白印迹法定量检测cAMP结合亲和力的结果示意图；

图3B为根据本发明实施例的293A细胞转染YFP-TREK-1与Popdc1-CFP(WT)或S201F-CFP(201F)，采用异丙肾上腺素治疗后FRET信号的相对变化示意图；

图3C为根据本发明实施例的TREK-1单独或共表达POPDC1-WT的后，TREK-1/Popdc1比分别为5：1和1：5的比例时，相对电流振幅示意图；

图3D为根据本发明实施例的爪蟾卵母细胞中单独注射TREK-1cRNA，以及TREK-1cRNA分别与POPDC1-WT、S201F、R172H、R129W和R143GcRNA的混合物48h后的电压关系示意图；

图3E为根据本发明实施例的爪蟾卵母细胞中单独注射TREK-1cRNA，以及TREK-1cRNA分别与POPDC1-WT、S201F、R172H、R129W和R143GcRNA的混合物48h后的相对电流示意图；

图3F为根据本发明实施例的卵母细胞在磷酸二酯酶抑制剂茶碱(phosphodiesteraseinhibitortheophylline)中培养48h，TREK-1电流振幅分析在0mV的条件下，在与POPDC1-WT、S201F、R172H、R129W和R143G的共表达条件下，各卵母细胞的相对电流示意图；

图3G为根据本发明实施例的转染到Cos-7细胞后的突变及POPDC1-WT正常蛋白分布的荧光显微图片，

图4显示了根据本发明实施例的POPDC1基因的结构图及预测的二级结构和三级结构的示意图，

其中，

图4A为根据本发明实施例的Popeye结构域蛋白的基本结构示意图；

图4B为根据本发明实施例的预测的POPDC1蛋白的Popeye结构域二级结构示意图；

图4C为根据本发明实施例的Popeye结构域的多序列比对的结构示意图；

图4D为根据本发明实施例的Popeye结构域接线图；

图4E为根据本发明实施例的Popeye结构域结构模型示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

POPDC1突变体

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种分离的编码POPDC1突变体的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸与SEQIDNO：1相比，具有c.602C>T突变、c.515G>A突变、c.385C>T突变和c.427A>G突变的至少之一。

在本文中所使用的表达方式“编码POPDC1突变体的核酸”，是指与编码POPDC1突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与POPDC1突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一些具体示例，所述核酸为DNA。

对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQIDNO：1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。例如提及POPDC1基因的cDNA序列，实际也包括相应的RNA序列。

该编码POPDC1突变体的核酸，是本申请的发明人通过目标区域捕获测序联合候选基因突变验证的方法确定的肢带型肌营养不良症的致病基因POPDC1的新的致病突变。该致病突变位点在现有技术中并未被提到。需要说明的是，在本文中所使用的表达方式“目标区域捕获测序”是指利用特制的探针对客户感兴趣的某段特定序列进行捕获富集后，再利用第二代测序技术进行高通量测序及基因组分析的方法。利用该方法能够获得指定目标区域的遗传信息，极大的提高了基因组中目标区域的研究效率，显著降低了研究成本。在本发明中，将该方法用于识别和研究与疾病相关的编码区域内的结构变异，进而，结合大量的公共数据库提供的数据，有利于更好地解释所得变异结构之间的关联和致病机理。

其中，野生型的POPDC1的cDNA的序列如下所示：

ATGAATTATACAGAGTCCAGCCCATTGAGAGAATCAACTGCCATAGGTTTTACACCTGAGTTAGAAAGTATCATACCTGTGCCTTCCAATAAGACCACTTGTGAAAACTGGAGAGAGATACATCATCTGGTTTTTCATGTAGCAAATATTTGTTTTGCAGTTGGGTTGGTTATTCCAACTACTCTTCACCTTCATATGATATTTCTTAGGGGAATGTTAACTCTAGGATGTACCCTTTATATCGTCTGGGCCACTCTCTACCGATGTGCCTTGGATATAATGATCTGGAACTCTGTGTTCTTGGGTGTCAACATTTTGCATCTGTCGTATCTTTTATACAAGAAGAGACCGGTAAAGATTGAAAAGGAACTCAGTGGCATGTACCGGCGATTGTTTGAACCACTCCGTGTGCCTCCAGATTTGTTCAGAAGACTAACTGGACAGTTTTGCATGATCCAAACCTTGAAAAAGGGCCAAACTTATGCTGCAGAGGATAAAACCTCAGTTGATGACCGTCTGAGTATTCTCTTGAAGGGAAAAATGAAGGTCTCCTATCGAGGACATTTTCTGCATAACATTTACCCCTGTGCCTTTATAGATTCTCCTGAATTTAGATCAACTCAGATGCACAAAGGTGAAAAATTCCAGGTCACCATTATTGCAGATGATAACTGCAGATTTTTATGCTGGTCAAGAGAAAGATTAACATACTTTCTGGAATCAGAACCTTTCTTGTATGAAATCTTTAGGTATCTTATTGGAAAAGACATCACAAATAAGCTCTACTCATTGAATGATCCCACCTTAAATGATAAAAAAGCCAAAAAGCTGGAACATCAGCTCAGCCTCTGCACACAGATCTCCATGTTGGAAATGAGGAACAGTATAGCCAGCTCCAGTGACAGTGACGACGGCTTGCACCAGTTTCTTCGGGGTACCTCCAGCATGTCCTCTCTTCATGTGTCATCCCCACACCAGCGAGCCTCTGCCAAGATGAAACCGATAGAAGAAGGAGCAGAAGATGATGATGACGTTTTTGAACCGGCATCTCCAAATACATTGAAAGTCCATCAGCTGCCTTGA(SEQIDNO：1，1083nt)

