CN105813648A - 氯毒素缀合物及其使用方法 - Google Patents

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丹尼斯·M·米勒
娜塔莉·奈恩
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凯丽·伯恩斯-布莱克
S·J·汉森
J·E·诺瓦克
V·R·维斯
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Abstract

提供了包含氯毒素缀合化合物的组合物、配制品以及试剂盒，该氯毒素缀合化合物包括缀合至报道分子的天然氯毒素肽以及其修饰的变体，这些报道分子包括荧光染料。还提供了使用氯毒素缀合化合物检测以及治疗癌症与肿瘤的方法，这些方法包括用于对肿瘤组织以及细胞进行成像的方法。还提供了使用氯毒素缀合化合物用于治疗以及诊断应用的剂量给药与药物代谢动力学曲线。

Description

氯毒素缀合物及其使用方法
交叉引用
本申请要求2013年9月17日提交的美国临时申请号61/879,096、2014年5月7日提交的美国临时申请号61/990,101和2013年9月17日提交的美国临时申请号61/879,108的权益，出于所有的目的将它们通过引用以全文结合在此。
联邦资助研究的声明
本发明是受美国政府支持在合同号HHSN261201200054C下由国家癌症研究所(NationalCancerInstitute)、美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)、美国卫生及公众服务部(DepartmentofHealthandHumanServices)授予的做出的。
发明的背景
就许多类型的癌而言，手术切除的精确度直接影响患者预后。不幸的是，肿瘤边缘或癌细胞的小灶点的术中鉴别仍然不精确或依赖于外科判断。因此，手术切除的程度受到避免伤害重要结构的需要的限制。
尽管在用于对肿瘤进行靶向和成像的探针开发方面有进展，但是对允许癌组织的术中可视化的探针存在着需要。
发明概述
在不同方面中，本披露的化合物具有化学式(I)的结构，或其药学上可接受的盐：
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R15、以及R16各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6亚烷基-COOH、磺酸酯、-COOH、-SO2-NH2、C1-C6烷氧基、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-O-、或C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-NR10-；
R9是氢、磺酸酯、-COOH、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-O-、或C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-NR10-；
L1是C3-C6亚烷基；
L2是C1-C10亚烷基；
L3是键、-O-、-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-、-O-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-(O-C1-C6亚烷基)n-、-NR10-L4-、-NR10-C1-C6亚烷基-NR11-(C(＝O)-C1-C6亚烷基-O-)m-、或-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-；
L4是键、-杂环基-、或-杂环基-C1-C6亚烷基-；
R10是氢或C1-C6烷基；
R11是氢或C1-C6烷基；
R12和R13各自独立地选自氢、C1-C6烷基，或R12和R13连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R14是氢或C1-C6亚烷基、-(L5)-芳基、-(L5)-芳基-A5、-(L5)-杂芳基、-(L5)-杂芳基-A5、-NR17R18，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
L5是键、C1-C10亚烷基、-O-、或-NR10-；
R17和R18各自独立地是氢或芳基；
R19和R20各自独立地选自氢、C1-C6烷基，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
n是0、1、2或3；
m是0、1、2或3；
p是0、1、2或3；
q是0、1、2或3；
x是0或1；并且
A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段，并且A1、A2、A3、A4、或A5中其他项各自独立地不存在、是氢、-COOH、或磺酸酯。
在不同方面中，本文所述化合物进一步包括可检测标记物，该可检测标记物可用于检测肽-标记物缀合物以及与它们所结合的癌性细胞。
在不同方面中，本披露的化合物具有化学式(XV)的结构，或其药学上可接受的盐：
其中：
R3、R4、R5、R6、R15、以及R16各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6亚烷基-COOH、磺酸酯、-COOH、-SO2-NH2、C1-C6烷氧基、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-O-、或C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-NR10-；
R9是氢、磺酸酯、-COOH、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-O-、或C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-NR10-；
L1是C3-C6亚烷基；
L2是C1-C10亚烷基；
L3是键、-O-、-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-、-O-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-(O-C1-C6亚烷基)n-、-NR10-L4-、-NR10-C1-C6亚烷基-NR11-(C(＝O)-C1-C6亚烷基-O-)m-、或-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-；
L4是键、-杂环基-、或-杂环基-C1-C6亚烷基-；
R10是氢或C1-C6烷基；
R11是氢或C1-C6烷基；
R12和R13各自独立地选自氢、C1-C6烷基，或R12和R13连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R14是氢或C1-C6亚烷基、-(L5)-芳基、-(L5)-芳基-A5、-(L5)-杂芳基、-(L5)-杂芳基-A5、-NR17R18，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
L5是键、C1-C10亚烷基、-O-、或-NR10-；
R17和R18各自独立地是氢或芳基；
R19和R20各自独立地选自氢、C1-C6烷基，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R21和R22各自独立地选自氢、C1-C6烷基，磺酸酯，或R21和R22连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元芳基；
R23和R24各自独立地选自氢、C1-C6烷基，磺酸酯，或R23和R24连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元芳基；
n是0、1、2或3；
m是0、1、2或3；
p是0、1、2或3；
q是0、1、2或3；
x是0或1；并且
A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段，并且A1、A2、A3、A4、或A5中其他项各自独立地不存在、是氢、-COOH、或磺酸酯。
在一些方面中，本披露的化合物具有化学式(II)的结构，或其药学上可接受的盐：
在某些方面中，本披露的化合物具有化学式(III)的结构，或其药学上可接受的盐：
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R15、以及R16各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6亚烷基-COOH、磺酸酯、-COOH、-SO2-NH2、或C1-C6烷氧基；
R9是氢、磺酸酯、或-COOH；
L1是C3-C6亚烷基；
L2是C1-C10亚烷基；
L3是键、-O-、-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-、-O-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-(O-C1-C6亚烷基)n-、-NR10-L4-、-NR10-C1-C6亚烷基-NR11-(C(＝O)-C1-C6亚烷基-O-)m-、或-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-；
L4是键、-杂环基-、或-杂环基-C1-C6亚烷基-；
R10是氢或C1-C6烷基；
R11是氢或C1-C6烷基；
R12和R13独立地选自氢、C1-C6烷基，或R12和R13连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R14是氢或C1-C6亚烷基、-(L5)-芳基、-(L5)-杂芳基、-NR17R18，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
L5是键、C1-C10亚烷基、-O-、-NR10-；
R17和R18各自独立地是氢或芳基；
R19和R20独立地选自氢、C1-C6烷基，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
n是0、1、2或3；
m是0、1、2或3；
p是0、1、2或3；
q是0、1、2或3；并且
A4是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段。
在其他方面中，本披露的化合物具有化学式(IV)的结构，或其药学上可接受的盐：
其中：
R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8、R15、以及R16各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6亚烷基-COOH、磺酸酯、-COOH、-SO2-NH2、或C1-C6烷氧基；
R3选自C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-O-、或C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-NR10-；
R9是氢、磺酸酯、或-COOH、或C1-C10烷基；
L1是C3-C6亚烷基；
L2是C1-C10亚烷基；
L3是氢、磺酸酯、-COOH、C1-C10烷基；
L4是键、-杂环基-、或-杂环基-C1-C6亚烷基-；
R10是氢或C1-C6烷基；
R11是氢或C1-C6烷基；
R12和R13独立地选自氢、C1-C6烷基，或R12和R13连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R14是氢或C1-C6亚烷基、-(L5)-芳基、-(L5)-杂芳基、-NR17R18，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
L5是键、C1-C10亚烷基、-O-、-NR10-；
R17和R18各自独立地是氢或芳基；
R19和R20独立地选自氢、C1-C6烷基，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
n是0、1、2或3；
m是0、1、2或3；
p是0、1、2或3；
q是0、1、2或3；
x是0或1；并且
A1是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段。
在其他方面中，本披露的化合物具有化学式(V)的结构，或其药学上可接受的盐：
其中：
R1、R2、R3、R4、R6、R7、R8、R15、以及R16各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6亚烷基-COOH、磺酸酯、-COOH、-SO2-NH2、或C1-C6烷氧基；
R5选自C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-O-、或C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-NR10-；
R9是氢、磺酸酯、或-COOH、或C1-C10烷基；
L1是C3-C6亚烷基；
L2是C1-C10亚烷基；
L3是氢、磺酸酯、-COOH、或C1-C10烷基；
L4是键、-杂环基-、或-杂环基-C1-C6亚烷基-；
R10是氢或C1-C6烷基；
R11是氢或C1-C6烷基；
R12和R13独立地选自氢、C1-C6烷基，或R12和R13连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R14是氢或C1-C6亚烷基、-(L5)-芳基、-(L5)-杂芳基、-NR17R18，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
L5是键、C1-C10亚烷基、-O-、-NR10-；
R17和R18各自独立地是氢或芳基；
R19和R20独立地选自氢、C1-C6烷基，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
n是0、1、2或3；
m是0、1、2或3；
p是0、1、2或3；
q是0、1、2或3；
x是0或1；并且
A2是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段。
在一些方面中，本披露的化合物具有化学式(VI)的结构，或其药学上可接受的盐：
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R15、以及R16各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6亚烷基-COOH、磺酸酯、-COOH、-SO2-NH2、或C1-C6烷氧基；
R9选自C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-O-、或C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-NR10-；
L1是C3-C6亚烷基；
L2是C1-C10亚烷基；
L3是氢、磺酸酯、-COOH、或C1-C10烷基；
L4是键、-杂环基-、或-杂环基-C1-C6亚烷基-；
R10是氢或C1-C6烷基；
R11是氢或C1-C6烷基；
R12和R13独立地选自氢、C1-C6烷基，或R12和R13连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R14是氢或C1-C6亚烷基、-(L5)-芳基、-(L5)-杂芳基、-NR17R18，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R17和R18各自独立地是氢或芳基；
R19和R20独立地选自氢、C1-C6烷基，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
n是0、1、2或3；
m是0、1、2或3；
p是0、1、2或3；
q是0、1、2或3；
x是0或1；
L5是键、C1-C10亚烷基、-O-、-NR10-；
A3是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段。
在另外的方面中，本披露的化合物具有化学式(III)的结构，或其药学上可接受的盐：
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R15、以及R16各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6亚烷基-COOH、磺酸酯、-COOH、-SO2-NH2、或C1-C6烷氧基；
R9是氢、磺酸酯、或-COOH；
L1是C3-C6亚烷基；
L2是C1-C10亚烷基；
L3是键、-O-、-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-、-O-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-(O-C1-C6亚烷基)n-、-NR10-L4-、-NR10-C1-C6亚烷基-NR11-(C(＝O)-C1-C6亚烷基-O-)m-、或-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-；
L4是键、-杂环基-、或-杂环基-C1-C6亚烷基-；
R10是氢或C1-C6烷基；
R11是氢或C1-C6烷基；
R12和R13独立地选自氢、C1-C6烷基，或R12和R13连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R14是-(L5)-芳基-A5、或-(L5)-杂芳基-A5；
L5是键、C1-C10亚烷基、-O-、-NR10-；
R17和R18各自独立地是氢或芳基；
R19和R20独立地选自氢、C1-C6烷基，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