本发明的发生c.602C>T突变的POPDC1突变体的cDNA序列如下所示，突变位点加框示出：

ATGAATTATACAGAGTCCAGCCCATTGAGAGAATCAACTGCCATAGGTTTTACACCTGAGTTAGAAAGTATCATACCTGTGCCTTCCAATAAGACCACTTGTGAAAACTGGAGAGAGATACATCATCTGGTTTTTCATGTAGCAAATATTTGTTTTGCAGTTGGGTTGGTTATTCCAACTACTCTTCACCTTCATATGATATTTCTTAGGGGAATGTTAACTCTAGGATGTACCCTTTATATCGTCTGGGCCACTCTCTACCGATGTGCCTTGGATATAATGATCTGGAACTCTGTGTTCTTGGGTGTCAACATTTTGCATCTGTCGTATCTTTTATACAAGAAGAGACCGGTAAAGATTGAAAAGGAACTCAGTGGCATGTACCGGCGATTGTTTGAACCACTCCGTGTGCCTCCAGATTTGTTCAGAAGACTAACTGGACAGTTTTGCATGATCCAAACCTTGAAAAAGGGCCAAACTTATGCTGCAGAGGATAAAACCTCAGTTGATGACCGTCTGAGTATTCTCTTGAAGGGAAAAATGAAGGTCTCCTATCGAGGACATTTTCTGCATAACATTTACCCCTGTGCCTTTATAGATTTCCTGAATTTAGATCAACTCAGATGCACAAAGGTGAAAAATTCCAGGTCACCATTATTGCAGATGATAACTGCAGATTTTTATGCTGGTCAAGAGAAAGATTAACATACTTTCTGGAATCAGAACCTTTCTTGTATGAAATCTTTAGGTATCTTATTGGAAAAGACATCACAAATAAGCTCTACTCATTGAATGATCCCACCTTAAATGATAAAAAAGCCAAAAAGCTGGAACATCAGCTCAGCCTCTGCACACAGATCTCCATGTTGGAAATGAGGAACAGTATAGCCAGCTCCAGTGACAGTGACGACGGCTTGCACCAGTTTCTTCGGGGTACCTCCAGCATGTCCTCTCTTCATGTGTCATCCCCACACCAGCGAGCCTCTGCCAAGATGAAACCGATAGAAGAAGGAGCAGAAGATGATGATGACGTTTTTGAACCGGCATCTCCAAATACATTGAAAGTCCATCAGCTGCCTTGA(SEQIDNO：2，1083nt)

发生c.515G>A变异的POPDC1的cDNA序列如下，其中突变碱基加框示出：

ATGAATTATACAGAGTCCAGCCCATTGAGAGAATCAACTGCCATAGGTTTTACACCTGAGTTAGAAAGTATCATACCTGTGCCTTCCAATAAGACCACTTGTGAAAACTGGAGAGAGATACATCATCTGGTTTTTCATGTAGCAAATATTTGTTTTGCAGTTGGGTTGGTTATTCCAACTACTCTTCACCTTCATATGATATTTCTTAGGGGAATGTTAACTCTAGGATGTACCCTTTATATCGTCTGGGCCACTCTCTACCGATGTGCCTTGGATATAATGATCTGGAACTCTGTGTTCTTGGGTGTCAACATTTTGCATCTGTCGTATCTTTTATACAAGAAGAGACCGGTAAAGATTGAAAAGGAACTCAGTGGCATGTACCGGCGATTGTTTGAACCACTCCGTGTGCCTCCAGATTTGTTCAGAAGACTAACTGGACAGTTTTGCATGATCCAAACCTTGAAAAAGGGCCAAACTTATGCTGCAGAGGATAAAACCTCAGTTGATGACCTCTGAGTATTCTCTTGAAGGGAAAAATGAAGGTCTCCTATCGAGGACATTTTCTGCATAACATTTACCCCTGTGCCTTTATAGATTCTCCTGAATTTAGATCAACTCAGATGCACAAAGGTGAAAAATTCCAGGTCACCATTATTGCAGATGATAACTGCAGATTTTTATGCTGGTCAAGAGAAAGATTAACATACTTTCTGGAATCAGAACCTTTCTTGTATGAAATCTTTAGGTATCTTATTGGAAAAGACATCACAAATAAGCTCTACTCATTGAATGATCCCACCTTAAATGATAAAAAAGCCAAAAAGCTGGAACATCAGCTCAGCCTCTGCACACAGATCTCCATGTTGGAAATGAGGAACAGTATAGCCAGCTCCAGTGACAGTGACGACGGCTTGCACCAGTTTCTTCGGGGTACCTCCAGCATGTCCTCTCTTCATGTGTCATCCCCACACCAGCGAGCCTCTGCCAAGATGAAACCGATAGAAGAAGGAGCAGAAGATGATGATGACGTTTTTGAACCGGCATCTCCAAATACATTGAAAGTCCATCAGCTGCCTTGA

(SEQIDNO:3，1083nt)

发生c.385C>T变异的POPDC1的cDNA序列如下，其中突变碱基加框示出

ATGAATTATACAGAGTCCAGCCCATTGAGAGAATCAACTGCCATAGGTTTTACACCTGAGTTAGAAAGTATCATACCTGTGCCTTCCAATAAGACCACTTGTGAAAACTGGAGAGAGATACATCATCTGGTTTTTCATGTAGCAAATATTTGTTTTGCAGTTGGGTTGGTTATTCCAACTACTCTTCACCTTCATATGATATTTCTTAGGGGAATGTTAACTCTAGGATGTACCCTTTATATCGTCTGGGCCACTCTCTACCGATGTGCCTTGGATATAATGATCTGGAACTCTGTGTTCTTGGGTGTCAACATTTTGCATCTGTCGTATCTTTTATACAAGAAGAGACCGGTAAAGATTGAAAAGGAACTCAGTGGCATGTACGGCGATTGTTTGAACCACTCCGTGTGCCTCCAGATTTGTTCAGAAGACTAACTGGACAGTTTTGCATGATCCAAACCTTGAAAAAGGGCCAAACTTATGCTGCAGAGGATAAAACCTCAGTTGATGACCGTCTGAGTATTCTCTTGAAGGGAAAAATGAAGGTCTCCTATCGAGGACATTTTCTGCATAACATTTACCCCTGTGCCTTTATAGATTCTCCTGAATTTAGATCAACTCAGATGCACAAAGGTGAAAAATTCCAGGTCACCATTATTGCAGATGATAACTGCAGATTTTTATGCTGGTCAAGAGAAAGATTAACATACTTTCTGGAATCAGAACCTTTCTTGTATGAAATCTTTAGGTATCTTATTGGAAAAGACATCACAAATAAGCTCTACTCATTGAATGATCCCACCTTAAATGATAAAAAAGCCAAAAAGCTGGAACATCAGCTCAGCCTCTGCACACAGATCTCCATGTTGGAAATGAGGAACAGTATAGCCAGCTCCAGTGACAGTGACGACGGCTTGCACCAGTTTCTTCGGGGTACCTCCAGCATGTCCTCTCTTCATGTGTCATCCCCACACCAGCGAGCCTCTGCCAAGATGAAACCGATAGAAGAAGGAGCAGAAGATGATGATGACGTTTTTGAACCGGCATCTCCAAATACATTGAAAGTCCATCAGCTGCCTTGA(SEQIDNO:4，1083nt)