n是0、1、2或3；
m是0、1、2或3；
p是0、1、2或3；
q是0、1、2或3；
x是0或1；
A4是氢、-COOH、或磺酸酯；以及
A5是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段。
在不同方面中，本披露提供了包括容器的试剂盒，该容器被构造成包含液体；在此描述的化合物以及组合物中的任一种；以及附着于该容器的弹性封堵物。
在不同方面中，本披露提供了包括化合物的组合物，该化合物包括与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段，其中当将该组合物按从1mg至30mg的剂量经静脉内给予人类受试者时，该组合物在该人类受试者中产生至少110ng/mL至240ng/mL平均最大化合物血浆浓度(平均C最大)/1mg剂量给予的化合物。
在不同方面中，本披露提供了向人类受试者给予组合物的方法，该方法包括：经静脉内给予该人类受试者1mg至30mg剂量的化合物，该化合物包括与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段；并且在该人类受试者中产生至少110ng/mL至240ng/mL平均最大化合物血浆浓度(平均C最大)/1mg剂量给予的化合物。
在不同方面中，本披露提供了检测人类受试者中癌细胞的方法，该方法包括：经静脉内给予该人类受试者1mg至30mg剂量的化合物，该化合物包括缀合至可检测标记物的、与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段；在该人类受试者中产生至少110ng/mL至240ng/mL平均最大化合物血浆浓度(平均C最大)/1mg剂量给予的化合物；并且检测该可检测标记物在该人类受试者中存在或不存在，其中该可检测标记物的存在表明癌细胞的存在。
在不同方面中，本披露提供了诊断人类受试者中癌症的方法，该方法包括：经静脉内给予该人类受试者1mg至30mg剂量的化合物，该化合物包括缀合至可检测标记物的、与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段；在该人类受试者中产生至少110ng/mL至240ng/mL平均最大化合物血浆浓度(平均C最大)/1mg剂量给予的化合物；并且检测该可检测标记物在该人类受试者中存在或不存在，其中该可检测标记物的存在表明癌症的诊断。
在不同方面中，本披露提供了治疗人类受试者中癌症的方法，该方法包括：经静脉内给予该人类受试者1mg至30mg剂量的化合物，该化合物包括缀合至治疗剂的、与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段；在该人类受试者中产生至少110ng/mL至240ng/mL平均最大化合物血浆浓度(平均C最大)/1mg剂量给予的化合物；并且减少或改善该人类受试者中与癌症相关的症状或病症。在一些方面中，该人类受试者对其有需要。在一些方面中，该方法包括向该人类受试者给予治疗有效剂量的化合物。
在不同方面中，本披露提供了向人类受试者给予组合物的方法，该方法包括：给予该人类受试者1mg至30mg剂量的化合物，该化合物包括与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段；并且在该人类受试者中产生图27的药物代谢动力学曲线。
在不同方面中，本披露提供了向人类受试者给予组合物的方法，该方法包括：经静脉内给予该人类受试者1mg至30mg剂量的本披露的任何适合化合物；并且在该人类受试者中产生至少110ng/mL至240ng/mL平均最大化合物血浆浓度(平均C最大)/1mg剂量给予的化合物。
在不同方面中，本披露提供了用于检测受试者中癌细胞的方法，该方法包括：给予本披露的任何适合化合物；并且检测该化合物在该受试者中的存在或不存在，其中该化合物的存在表明癌细胞的存在。
在不同方面中，本披露提供了向受试者给予本披露的任何适合化合物的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的该化合物。
在不同方面中，本披露提供了治疗对其有需要的受试者的方法，该方法包括向该受试者给予本披露的任何适合化合物，该化合物进一步包含治疗剂，该治疗剂的量足以治疗该受试者的癌症。在某些方面，该治疗剂是细胞毒性剂。
在一个实施例中，该氯毒素缀合物包括化学治疗剂、抗癌剂、或抗癌药。在另一个实施例中，在手术过程中检测到中央或原发性肿瘤之后，给予包括化学治疗剂、抗癌剂、或抗癌药的该氯毒素缀合物。在另外的实施例中，用缀合至标记试剂的氯毒素检测该中央或原发性肿瘤。
在另一个方面中，提供了抑制、预防、最少化、缩减、或杀死细胞、或预防个体瘤床中残留肿瘤细胞转移的方法，该方法包括向该个体给予氯毒素缀合物的步骤，其中该氯毒素缀合物结合至瘤床中的残留肿瘤细胞；并且借此瘤床中的残留肿瘤细胞被抑制、预防、最少化、缩减、或杀死、或转移被防止。在一个实施例中，该氯毒素缀合物包括化学治疗剂、抗癌剂、或抗癌药。在另一个实施例中，在手术过程中检测到中央或原发性肿瘤之后，给予包括化学治疗剂、抗癌剂、或抗癌药的该氯毒素缀合物。在另外的实施例中，用缀合至标记试剂的氯毒素检测该中央或原发性肿瘤。
在另一个方面中，本发明提供了向个体给予缀合至化学治疗剂、抗癌剂、或抗癌药的氯毒素以治疗、抑制、预防、最少化、缩减、或杀死细胞、或在用缀合至标记试剂的氯毒素鉴别出的细胞中预防转移的方法。在一些实施例中，该抗癌剂包括抗体、多肽、多糖、以及核酸。在实施例中，在手术前大约1天给予该氯毒素缀合物。在另一个实施例中，在手术前大约2天给予该氯毒素缀合物。在另一个实施例中，按多次亚剂量给予该氯毒素缀合物。在实施例中，按大约2次亚剂量、3次亚剂量、4次亚剂量、或更多次亚剂量给予该氯毒素缀合物。在另一个实施例中，在手术过程中检测到中央或原发性肿瘤之后，给予包括化学治疗剂、抗癌剂、或抗癌药的该氯毒素缀合物。在另外的实施例中，用缀合至标记试剂的氯毒素检测该中央或原发性肿瘤。
在一个方面中，本发明提供了检测个体中软组织肉瘤的方法，该方法包括以下步骤：a)向该个体给予氯毒素缀合物，其中该氯毒素缀合物结合至软组织肉瘤；以及b)对该结合的氯毒素缀合物进行成像、可视化、或分析。在实施例中，检测包括体内或离体检测。在另一个实施例中，成像、可视化、或分析包括可视化该氯毒素缀合物。在另外的实施例中，成像、可视化、或分析包括体内或离体成像、可视化、或分析。在一些实施例中，可视化包括对肉瘤进行光学成像。在一些实施例中，由氯毒素缀合物的荧光强度进行制图。
在一个方面，将包括一个或多个标记试剂的氯毒素缀合物用于检测软组织肉瘤。在实施例中，该标记试剂包括荧光部分。在另外的实施例中，该荧光部分包括近红外荧光部分。在另一个实施例中，该标记试剂包括放射性核素。在另一个实施例中，该软组织肉瘤选自下组，该组由以下各项组成：气管肿瘤、脂肪组织肿瘤、肌肉组织肿瘤、骨骼肌肉瘤、横纹肌肉瘤、周围神经肿瘤、纤维组织肿瘤、黏液纤维肉瘤、纤维瘤病、关节组织肿瘤、血管以及淋巴管肿瘤、血管肉瘤、胃肠道间质瘤、软组织腺泡状肉瘤、隆凸性皮肤纤维肉瘤(DFSP)、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、上皮样肉瘤、骨外黏液样软骨肉瘤(extraskeletalmyxoidchondrosarcoma)、以及巨细胞纤维母细胞瘤(GCF)。
在另一个方面中，将氯毒素缀合物用于检测皮下脂肪组织中的软组织肉瘤。在实施例中，检测包括对在手术、手术切除、或术中成像和切除过程中或与其相关情况下的氯毒素缀合物进行成像、可视化、或分析。在另一个实施例中，在手术过程中或与其相关情况下去除肉瘤或其部分。
本发明提供了检测个体中皮肤鳞状细胞癌的方法，该方法包括以下步骤：a)向该个体给予氯毒素缀合物骤，其中该氯毒素缀合物结合至皮肤鳞状细胞癌；以及b)对该结合的氯毒素缀合物进行成像、可视化、或分析。在实施例中，检测包括体内或离体检测。在另一个实施例中，成像、可视化、或分析包括可视化该氯毒素缀合物。在另一个实施例中，成像、可视化、或分析包括体内或离体成像、可视化、或分析。
在另一方面，本发明提供了使用氯毒素缀合物以对皮肤鳞状细胞癌进行光学成像的方法。在实施例中，该氯毒素缀合物包括一个或多个标记试剂。在另一个实施例中，该标记试剂包括荧光部分。在另外的实施例中，该荧光部分包括近红外荧光部分。在另一个实施例中，该标记试剂包括放射性核素。在一些实施例中，检测包括对在手术、手术切除、或术中成像和切除过程中或与其相关情况下的氯毒素缀合物进行成像、可视化、或分析。在一些实施例中，在手术过程中或与其相关情况下去除皮肤鳞状细胞癌或其部分。在一些实施例中，实现缀合氯毒素物的荧光强度。
在一个方面中，本发明提供了检测个体中的低度肿瘤的方法，该方法包括以下步骤：a)向该个体给予氯毒素缀合物，其中该氯毒素缀合物结合至低度肿瘤；以及b)对该结合的氯毒素缀合物进行成像、可视化、或分析。在实施例中，检测包括体内或离体检测。在一些实施例中，成像、可视化、或分析包括体内或离体成像、可视化、或分析。
本发明提供了使用氯毒素缀合物以对低度肿瘤进行光学成像的方法。在实施例中，该氯毒素缀合物包括一个或多个标记试剂。在实施例中，该标记试剂包括荧光部分。在实施例中，该荧光部分包括近红外荧光部分。在另一个实施例中，该标记试剂包括放射性核素。在另一个实施例中，在手术或切除过程中或与其相关情况下进行检测。在另外的实施例中，在手术、手术切除、或术中成像和切除过程中或与之相关情况下去除低度肿瘤或其部分。在一些实施例中，该低度肿瘤选自下组，该组由以下各项组成：a)脑组织中的或来自脑组织的低度肿瘤；b)皮下脂肪组织中的或来自皮下脂肪组织的低度肿瘤；c)乳房或乳腺组织中的或来自乳房或乳腺组织的低度肿瘤；以及d)肺组织中的或来自肺组织的低度肿瘤。在一些实施例中，由氯毒素缀合物的荧光强度进行制图。
在实施例中，该氯毒素缀合物包括一个或多个标记试剂。在实施例中，该标记试剂包括荧光部分。在实施例中，该荧光部分包括近红外荧光部分。在另一个实施例中，该标记试剂包括放射性核素。在实施例中，检测包括体内或离体检测。在实施例中，成像、可视化、或分析包括体内或离体成像、可视化、或分析。在一些实施例中，由氯毒素缀合物的荧光强度进行制图。
在另一方面，提供了用于使用氯毒素缀合物以在乳腺癌手术中去除原发性或中央肿瘤后检测个体瘤床中残留癌的方法，该方法包括：a)向该个体给予氯毒素缀合物，其中该氯毒素缀合物结合至残留癌；以及b)对该结合的氯毒素缀合物进行成像、可视化、或分析。在实施例中，该氯毒素缀合物包括一个或多个标记试剂。在另外的实施例中，该标记试剂包括荧光部分。在另一个实施例中，该荧光部分包括近红外荧光部分。在另一个实施例中，该标记试剂包括放射性核素。在一些实施例中，在手术或切除过程中或与其相关情况下进行检测。在另外的实施例中，在手术、手术切除、或术中成像和切除过程中或与之相关情况下去除残留癌或其部分。
在实施例中，该氯毒素缀合物包括一个或多个标记试剂。在另外的实施例中，该标记试剂包括荧光部分。在另一个实施例中，该荧光部分包括近红外荧光部分。在另一个实施例中，该标记试剂包括放射性核素。在一个方面中，本发明提供了用于检测个体中肿瘤的方法，该方法包括以下步骤：a)向该个体给予氯毒素缀合物，其中该氯毒素缀合物结合至肿瘤；以及b)对该结合的氯毒素缀合物进行成像、可视化、或分析，其中以大约0.9mg/m2至大约1.1mg/m2之间的量或以大约3mg至大约6mg之间的量给予氯毒素缀合物。在实施例中，检测包括体内或离体检测。在一些实施例中，成像、可视化、或分析包括体内或离体成像、可视化、或分析。
本发明提供了使用氯毒素缀合物以对肿瘤进行光学成像的方法，在实施例中，该氯毒素缀合物包括一个或多个标记试剂。在另外的实施例中，该标记试剂包括荧光部分。在另外的实施例中，该荧光部分包括近红外荧光部分。在另一个实施例中，该标记试剂包括放射性核素。在一些实施例中，在手术或切除过程中或与其相关情况下进行检测。在一些实施例中，在手术、手术切除、或术中成像和切除过程中或与其相关情况下去除肿瘤或其部分。
本发明提供了向个体给予氯毒素缀合物以检测皮肤或乳房肿瘤中、以及肺癌和乳腺癌中软组织肉瘤、低度肿瘤、皮肤鳞状细胞癌、或其中的细胞的方法。在实施例中，该氯毒素缀合物包括一个或多个标记试剂。在实施例中，该标记试剂包括荧光部分。在实施例中，该荧光部分包括近红外荧光部分。在另一个实施例中，该标记试剂包括放射性核素。在另一个实施例中，在手术或切除过程中或与其相关情况下进行检测。在另外的实施例中，在手术、手术切除、或术中成像和切除过程中或与之相关情况下去除皮肤或乳房肿瘤中、以及肺癌和乳腺癌中、或其部分中的软组织肉瘤、低度肿瘤、皮肤鳞状细胞癌、或其中的细胞。在其他实施例中，以大约0.9mg/m2至大约1.1mg/m2之间的量或以大约3mg至大约6mg之间的量给予氯毒素缀合物。在实施例中，在手术前大约1天给予该氯毒素缀合物。在另一个实施例中，在手术前大约2天给予该氯毒素缀合物。在另一个实施例中，按多次亚剂量给予该氯毒素缀合物。在实施例中，按大约2次亚剂量、3次亚剂量、4次亚剂量、或更多次亚剂量给予该氯毒素缀合物。在实施例中，检测包括体内或离体检测。在一些实施例中，成像、可视化、或分析包括体内或离体成像、可视化、或分析。在一些实施例中，由氯毒素缀合物的荧光强度进行制图。
在另一方面，提供了用于使用氯毒素缀合物以在乳腺癌手术中去除原发性或中央肿瘤后检测个体瘤床中残留癌的方法，该方法包括：a)向该个体给予氯毒素缀合物，其中该氯毒素缀合物结合至残留癌；以及b)对该结合的氯毒素缀合物进行成像、可视化、或分析。在实施例中，该氯毒素缀合物包括一个或多个标记试剂。在另外的实施例中，该标记试剂包括荧光部分。在另一个实施例中，该荧光部分包括近红外荧光部分。在另一个实施例中，该标记试剂包括放射性核素。在一些实施例中，在手术或切除过程中或与其相关情况下进行检测。在另外的实施例中，在手术、手术切除、或术中成像和切除过程中或与之相关情况下去除残留癌或其部分。
在实施例中，该氯毒素缀合物包括一个或多个标记试剂。在实施例中，该标记试剂包括荧光部分。在实施例中，该荧光部分包括近红外荧光部分。在另一个实施例中，该标记试剂包括放射性核素。在另一个实施例中，在手术或切除过程中或与其相关情况下进行检测。在实施例中，在手术前大约1天给予该氯毒素缀合物。在另一个实施例中，在手术前大约2天给予该氯毒素缀合物。在另一个实施例中，按多次亚剂量给予该氯毒素缀合物。在实施例中，按大约2次亚剂量、3次亚剂量、4次亚剂量、或更多次亚剂量给予该氯毒素缀合物。在实施例中，检测包括体内或离体检测。在一些实施例中，成像、可视化、或分析包括体内或离体成像、可视化、或分析。在一些实施例中，由氯毒素缀合物的荧光强度进行制图。
本发明进一步提供了用于检测个体中软组织肉瘤的方法，该方法包括：向该个体给予氯毒素缀合物，其中该氯毒素缀合物包括可检测试剂以及与MCMPCFTTDHQMARXCDDCCGGXGRGXCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的氯毒素多肽；将该氯毒素缀合物结合至软组织肉瘤；并且检测该结合的氯毒素缀合物，其中结合的氯毒素缀合物的水平升高表明软组织肉瘤的存在。
通过引用结合
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引入结合在此，如同每一单独的出版物、专利或专利申请具体且单独地通过引入结合在此。
附图简要说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体提出。通过参考对说明性实施例进行叙述的以下详细说明，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些实施例中利用了本发明的原理，并且在这些附图中：
图1示出了在室温下14天之后氯毒素缀合物配制品的SDS-PAGE。
图2示出了在40℃下5天之后(以及t0)氯毒素缀合物配制品的SDS-PAGE。
图3示出了在光照或3XF/T中在室温下3天之后氯毒素缀合物配制品的SDS-PAGE。样品是在光照中在室温下3天后，除非被标记为F/T
图4示出了对于快速和慢速冷冻、未冻干或冻干的氯毒素缀合物配制品的RP-HPLC色谱的总峰面积。
图5示出了对于用慢速对比快速冷冻(左)进行冻干的以及液体配制品形式(右)的氯毒素缀合物所获得的FTIR衍生的二级结构。
图6示出了不同冻干配制品的SDS-PAGE分析。
图7示出了注射后24小时U87胁部肿瘤中氯毒素缀合物的信噪比(SNR)。
图8示出了化合物76-2kD(左)、化合物76-5kD(中)以及化合物76-40kD(右)的荧光图像。
图9A示出了化合物76-5kD的荧光图像。图9B示出了组织样品的H&E染色。
图10示出了化合物76-5kD的生物分布分析。图10A示出了来自肝、肾、脾、心以及脑切片的积分强度。图10B以及10C分别示出了来自肝和肾的代表性图像。
图11示出了心脏组织的化合物76-5kD(顶部)以及H&E染色剂(底部)的奥德赛(Odyssey)荧光图像。
图12A示出了对于不同剂量氯毒素缀合物的SNR(肿瘤/肌肉)(n＝2-7；样品量示于各柱内部；误差＝标准差)。
图12B示出了来自肿瘤以及肌肉样品亚组的信号。下图显示对于注射后1天与3天、6nmol与20nmol剂量组的代表性肌肉与肿瘤图像。
图13示出了使用IVIS光谱成像系统选择的组织的生物分布。图13A代表注射后1天的组织。图13B示出了注射后3天的成像的组织。(B-脑，H-心，K-肾，S-皮肤，L-肝)。图13C示出了对于注射后1天与3天、2nmol与20nmol组的组织中的荧光信号。
图14示出了注射后从6小时至3天，氯毒素缀合物的整体活体动物成像。
图15A示出了注射后1天，使用IVIS光谱氯毒素缀合物的离体成像。图15B示出了来自常位小鼠#2的脑的离体成像。图15C示出了来自常位小鼠#1的脑以及颅骨的离体奥德赛(Odyssey)成像。
图18示出了肿瘤与背景比率达到最大时的氯毒素缀合物剂量的测定。由对该荧光数据一无所知的组织病理学专家对肿瘤和非肿瘤组织的部分进行评分。测量2x2mm网格方块中的总荧光，并通过将荧光图像与组织病理学专家评分的H&E图像叠加，来指定各个方块为肿瘤或非肿瘤。肿瘤或非肿瘤方块的平均值被用于计算肿瘤与背景比率(TBR)，示于各个数据点的右侧。
图19示出了对于软组织肉瘤(所有亚型)以及癌(包括腺癌和鳞状细胞癌)的总肿瘤强度的盒须图。将组织用BLZ-100标记。
图20示出了SmoA1小鼠脑中肿瘤对比正常皮层组织的信号与图象分析。
图21示出了对应于H&E染色的载玻片中突出显示的小簇肿瘤细胞的小型荧光病灶。
图22示出了在静脉内单次推注给予雌性小鼠0.02mgBLZ-100之后，血清BLZ-100浓度平均值(SD)对比时间的曲线。
图23示出了在静脉内单次推注给雄性大鼠0.03或0.3mg剂量之后，血清BLZ-100浓度平均值(SD)对比时间的曲线。
图24示出了在静脉内单次推注给雄性猴0.6mg剂量之后，个体血清BLZ-100浓度对比时间的曲线。
图25示出了在静脉内单次推注剂量给雄性和雌性大鼠之后，按剂量汇总的平均(±SD)BLZ-100血清浓度(ng/mL)。
图26示出了在静脉内单次推注剂量给雄性和雌性猴之后，按剂量汇总的平均(±SD)BLZ-100血清浓度(ng/mL)。
图27示出了人类受试者氯毒素缀合物血清浓度对比时间。
图28示出了软组织肉瘤的术中成像(患者19)。(A)总肿瘤的白光手术前图像显示出溃疡的以及大体上肿胀的癌周皮肤。(B)原位肿瘤的NIR图像。(C)沿着通过B图中的图像绘制的线的荧光强度的曲线图。(D)切除的肿瘤的NIR图像。(E)沿着通过D图中的图像绘制的线的荧光强度的曲线图。(F)癌周皮肤、周围未涉及的皮肤、以及瘤床的NIR图像。癌周皮肤的强度是未涉及的皮肤的6倍。瘤床中没有残留荧光。将组织用BLZ-100标记。
图29示出了乳腺癌的术中成像(患者22)。(A)来自原发肿块(箭头)的荧光的NIR图像，成像自切除组织的底部，切除后立即拍摄。该视图有0.5cm的正常组织边缘。B图(荧光)与C图(叠加)显示来自皮肤侧的原发肿块，在皮肤开口之后，移除切片用于进一步成像。小型荧光斑最初是原发肿块的一部分，但通过移除切片而分离了。D图与E图显示提交用于进一步成像的片的大体外观与荧光叠加。总肿瘤与相邻组织之间的对比约为2.5倍。(F)瘤床的叠加图像，显示出肌肉壁中没有残留荧光。将组织用BLZ-100标记。
图30示出了皮肤鳞状细胞癌的术中成像(患者23)。(A)肿瘤位点的白光手术前图像，显示出大体上溃疡以及肿胀的癌周皮肤。B图与C图显示来自顶部(B)与侧面(C)的肿瘤的手术前NIR荧光图像。在移除尾部之后显示NIR荧光(D)与叠加(E)。右面的肿块是中央肿瘤的部分，将其移除用于进一步分析。将皮肤牵开，并显示剩余的总肿瘤(箭头)。中央肿瘤与其余的总肿瘤中的荧光强度类似，而癌周皮肤具有略低的荧光强度(F)。将组织用BLZ-100标记。
图32示出了对于每个分析的组织切片而言网格方块中的荧光强度的盒须图。T，肿瘤。NT，相邻的非肿瘤组织。PS，癌周皮肤。S，未涉及的皮肤。对于皮肤肿瘤，NT由下面的真皮、皮下脂肪以及相邻的真皮/表皮组成。用氯毒素缀合化合物标记组织。
图33示出了用BLZ-100标记的脑肿瘤的成像。(A)原位肿瘤的NIR荧光图像。T，肿瘤。M，鼻黏膜。B，正常脑。B图与C图显示来自两个肿瘤块的30微米切片的荧光图像。D图与E图分别显示B和C中的切片的H&E染色。
图16示出了总肿瘤的荧光强度，按肿瘤类型分组。在总肿瘤的奥德赛(Odyssey)扫描上绘制了感兴趣区域(ROI)。在整个数据组中ROI大小相同。
图17示出了犬软组织肉瘤的离体成像。患者13是一只7岁大雌性标准贵宾犬，它表现为皮下血管外皮细胞瘤，软组织肉瘤的一种类型。用0.94mg/m2的BLZ-100对其治疗，并且在48小时之后进行手术。显示了总肿瘤与相邻正常脂肪(A，B)与未涉及的皮肤(C，D)的白光(A，C)与奥德赛(Odyssey)近红外(B，D)图像。肿瘤与脂肪的总比为257:1至127:1，而肿瘤与皮肤的总比为89:1至33:1。
图31示出了甲状腺癌的术中成像(患者20)。(顶部)切除的淋巴结、甲状腺肿块以及瘤床的白光图像。(中部)叠加在白光图像上的NIR荧光信号。(底部)单色NIR图像。淋巴结与甲状腺肿块各自具有移除的切片用于进一步分析，与块状组织并排显示。
具体实施方式
本披露提供了用于检测和/或治疗癌症的组合物以及方法。在此描述的组合物包括肽缀合物，该肽缀合物包括可检测标记物，适合用于检测和治疗多种癌症。在某些方面，这些组合物与药学上可接受的载体组合提供，可通过任何胃肠外给药途径给予受试者。当经静脉内给予人类受试者时，在此描述的组合物产生药物代谢动力学曲线。给予在此描述的组合物后，缀合物选择性地结合至癌细胞。然后，可以通过例如成像或其他适合于检测肽缀合物的可检测标记物的可视化方法或检测方法检测癌细胞。在其他方面，本文所述组合物可以治疗剂的方式用于治疗癌症，将其附接到缀合物上并且通过缀合物的肽部分结合之后其作用于癌细胞。在此详细地描述了这些和其他方面。
本发明将通过结合附图、参考以下对本发明各方面以及实施例的详细描述来更好地理解。以下讨论是描述性、说明性以及示例性的，并且不应该被视为限制由所附权利要求所定义的范围。
如在本说明书和随附权利要求书中所使用的，下列术语具有所示含义，除非规定与此相反。
当在本文和附带的权利要求中使用时，单数形式“一个/种(a)”、“和(and)”和“所述/该(the)”包括复数指代物，除非上下文明确地指示其他的情况。因此，例如，提及“一个/种化合物”时包括多个/种此类化合物，提及“一个/种药剂”时包括多个/种此类药剂，并且提及“所述/该细胞”时包括提及一种或多种细胞(或指多个细胞)和本领域技术已知的其等价物，等等。当范围在此用于物理性质(如分子量)或化学性质(如化学式)时，旨在包括范围的所有组合和子组合、及其中的特定实施例。当提及数字或数值范围时，术语“约”是指所提及的数字或数值范围是在一个实验变异内(或在统计实验误差内)的近似值，并且由此该数字或数值范围可以在所陈述数字或数值范围的1％与15％之间变化。术语“包括(comprising)”(以及相关术语如“包括(comprise)”或“包括(comprises)”或“具有(having)”或“包括(including)”)并不旨在排除以下情况：在某些其他实施例中，例如，在此描述的任何物质组合物、组合物、方法、或工艺等的实施例可“由”所描述的特征“组成(consistof)”和“基本上由”所描述的特征“组成(consistessentiallyof)”。
“氰基”是指-CN基团。
“硝基”是指-NO2基团。
“氧杂”是指-O-基团。
“氧代”是指＝O基团。
“硫代”是指＝S基团。
“亚氨基”是指＝N-H基团。
“肼基”是指＝N-NH2基团。
“烷基”是指直链或支链的仅由碳和氢原子组成的烃链基团，不包含不饱和度，含有一至十五个碳原子(例如，C1-C15烷基)。在某些实施例中，烷基包括一至十三个碳原子(例如，C1-C13烷基)。在某些实施例中，烷基包括一至八个碳原子(例如，C1-C8烷基)。在其他实施例中，烷基包括五至十五个碳原子(例如，C5-C15烷基)。在其他实施例中，烷基包括五至八个碳原子(例如，C5-C8烷基)。烷基通过单键与该分子的其余部分附接，例如，甲基(Me)、乙基(Et)、-正丙基、1-甲基乙基(-异丙基)、-正丁基、-正戊基、1,1-二甲基乙基(-叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基等。除非说明书中另外特别说明，烷基基团任选地被一或多个下列取代基所取代：卤素、氰基、硝基、氧代、硫代、三甲基硅烷基、-ORa、-SRa、-OC(O)-Ra、-N(Ra)2、-C(O)Ra、-C(O)ORa、-C(O)N(Ra)2、-N(Ra)C(O)ORa、-N(Ra)C(O)Ra、-N(Ra)S(O)tRa(其中t是1或2)、-S(O)tORa(其中t是1或2)以及-S(O)tN(Ra)2(其中t是1或2)，其中Ra各自独立地是氢、烷基、氟烷基、碳环基、碳环基烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基或杂芳基烷基。
“烯基”指的是只由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基，含至少一个双键，并且具有2至12个碳原子。在某些实施例中，烯基包括2至8个碳原子。在其他实施例中，烯基包括2至4个碳原子。烯基通过单键与该分子的其余部分附接，例如，次乙基(即乙烯基)、丙-1-烯基(即烯丙基)、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基等。除非说明书中另外特别说明，烯基基团任选地被一或多个下列取代基所取代：卤素、氰基、硝基、氧代、硫代、三甲基硅烷基、-ORa、-SRa、-OC(O)-Ra、-N(Ra)2、-C(O)Ra、-C(O)ORa、-C(O)N(Ra)2、-N(Ra)C(O)ORa、-N(Ra)C(O)Ra、-N(Ra)S(O)tRa(其中t是1或2)、-S(O)tORa(其中t是1或2)以及-S(O)tN(Ra)2(其中t是1或2)，其中Ra各自独立地是氢、烷基、氟烷基、碳环基、碳环基烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基或杂芳基烷基。
“炔基”指的是只由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基，含至少一个三键，具有2至12个碳原子。在某些实施例中，炔基包括2至8个碳原子。在其他实施例中，炔基具有2至4个碳原子。炔基通过单键与该分子的其余部分附接，例如，乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。除非说明书中另外特别说明，炔基基团任选地被一或多个下列取代基所取代：卤素、氰基、硝基、氧代、硫代、三甲基硅烷基、-ORa、-SRa、-OC(O)-Ra、-N(Ra)2、-C(O)Ra、-C(O)ORa、-C(O)N(Ra)2、-N(Ra)C(O)ORa、-N(Ra)C(O)Ra、-N(Ra)S(O)tRa(其中t是1或2)、-S(O)tORa(其中t是1或2)以及-S(O)tN(Ra)2(其中t是1或2)，其中Ra各自独立地是氢、烷基、氟烷基、碳环基、碳环基烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基或杂芳基烷基。
“亚烷基”或“亚烷基链”指的是将该分子的其余部分与基团相连的二价直烃链或支烃链，只由碳和氢原子组成，不含不饱和，含1到12个碳原子，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基和正-亚丁基等。亚烷基链通过单键与该分子的其他部分附接并通过单键与基团附接。亚烷基链与该分子的其余部分以及与基团附接的点可以通过亚烷基链中的一个碳或通过链内的任意两个碳。除非说明书中另外特别说明，亚烷基链任选地被一或多个下列取代基所取代：卤素、氰基、硝基、芳基、环烷基、杂环基、杂芳基、氧代、硫代、三甲基硅烷基、-ORa、-SRa、-OC(O)-Ra、-N(Ra)2、-C(O)Ra、-C(O)ORa、-C(O)N(Ra)2、-N(Ra)C(O)ORa、-N(Ra)C(O)Ra、-N(Ra)S(O)tRa(其中t是1或2)、-S(O)tORa(其中t是1或2)以及-S(O)tN(Ra)2(其中t是1或2)，其中Ra各自独立地是氢、烷基、氟烷基、碳环基、碳环基烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基或杂芳基烷基。
“亚烯基”或“亚烯基链”指的是将该分子的其余部分与基团相连的二价直烃链或支烃链，只由碳和氢原子组成，含至少一个双键，含2到12个碳原子，例如亚乙烯基、亚丙烯基和正-亚丁烯基等。亚烯基链通过双键或单键与该分子的其余部分附接，通过双键或单键与基团附接。亚烯基链与该分子的其余部分以及与基团附接的点可以通过链内的一个碳或任意两个碳。除非说明书中另外特别说明，亚烯基链任选地被一或多个下列取代基所取代：卤素、氰基、硝基、芳基、环烷基、杂环基、杂芳基、氧代、硫代、三甲基硅烷基、-ORa、-SRa、-OC(O)-Ra、-N(Ra)2、-C(O)Ra、-C(O)ORa、-C(O)N(Ra)2、-N(Ra)C(O)ORa、-N(Ra)C(O)Ra、-N(Ra)S(O)tRa(其中t是1或2)、-S(O)tORa(其中t是1或2)以及-S(O)tN(Ra)2(其中t是1或2)，其中Ra各自独立地是氢、烷基、氟烷基、环烷基、环烷基烷基、芳基(任选地被一个或多个卤素基团取代)、芳烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基或杂芳基烷基，并且其中除非另外指明，以上各取代基未被取代。
“芳基”是指通过从环碳原子上移除氢原子而衍生自芳族单环或多环烃环系统的基团。芳族单环或多环烃环系统只含有氢和碳(6至18个碳原子)，其中该环系统中的至少一个环是完全不饱和的，即其含有环状、离域的、根据胡克尔(Hückel)理论的(4n+2)π-电子系统。芳基包括但不限于例如苯基、芴基和萘基。除非本说明书中另外特别说明，否则术语“芳基”或前缀“芳-”(诸如在“芳烷基”中)意指包括任选被一个或多个取代基取代的芳烃基，所述取代基独立地选自烷基、烯基、炔基、卤素、氟烷基、氰基、硝基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的芳烯基、任选取代的芳炔基、任选取代的碳环基、任选取代的碳环基烷基、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳基烷基、-Rb-ORa、-Rb-OC(O)-Ra、-Rb-N(Ra)2、-Rb-C(O)Ra、-Rb-C(O)ORa、-Rb-C(O)N(Ra)2、-Rb-O-Rc-C(O)N(Ra)2、-Rb-N(Ra)C(O)ORa、-Rb-N(Ra)C(O)Ra、-Rb-N(Ra)S(O)tRa(其中t是1或2)、-Rb-S(O)tORa(其中t是1或2)以及-Rb-S(O)tN(Ra)2(其中t是1或2)，其中Ra各自独立地是氢、烷基、氟烷基、环烷基、环烷基烷基、芳基(任选地被一个或多个卤素基团取代)、芳烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基或杂芳基烷基，Rb各自独立地是直接键或者直链或支链亚烷基或亚烯基链，并且Rc是直链或支链亚烷基或亚烯基链，并且其中除非另外指明，以上各取代基未被取代。
“芳烷基”是指具有化学式-Rc-芳基的基团，其中Rc是如上定义的亚烷基链，例如苯甲基、二苯甲基等。芳烷基的亚烷基链部分任选如上述对亚烷基链所述的那样被取代。芳烷基基团的芳基部分如以上对芳基描述的那样被任选取代。
“芳烯基”是指具有化学式-Rd-芳基的基团，其中Rd是如以上所定义的亚烯基链。芳烯基基团的芳基部分如以上对芳基描述的那样被任选取代。芳烯基基团的亚烯基链部分任选如上述对亚烯基基团所定义的那样被取代。
“芳炔基”是指具有化学式-Re-芳基的基团，其中Re是如以上所定义的亚炔基链。芳炔基基团的芳基部分如以上对芳基描述的那样被任选取代。芳炔基基团的亚炔基链部分任选如上述对亚炔基链所定义的那样被取代。
“碳环基”是指具有3至15个碳原子的仅由碳和氢原子组成的稳定的非-芳族单环或多环烃基团，它可以包括稠合环系统或桥连环系统。在某些实施例中，碳环基包括3至10个碳原子。在其他实施例中，碳环基包括5至7个碳原子。碳环基通过单键与该分子的其余部分附接。碳环基可以是饱和的(即只包含单C-C键)或不饱和的(即包含一个或多个双键或三键)。完全饱和的碳环基基团也被称为“环烷基”。单环环烷基的实例包括，例如环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，和环辛基。不饱和的碳环基也被称为“环烯基”。单环环烯基的实例包括，例如环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、以及环辛烯基。多环碳环基基团包括，例如金刚烷基、降冰片基(即二环[2.2.1]庚基)、降冰片烯基、十氢萘基、7,7-二甲基-二环[2.2.1]庚基等。除非本说明书中另外特别说明，否则术语“碳环基”意指包括任选被一个或多个取代基取代的碳环基基团，所述取代基独立地选自烷基、烯基、炔基、卤素、氟烷基、氧代、硫代、氰基、硝基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的芳烯基、任选取代的芳炔基、任选取代的碳环基、任选取代的碳环基烷基、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳基烷基、-Rb-ORa、-Rb-SRa、-Rb-OC(O)-Ra、-Rb-N(Ra)2、-Rb-C(O)Ra、-Rb-C(O)ORa、-Rb-C(O)N(Ra)2、-Rb-O-Rc-C(O)N(Ra)2、-Rb-N(Ra)C(O)ORa、-Rb-N(Ra)C(O)Ra、-Rb-N(Ra)S(O)tRa(其中t是1或2)、-Rb-S(O)tORa(其中t是1或2)以及-Rb-S(O)tN(Ra)2(其中t是1或2)，其中Ra各自独立地是氢、烷基、氟烷基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基或杂芳基烷基，Rb各自独立地是直接键或者直链或支链亚烷基或亚烯基链，并且Rc是直链或支链亚烷基或亚烯基链，并且其中除非另外指明，以上各取代基未被取代。
“碳环基烷基”是指具有化学式-Rc-碳环基的基团，其中Rc是如以上所定义的亚烷基链。亚烷基链和碳环基基团任选如上述定义的那样被取代。
“卤代(Halo)”或“卤素(halogen)”是指溴、氯、氟、或碘取代基。
“氟烷基”是指被一或多个如上文所定义的氟代基团取代的如上文所定义的烷基，例如，三氟甲基、二氟甲基、2,2,2-三氟乙基、1-氟甲基-2-氟乙基等。氟烷基基团的烷基部分如以上对烷基定义的那样被任选取代。