发生c.427A>G变异的POPDC1的cDNA序列如下，其中突变碱基加框示出

ATGAATTATACAGAGTCCAGCCCATTGAGAGAATCAACTGCCATAGGTTTTACACCTGAGTTAGAAAGTATCATACCTGTGCCTTCCAATAAGACCACTTGTGAAAACTGGAGAGAGATACATCATCTGGTTTTTCATGTAGCAAATATTTGTTTTGCAGTTGGGTTGGTTATTCCAACTACTCTTCACCTTCATATGATATTTCTTAGGGGAATGTTAACTCTAGGATGTACCCTTTATATCGTCTGGGCCACTCTCTACCGATGTGCCTTGGATATAATGATCTGGAACTCTGTGTTCTTGGGTGTCAACATTTTGCATCTGTCGTATCTTTTATACAAGAAGAGACCGGTAAAGATTGAAAAGGAACTCAGTGGCATGTACCGGCGATTGTTTGAACCACTCCGTGTGCCTCCAGATTTGTTCGAAGACTAACTGGACAGTTTTGCATGATCCAAACCTTGAAAAAGGGCCAAACTTATGCTGCAGAGGATAAAACCTCAGTTGATGACCGTCTGAGTATTCTCTTGAAGGGAAAAATGAAGGTCTCCTATCGAGGACATTTTCTGCATAACATTTACCCCTGTGCCTTTATAGATTCTCCTGAATTTAGATCAACTCAGATGCACAAAGGTGAAAAATTCCAGGTCACCATTATTGCAGATGATAACTGCAGATTTTTATGCTGGTCAAGAGAAAGATTAACATACTTTCTGGAATCAGAACCTTTCTTGTATGAAATCTTTAGGTATCTTATTGGAAAAGACATCACAAATAAGCTCTACTCATTGAATGATCCCACCTTAAATGATAAAAAAGCCAAAAAGCTGGAACATCAGCTCAGCCTCTGCACACAGATCTCCATGTTGGAAATGAGGAACAGTATAGCCAGCTCCAGTGACAGTGACGACGGCTTGCACCAGTTTCTTCGGGGTACCTCCAGCATGTCCTCTCTTCATGTGTCATCCCCACACCAGCGAGCCTCTGCCAAGATGAAACCGATAGAAGAAGGAGCAGAAGATGATGATGACGTTTTTGAACCGGCATCTCCAAATACATTGAAAGTCCATCAGCTGCCTTGA(SEQIDNO:5，1083nt)

发明人惊奇的发现，该突变体与肢带型肌营养不良症的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患肢带型肌营养不良症，根据本发明的实施例，该突变体的核酸进一步丰富了POPDC1基因的致病突变图谱，并且更深入地阐明了肢带型肌营养不良症的分子发病机制，为肢带型肌营养不良症的早期致病基因筛查和干预治疗提供科学依据。

根据本发明的第二方面，本发明还提供了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQIDNO：4相比，所述分离的多肽具有p.S201F突变、p.R172H突变、p.R129W突变和p.R143G突变的至少之一。具体地，致病基因POPDC1上c.602C>T三碱基缺失，引起多肽p.S201F突变，而c.515G>A突变，导致p.R172H突变，c.385C>T突变，导致p.R129W突变，c.427A>G突变，导致p.R143G突变。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患肢带型肌营养不良症。

根据本发明的一些具体示例，所述多肽由权利要求1所述的核酸编码。其中，野生型的POPDC1的cDNA编码的多肽的氨基酸序列如下：

MNYTESSPLRESTAIGFTPELESIIPVPSNKTTCENWREIHHLVFHVANICFAVGLVIPTTLHLHMIFLRGMLTLGCTLYIVWATLYRCALDIMIWNSVFLGVNILHLSYLLYKKRPVKIEKELSGMYRRLFEPLRVPPDLFRRLTGQFCMIQTLKKGQTYAAEDKTSVDDRLSILLKGKMKVSYRGHFLHNIYPCAFIDSPEFRSTQMHKGEKFQVTIIADDNCRFLCWSRERLTYFLESEPFLYEIFRYLIGKDITNKLYSLNDPTLNDKKAKKLEHQLSLCTQISMLEMRNSIASSSDSDDGLHQFLRGTSSMSSLHVSSPHQRASAKMKPIEEGAEDDDDVFEPASPNTLKVHQLP(SEQIDNO：6，360个氨基酸)

发生c.602C>T突变的POPDC1突变体的氨基酸序列如下：

MNYTESSPLRESTAIGFTPELESIIPVPSNKTTCENWREIHHLVFHVANICFAVGLVIPTTLHLHMIFLRGMLTLGCTLYIVWATLYRCALDIMIWNSVFLGVNILHLSYLLYKKRPVKIEKELSGMYRRLFEPLRVPPDLFRRLTGQFCMIQTLKKGQTYAAEDKTSVDDRLSILLKGKMKVSYRGHFLHNIYPCAFIDPEFRSTQMHKGEKFQVTIIADDNCRFLCWSRERLTYFLESEPFLYEIFRYLIGKDITNKLYSLNDPTLNDKKAKKLEHQLSLCTQISMLEMRNSIASSSDSDDGLHQFLRGTSSMSSLHVSSPHQRASAKMKPIEEGAEDDDDVFEPASPNTLKVHQLP(SEQIDNO:15，360个氨基酸)

发生c.515G>A突变的POPDC1突变体的氨基酸序列如下，其中突变氨基酸加框示出：

MNYTESSPLRESTAIGFTPELESIIPVPSNKTTCENWREIHHLVFHVANICFAVGLVIPTTLHLHMIFLRGMLTLGCTLYIVWATLYRCALDIMIWNSVFLGVNILHLSYLLYKKRPVKIEKELSGMYRRLFEPLRVPPDLFRRLTGQFCMIQTLKKGQTYAAEDKTSVDDLSILLKGKMKVSYRGHFLHNIYPCAFIDSPEFRSTQMHKGEKFQVTIIADDNCRFLCWSRERLTYFLESEPFLYEIFRYLIGKDITNKLYSLNDPTLNDKKAKKLEHQLSLCTQISMLEMRNSIASSSDSDDGLHQFLRGTSSMSSLHVSSPHQRASAKMKPIEEGAEDDDDVFEPASPNTLKVHQLP(SEQIDNO:16，360个氨基酸)