“杂环基”是指稳定的3-至18-元非芳族环的基团，它包括2至12个碳原子以及1至6个杂原子，这些杂原子选自氮、氧以及硫。除非本说明书中另外特别说明，杂环基基团可以是单环、二环、三环或四环环系统，它可包含稠合环系统或桥连环系统。杂环基中的杂原子可以任选是被氧化的。一个或多个氮原子，如果存在，任选地季铵化。杂环基是部分或完全饱和的。杂环基可以通过该环或这些环中的任何原子附接到该分子的其余部分。此类杂环基基团的实例包括但不限于二氧戊环基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗琳基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、硫杂吗啉基、1-氧代-硫代吗啉基、以及1,1-二氧代-硫代吗啉基。除非本说明书中另外特别说明，否则术语“杂环基”意指包括任选被一个或多个取代基取代的如上述定义的杂环基基团，所述取代基选自烷基、烯基、炔基、卤素、氟烷基、氧代、硫代、氰基、硝基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的芳烯基、任选取代的芳炔基、任选取代的碳环基、任选取代的碳环基烷基、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳基烷基、-Rb-ORa、-Rb-SRa、-Rb-OC(O)-Ra、-Rb-N(Ra)2、-Rb-C(O)Ra、-Rb-C(O)ORa、-Rb-C(O)N(Ra)2、-Rb-O-Rc-C(O)N(Ra)2、-Rb-N(Ra)C(O)ORa、-Rb-N(Ra)C(O)Ra、-Rb-N(Ra)S(O)tRa(其中t是1或2)、-Rb-S(O)tORa(其中t是1或2)以及-Rb-S(O)tN(Ra)2(其中t是1或2)，其中Ra各自独立地是氢、烷基、氟烷基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基或杂芳基烷基，Rb各自独立地是直接键或者直链或支链亚烷基或亚烯基链，并且Rc是直链或支链亚烷基或亚烯基链，并且其中除非另外指明，以上各取代基未被取代。
“N-杂环基”或“N-连接的杂环基”是指含有至少一个氮的如上定义的杂环基基团，并且其中该杂环基基团与该分子的其余部分的附接点是通过该杂环基基团中的氮原子。N-杂环基基团如以上对杂环基基团描述的那样被任选取代。此类N-杂环基基团的实例包括但不限于1-吗啉基、1-哌啶基、1-哌嗪基、1-吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑啉基、以及咪唑烷基。
“C-杂环基”或“C-附接的杂环基”是指含有至少一个杂原子的如上定义的杂环基基团，并且其中该杂环基基团与该分子的其余部分的附接点是通过该杂环基基团中的碳原子。C-杂环基基团如以上对杂环基基团描述的那样被任选取代。此类C-杂环基基团的实例包括但不限于2-吗啉基、2-或3-或4-哌啶基、2-哌嗪基、2-或3-吡咯烷基等。
“杂环基烷基”是指具有化学式-Rc-杂环基的基团，其中Rc是如以上所定义的亚烷基链。如果杂环基是含氮杂环基，杂环基在氮原子处任选地附接至烷基。杂环基烷基基团的亚烷基链如上文对亚烷基链所定义的那样被任选取代。杂环基烷基基团的杂环基部分如以上对杂环基定义的那样被任选取代。
“杂芳基”是指衍生自3-至18-元芳族环的基团，它包括2至17个碳原子以及1至6个杂原子，这些杂原子选自氮、氧以及硫。如在此使用的，杂芳基基团可以是单环、二环、三环或四环环系统，其中该环系统中的至少一个环是完全不饱和的，即其含有环状、离域的、根据胡克尔理论的(4n+2)π-电子系统。杂芳基包含稠合环系统或桥连环系统。杂芳基基团中的该杂原子或这些杂原子是任选被氧化的。一个或多个氮原子，如果存在，任选地季铵化。杂芳基通过该环或这些环中的任何原子附接到该分子的其余部分。杂芳基的实例包括但不限于：氮杂卓基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、1,3-苯并间二氧杂环戊烯基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并[d]噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二氧杂环庚基、苯并[b][1,4]噁嗪基、1,4-苯并二噁烷基、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并间二氧杂环戊烯基、苯并二噁英基、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基(苯并苯硫基)、苯并噻吩并[3,2-d]嘧啶基、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、氮芴基、噌啉基、环戊二烯并[d]嘧啶基、6,7-二氢-5H-环戊二烯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6-二氢苯并[h]喹唑啉基、5,6-二氢苯并[h]噌啉基、6,7-二氢-5H-苯并[6,7]环庚并[1,2-c]哒嗪基、二苯并呋喃基、二苯并苯硫基、呋喃基、呋喃酮基、呋喃并[3,2-c]吡啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛[d]嘧啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛[d]哒嗪基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛[d]吡啶基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、异吲哚基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、异喹啉基、吲嗪基、异噁唑基、5,8-甲醇-5,6,7,8-四氢喹唑啉基、萘啶基、1,6-萘啶酮基、噁二唑基、2-氧代氮杂卓基、噁唑基、环氧乙烷基、5,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢苯并[h]喹唑啉基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡唑并[3,4-d]嘧啶基、吡啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、异喹啉基、四氢喹啉基、5,6,7,8-四氢喹唑啉基、5,6,7,8-四氢苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、6,7,8,9-四氢-5H-环庚并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6,7,8-四氢吡啶并[4,5-c]哒嗪基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基、噻吩并[2,3-d]嘧啶基、噻吩并[3,2-d]嘧啶基、噻吩并[2,3-c]吡啶基、以及苯硫基(即，噻吩基)。除非本说明书中另外特别说明，否则术语“杂芳基”意指包括任选被一个或多个取代基取代的如上述定义的杂芳基基团，所述取代基选自烷基、烯基、炔基、卤素、氟烷基、卤烯基、卤炔基、氧代、硫代、氰基、硝基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、任选取代的芳烯基、任选取代的芳炔基、任选取代的碳环基、任选取代的碳环基烷基、任选取代的杂环基、任选取代的杂环基烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳基烷基、-Rb-ORa、-Rb-SRa、-Rb-OC(O)-Ra、-Rb-N(Ra)2、-Rb-C(O)Ra、-Rb-C(O)ORa、-Rb-C(O)N(Ra)2、-Rb-O-Rc-C(O)N(Ra)2、-Rb-N(Ra)C(O)ORa、-Rb-N(Ra)C(O)Ra、-Rb-N(Ra)S(O)tRa(其中t是1或2)、-Rb-S(O)tORa(其中t是1或2)以及-Rb-S(O)tN(Ra)2(其中t是1或2)，其中Ra各自独立地是氢、烷基、氟烷基、环烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基或杂芳基烷基，Rb各自独立地是直接键或者直链或支链亚烷基或亚烯基链，并且Rc是直链或支链亚烷基或亚烯基链，并且其中除非另外指明，以上各取代基未被取代。
“N-杂芳基”是指含有至少一个氮的如上定义的杂芳基基团，并且其中该杂芳基基团与该分子的其余部分的附接点是通过该杂芳基基团中的氮原子。N-杂芳基基团如以上对杂芳基基团描述的那样被任选取代。
“C-杂芳基”是指如上定义的杂芳基基团，并且其中该杂芳基基团与该分子的其余部分的附接点是通过该杂芳基基团中的碳原子。C-杂芳基基团如以上对杂芳基基团描述的那样被任选取代。
“杂芳基烷基”是指具有化学式-Rc-杂芳基的基团，其中Rc是如以上所定义的亚烷基链。如果杂芳基是含氮杂芳基，杂芳基在氮原子处任选地附接至烷基。杂芳基烷基的亚烷基链如上文对亚烷基链所定义的那样被任选取代。杂芳基烷基基团的杂芳基部分如以上对杂芳基定义的那样被任选取代。
这些化合物或其药学上可接受的盐可以含有一或多个不对称中心，因此可以产生对映异构体、非对映异构体和其他立体异构形式，它们可以根据绝对立体化学进行定义，如(R)-或(S)-，或者对于氨基酸而言，如(D)-或(L)-。当此处描述的这些化合物含有烯烃双键或几何不对称的其他中心时，并且除非另外指明，否则意图是这些化合物包括E(或反式)和Z(顺式)几何异构体两者。类似地，所有可能的异构体，以及它们的外消旋形式和光学纯形式，和所有互变异构形式也意图被包括。
“立体异构体”是指由通过相同的价键键合的相同原子构成的化合物，但是具有不同三维结构，它们不可互换。因此，考虑了各种立体异构体及其混合物，包括“对映异构体”，它指的是两个立体异构体，它们的分子是另一个的不可叠加的镜像。
“互变异构体”指的是质子从分子的一个原子移动到同一个分子的另一个原子。在此呈现的化合物可以互变异构体的形式存在。互变异构体是通过氢原子转移而相互转变的化合物，伴随着单键和相邻双键的转变。在其中互变异构化是可能的溶液中，将存在互变异构体的化学平衡。互变异构体的确切比率取决于几种因素，包括温度、溶剂以及pH。互变异构对的一些实例包括：
“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可以发生，也可以不发生，并且该描述包括其中该事件或情况发生的情形和不发生的情形。
“药学上可接受的盐”包括酸和碱加成盐。在此描述的烷氧基苯基连接的胺衍生化合物的任一种的药学上可接受的盐意图涵盖任意以及所有药学上合适的盐形式。优选的在此描述的化合物的药学上可接受的盐是药学上可接受的酸加成盐以及药学上可接受的碱加成盐。
“药学上可接受的酸加成盐”是指能够保持游离碱的生物有效性和性质的那些盐，它们不是生物学方面或其他方面不合需要的，并且它们是与无机酸形成的，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢碘酸、氢氟酸、亚磷酸等。还包括与有机酸形成的盐，如脂族单-或二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、链烷双酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等，并且包括例如乙酸、三氟乙酸、丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。因此，示例性的盐包括：硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、三氟醋酸盐、丙酸盐、辛酸盐、异丁酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐等。还考虑的是氨基酸的盐，如精氨酸盐、葡萄糖酸盐、以及半乳糖醛酸盐(参见例如，Berge(贝尔热)S.M.等人，“PharmaceuticalSalts(药用盐)”，JournalofPharmaceuticalScience(药物科学杂志)，66:1-19(1997)，将其披露通过引用以其全部内容特此结合)。可以根据技术人员熟悉的方法和技术通过使游离碱形式与足量的所希望的酸相接触以产生盐而制备碱性化合物的酸加成盐类。
“药学上可接受的碱加成盐”指那些能够保持游离酸的生物学有效性和性质的那些盐，它们不是生物学或其他所不需要的。这些盐可以通过无机碱或有机碱与游离酸的加成而制备。可使用金属或胺(例如碱金属和碱土金属、或者有机胺)来形成药学上可接受的碱加成盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠、钾、钜、铰、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等。来源于有机碱的盐包括但不限于以下各项的盐：伯胺、仲胺以及叔胺，取代的胺，包括天然存在的取代胺、环胺以及碱离子交换树脂，比如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、N,N-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、哈胺青霉素、胆碱、甜菜碱、乙二胺、亚乙基二苯胺、N-甲基葡糖胺、氨基葡萄糖、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂以及类似物。参见Berge(贝尔热)等人，同上。
如此处使用的，“治疗(treatment)”或“进行治疗(treating)”或“减轻”或“改善”在此可互换使用。这些术语是指如下途径，该途径用于获得有益或希望的结果，包括但不限于治疗益处和/或预防益处。“治疗益处”意指正在治疗的潜在病症的根除或缓解。同样，通过与潜在病症相关联的一种或多种生理症状的根除或缓解来实现治疗益处，使得尽管该患者可能仍被这种潜在病症所折磨，但在患者中观察到改善。对于预防益处，这些组合物可给予至处于发展具体的疾病的风险的患者，或给予至报告了疾病的一个或多个生理学症状的患者，尽管这种疾病的诊断可能还没有做出来。
“前药”表示可以在生理条件下或通过溶剂分解作用转化成有生物学活性的在此描述的化合物的化合物。因此，术语“前药”是指药学上可接受的生物活性化合物的前体。当施用至受试者时，前药可以是无活性的，但在体内例如通过水解转化成活性化合物。前药化合物通常在溶解性、哺乳动物组织相容性或延迟释放方面具有优势(参见，例如，Bungard，H.，DesignOfFrodrugs(前药设计)1985)，第7-9页，第21-24页(ElSevier，Amsterdam))。
关于前药的讨论提供于Higuchi,T.等人的“作为新递送系统的前药(Pro-drugsasNovelDeliverySystems)”(A.C.S.SymposiumSeries)，第14卷，及EdwardB.Roche编辑的“药物设计的生物可逆性载体(BioreversibleCarriersinDrugDesign)”(美国药学协会和佩加蒙出版社(AmericanPharmaceuticalAssociationandPergamonPress)，1987)中，二者均通过引用全部结合在此。
术语“前药”还意指包括任意共价键合的载体，当所述前药被施用于哺乳动物受试者时其在体内释放出活性化合物。通过修饰存在于所述活性化合物中的官能团来制备如在此描述的活性化合物的前药，所述修饰的方式允许所述修饰在常规操作中或在体内被裂解成母体活性化合物。前药包括其中羟基、氨基或巯基基团与以下任何基团结合的化合物，当活性化合物的前药给药于哺乳动物受试者时，所述任何基团分别可以切割形成游离羟基、游离氨基或游离巯基基团。前药的实例包括但不限于活性化合物中醇或胺官能团的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物等。
缀合化合物
本披露提供了选择性地结合至癌性细胞和组织的化合物。在不同方面中，本披露的化合物包括缀合在一起的肽部分和可检测试剂。
在本披露的不同方面中，在此描述的化合物的肽部分具有某些与天然氯毒素(CTX)肽一样的特征。天然氯毒素肽最初分离自蝎-以色列金蝎。氯毒素是选择性地结合至癌性细胞的36个氨基酸肽。本披露的化合物的肽部分有利地保留了氯毒素的至少部分癌细胞结合活性。氯毒素的癌细胞结合活性为癌症的检测和治疗提供了某些优势，因为它促进了用于检测和治疗癌症的可检测试剂和治疗剂至癌细胞的选择性定位。
下面表1中列出了与本披露一起使用的某些多肽序列。瓜氨酸在这些序列中表示为“Cit”。
表1.适合用于本披露中化合物的示例性的肽序列。Cit＝瓜胺酸。
氯毒素缀合物包括氯毒素以及标记试剂或可检测标记物。在实施例中，氯毒素是包括与氯毒素的天然肽的序列至少60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、86％、89％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的变体。在另一个实施例中，本披露提供了具有以下氨基酸序列的氯毒素：MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR。在另外的实施例中，本披露提供了包括与以下氨基酸序列至少60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、86％、89％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的氯毒素变体：MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR。在另一个实施例中，该氯毒素是与MCMPCFTTDHQMARXCDDCCGGXGRGXCYGPQCLCR的序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、86％、89％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列一致性的氯毒素或其变体，其中X选自K、A以及R。在另一个实施例中，该氯毒素是与MCMPCFTTDHQMARXCDDCCGGXGRGXCYGPQCLCR的序列具有至少85％序列一致性的氯毒素或其变体，其中X选自K、A以及R。
在另一个实施例中，该氯毒素是BLZ-100，它是包括MCMPCFTTDHQMARXCDDCCGGXGRGXCYGPQCLCR的序列的氯毒素变体，其中X15和X23是精氨酸，而X27是缀合至菁荧光标记的赖氨酸。该肽可以进一步由存在于序列中的半胱氨酸残基之间的二硫键形成的四个二硫键交联。
在一些方面，该肽是氯毒素的天然肽的变体，但保留了天然肽的所有八个半胱氨酸残基，使得能由多达四个二硫键交联。半胱氨酸残基的保护有助于保护二级结构、电荷分布、等电点(pI)以及天然氯毒素肽的其他特征，这是因为半胱氨酸残基之间形成的二硫键。