发生c.385C>T突变的POPDC1突变体的氨基酸序列如下，其中突变氨基酸加框示出：

MNYTESSPLRESTAIGFTPELESIIPVPSNKTTCENWREIHHLVFHVANICFAVGLVIPTTLHLHMIFLRGMLTLGCTLYIVWATLYRCALDIMIWNSVFLGVNILHLSYLLYKKRPVKIEKELSGMYRLFEPLRVPPDLFRRLTGQFCMIQTLKKGQTYAAEDKTSVDDRLSILLKGKMKVSYRGHFLHNIYPCAFIDSPEFRSTQMHKGEKFQVTIIADDNCRFLCWSRERLTYFLESEPFLYEIFRYLIGKDITNKLYSLNDPTLNDKKAKKLEHQLSLCTQISMLEMRNSIASSSDSDDGLHQFLRGTSSMSSLHVSSPHQRASAKMKPIEEGAEDDDDVFEPASPNTLKVHQLP(SEQIDNO:17，360个氨基酸)

发生c.427A>G突变的POPDC1突变体的氨基酸序列如下，其中突变氨基酸加框示出：MNYTESSPLRESTAIGFTPELESIIPVPSNKTTCENWREIHHLVFHVANICFAVGLVIPTTLHLHMIFLRGMLTLGCTLYIVWATLYRCALDIMIWNSVFLGVNILHLSYLLYKKRPVKIEKELSGMYWRLFEPLRVPPDLFRLTGQFCMIQTLKKGQTYAAEDKTSVDDRLSILLKGKMKVSYRGHFLHNIYPCAFIDSPEFRSTQMHKGEKFQVTIIADDNCRFLCWSRERLTYFLESEPFLYEIFRYLIGKDITNKLYSLNDPTLNDKKAKKLEHQLSLCTQISMLEMRNSIASSSDSDDGLHQFLRGTSSMSSLHVSSPHQRASAKMKPIEEGAEDDDDVFEPASPNTLKVHQLP(SEQIDNO:18，360个氨基酸)

通过比对发现，与SEQIDNO：1相比，发生c.602C>T突变的POPDC1突变体的cDNA具有c.602C>T突变，进而，其编码产物与野生型的POPDC1多肽的氨基酸序列相比，具有p.S201F突变，即Ser突变为Phe；与SEQIDNO：1相比，发生c.515G>A突变的POPDC1突变体的cDNA具有c.515G>A突变，进而，其编码产物与野生型的POPDC1多肽的氨基酸序列相比，具有p.R172H突变，即Arg突变为His；与SEQIDNO：1相比，发生c.385C>T突变的POPDC1突变体的cDNA具有c.385C>T突变，进而，其编码产物与野生型的POPDC1多肽的氨基酸序列相比，具有p.R129W突变，即Arg突变为Trp；与SEQIDNO：1相比，发生c.427A>G突变的POPDC1突变体的cDNA具有c.427A>G突变，进而，其编码产物与野生型的POPDC1多肽的氨基酸序列相比，具有p.R143G突变，即Arg突变为Gly。综上，上述两种突变均可引起肢带型肌营养不良症。

此外，需要说明的是，本发明的检测突变POPDC1基因或蛋白的方法也可以用于非诊断疾病的目的。所述的非检测疾病的目的包括但不限于研究SNP分布和多态性，用于家族演化研究。本发明可以对肢带型肌营养不良症的发病机理提供重要线索，对肢带型肌营养不良症的诊断治疗具有十分重要的意义。这样的应用也是本领域技术人员可以理解的。

需要指出的是，有些个体携带本发明所述的POPDC1基因突变体中p.S201F突变，但不患肢带型肌营养不良症，例如仅一条染色体携带突变的杂合基因型。对这部分人群的检测可以任何不涉及诊断疾病的目的，因为这些个体并不患病。但对于他们进行检测的结果可以作为例如有用信息使用，例如作为育前检查的重要指标，指导生育，或者用于突变携带者筛查，或者作为SNP分布和多态性研究的工具或者追踪基因突变或家族演化。

筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品的系统和试剂盒

根据本发明的第三方面，本发明提供了一种筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品的系统。参照图1A，该系统包括：

核酸提取装置100，所述核酸提取装置100用于提取所述生物样品中的核酸样本。根据本发明的一些具体示例，所述核酸提取装置100进一步包括：RNA提取单元101，所述RNA提取单元101用于从生物样品中提取RNA样本；以及逆转录单元102，所述逆转录单元102与所述RNA提取单元101相连，用于对所述RNA样本进行逆转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。

核酸序列确定装置200，所述核酸序列确定装置200与所述核酸提取装置100相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列。根据发明的具体示例，所述核酸序列确定装置进一步包括：文库构建单元201，所述文库构建单元201用于针对所述核酸样本，构建所述核酸的文库；以及测序单元202，所述测序单元202与所述文库构建单元201相连，通过对所述文库进行测序，以便确定所述核酸的序列。其中，所述文库构建单元201进一步包括：PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有POPDC1基因外显子特异性引物，以便利用所述特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增。根据本发明的实施例，所述特异性引物至少包括以下引物对之一：第一引物对，具有SEQIDNO：7和8所示的核苷酸序列，用于扩增c.602C>T突变位点；第二引物对，具有SEQIDNO：9和10所示的核苷酸序列，用于扩增c.515G>A突变位点，第三引物对，具有SEQIDNO：11和12所示的核苷酸序列，用于扩增c.385C>T突变位点，第四引物对，具有SEQIDNO：13和14所示的核苷酸序列，用于扩增c.427A>G突变位点。根据本发明的一些具体示例，所述测序单元包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。

判断装置300，所述判断装置300与所述核酸序列确定装置200相连，以便基于将所述核酸的序列与SEQIDNO：1相比，是否具有c.602C>T突变和c.515G>A突变之一，判断所述生物样品是否易患肢带型肌营养不良症。