在一些方面，氯毒素肽变体保留了天然肽的所有八个半胱氨酸残基并且与天然氯毒素肽具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、86％、89％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列一致性。
在一些方面，氯毒素肽变体具有八个半胱氨酸残基，这些残基被定位为使得半胱氨酸对之间的距离与天然肽中发现的半胱氨酸对之间的距离相同，并且氯毒素肽变体与天然氯毒素肽具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、86％、89％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列一致性。
在一些方面，氯毒素肽变体具有八个半胱氨酸残基，这些残基被定位为使得半胱氨酸对之间的距离与天然肽中发现的半胱氨酸对之间的距离功能上等效或功能上相似，并且氯毒素肽变体与天然氯毒素肽具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、86％、89％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列一致性。
在一些方面，氯毒素肽变体具有八个半胱氨酸残基，这些残基被定位为使得半胱氨酸对之间的距离允许天然氯毒素肽的二级结构和等电点得以保存，并且氯毒素肽变体与天然氯毒素肽具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、86％、89％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列一致性。
在一些方面，氯毒素肽变体具有八个半胱氨酸残基，这些残基被定位为使得半胱氨酸对之间的距离足够允许形成二硫键，并且氯毒素肽变体与天然氯毒素肽具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、86％、89％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列一致性。
在一些方面，氯毒素肽变体的一个或多个甲硫氨酸被其他的氨基酸替换。在一些方面，氯毒素肽变体的一个或多个甲硫氨酸被其他的氨基酸替换，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸或其组合。
在一些实施例中，氯毒素可以是氯毒素变体。氯毒素和氯毒素变体进一步描述于PCT专利申请公开号WO2006115633以及WO2011142858中，通过引用以其整体结合在此。
在一个实施例中，肽可具有下式：H-Met-Cys-Met-Pro-Cys-Phe-Thr-Thr-Asp-His-Gln-Met-Ala-Arg-Xaa-Cys-Asp-Asp-Cys-Cys-Gly-Gly-Xaa-Gly-Arg-Gly-Xaa-Cys-Tyr-Gly-Pro-Gln-Cys-Leu-Cys-Arg-OH乙酸盐(二硫键，空气氧化的)，其中Xaa是Arg、Ala、或Lys。
在另一个实施例中，肽可具有下式：H-Met-Cys-Met-Pro-Cys-Phe-Thr-Thr-Asp-His-Gln-Met-Ala-Arg-Xaa-Cys-Asp-Asp-Cys-Cys-Gly-Gly-Xaa-Gly-Arg-Gly-Lys-Cys-Tyr-Gly-Pro-Gln-Cys-Leu-Cys-Arg-OH乙酸盐(二硫键，空气氧化的)，其中Xaa是Arg或Ala。
在另一个实施例中，肽可具有下式：H-Met-Cys-Met-Pro-Cys-Phe-Thr-Thr-Asp-His-Gln-Met-Ala-Arg-Arg-Cys-Asp-Asp-Cys-Cys-Gly-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Lys-Cys-Tyr-Gly-Pro-Gln-Cys-Leu-Cys-Arg-OH乙酸盐(二硫键，空气氧化的)。
在另一个实施例中，肽可具有下式：H-Met-Cys-Met-Pro-Cys-Phe-Thr-Thr-Asp-His-Gln-Met-Ala-Arg-Arg-Cys-Asp-Asp-Cys-Cys-Gly-Gly-Ala-Gly-Arg-Gly-Lys-Cys-Tyr-Gly-Pro-Gln-Cys-Leu-Cys-Arg-OH乙酸盐(二硫键，空气氧化的)。
在另一个实施例中，肽可具有下式：H-Met-Cys-Met-Pro-Cys-Phe-Thr-Thr-Asp-His-Gln-Met-Ala-Arg-Ala-Cys-Asp-Asp-Cys-Cys-Gly-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Lys-Cys-Tyr-Gly-Pro-Gln-Cys-Leu-Cys-Arg-OH乙酸盐(二硫键，空气氧化的)。
在另一个实施例中，肽可具有下式：H-Met-Cys-Met-Pro-Cys-Phe-Thr-Thr-Asp-His-Gln-Met-Ala-Arg-Ala-Cys-Asp-Asp-Cys-Cys-Gly-Gly-Ala-Gly-Arg-Gly-Lys-Cys-Tyr-Gly-Pro-Gln-Cys-Leu-Cys-Arg-OH乙酸盐(二硫键，空气氧化的)。
在某些实施例中，氯毒素和氯毒素变体可与多种部分缀合，如在受试者中可以检测出的(例如可视化的)可检测标记物(例如染料)。在一些实施例中，氯毒素和/或氯毒素变体可缀合至可检测标记物，以使能追踪缀合的肽的生物分布。可检测标记物可包括荧光染料。可以在本披露中被用作共扼分子的荧光染料的非限制性实例包括罗丹明、对甲氨基酚、荧光素、硫代荧光素、氨基荧光素、羧基荧光素、氯代荧光素、甲基荧光素、磺基荧光素、氨基对甲氨基酚、羧基对甲氨基酚、氯代对甲氨基酚、甲基对甲氨基酚、磺基对甲氨基酚、氨基罗丹明、羧基罗丹明、氯代罗丹明、甲基罗丹明、磺基罗丹明、以及硫代罗丹明、菁、吲哚碳菁、氧杂碳菁、噻碳菁、部花青、菁染料(例如菁2、菁3、菁3.5、菁5、菁5.5、菁7)、噁二唑衍生物、吡啶基噁唑、硝基苯噁二唑、苯并硝基苯、芘衍生物、瀑布蓝、噁嗪衍生物、尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170、吖淀衍生物、前黄素、吖啶橙、吖啶黄、芳基甲川衍生物、金胺、噻吨染料、磺化噻吨染料、亚历克萨荧光(AlexaFluor)(例如亚历克萨荧光594、亚历克萨荧光633、亚历克萨荧光647、亚历克萨荧光700)、结晶紫、孔雀绿、四吡咯衍生物、卟啉、酞菁、以及胆红素。一些其他实例染料包括近红外染料，如但不限于Cy5.5、吲哚菁绿(ICG)、DyLight750或IRdye800。在一些实施例中，近红外染料可包括菁染料。
化疗药物、抗癌药物以及抗癌剂包括但不限于放射性同位素、毒素、酶、致敏药物、核酸(包括干扰RNA)、抗体、抗血管生成剂、顺铂、抗代谢药、有丝分裂抑制剂、生长因子抑制剂、紫杉醇、替莫唑胺、拓扑替康、氟尿嘧啶、长春新碱、长春花碱、丙卡巴肼、氨烯咪胺、六甲蜜胺、甲氨蝶呤、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨、喷司他丁、阿糖孢苷、阿扎胞苷、依托泊苷、替尼泊苷、伊立替康、多西他赛、阿霉素、柔红霉素、更生霉素、伊达比星、普卡霉素、丝裂霉素、博来霉素、三苯氧胺、氟他米特、亮丙瑞林、戈舍瑞林、氨鲁米特(aminogluthimide)、阿那曲唑、安吖啶、天冬酰胺酶、米托蒽醌、米托坦和氨磷汀，以及其等同物，连同光消融。
如在此使用的，关于数字的术语“约”和“大约”在此用于包括在任一方向上(大于或小于)落入10％、5％、或1％范围的数字，除非数字另有指明或另外从上下文明显可见(除了会超过可能值的100％的这种数字)。
适合的诊断剂包括通过荧光法以及除荧光成像外的方法提供用于检测的试剂。其他适合的诊断剂包括放射性标记(例如放射性同位素标记的化合物)，如125I、14C、以及31P等；以及磁共振成像剂。
适合的靶向剂包括抗体、多肽、多糖以及核酸。
在本发明的另一方面，提供了包括修饰的氯毒素肽缀合物的组合物。该组合物可包括用于递送修饰的氯毒素肽缀合物的药学上可接受的载体或稀释剂。适合的药学上可接受的载体或稀释剂包括注射用盐水以及右旋糖。
在不同方面中，本文所述化合物进一步包括可检测标记物，该可检测标记物可用于检测肽-标记物缀合物以及与它们所结合的癌性细胞。
在不同方面中，本披露的化合物具有化学式(I)的结构，或其药学上可接受的盐：
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R15、以及R16各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6亚烷基-COOH、磺酸酯、-COOH、-SO2-NH2、C1-C6烷氧基、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-O-、或C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-NR10-；
R9是氢、磺酸酯、-COOH、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-O-、或C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-NR10-；
L1是C3-C6亚烷基；
L2是C1-C10亚烷基；
L3是键、-O-、-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-、-O-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-(O-C1-C6亚烷基)n-、-NR10-L4-、-NR10-C1-C6亚烷基-NR11-(C(＝O)-C1-C6亚烷基-O-)m-、或-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-；
L4是键、-杂环基-、或-杂环基-C1-C6亚烷基-；
R10是氢或C1-C6烷基；
R11是氢或C1-C6烷基；
R12和R13各自独立地选自氢、C1-C6烷基，或R12和R13连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R14是氢或C1-C6亚烷基、-(L5)-芳基、-(L5)-芳基-A5、-(L5)-杂芳基、-(L5)-杂芳基-A5、-NR17R18，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
L5是键、C1-C10亚烷基、-O-、或-NR10-；
R17和R18各自独立地是氢或芳基；
R19和R20各自独立地选自氢、C1-C6烷基，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
n是0、1、2或3；
m是0、1、2或3；
p是0、1、2或3；
q是0、1、2或3；
x是0或1；并且
A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段，并且A1、A2、A3、A4、或A5中其他项各自独立地不存在、是氢、-COOH、或磺酸酯。
在不同方面中，本文所述化合物进一步包括可检测标记物，该可检测标记物可用于检测肽-标记物缀合物以及与它们所结合的癌性细胞。
在不同方面中，本披露的化合物具有化学式(XV)的结构，或其药学上可接受的盐：
其中：
R3、R4、R5、R6、R15、以及R16各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6亚烷基-COOH、磺酸酯、-COOH、-SO2-NH2、C1-C6烷氧基、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-O-、或C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-NR10-；
R9是氢、磺酸酯、-COOH、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-O-、或C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-NR10-；
L1是C3-C6亚烷基；
L2是C1-C10亚烷基；
L3是键、-O-、-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-、-O-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-(O-C1-C6亚烷基)n-、-NR10-L4-、-NR10-C1-C6亚烷基-NR11-(C(＝O)-C1-C6亚烷基-O-)m-、或-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-；
L4是键、-杂环基-、或-杂环基-C1-C6亚烷基-；
R10是氢或C1-C6烷基；
R11是氢或C1-C6烷基；
R12和R13各自独立地选自氢、C1-C6烷基，或R12和R13连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R14是氢或C1-C6亚烷基、-(L5)-芳基、-(L5)-芳基-A5、-(L5)-杂芳基、-(L5)-杂芳基-A5、-NR17R18，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
L5是键、C1-C10亚烷基、-O-、或-NR10-；
R17和R18各自独立地是氢或芳基；
R19和R20各自独立地选自氢、C1-C6烷基，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R21和R22各自独立地选自氢、C1-C6烷基，磺酸酯，或R21和R22连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元芳基；
R23和R24各自独立地选自氢、C1-C6烷基，磺酸酯，或R23和R24连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元芳基；
n是0、1、2或3；
m是0、1、2或3；
p是0、1、2或3；
q是0、1、2或3；
x是0或1；并且
A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段，并且A1、A2、A3、A4、或A5中其他项各自独立地不存在、是氢、-COOH、或磺酸酯。
在一些方面中，本披露的化合物具有化学式(II)的结构，或其药学上可接受的盐：
在某些方面中，本披露的化合物具有化学式(III)的结构，或其药学上可接受的盐：
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R15、以及R16各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6亚烷基-COOH、磺酸酯、-COOH、-SO2-NH2、或C1-C6烷氧基；
R9是氢、磺酸酯、或-COOH；
L1是C3-C6亚烷基；
L2是C1-C10亚烷基；
L3是键、-O-、-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-、-O-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-(O-C1-C6亚烷基)n-、-NR10-L4-、-NR10-C1-C6亚烷基-NR11-(C(＝O)-C1-C6亚烷基-O-)m-、或-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-；
L4是键、-杂环基-、或-杂环基-C1-C6亚烷基-；
R10是氢或C1-C6烷基；
R11是氢或C1-C6烷基；
R12和R13独立地选自氢、C1-C6烷基，或R12和R13连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R14是氢或C1-C6亚烷基、-(L5)-芳基、-(L5)-杂芳基、-NR17R18，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
L5是键、C1-C10亚烷基、-O-、-NR10-；
R17和R18各自独立地是氢或芳基；
R19和R20独立地选自氢、C1-C6烷基，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
n是0、1、2或3；
m是0、1、2或3；
p是0、1、2或3；
q是0、1、2或3；并且
A4是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段。
在其他方面中，本披露的化合物具有化学式(IV)的结构，或其药学上可接受的盐：
其中：
R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8、R15、以及R16各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6亚烷基-COOH、磺酸酯、-COOH、-SO2-NH2、或C1-C6烷氧基；
R3选自C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-O-、或C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-NR10-；
R9是氢、磺酸酯、或-COOH、或C1-C10烷基；
L1是C3-C6亚烷基；
L2是C1-C10亚烷基；
L3是氢、磺酸酯、-COOH、C1-C10烷基；
L4是键、-杂环基-、或-杂环基-C1-C6亚烷基-；
R10是氢或C1-C6烷基；
R11是氢或C1-C6烷基；