其中，需要说明的是，本发明中所使用的表达方式“易患肢带型肌营养不良症的生物样品”，即包含患有肢带型肌营养不良症的生物样品，也包括肢带型肌营养不良症突变基因携带者的生物样品。

发明人惊奇地发现，利用该系统可以对肢带型肌营养不良症进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种用于筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测POPDC1基因突变体的试剂，其中与SEQIDNO：1相比，所述POPDC1基因突变体具有具有c.602C>T突变和c.515G>A突变的至少之一。

在发明中，所使用的术语“适于检测POPDC1基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测POPDC1编码基因的试剂，也可以是检测POPDC1突变体多肽的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。根据本发明的一些具体示例，所述试剂为核酸探针或引物。由此，能够特异性的检测POPDC1基因。优选地，所述核酸探针或者引物包括以下至少之一：第一核酸探针或者引物对，具有SEQIDNO：7和8所示的核苷酸序列，用于扩增c.602C>T突变位点；第二核酸探针或者引物对，具有SEQIDNO：9和10所示的核苷酸序列，用于扩增c.515G>A突变位点，第三核酸探针或者引物对，具有SEQIDNO：11和12所示的核苷酸序列，用于扩增c.385C>T突变位点，第四核酸探针或者引物对，具有SEQIDNO：13和14所示的核苷酸序列，用于扩增c.427A>G突变位点。由此，对POPDC1基因检测的特异性好，准确性高。

由此，利用该试剂盒，可以对POPDC1基因突变体进行高精度的检测，从而对肢带型肌营养不良症进行基因层面的检测，有助于更准确的筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品。

构建体和重组细胞

根据本发明的第五方面，本发明提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含前述的分离的编码POPDC1突变体的核酸。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用于筛选治疗肢带型肌营养不良症的药物。

在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

根据本发明的第六方面，本发明还提供了一种重组细胞，根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过表达前述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的一些实施例，利用本发明的重组细胞，能够有效地筛选治疗肢带型肌营养不良症的药物。

构建药物筛选模型的方法

根据本发明的第七方面，本发明还提供了一种构建药物筛选模型的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使动物的至少一部分细胞表达前述的多肽。根据本发明的实施例，所述动物为小鼠、猪、狗、灵长类动物。根据本发明的一些实施例，利用本发明的动物模型，能够有效地筛选治疗肢带型肌营养不良症的药物。

其中，需要说明的是，本发明构建药物筛选模型的方法不受特别的限制，只要使动物的至少一部分细胞表达前述的多肽即可。例如，采用分子生物学技术，对受体细胞产生精确的目标基因定点突变，获得患有肢带型肌营养不良症的动物，该动物可以作为模型用于筛选治疗该疾病的药物。例如，可以通过无标记转基因技术，定点整合技术，基因组编辑技术等方法实现目标基因的定点突变，获得本发明的编码POPDC1突变体的基因，进而构建POPDC1突变体基因的重组载体，将该重组载体通过一定的方式(常用电穿孔法)导入同源的胚胎干细胞中，使突变的外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而POPDC1突变体基因在细胞中得以表达。再将重组细胞植入假孕母体，使其发育成嵌合体动物。利用嵌合体之间的交配，产生纯合体动物，嵌合体动物和纯化体动物均可用于药物筛选模型，从而有效地筛选治疗肢带型肌营养不良症的药物。

本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明发现了LGMD相关基因的4个新的突变位点，对该基因位点的检测可以用于LGMD患者的辅助诊断，并且可进一步应用于LGMD患者的分子诊断。因此，本发明的检测突变POPDC1基因或蛋白的方法可以可用于早期筛查肢带型肌营养不良症致病突变携带者，进而在携带者发病之前进行早期干预治疗。该技术具有快速、准确、高效、简便、早期诊断率高等优点。

(2)本发明可以对LGMD的发病机理提供重要线索，对LGMD的诊断治疗具有十分重要的意义。

(3)本发明发现的POPDC1基因可以作为SNP分布和多态性研究的工具或者追踪基因突变或家族演化。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

实施例1

确定肢带型肌营养不良症突变基因的方法，具体如下：

1、样本采集

本实施例收集了不同地区的4个家系的样本，每个家系中均有肢带型肌营养不良症患者。其中，家系中的患者信息如下：

一号家系，家系图如图2A所示，该家系是意大利南部卡拉布里亚地区的一个家系，该家系表现为伪显性遗传，该家庭源于一个有大概3000人口的阿尔巴尼亚飞地的小镇上。祖父为患者，他有2个表型正常的兄弟和7姐妹；其中一个的姐妹的两个外孙有类似的症状，其父母双方均认定并非近亲结婚。其中，患者的具体情况如下

Ⅰ1患者，祖父患有类似Emery-Dreifuss肌营养不良症的肢带型肌营养不良症，同时伴有房室传导阻滞，现年80岁。他40岁时，开始出现一些下肢带虚弱；60岁时，丧失独立行走的能力，检测发现血液肌酸激酶(CK)浓度升高(750-1300IU/L)，左三角肌活检发现有肌肉萎缩症病变，如直径变化、中央核增加，纤维极少坏死更新；用免疫组化法检测肌营养不良蛋白、肌糖、伊默菌素、分区蛋白、小窝蛋白3，结果显示为正常；69岁时，开始出现经常性昏厥，并发现有第二度房室传导阻滞；70岁时，检测发现CK浓度在600U/L，安装了心脏起搏器，超声心动图结果排除了患有心肌症的可能；72岁时，肌力测试显示：颈部屈肌MRC评分为5，腰大肌MRC评分右侧为3.5、左侧为4，四头肌MRC评分为2，臀肌MRC评分为1，腓肠肌MRC评分为5，足背屈肌MRC评分为5。

Ⅲ2患者，患有轻度心肌症，并伴有严重房室传导阻滞，12岁时安装了心脏起搏器，无肌肉病变征兆，但CK浓度在3000UI/L。在12岁时出现昏厥以及颌面创伤，当时经过长时间运动后CK浓度达7643IU/L，休息时为3183IU/L；住院治疗期间，心电图记录到了二度房室传导阻滞(Mobitz1)的初次发作和经常性发作。平视式倾斜测试显示窦性心动过缓和交界性逸搏性心律，无昏厥或昏厥发生前症状。超声波心动图结果正常，排除了心肌病的可能。心内心电图记录到了正常的HV间期(30s)，在心房起搏周小于600ms时，结下AV传导阻滞提前。从那以后，Pt2植入了VVI心内膜起搏器。肌肉活检结果正常，最近一次肌力测试是在19岁的时候，排除骨骼肌的参与。目前，这名患者正在接受定期检查，没有再发生昏厥或其他症状了。

Ⅲ1患者，患有轻度心肌症，并伴有严重房室传导阻滞，17岁时安装了心脏起搏器，无肌肉病变征兆，但CK浓度在3000UI/L。在17岁时出现昏厥，CK浓度上升到1216IU/L。当时的心电图显示在希式束下部有二度房室传导阻滞，心室内传导无异常；超声心动图结果正常。肌力测试正常，最近一次肌力测试是在25岁，结果正常。

二号家系，家系图如图2B所示，起源于德国，患者Ⅱ2参与该研究时有80岁，二战后期作为难民进入德国鲁尔区，未表现出明显的肌肉或神经系统疾病的迹象。

三号家系，家系图如图2C所示，来自中国，患者Ⅱ1父母表型正常，妊娠及分娩过程均正常。在约1岁时该患者表现出进食及呼吸困难，几天后患者出现长期晕厥，心电图和超声心动图显示心房扑动伴有完全的房室传导阻滞及严重的左心室扩张，随后展开抗充血性药物治疗及植入心外膜双腔起搏器。进一步检查排除代谢性疾病。一个月后患者出院，随访期间，左心功能不全得到改善，心脏节律由起搏器及药物控制。患者现在5岁，为表现出肌肉疾病症状。

四号家系，家系图如图2D所述，来自意大利，患者Ⅱ2，68岁，30岁时表现出步态困难及小腿肥大，57岁时患者表现出不行及上楼梯困难。住院后诊断显示双上肢及下肢腰带的近端肌肉无力，肌肉活检显示核集中及典型的营养不良现象。患者血清肌酸激酶正常，肌电图呈弥漫性疾病模式，感觉诱发电位正常。问及家族史时，患者提到其母亲(70岁时由于心脏节律紊乱死亡)曾有心脏病发生史。

样本来源如下：

	时间	地点	取样人
				直接来源	2013年3月	中国深圳华大基因研究院	方明艳
原始来源	2013年3月	Harefield心脏研究中心	Alessandra Ferlini

上述患者均具有LGMD特征。由于目前LGMD的发病机理和遗传方式尚不清楚，发明人利用NimbleGen序列捕获技术(SeqCapEZlibrary)结合HiSeq2000(Illumina,SanDiego,CA)高通量测序技术，以一号家庭为例，对一号家系中的患者Ⅲ1和Ⅲ2及其父母Ⅱ5、Ⅱ6(两个患病的兄弟和他们的表型正常的父母)进行了全外显子测序。

2、样品制备

采集的上述家系患者及正常人的样本(2个患者样本，即Ⅲ1和Ⅲ2，以及2个正常样本，即Ⅱ5和Ⅱ6)的外周血，根据世界医学会《赫尔辛基宣言》的要求，研究中所有患者及正常人均与BGI合作机构意大利分子神经遗传学研究所伦理委员会签署了知情同意书。利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个样本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/μl，总量不少于30μg。所有血样均签属知情同意书，并获得伦理委员会批准。

3、芯片设计、文库构建和高通量测序

用NimbleGen44Mkit(SeqCapEZHumanExomeLibraryv2.0)结合IlluminaHiSeq2000高通量测序技术对上述5个患者及两个正常人的外显子组序列进行了测序，具体如下：

1)利用捕获芯片NimbleGen44Mkit(SeqCapEZHumanExomeLibraryv2.0)对基因组的外显子、剪接位点和邻近的内含子序列进行捕获。

2)将基因组DNA随机打断成100-200bp左右的片段，随后在片段两端分别连接上接头，制备测序文库(参见http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书)。

3)文库经纯化后经过ligation-mediatedPCR(LM-PCR)的线性扩增与customcapturearray进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增后进行上机测序。测序平台为IlluminaHiseq2000，读取长度为90bp，双端测序。

3、变异检测、注释及与数据库比较

1)测序后获得的原始数据由IlluminabasecallingSoftware1.7进行处理。然后过滤低质量读段和包含接头污染读段。使用SOAPaligner/SOAP2(可参见：LiR,LiY,KristiansenK,etal,SOAP:shortoligonucleotidealignmentprogram.Bioinformatics2008,24(5):713-714；LiR,YuC,LiY,etal.,SOAP2:animprovedultrafasttoolforshortreadalignment.Bioinformatics2009,25(15):1966-1967.，通过参照将其全文并入本文)比对到参考基因组Hg19(snp132)，以便获得比对到基因组上的唯一比对序列。然后利用SOAPsnp(可参见：LiR,LiY,FangX,YangH,etal,SNPdetectionformassivelyparallelwhole-genomeresequencing.GenomeRes2009,19(6):1124-1132.，通过参照将其全文并入本文)确定靶区域的基因型。

2)对于检出的SNP和indel变异，本实施例中采用BWA(version0.7.5)(可参见LiH,DurbinR.Fastandaccuratelong-readalignmentwithBurrows-Wheelertransform.Bioinformatics2010；26(5):589-595)和GATK(version2.8-1)(可参见DePristoMA,BanksE,PoplinR,etal.Aframeworkforvariationdiscoveryandgenotypingusingnext-generationDNAsequencingdata.NatGenet2011；43:491-8.，通过参照将其全文并入本文)确定indel的类型。

同时，关注非同义突变，剪接受体/供体位点突变和编码区插入和缺失突变这三类最有可能与疾病相关的突变。将检出的变异和dbSNP135数据库、千人基因组数据库和HapMap数据库，YH数据库等公共数据库)等公共数据库和CAG数据库进行了比较，保留了低频的变异(MAF≤0.005)。

3)在一号家系中，该疾病为隐性遗传模式，且双亲来自同一个非常小的城镇，可能存在类似近亲结婚的情况，故优先考虑纯和突变位点。去掉同义突变，将剩下的非同义/剪接位点突变和微小插入缺失进行优先选择：最后剩下4个SNPs和1个Indel位点为可能的致病突变。然而，经过SIFT(http://sift.bii.a-star.edu.sg)、Pmut(http://mmb.pcb.ub.es/PMut)和Polyphen2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)软件进行突变位点危害性预测后发现，仅一个纯和错义突变POPDC1基因c.602C>T，p.S201F被预测为有害突变。