R12和R13独立地选自氢、C1-C6烷基，或R12和R13连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R14是氢或C1-C6亚烷基、-(L5)-芳基、-(L5)-杂芳基、-NR17R18，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
L5是键、C1-C10亚烷基、-O-、-NR10-；
R17和R18各自独立地是氢或芳基；
R19和R20独立地选自氢、C1-C6烷基，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
n是0、1、2或3；
m是0、1、2或3；
p是0、1、2或3；
q是0、1、2或3；
x是0或1；并且
A1是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段。
在其他方面中，本披露的化合物具有化学式(V)的结构，或其药学上可接受的盐：
其中：
R1、R2、R3、R4、R6、R7、R8、R15、以及R16各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6亚烷基-COOH、磺酸酯、-COOH、-SO2-NH2、或C1-C6烷氧基；
R5选自C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-O-、或C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-NR10-；
R9是氢、磺酸酯、或-COOH、或C1-C10烷基；
L1是C3-C6亚烷基；
L2是C1-C10亚烷基；
L3是氢、磺酸酯、-COOH、或C1-C10烷基；
L4是键、-杂环基-、或-杂环基-C1-C6亚烷基-；
R10是氢或C1-C6烷基；
R11是氢或C1-C6烷基；
R12和R13独立地选自氢、C1-C6烷基，或R12和R13连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R14是氢或C1-C6亚烷基、-(L5)-芳基、-(L5)-杂芳基、-NR17R18，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
L5是键、C1-C10亚烷基、-O-、-NR10-；
R17和R18各自独立地是氢或芳基；
R19和R20独立地选自氢、C1-C6烷基，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
n是0、1、2或3；
m是0、1、2或3；
p是0、1、2或3；
q是0、1、2或3；
x是0或1；并且
A2是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段。
在一些方面中，本披露的化合物具有化学式(VI)的结构，或其药学上可接受的盐：
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R15、以及R16各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6亚烷基-COOH、磺酸酯、-COOH、-SO2-NH2、或C1-C6烷氧基；
R9选自C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-O-、或C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-NR10-；
L1是C3-C6亚烷基；
L2是C1-C10亚烷基；
L3是氢、磺酸酯、-COOH、或C1-C10烷基；
L4是键、-杂环基-、或-杂环基-C1-C6亚烷基-；
R10是氢或C1-C6烷基；
R11是氢或C1-C6烷基；
R12和R13独立地选自氢、C1-C6烷基，或R12和R13连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R14是氢或C1-C6亚烷基、-(L5)-芳基、-(L5)-杂芳基、-NR17R18，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R17和R18各自独立地是氢或芳基；
R19和R20独立地选自氢、C1-C6烷基，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
n是0、1、2或3；
m是0、1、2或3；
p是0、1、2或3；
q是0、1、2或3；
x是0或1；
L5是键、C1-C10亚烷基、-O-、-NR10-；
A3是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段。
在另外的方面中，本披露的化合物具有化学式(III)的结构，或其药学上可接受的盐：
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R15、以及R16各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6亚烷基-COOH、磺酸酯、-COOH、-SO2-NH2、或C1-C6烷氧基；
R9是氢、磺酸酯、或-COOH；
L1是C3-C6亚烷基；
L2是C1-C10亚烷基；
L3是键、-O-、-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-、-O-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-(O-C1-C6亚烷基)n-、-NR10-L4-、-NR10-C1-C6亚烷基-NR11-(C(＝O)-C1-C6亚烷基-O-)m-、或-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-；
L4是键、-杂环基-、或-杂环基-C1-C6亚烷基-；
R10是氢或C1-C6烷基；
R11是氢或C1-C6烷基；
R12和R13独立地选自氢、C1-C6烷基，或R12和R13连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R14是-(L5)-芳基-A5、或-(L5)-杂芳基-A5；
L5是键、C1-C10亚烷基、-O-、-NR10-；
R17和R18各自独立地是氢或芳基；
R19和R20独立地选自氢、C1-C6烷基，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
n是0、1、2或3；
m是0、1、2或3；
p是0、1、2或3；
q是0、1、2或3；
x是0或1；
A4是氢、-COOH、或磺酸酯；并且
A5是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段。
在某些方面，A1、A2以及A3不存在。在一些方面，A5是氢。在某些方面，R3、R4、R5以及R6各自独立地是C1-C6烷基。在一些方面，R3、R4、R5、R6各自独立地是甲基。在某些方面，R1、R2、R7、R8、R15、以及R16各自独立地选自氢或磺酸酯。在其他方面，R1、R2、R7、R8、R15、以及R16各自独立地是氢。在一些方面，R12、R13、R14、R19、R20各自独立地是氢。
在某些方面，R12以及R13连同它们所附接的原子连接在一起形成六元碳环。在其他方面，R12以及R13连同它们所附接的原子连接在一起形成五元碳环。在某些方面，R14以及R19连同它们所附接的原子连接在一起形成六元碳环。在一些方面，R14以及R20连同它们所附接的原子连接在一起形成六元碳环。在某些方面，L1是C3-C6亚烷基。在其他方面，L1是C3-C5亚烷基。在仍其他方面，L1是亚丙基。在仍其他方面，L1是亚丁基。在其他方面，L1是亚戊基。在一些方面，L2是C3-C6亚烷基。在其他方面，L2是亚丙基。在仍其他方面，L2是亚丁基。在其他方面，L2是亚戊基。在一些方面，R9是磺酸酯。在其他方面，R9是氢。在一些方面，R14是氢。在其他方面，R14是-(L5)-芳基。在仍其他方面，R14是-(L5)-芳基-A5。
在一些方面，R1是氢。在某些方面，R2是氢。在一些方面，R3是甲基。在某些方面，R4是甲基。在一些方面，R5是甲基。在某些方面，R6是甲基。在一些方面，R7是氢。在某些方面，R8是氢。在一些方面，R12是氢。在某些方面，R13是氢。在一些方面，R14是氢。在某些方面，R19是氢。在一些方面，R20是氢。在某些方面，R10是氢。在一些方面，R11是氢。
在一些方面，R17和R18独立地是苯基。在一些方面，L3选自键、-O-、-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-、-O-NR10-、或-NR10-L4-。在其他方面，L3是键。
在一些方面，L4是-杂环基-或-杂环基-C1-C6亚烷基-。在其他方面，L4是-哌嗪基-(C1-C6亚烷基)-。在仍其他方面，L4是
在一些方面，p为1。在某些方面，q是1。
在一些方面，该化合物具有化学式(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)、或(XIV)中任一项的结构：
在一些方面，A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少87％序列一致性的多肽或其片段。在其他方面，A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少90％序列一致性的多肽或其片段。在仍其他方面，A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少92％序列一致性的多肽或其片段。在仍其他方面，A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少95％序列一致性的多肽或其片段。在仍其他方面，A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少97％序列一致性的多肽或其片段。在仍其他方面，A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有100％序列一致性的多肽或其片段。在仍其他方面，A1、A2、A3、A4、或A5中之一是具有序列MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR的多肽或其片段。
在一些方面，A1、A2、A3、A4、或A5的片段具有至少25个氨基酸残基的长度。在其他方面，A1、A2、A3、A4、或A5的片段具有至少27个氨基酸残基的长度。在仍其他方面，A1、A2、A3、A4、或A5的片段具有至少29个氨基酸残基的长度。在仍其他方面，A1、A2、A3、A4、或A5的片段具有至少31个氨基酸残基的长度。在仍其他方面，A1、A2、A3、A4、或A5的片段具有至少33个氨基酸残基的长度。
在一些方面，A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段，该多肽或其片段具有天然氯毒素的肿瘤细胞结合亲和力。在某些方面，A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段，该多肽或其片段具有与天然氯毒素基本相同的肿瘤细胞结合亲和力。在一些方面，A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段，该多肽或其片段具有天然氯毒素的肿瘤细胞结合亲和力，其中A1、A2、A3、A4、或A5中之一具有选自SEQIDNOS:1-481的序列。
在一些方面，该多肽包括至少一个赖氨酸氨基酸残基。在某些方面，该多肽包括单个赖氨酸氨基酸残基。在一些方面，该多肽包括一个、两个或三个赖氨酸氨基酸残基。在一些方面，该多肽在与天然氯毒素的K-27对应的位置处包括赖氨酸残基。在一些方面，该多肽在与天然氯毒素的K-23对应的位置处包括赖氨酸残基。在一些方面，该多肽在与天然氯毒素的K-15对应的位置处包括赖氨酸残基。
在一些方面，该多肽的一个或多个氨基酸被非天然存在的氨基酸残基取代。在其他方面，非天然存在的氨基酸残基是瓜氨酸氨基酸残基。在仍其他方面，L3在A4的瓜氨酸氨基酸残基处附接到该多肽。
在一些方面，L3在A4的赖氨酸氨基酸残基处附接到该多肽。在某些方面，L3在A4的N-端处附接到该多肽。在一些方面，L3在A4的C-端处附接到该多肽。在一些方面，R3在A1的赖氨酸氨基酸残基、A1的瓜氨酸氨基酸残基、A1的N-端、或A1的C-端处附接到该多肽。在一些方面，R5在A2的赖氨酸氨基酸残基、A2的瓜氨酸氨基酸残基、A2的N-端、或A2的C-端处附接到该多肽。在一些方面，R9在A3的赖氨酸氨基酸残基、A3的瓜氨酸氨基酸残基、A3的N-端、或A3的C-端处附接到该多肽。在一些方面，芳基在A5的赖氨酸氨基酸残基、A5的瓜氨酸氨基酸残基、A5的N-端、或A5的C-端处附接到该多肽。
在一些方面，该化合物具有如见于表2-13中化合物1至721中任一项的结构。
在一些方面，该化合物缀合至聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉、聚乙烯醇、水溶性聚合物、两性离子水溶性聚合物、水溶性聚(氨基酸)、白蛋白衍生物、或脂肪酸。
在一些方面，该多肽具有7.5至9.0的等电点。在一些方面，该多肽具有8.0至9.0的等电点。在一些方面，该多肽具有8.5至9.0的等电点。在一些方面，该多肽是碱性的并且具有大于7.5的等电点。
在一些方面，该多肽包括至少八个半胱氨酸氨基酸残基。在一些方面，该多肽包括八个半胱氨酸氨基酸残基。在一些方面，该多肽包括四个二硫键。在一些方面，该多肽包括六个至七个半胱氨酸氨基酸残基。在一些方面，该多肽包括三个二硫键。在一些方面，该多肽中半胱氨酸氨基酸残基之间的间隔与天然氯毒素中的基本相同。在一些方面，该多肽表面的电荷分布与天然氯毒素中的基本相同。
在一些方面，一个或多个甲硫氨酸氨基酸残基被被选自异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、甘胺酸、丙氨酸、或其组合的氨基酸残基替代。
在一些方面，该化合物能够穿越血脑屏障。在一些方面，该化合物进一步包括附接到A上的治疗剂。在其他方面，该治疗剂是细胞毒性剂。
在不同方面中，本披露提供了包括化合物的组合物，该化合物包括与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段，其中当将该组合物按从1mg至30mg的剂量经静脉内给予人类受试者时，该组合物在该人类受试者中产生至少110ng/mL至240ng/mL平均最大化合物血浆浓度(平均C最大)/1mg剂量给予的化合物。
在一些方面，该组合物的化合物是本披露中所描述的任何合适的化合物。
某些落入这些类别范围内的示例性化合物提供在下表2至13中，包括肽部分(表示为A)和可检测标记物部分两者。
表2.根据本披露的示例性化合物。
表3.根据本披露的示例性化合物。
表4.根据本披露的示例性化合物。
表5.根据本披露的示例性化合物。
表6.根据本披露的示例性化合物。
表7.根据本披露的示例性化合物。
表8.根据本披露的示例性化合物。
表9.根据本披露的示例性化合物。
表10.根据本披露的示例性化合物。
表11.根据本披露的示例性化合物。
表12.根据本披露的示例性化合物。
表13.根据本披露的示例性化合物。
在某些方面，本文所述的肽缀合至多种部分，如在受试者中检测出的(例如可视化的)可检测标记物(例如染料或放射性标记)。在一些方面，氯毒素和/或氯毒素变体缀合至可检测标记物，以使能追踪缀合的肽的生物分布。荧光部分共价偶联到氯毒素上以允许直接或通过如在此描述并且本领域普通技术人员已知的接头通过荧光成像进行缀合物的可视化。
在一些方面，荧光标记具有具体应用所需要的发射特性。例如，荧光标记是荧光染料，该荧光染料具有在500nm至1100nm范围之间、在600nm至1000nm范围之间、在600nm至800nm范围之间、在650nm至850nm范围之间、或在700nm至800nm范围之间的最大发射波长。再例如，荧光标记是荧光染料，该荧光染料具有在约500nm至约1100nm范围之间、在约600nm至约1000nm范围之间、在约600nm至约800nm范围之间、在约650nm至约850nm范围之间、或在约700nm至约800nm范围之间的最大发射波长。本领域技术人员会理解用作可检测标记物并且具有上述发射特性的各种染料。
一些其他示例性的染料包括近红外染料，如但不限于DyLight-680、DyLight-750、VivoTag-750、DyLight-800、IRDye-800、VivoTag-680、Cy5.5、或吲哚菁绿(ICG)。在一些方面，近红外染料通常包括菁染剂。在本披露中用作共扼分子的荧光染料的其他非限制性实例包括吖啶橙或吖啶黄、亚历克萨荧光(AlexaFluor)及其任何衍生物、7-放线菌素D、8-苯胺基萘-1-磺酸、ATTO染料及其任何衍生物、金胺-罗丹明染剂及其任何衍生物、本三佐宏恩(bensantrhone)、比曼恩(bimane)、9-10-双(苯乙炔基)蒽、5,12-双(苯乙炔基)并四苯、双苯酰亚胺、脑彩虹(brainbow)、钙荧光素、羧基荧光素及其任何衍生物、1-氯-9,10-双(苯乙炔基)蒽及其任何衍生物、DAPI、DiOC6、DyLight荧光(DyLightFluors)及其任何衍生物、艾吡可酮(epicocconone)、溴化乙锭、FlAsH-EDT2、福罗泰(Fluodye)及其任何衍生物、福若波(FluoProbe)及其任何衍生物、荧光素及其任何衍生物、福拉(Fura)及其任何衍生物、凝胶绿(GelGreen)及其任何衍生物、凝胶红(GelRed)及其任何衍生物、荧光蛋白及其任何衍生物、m同种型蛋白及其任何衍生物(如mCherry)、赫他明(hetamethine)染料及其任何衍生物、赫斯特(hoeschst)染剂、伊诺克马瑞(iminocoumarin)、印度黄、引多-1(indo-1)及其任何衍生物、来若丹(laurdan)、荧光黄及其任何衍生物、荧光素及其任何衍生物、荧光素酶及其任何衍生物、部花青及其任何衍生物、尼罗染料(niledyes)及其任何衍生物、苝、焰红染料、藻染料(phycodye)及其任何衍生物、碘化丙锭、比染因(pyranine)、罗丹明及其任何衍生物、瑞博绿(ribogreen)、RoGFP、红荧烯、芪及其任何衍生物、磺基罗丹明及其任何衍生物、SYBR及其任何衍生物、synapto-pHluorin、四苯基丁二烯、四钠三(tetrasodiumtris)、德克萨斯红、钛黄、TSQ、伞形酮、紫蒽酮染料、黄色荧光蛋白以及YOYO-1。其他适合的荧光染料包括但不限于荧光素和荧光素染料(例如荧光素异硫氰酸酯或FITC、萘并荧光素、4′,5′-二氯-2′,7′-二甲氧基荧光素、6-羧基荧光素或FAM等)、羰花青、部花青、苯乙烯染料、氧杂菁染料(oxonoldyes)、藻红蛋白、原藻红、曙红、罗丹明染料(例如羧基四甲基-罗丹明或TAMRA、羧基罗丹明6G、羧基-X-罗丹明(ROX)、丽丝胺罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基若丹明(TMR)等)、香豆素和香豆素染料(例如甲氧基香豆素、二烷基氨基香豆素、羟基香豆素、氨甲基香豆素(AMCA)等)、俄勒冈绿染料(例如俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514等)、德克萨斯红、德克萨斯红-X、SPECTRUMRED、SPECTRUMGREEN、菁染料(例如CY-3、Cy-5、CY-3.5、CY-5.5等)、ALEXAFLUOR染料(例如亚历克萨荧光染料350、亚历克萨荧光染料488、亚历克萨荧光染料532、亚历克萨荧光染料546、亚历克萨荧光染料568、亚历克萨荧光染料594、亚历克萨荧光染料633、亚历克萨荧光染料660、亚历克萨荧光染料680等)、氟硼荧(BODIPY)染料(例如氟硼荧FL、氟硼荧R6G、氟硼荧TMR、氟硼荧TR、氟硼荧530/550、氟硼荧558/568、氟硼荧564/570、氟硼荧576/589、氟硼荧581/591、氟硼荧630/650、氟硼荧650/665等)、IRDyes(例如IRD40、IRD700、IRD800等)以及类似物。在一些方面，本披露的缀合物包括其他染料，包括但不限于在下表14中提供的那些。