在二、三、四号家系中，发明人利用上述方法，又分别在三个家系的三个患者中发现了该基因上的另外三个杂合突变位点(c.515G>A,p.R172H；c.385C>T，p.R129W；c.427A>G，p.R143G)。

综上所述，发明人认为本实施例中的POPDC1基因的突变位点，极可能是LGMD(肢带型肌营养不良症)的致病变异位点。

实施例2

由于外显子组测序存在一定程度的假阳性，本实施例利用Sanger测序方法，对实施例1中的4个家系中发现的POPDC1基因的突变位点进行验证，具体方法如下：

利用实施例1中4个家系，采用Sanger法对肢带型肌营养不良症致病突变位点进行验证，包括针对POPDC1基因3号和4号外显子及其周围的序列设计引物，通过PCR扩增、产物纯化、测序的方法获得POPDC1基因有关序列，并根据序列测定结果属于突变型还是野生型，验证POPDC1与患者临床表型之间的相关性。具体步骤如下：

1、DNA提取

采集的一号家系两个患者兄弟及其父母和祖父、二号家庭的患者Ⅱ2、三号家庭的患者Ⅱ1以及四号家庭的患者Ⅱ2的外周静脉血，另采集无亲缘关系的107个患有肌营养不良症和/或心脏疾病患者的外周静脉血，根据世界医学会《赫尔辛基宣言》的要求，参与本研究的患者均与BGI合作机构意大利分子神经遗传学研究所伦理委员会签署了知情同意书。利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个样本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/μl，总量不少于6μg。

2、引物设计及PCR反应

参考人类基因组序列数据库GRCh37/hg19设计POPDC1基因外显子特异性引物，具体见下。

a)引物序列：

b)反应体系：25μL

c)反应条件：

94℃，5分钟，一个循环；94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，45秒，35个循环；72℃，5分钟，一个循环。

由此，获得患者和家系内正常人的PCR扩增产物。

3)将步骤2中获得PCR扩增产物纯化后用ABIPrism3130XL进行DNA测序。

Sanger测序的结果验证了S201F的SNP突变位点确定了其以杂合的形式存在于1号家系的两个表型正常的父母中，且以纯和的形式存在于1号家系的两个患者兄弟和其祖父体内。二、三、四号三个家系的三个患者中三个突变位点(c.515G>A,p.R172H；c.385C>T，p.R129W；c.427A>G，p.R143G)均为杂合突变，并且突变所在的区域为保守区域。

发明人认为POPDC1蛋白与心脏病变相关，并进行以下实验进行验证，对实验结果进行P检验，其ns表示无显著差异，*代表p<0.05,**代表p<0.01，***代表p<0.001。利用蛋白印迹法定量检测cAMP结合亲和力，结果如图3A所示，变异S201F表现出cAMP结合亲和力显著降低；采用293A细胞转染YFP-TREK-1与Popdc1-CFP(WT)或S201F-CFP(201F)，并检测采用异丙肾上腺素治疗后FRET信号的相对变化，结果如图3B所示，同样观察到了S201F突变体cAMP敏感性的降低。利用TREK-1单独或共表达的POPDC1-WT，以TREK-1/Popdc1比分别为5：1和1：5的检测相对电流振幅，结果如图3C所示，结果显示TREK-1外向电流升高(***：仅相对于TREK-1p<0.001)；在爪蟾卵母细胞中被单独注射TREK-1cRNA，以及TREK-1cRNA分别与POPDC1-WT、S201F、R172H、R129W和R143GcRNA的混合物后，48h的电压关系如图3D所示，由图中可看出突变S201F以及R127H引起的TREK-1外向电流升高比野生型与R143G、R129W突变一起的TREK-1外向电流升高要显著，相对的电流振幅如图3E所示(*:p<0.05,***:p<0.001)；当爪蟾卵母细胞在磷酸二酯酶抑制剂茶碱(phosphodiesteraseinhibitortheophylline)中培养48h后，在TREK-1电流振幅在0mV的条件下，分别在与POPDC1-WT、S201F、R172H、R129W和R143G的共表达后，检测共表达细胞的相对电位，结果如图3F所示，电位出现显著降低；转染到Cos-7细胞后的突变及POPDC1-WT正常蛋白的分布情况如图3G所示，结果显示突变蛋白与野生型无明显差别。上述结果表明，POPDC1基因与心脏病变相关，进而可能导致肢带型肌营养不良症，由此，POPDC1基因可能是LGMD的致病基因。POPDC1蛋白的Popeye结构域蛋白的基本结构如图4A所示，发明人对突变蛋白的结构进行预测，POPDC1蛋白的Popeye结构域二级结构如图4B所示，图4C所示为Popeye结构域的多序列比对，显示R172和S201位点的高保守性；图4D所示为Popeye结构域接线图，显示R172和S201位点所在位置；图4E所示为Popeye结构域结构模型示意图。通过对突变蛋白的上述结构模型的研究，发明人发现突变p.S201F、p.R172H、p.R129W和p.R143G均能影响保守的Popeye结构域的功能。Popeye结构域类似于一个cAMP结合结构域，并且与核苷酸结合后能引起构象变化，因此Popeye结构域可能是引发蛋白相互作用的一个功能结构域。在Popeye结构域的3D模型中，S201位于朝向cAMP分子的那部分核苷酸结合区域；而R172则在紧接着Popeye结构域，很接近cAMP结合口袋；R129和R143则位于Popeye结构域的N末端。通过cAMP亲和沉淀，发明人发现，突变体蛋白对cAMP的亲和力下降。可见突变体很可能通过影响Popeye结构域的cAMP亲和能力，改变了POPDC1蛋白的功能，从而引发疾病。

因此，综上所述，发明人认为本发明找到的POPDC1基因的4个突变位点，即c.602C>T、c.515G>A、c.385C>T和c.427A>G位点，极可能是LGMD(肢带型肌营养不良症)的致病变异位点。