表14.示例性的荧光报道分子具有峰吸收(Abs.)以及峰发射(Em.)波长特异性(以纳米计)。
在一些其他方面，缀合化合物包括化学发光化合物、胶态金属、发光化合物、酶、放射性同位素、或顺磁标记。
在某些方面，本披露的缀合物缀合至放射性同位素而非其他类型的可检测试剂或除其他类型的可检测试剂之外还缀合至放射性同位素。适合用于本披露中化合物的某些同位素包括但不限于碘-131、碘-125、铋-212、铋-213、镥-177、铼-186、铼-188、钇-90、砹-211、磷-32和/或钐-153。在一些方面，本披露的缀合物包含一个或多个原子，这些原子具有与通常见于自然中的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数，包括但不限于氢、碳、氟、磷、铜、镓、钇、锝、铟、碘、铼、铊、铋、砹、钐、以及镥(例如3H、3H、13C、14C、18F、32P、35S、64Cu、67Ga、90Y、99MTc、111In、125I、123I、131I、135I、186Re、187Re、201Tl、212Bi、211At、153Sm和/或177Lu)。在其他方面，本披露的缀合物被顺磁金属离子标记，该离子是磁共振成象(MRI)中良好的对比度增强剂。此类顺磁金属离子的实例包括但不限于钆III(Gd3+)、铬111(Cr3+)、镝III(Dy3+)、铁111(Fe3+)、锰II(Mn2+)、以及镱III(Yb3+)。在某些实施例中，标记部分包括钆III(Gd3+)。
在一些方面，本披露的缀合物缀合至生物素。除了延长半衰期，生物素还充当亲和力手柄(affinityhandle)用于从组织或其他部位提取肽。在一方面，缀合物缀合至例如具有PEG接头的生物素酰胺酶耐受的生物素(例如NHS-dPEG4-生物素酰胺酶耐受的生物素)。在一些方面，使用了可同时充当可检测标记物和亲和力手柄的荧光生物素缀合物。可商购的荧光生物素缀合物的非限制性实例包括Atto425-生物素、Atto488-生物素、Atto520-生物素、Atto-550生物素、Atto565-生物素、Atto590-生物素、Atto610-生物素、Atto620-生物素、Atto655-生物素、Atto680-生物素、Atto700-生物素、Atto725-生物素、Atto740-生物素、荧光素生物素、生物素-4-荧光素、生物素-(5-荧光素)缀合物、以及生物素-B-藻红蛋白、亚历克萨荧光染料488生物胞素、亚历克萨荧光染料546、亚历克萨荧光染料549、荧光黄尸胺生物素-X、荧光黄生物胞素、俄勒冈绿488生物胞素、生物素-罗丹明以及四甲基若丹明生物胞素。
接头。在一些方面，本披露的肽直接缀合至可检测标记物，如染料、荧光部分或诸如此类，这样使得无另外的氨基酸、糖、核酸、聚合物、有机链或诸如此类添加至氯毒素或氯毒素变体和/或染料、荧光部分或诸如此类以包括在此描述的氯毒素缀合物。在一些其他方面，接头用于缀合氯毒素或氯毒素变体，该氯毒素或氯毒素变体未直接缀合至染料、荧光部分或诸如此类，这样使得另外的氨基酸、糖、核酸或诸如此类添加至氯毒素或氯毒素变体和/或染料、荧光部分或诸如此类以包括在此描述的氯毒素缀合物。如在此使用，术语“接头”是指包括两个官能团的至少一种化合物，所述官能团能够与其他部分特异地反应以形成共价键或非共价键。此类部分包括但不限于天然或非天然氨基酸上的或包含这类天然或非天然氨基酸的肽上的侧基团。通过举例，接头具有一个与第一肽上基团反应的官能团，以及另一个与第二肽上基团反应的官能团，由此形成包含第一肽、接头以及第二肽的缀合物。已知许多用于将不同化合物附接至肽的方法和接头分子。参见例如欧洲专利申请号188,256；美国专利号4,671,958、4,659,839、4,414,148、4,699,784；4,680,338；以及4,569,789，将其通过引用以其全文结合在此。
如在此使用的，术语“键”是指从接头的官能团与另一个分子之间的化学反应中形成的键或化学部分。此类键包括但不限于共价键和非共价键，而此类化学部分包括但不限于酯、碳酸酯、亚胺磷酸酯、腙、缩醛、原酸酯、肽键、以及寡核苷酸键。水解稳定的键意指在水中基本上稳定并且不与处于中性pH值的水反应的键，包括但不限于在生理条件下持续一段延长的时间，可能甚至无限期。水解不稳定或可降解键意指键在水中或在水溶液中，包括例如血，是可降解的。酶促不稳定或可降解键意指键通常被一种或多种酶降解。通过举例，PEG和相关的聚合物包括聚合物骨架中的或聚合物骨架与聚合物分子的一个或多个封端官能团之间的连接基团中的可降解键。此类可降解键包括但不限于通过PEG羧酸或活化的PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应形成的酯键，其中此类酯基通常在生理条件下水解以释放该生物活性剂。其他的水解可降解键包括但不限于碳酸酯键；由胺与醛反应形成的亚胺键；由醇与磷酸基团反应形成的磷酸酯键；酰肼和醛的反应产物腙键；醛和醇的反应产物缩醛键；甲酸和醇的反应产物原酸酯键；由胺基与肽的羧基在包括但不限于如PEG的聚合物的末端处形成的肽键；以及由亚磷酰胺基与寡核苷酸的5’羟基在包括但不限于聚合物的末端处形成的寡核苷酸键。
通过使用任何本领域公认的方法(该方法形成络合物，该络合物包括配体的共价键、离子键、或氢键)将用于在此描述的方法中使用的缀合物缀合至成像剂，直接或间接地经由连接基团，如接头。该缀合物通常是通过配体共价键合至成像剂而形成，这是通过络合物的各自组分上的酸、醛、羟基、氨基、或亚肼基之间形成酰胺、酯或亚氨键，或例如通过形成二硫键。
此外，缀合物接头部分的结构修饰在此予以考虑。例如，缀合物的接头部分常进行多个氨基酸置换，包括但不限于天然存在的氨基酸，以及可从常规合成法获得的那些氨基酸。在一方面，β、γ、和较长链氨基酸被用于代替一个或多个α氨基酸。在另一方面，对在此类分子中发现的手性中心的立体化学进行选择，以形成整个分子的光学纯度的各种混合物、或仅仅存在的手性中心的亚型。在另一方面，通过改变其中所含氨基酸的个数或者通过包含更多或更少β、γ、或较长链氨基酸来缩短或加长接头中所包含的肽链的长度。在另一方面，对肽部分中氨基酸侧链进行选择以特异地增加或减少接头部分的相对亲水性或总体地增加或减少整个分子的相对亲水性。
类似地，通常对此处所述接头的其他化学片段的长度及形状进行修饰。在一些方面，接头包括亚烷基链。亚烷基链通常长度不同、或包括支链基、或包括环状部分，它们相对于丙炔链成直线或螺旋状。在另一方面，当接头包括β硫醇可释放片段时，应理解，其他将硫醇端连接至羟基或碳酸端的干涉基团被用于代替亚乙基桥，如但不限于任选取代的苯甲基，其中羟基端在苄基碳处连接并且硫醇端经由苯基位置的邻位或对位连接，并且反之亦然。
氯毒素物的配制品缀合
在不同方面中，本披露提供了包含上述化合物和药学上可接受的载体的组合物。在一些方面，该组合物被配制成用于胃肠外给药。在其他方面，该组合物被配制成用于静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药或其组合。
在此描述的某些方法包括向该受试者静脉内给予药物组合物，该组合物包括例如，如在此描述的氯毒素缀合物。氯毒素缀合物的静脉内药物组合物包括适于通过任何静脉内方法给予受试者的任何配制品，包括推注剂(bolus)、随着时间的推移进行输注或任何其他本领域中已知的静脉内方法。在一些方面，输注的速率使得在少于5分钟、多于5分钟但少于15分钟或多于15分钟的时间段内给予该剂量。在其他方面，输注的速率使得在少于5分钟的时间段内给予该剂量。在其他方面，输注的速率使得在多于5分钟并且少于15分钟的时间段内给予该剂量。在一些其他方面，输注的速率使得在多于15分钟的时间段内给予该剂量。
“产品”或“剂型”用于本文是指任何用于给药的固体、半固体、冻干、水性、液体或冷冻的配制品或制剂。在给药时，活性部分从产品中释放的速率往往在很大程度上受构成产品本身赋形剂和/或产品特性影响。例如，片剂上的肠溶衣被设计成用于将片剂成分与胃内容物分隔开来，以防止，例如，通常诱发胃肠不适或损伤的胃的降解。根据目前被接受的传统理解，活性部分的全身性暴露将对小的配制品变化变得较不敏感。
如在此使用的，“药学上可接受的”或者“药理学上可接受的”包括当给予如适当的受试者时，不产生不利的、过敏的或者其他不良反应的分子实体和组合物。“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和试剂用于药物活性成分的用途在本领域内是熟知的。除非任何常规介质或试剂与所述活性成分不相容，否则预期其在治疗性组合物中的用途。通常还将补充活性成份掺入组合物中。
在不同方面中，本发明组合物包括作为活性药物成分的化合物的浓缩物，其具有1mg/mL至40mg/mL的浓度。在其他方面，该化合物的浓度为1mg/mL至20mg/mL。在仍其他方面，该化合物的浓度为4mg/mL至10mg/mL。在另外的方面中，该化合物的浓度为5mg/mL至8mg/mL。在又另外的方面中，该化合物的浓度为5mg/mL至6mg/mL。
在一些方面，药学上可接受的载体包括tris、D-甘露醇、以及基本上6.8的pH。在其他方面，这些组合物基本上由tris、D-甘露醇、以及6.8的pH组成。
在一些方面，药学上可接受的载体包括组氨酸和甘露醇。在一些方面，药学上可接受的载体包括组氨酸和具有聚山梨酯20的甘露醇。在一些方面，药学上可接受的载体包括L-组氨酸、D-甘露醇、L-甲硫氨酸、以及基本上6.8的pH。在另外的方面中，该药学上可接受的载体基本上由L-组氨酸、D-甘露醇、L-甲硫氨酸、以及6.8的pH组成。
在一些方面，该药学上可接受的载体包括L-组氨酸、D-甘露醇、聚山梨酯20、以及基本上6.8的pH。在一些方面，该药学上可接受的载体包括L-组氨酸、D-甘露醇、以及基本上6.8的pH。在一些方面，该药学上可接受的载体包括L-组氨酸、D-甘露醇、聚山梨酯20、海藻糖、以及基本上6.8的pH。
根据已知方法，将包含氯毒素缀合物的药物组合物进行配制，以制备药学上有用的组合物，例如，如见于“ExcipientSelectioninParenteralFormulationDevelopment(胃肠外制剂发展中的赋形剂选择)”Pramanick等人，PharmaTimes，第45卷，第3期，2013年3月，将其通过引用以其整体结合在此。在一些方面，该氯毒素缀合物与药学上可接受的载体组合。组合物被称为药学上可接受的载体，如果它的给药被受者患者所忍受的话。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上可接受的载体的一个实例。其他合适的载体是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Gennaro(詹纳罗)(编辑)，Remington’sPharmaceuticalSciences(雷明顿的药物科学)，第19版，(MackPublishingCompany(Mack出版公司)，1995)。
通常以(但不限于)液体、固体或半固体产品或剂型，例如片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂或冻干产品，提供用于给予氯毒素缀合物的配制品。在一些方面，将该氯毒素缀合物配制为除药物载体之外不包括其他物质。在一些其他方面，将该氯毒素缀合物进行配制，使得其包括核心“基质材料”，所述材料封装、结合至、包被或邻近于该氯毒素缀合物。在一些其他方面，该氯毒素缀合物和基质材料进一步包括保护性包衣。各种配制品是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Gennaro(詹纳罗)(编辑)，Remington’sPharmaceuticalSciences(雷明顿的药物科学)，第19版，(MackPublishingCompany(Mack出版公司)，1995)。
用于同氯毒素缀合物一起使用的合适的赋形剂通常包含在用于静脉内使用的配制品中，例如注射液。注射液是一种或多种活性成分在合适的运载体或载体中的无菌、无热原溶液或分散体(乳液或悬浮液)。注射液是应保持足够稳定的分散体，以使得震摇后取出均一剂量。更确切地说，优选包括氯毒素缀合物和一种或多种但不限于合适的赋形剂(例如帮助调整所给予的氯毒素缀合物的PK特征的基质材料、粘合剂、润滑剂、助流剂或崩解剂)的配制品。在一些方面，包括氯毒素缀合物与一种或多种合适的赋形剂以及一种或多种特定的产品性状(如溶出度或含水量)相结合的组合物导致氯毒素缀合物在体内的药物代谢动力学曲线改进。因而，此处包括的氯毒素缀合物剂型/产品的体内性能是基于在生产过程中添加的赋形剂的组合物和/或通过特殊处理参数和方法产生的最终产品性状。其他的赋形剂是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Gennaro(詹纳罗)(编辑)，Remington’sPharmaceuticalSciences(雷明顿的药物科学)，第19版，(MackPublishingCompany(Mack出版公司)，1995)。
适合的用于静脉内给药的载体包括(例如但不限于)生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，Tris，以及含有增溶剂(如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇)、添加剂(如组氨酸、右旋糖、甘露醇)及其混合物的溶液。在一些方面，用于静脉内给药的载体包括组氨酸和右旋糖、Tris和右旋糖或Tris和甘露醇的混合物。其他的载体是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Gennaro(詹纳罗)(编辑)，Remington’sPharmaceuticalSciences(雷明顿的药物科学)，第19版，(MackPublishingCompany(Mack出版公司)，1995)。
配制品通常包含水性载体。水性载体包括，例如且不限于氯化钠溶液、林格氏溶液、等渗右旋糖溶液、无菌水溶液、葡萄糖和乳酸钠林格氏溶液。非水性载体包括，例如且不限于植物来源的不挥发性油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油、苯甲酸苄酯、蓖麻油、N,N-二甲基乙酰胺、乙醇、无水乙醇、甘油(glycerin)、丙三醇(glycerol)、N-甲基-2-吡咯烷酮、聚乙二醇及其任何衍生物、丙二醇、红花油以及大豆油。其他的载体是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Gennaro(詹纳罗)(编辑)，Remington’sPharmaceuticalSciences(雷明顿的药物科学)，第19版，(MackPublishingCompany(Mack出版公司)，1995)。
在一些方面，组合物药学上可接受的载体包括渗压剂。在一些方面，该渗压剂包括糖、糖醇或其组合。
在某些方面，该组合物包括糖醇，该糖醇选自山梨糖醇、肌醇、甘露醇、木糖醇以及丙三醇或其组合。在其他方面，该糖醇包括甘露醇。在某些方面，该组合物包含2％至20％(wt/vol％)的甘露醇。在一些方面，该组合物包含2％至10％(wt/vol％)的甘露醇。在其他方面，该组合物基本上包含5％(wt/vol％)的甘露醇。
在其他方面，该组合物包括糖。在某些方面，该糖选自海藻糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖、果糖、右旋糖或其组合。在另外的方面中，该糖选自海藻糖、蔗糖或其组合。在一些方面，该组合物包含1％至40％(wt/vol％)的海藻糖、蔗糖、或海藻糖和蔗糖的组合。在其他方面，该组合物包含1％至20％(wt/vol％)的海藻糖、蔗糖、或海藻糖和蔗糖的组合。在另外的方面中，该组合物包含2％(wt/vol％)的海藻糖、蔗糖、或海藻糖和蔗糖的组合。
在某些方面，该组合物进一步包含渗压剂，该渗压剂选自甘氨酸、肉毒碱、乙醇胺、其磷酸盐、单糖或其组合。
在一些方面，本发明组合物是等渗的。在其他方面，本发明组合物基本上是等渗的。
在某些方面，该组合物的离子强度小于50mM。在其他方面，该组合物的离子强度小于10mM。
通常将抑细菌浓度或抑真菌浓度的抗微生物剂添加到包装在多剂量容器内的制剂中，所述抗微生物剂包括，例如且不限于，酚或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。其他抗微生物剂是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Gennaro(詹纳罗)(编辑)，Remington’sPharmaceuticalSciences(雷明顿的药物科学)，第19版，(MackPublishingCompany(Mack出版公司)，1995)。