实施例3

对实施例1中检测到二号、三号和四号家庭的突变基因检测结果进行基因相互作用分析，具体分析内容如下：

在对在二号家系的分析中，发明人利用临床外显子分析检测到LMNA基因的错义突变(c.1070A>C,p.D357A)以杂合的形式出现在患者Ⅱ2及其患病的姐妹和一个健康的儿子身上，而LMNA突变以及其另一个亚型在相似的案例中被发现与DCM(扩张型心肌病)相关。

在三号家系中，发明人利用临床外显子分析检测到4个杂合的错义突变在以下四个基因中：SDHA(R465Q),DSP(I1216V),andTTN(G33394DandS35939T)，共分离分析显示这些突变遗传自母亲Ⅰ2.在来自意大利的四号家系中，根据Polyphen软件预测SDHA的突变为有害突变，根据双基因遗传模型，预测POPDC1/SDHA双杂合在全部人口中出现的频率为0.0016，而在亚洲人中出现频率上升为0.076.但基因型的频率没有达到对于单基因病人群中基因型频率小于1/2000的要求，因此两个基因之间相互作用出现频率可能需要进一步更大量散发人群中的研究支撑。

在四号家系中，临床外显子测序的结果显示，四个杂合突变：位于MYH6上的Indel突变(c.5476_5477delinsAA)、TTN上的两个错义突变(D25814Y,V3925L)和一个缺失突变(c.44427_44429delGGT)都在患者中发现并且有极高的致病性，共分离分析的结果显示，TTN上的错义突变在其他家系成员中没有出现，而MYH6的缺失突变以杂合的形式出现在了患者的一个健康儿子Ⅲ2身上而另一个Ⅲ1没有。另外，已有MYH6(c.5476_5477delinsAA)对扩张型心肌病的致病性报道。因此，综上所述发现在该家系中只有当POPDC1和MYH6两个基因的突变同时存在并发生双基因遗传时，心脏的病例表型才会出现。

因此，该分析进一步证明了POPDC1基因的四个突变位点，即c.602C>T、c.515G>A、c.385C>T突变和c.427A>G位点突变，是LGMD(肢带型肌营养不良症)的致病变异位点。

实施例4

制备一检测试剂盒，其包含能够检测POPDC1基因的c.602C>T、c.515G>A、c.385C>T突变和c.427A>G突变的引物，用于筛选肢带型肌营养不良症的生物样品，其中这些引物为POPDC1基因外显子特异性引物，本实施例中采用实施例2的POPDC1基因外显子4和3的引物对。

利用上述试剂盒筛选肢带型肌营养不良症的生物样品的具体步骤为：按照实施例2的步骤1所述的方法提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述POPDC1基因的外显子特异性引物进行PCR反应，PCR反应的反应体系和反应条件如实施例2所示，并按照本领域常规方法对PCR产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后通过观察测序所得到的序列是否具有c.602C>T、c.515G>A、c.385C>T突变和c.427A>G突变之一，能够有效地检测本发明的POPDC1基因突变体在待测者DNA中是否存在，从而能够有效地检测待测者是否易患肢带型肌营养不良症，进一步，能够从待测者中筛选出肢带型肌营养不良症的生物样品。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种分离的编码POPDC1突变体的核酸，其特征在于，所述核酸与SEQIDNO：1相比，具有c.602C>T突变、c.515G>A突变、c.385C>T突变和c.427A>G突变的至少之一，

任选地，所述核酸为DNA。

2.一种分离的多肽，其特征在于，与SEQIDNO：4相比，所述分离的多肽具有p.S201F突变、p.R172H突变、p.R129W突变和p.R143G突变的至少之一，

任选地，所述多肽由权利要求1所述的核酸编码。

3.一种筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品的系统，其特征在于，包括：

核酸提取装置，所述核酸提取装置用于提取所述生物样品中的核酸样本；

核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；以及

判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于将所述核酸的序列与SEQIDNO：1相比，是否具有c.602C>T突变、c.515G>A突变、c.385C>T突变和c.427A>G之一，判断所述生物样品是否易患肢带型肌营养不良症。

4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述核酸提取装置进一步包括：

RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从生物样品中提取RNA样本；以及

逆转录单元，所述逆转录单元与所述RNA提取单元相连，用于对所述RNA样本进行逆转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。

5.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述核酸序列确定装置进一步包括：

文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建所述核酸的文库；以及

测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，通过对所述文库进行测序，以便确定所述核酸的序列。

6.根据权利要求5所述的系统，其特征在于，所述文库构建单元进一步包括：

PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有POPDC1基因外显子特异性引物，以便利用所述特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，

任选地，所述特异性引物至少包括以下引物对之一：

第一引物对，具有SEQIDNO：7和8所示的核苷酸序列，用于扩增c.602C>T突变位点；

第二引物对，具有SEQIDNO：9和10所示的核苷酸序列，用于扩增c.515G>A突变位点，

第三引物对，具有SEQIDNO：11和12所示的核苷酸序列，用于扩增c.385C>T突变位点，

第四引物对，具有SEQIDNO：13和14所示的核苷酸序列，用于扩增c.427A>G突变位点，

任选地，所述测序单元包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。

7.一种用于筛选易患肢带型肌营养不良症的生物样品的试剂盒，其特征在于，含有：

适于检测POPDC1基因突变体的试剂，其中与SEQIDNO：1相比，所述POPDC1基因突变体具有c.602C>T突变、c.515G>A突变、c.385C>T突变和c.427A>G突变的至少之一，

任选地，所述试剂为核酸探针或者引物，

任选地，所述核酸探针或者引物包括以下至少之一：

第一核酸探针或者引物对，具有SEQIDNO：7和8所示的核苷酸序列，用于扩增c.602C>T突变位点；

第二核酸探针或者引物对，具有SEQIDNO：9和10所示的核苷酸序列，用于扩增c.515G>A突变位点，

第三核酸探针或者引物对，具有SEQIDNO：11和12所示的核苷酸序列，用于扩增c.385C>T突变位点，

第四核酸探针或者引物对，具有SEQIDNO：13和14所示的核苷酸序列，用于扩增c.427A>G突变位点。

8.一种构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的分离的编码POPDC1突变体的核酸。

9.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过表达权利要求8所述的构建体转化受体细胞而获得的。

10.一种构建药物筛选模型的方法，其特征在于，包括：

使动物的至少一部分细胞表达权利要求1所述的核酸，

任选地，所述动物为小鼠、猪、狗、灵长类动物。