缓冲剂包括，例如且不限于乙酸盐、硫酸铵、氢氧化铵、精氨酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸钠、苯甲酸、碳酸盐、碳酸钠、二氧化碳、柠檬酸盐、二乙醇胺、葡萄糖酸-δ-内酯、甘氨酸、甘氨酸HCl、组氨酸、组氨酸HCl、盐酸、氢溴酸、赖氨酸马来酸、葡甲胺、甲磺酸、单乙醇胺、磷酸盐、磷酸钠、柠檬酸盐、琥珀酸钠、硫酸、酒石酸钠、缓血酸胺(trmethamine)、柠檬酸钠、氢氧化物、氢氧化钠、Tris碱、Tris碱-65、Tris乙酸盐、TrisHCl、以及TrisHCl-65。
在不同方面中，该药学上可接受的载体包括缓冲剂。在一些方面，该缓冲剂选自tris、HEPES、组氨酸、乙二胺或其组合。在其他方面，该缓冲剂选自tris、组氨酸或其组合。在其他方面，该缓冲剂包括组氨酸，其可任选地是L-组氨酸。在另外的方面中，该组合物包含至少100mM组氨酸。在其他方面，该组合物包含至少50mM组氨酸。在一些方面，该组合物包含至少20mM组氨酸。在另外的方面中，该组合物包含10至100mM组氨酸。在其他方面，该组合物包含10至20mM组氨酸。
抗氧化剂包括，例如且不限于硫酸氢钠、丙酮硫酸氢钠、氩、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸钠、抗坏血酸、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、半胱氨酸、塞斯纳特Hcl(cystenateHcl)、连二亚硫酸钠、龙胆酸、龙胆酸乙醇胺、谷氨酸一钠、谷胱甘肽、甲酸合次硫酸氢钠(formaldehydesolfoxylatesodium)、焦亚硫酸钾、焦亚硫酸钠、甲硫氨酸、单硫代甘油、氮、没食子酸丙酯、亚硫酸钠、生育酚α、α生育酚氢化琥珀酸盐以及巯基乙酸钠(thioglycolyatesodium)。
在一些方面，这些组合物包含抗氧化剂、自由基清除剂、淬灭剂、抗氧化剂协同剂或其组合。
在一些方面，该抗氧化剂选自甲硫氨酸、丁羟甲苯、丁羟茴醚、没食子酸丙酯或其组合。在其他方面，该抗氧化剂包括甲硫氨酸。在其他方面，该抗氧化剂是L-甲硫氨酸。在某些方面，这些组合物包含至少20mM甲硫氨酸。在其他方面，这些组合物包含至少10mM甲硫氨酸。
悬浮剂、乳化剂和/或分散剂包括，例如且不限于羧基甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、聚山梨酯80(80)以及聚乙烯吡咯烷酮。
在不同方面中，这些组合物包括表面活性剂。在某些方面，该表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80、普朗尼克、聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯、聚乙烯单月桂酸酯、N-乙酰葡萄糖苷或其组合。在某些方面，该表面活性剂是聚山梨酯20。在其他方面，这些组合物包含0.0001％至0.1％(wt/vol％)的聚山梨酯20。在另外的方面中，这些组合物包括环糊精。在其他方面，该环糊精包括(2-羟丙基)-β-环糊精。
金属离子的掩蔽剂或螯合剂包括，例如且不限于EDTA钙二钠、EDTA二钠、EDTA钠、维瑟他明钙钠(calciumversetamindesodium)、钙立醇以及DPTA。在一些方面，本发明组合物包括金属螯合剂。在某些方面，该金属螯合剂选自EDTA、甲磺酸去铁胺、EGTA、富马酸、以及苹果酸、其盐、或其组合。在其他方面，该金属螯合剂包括EDTA或其盐。在某些方面，这些组合物具有约0.1mg/ml至约1.0mg/ml的EDTA浓度。
其他等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮分散剂、乳化剂以及螯合剂是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Gennaro(詹纳罗)(编辑)，Remington’sPharmaceuticalSciences(雷明顿的药物科学)，第19版，(MackPublishingCompany(Mack出版公司)，1995)。
药物载体还包括，例如且不限于用于水混溶性载体的乙醇、聚乙二醇和丙二醇以及氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。其他的药物载体是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Gennaro(詹纳罗)(编辑)，Remington’sPharmaceuticalSciences(雷明顿的药物科学)，第19版，(MackPublishingCompany(Mack出版公司)，1995)。
通常使用多个参数(包括例如且不限于pH、摩尔浓度、％重量/体积、％体积/体积等)对在此描述的氯毒素缀合物进行配制。在氯毒素缀合物的配制、稳定性、贮藏、运输中所考虑的其他因素包括例如且不限于气体环境、容器材料、容器颜色、盖材料、盖颜色、其他方面的存在，如抗氧化剂、稳定剂、光保护化合物、保护剂、糖、离子螯合剂、离子供体或诸如此类。通常将本领域普通技术人员已知用作上述因素中任一项的任何因素与在此描述的氯毒素缀合物一起使用，但不限于如此。
根据本发明所公开的内容，药物或药理学组合物的制备是本领域的普通技术人员已知的。用于配制和给药的通用技术见于“Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(雷明顿：药物科学与实践)，第20版”，LippincottWilliams&Wilkins(利平科特威廉姆斯&威尔金斯)，费城，Pa。片剂、胶囊、药丸、粉剂、颗粒、糖锭剂、凝胶、浆液、软膏剂、溶液栓剂、注射液、吸入剂以及气雾剂是此类制剂的实例。
通常将氯毒素缀合物在不同温度下储存，包括例如且不限于冷冻(例如在约-20℃、约-70℃、约-100℃、约-120℃、约-150℃、约-200℃或高于约-200℃下)、冷藏(例如在约10℃、约5℃、约4℃、约2℃、约0℃、约-2℃或高于约-5℃下)、或任何其他以使得组合物保持稳定的适合温度。
在一些方面，包含在此描述的化合物的组合物作为冻干固体贮存。在一些方面，本披露提供了用于生产冻干组合物的方法，该方法包括提供该组合物；并且冻干该组合物，从而生产该冻干组合物。
使用冻干，可能以维持生理或最佳pH、等渗性以及稳定性的方式贮藏化合物。此类材料包括pH缓冲剂、防腐剂、张力调整剂、抗氧化剂、其他聚合物(例如粘度调节剂或增充剂)以及赋形剂以稳定不稳定蛋白对抗干燥的压力以及干燥产品的贮藏。此类添加剂的特定说明性实例包括磷酸盐、柠檬酸盐、或硼酸盐缓冲剂；硫柳汞；山梨酸；对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、已经三氯叔丁醇防腐剂；氯化钠；聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮；甘露醇、右旋糖、葡聚糖、乳糖、蔗糖、乙二胺四乙酸等。本领域中已知的合适的制剂(Remington’sPharmaceuticalSciences(雷明顿药物科学)(最新版)MackPublishingCompany(马克出版公司)，Easton(伊斯顿)，Pa.；Arakawa(荒川)等人(1990)，同上；Carpenter(卡彭特)等人(1991)，同上；以及Pikal(皮卡尔)(1990)，同上)。
在某些方面，该药学上可接受的载体包括重构稳定剂。在其他方面，该重构稳定剂包括水溶性聚合物。在另外的方面中，该水溶性聚合物选自泊洛沙姆(polaxamer)、多元醇、聚乙二醇、聚乙烯醇、羟乙基淀粉、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮聚(丙烯酸)或其组合。
术语“重构稳定剂”意指任何能够防止重构的蛋白质在水性介质中聚集的赋形剂。具有对于本发明所必要性状的赋形剂是本领域熟知的，并且通常通过电荷排斥、位阻、疏水结合或特异性高亲和力结合至干燥蛋白的机制发挥作用。示例性赋形剂包括各种渗压剂、各种盐、水溶性合成以及天然聚合物、表面活性剂、硫酸多糖、载体蛋白、缓冲剂等(Manning(曼宁)等人(1989)，PharmaceuticalResearch(药学研究)，6:903-918；以及Paborji等人(1994)，PharmaceuticalResearch(药学研究)，11:764-771)。
将本披露的化合物和有效量的重构稳定剂在有效减少本披露的化合物在用重构介质(例如溶剂以及任选其他组分，如抗菌剂)重构时凝聚的条件下混合。重构稳定剂可以与化合物在重构之前、过程中或之后合适的时间混合；优选地，该重构稳定剂将预先溶解于重构介质中。化合物在这样的温度下重构，该温度高于重构介质的冰点，但不会降解化合物并且不会有害于该重构稳定剂；优选地，该温度将在约2℃至50℃之间。混合重构稳定剂和干燥的化合物所需的时间应该是足以制备适合的混合物的一段时间；优选地，混合将持续1至30分钟的时间。一般来说，在重构不久后使用重构的配制品。
在某些方面，本发明组合物从冻干形式重构。在其他方面，本披露提供了用于生产重构组合物的方法，该方法包括提供冻干组合物；并且用溶液重构该组合物，以生产重构组合物。在不同方面中，该重构溶液包括水。在一些方面，该重构溶液选自无菌水、生理盐溶液、葡萄糖溶液或其他水性溶剂(例如醇，如乙基、正丙基或异丙基、丁醇)或其组合，它们能够溶解干燥的组合物并且可与所选给药途径配伍，并且不会负面干扰化合物以及所使用的重构稳定剂。
储存容器
在一些方面，在配制之后将氯毒素缀合物置于容器中。通常容器包括例如且不限于玻璃，例如琥珀玻璃或无色玻璃。容器通常包括例如且不限于塑料、橡胶、金属、生物降解材料或诸如此类本领域技术人员已知的，并且是任何颜色、无色、不透明或透明的。在一些方面，在配制之后将氯毒素缀合物置于容器中并且密封。通常，密封是盖，例如，盖是塑料、橡胶、金属、生物降解材料、其组合或诸如此类本领域技术人员已知的，并且是任何颜色、无色、不透明或透明的，有时是薄膜。在一些方面，容器中含有气体，通常用以提高氯毒素缀合物的稳定性或阻止氧气接触氯毒素缀合物。例如，气体包括例如且不限于惰性气体，如氮或氩、偶尔地稀有气体，并且以任何合适的浓度适应。
在一些方面，本披露的化合物储存在含有玻璃的容器中，尤其是I型玻璃，该玻璃已经经受冲洗或萃取处理，该处理减少玻璃表面中/上存在的可萃取的三价以及二价金属离子的水平。此类处理包括浸渍热(优选地至少90℃)水或另外的水性介质(例如硫酸铵溶液)中或用其萃取，或用二氧化硫处理。
在一些方面，本披露的化合物储存在含有USP1型硼硅玻璃小瓶的容器中，该小瓶具有13mm基于氯丁基的塞子，塞上有弗泰克(flourotech)涂层，并且顶部有B2涂层，并且铝覆盖密封，具有翻转上盖。
在某些方面，本披露的化合物储存在内衬有铝箔的腔中。在一些方面，该腔包括干燥的惰性气氛，优选地氮，以及干燥剂或吸氧剂。
在不同方面中，本披露提供了包括容器的试剂盒，该容器被构造成包含液体；在此描述的化合物以及组合物中的任一种；以及附着于该容器的弹性封堵物。
在一些方面，该试剂盒进一步包括遮光物。在其他方面，该遮光物是物理屏障，该物理屏障被构造成为组合物遮挡至少部分入射到容器上的光。在仍其他方面，该物理屏障包括不透明或半透明的材料。
在一些方面，该容器是玻璃小瓶。在其他方面，该玻璃小瓶包括透明或琥珀玻璃。在一些方面，该玻璃小瓶是未处理的玻璃容器。在某些方面，该玻璃小瓶包括USPI型、II型、III型、或IV型玻璃。在一些方面，该容器的内部进一步包括二氧化硅(SiO2)涂层或硅酮涂层。在一些方面，该未处理的玻璃容器选自安瓿瓶、小瓶、即用型注射器、或圆柱状管(carpoule)。
在一些方面，该弹性封堵物是卤代丁基橡胶塞。在其他方面，该卤代丁基橡胶塞选自氯丁基橡胶塞或溴丁基橡胶塞。在一些方面，用弗泰克、B2或其组合涂覆弹性封堵物。
在一些方面，该试剂盒进一步包括围绕该容器的不透明的次级包装。在某些方面，该不透明的次级包装包括不透明的盒、不透明的铝箔小袋或其组合。在其他方面，该不透明的次级包装被构造成为组合物遮挡至少90％入射到包装外部上的光。在仍其他方面，该不透明的次级包装被构造成为组合物遮挡至少95％入射到包装外部上的光。在仍其他方面，该不透明的次级包装被构造成为组合物遮挡至少99％入射到包装外部上的光。在仍其他方面，该不透明的次级包装被构造成为组合物遮挡至少99.9％入射到包装外部上的光。
在一些方面，该容器包括与组合物接触的减氧环境。在某些方面，该容器包括与组合物接触的惰性气体。在一些方面，将该组合物用惰性气体进行喷淋，从而在该容器中产生减氧环境。在某些方面，该惰性气体包括氮气或氩气。
化合物的剂量和毒性
由用于生成配制品(如粉末剂、冻干组合物等)的加工方法和/或参数引起的产品或剂型性状包括但不限于密度、含水量、脆性、分解、溶解特性曲线、形状、尺寸、重量、均匀性以及颗粒的组成。这些产品性状通常以多种方式进行调整并且影响制剂最终的体外和/或体内性能。产品或剂型性状通常是赋形剂选择、赋形剂组成、所应用的生产方法或以上任意的组合的结果。赋形剂连同最终剂型的产品性状(包括加工方法或加工参数)的组合将最终决定活性成分在体内的药物代谢动力学曲线。所给予的在此描述的氯毒素缀合物配制品通常在以下特定条件下进行加工或生产，例如混合方法(包括筛分粒度、rpm、以及碾磨)、干燥时间、条件、环境参数(例如温度和湿度)及其组合)，它们本身调整氯毒素组合物在体内的药物代谢动力学曲线(即提高平均C最大或AUC)。为了定量比较一种配制品与另一种配制品，通常测量若干这些产品或剂型性状。当试图复制多批次时，这也是需要的。
溶解和从配制品中的药物释放取决于许多因素，包括活性成分的溶解度和浓度、赋形剂的性质和组成、含量均一性、含水量、产品形状和大小、孔隙度、分解时间和其他因素。在体外从最终剂型中释放药物或活性成分通常特征在于在标准条件下(使用美国药典(USP)或类似接受的方法供参考)并且在合适的pH(通常是中性pH)下其溶解特性曲线。溶解特性曲线显示出在特定条件下药物随时间释放进入测试介质的数量。标准条件在合适的pH下使用缓冲剂以便最好地模拟受试者血液的pH。
通常将治疗有效剂量配制成含有剂量为至少约0.1mg高达至约1.5mg或更多(如大于1.5mg)的氯毒素缀合物。在一些方面，有效剂量被配制为包含至少约0.01mg、约0.02mg、约0.03mg、约0.5mg、约0.07mg、约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.35mg、约0.375mg、约0.4mg、约0.5mg、约0.6mg、约0.7mg、约0.75mg、约0.8mg、约0.9mg、约1mg、约1.3mg、约1.4mg、约1.5mg、约1.8mg、约1.9mg、约2mg、约2.4mg、约3mg、约5mg、约6mg、约7mg、约12mg、约18mg或约60mg更多剂量的氯毒素缀合物。在一个示例性方面，对于小鼠剂量为0.1mg，对于狗剂量为1mg，对于大鼠剂量为0.3mg，对于猴剂量为0.6mg以及对于人类剂量为3mg。给予受试者氯毒素缀合物的量通常为关于在此列出的总和。在一些方面，对于在此列出的每个量，给予受试者氯毒素缀合物的量通常为大约每毫克、克或千克的受试者重量。在其他方面，对于在此列出的每个量，给予受试者氯毒素缀合物的量通常为大约每毫升或升的液体体积。在另外其他方面，对于在此列出的每个量，给予受试者氯毒素缀合物的量通常为大约每平方毫米、平方厘米或平方米的受试者体表面积或受试者体面积。
本文所用术语“给药方案”是指用于向受试者静脉内给予药物配制品的方案，该静脉内药物配制品包括氯毒素缀合物。在一些方面，给药方案包括给药量和给药间隔。在一些方面，给药方案进一步包括给药持续时间。本文所用“给药持续时间”是指给予剂量所持续的时间。
在一些方面，使用固定或缩放给药方案向受试者给予氯毒素缀合物的剂量。例如，固定给药方案包括通过静脉内给药途径向受试者给予单次剂量或连续剂量的氯毒素缀合物，其中该固定的剂量是，例如但不限于，约3mg至约6mg并且不考虑受试者的年龄、重量、身高、身体质量指数、新陈代谢或类似物或不为之调整。例如，缩放给药方案包括通过静脉内给药途径向受试者给予单次剂量或连续剂量的氯毒素缀合物，其中该缩放的剂量是，例如但不限于，约3mg至约6mg并且考虑受试者的年龄、重量、身高、身体质量指数、新陈代谢或类似物或为之调整。在一些方面，对于受试者其固定的剂量和/或缩放的剂量的确定取决于给予不同受试者的剂量，其中这些受试者是或不是同一物种，例如小鼠和人或大鼠和人、或狗和人或猴和人或非人类灵长动物和人。通常以固定的剂量，给予所有受试者相同的剂量或大约相同的剂量，例如小鼠和人或大鼠和人、或狗和人或猴和人或非人类灵长动物和人。在一些方面，给予受试者缩放的剂量的确定取决于给予不同受试者的剂量，其中这些受试者是或不是同一物种，例如小鼠和人或大鼠和人、或狗和人或猴和人或非人类灵长动物和人。因此，基于小鼠、大鼠、狗、猴或非人类灵长动物与人在如受试者年龄、重量、身高、新陈代谢、大小或等等因素方面的差异，缩放的剂量自向小鼠、大鼠、狗、猴或非人类灵长动物给予的剂量升高至向人给予的剂量。在优选方面，剂量在大鼠和人类之间缩放。
在手术之前、在手术过程中向受试者给予此描述的化合物以及组合物和/或将从该受试者切离的组织与氯毒素缀合物的组合物接触。在一些方面，在手术之前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约9小时、约12小时、约24小时、约36小时、约48小时或约72小时向受试者静脉内给予氯毒素缀合物的组合物。在一些方面，在手术之前0至1小时之间、1至2小时之间、2至3小时之间、3至4小时之间、4至5小时之间、5至6小时之间、6至9小时之间、9至12小时之间、12至24小时之间、24至36小时之间、36至48小时之间或48至72小时之间(包括在内的)向受试者静脉内给予氯毒素缀合物的组合物。在给予氯毒素缀合物之前，通常将组织或体液样品从受试者中分离出来，有时作为基线基准。通常在给予本披露的化合物少于约1分钟之后、约2分钟之后、约3分钟之后、约4分钟之后、约5分钟之后、约6分钟之后、约7分钟之后、约8分钟之后、约9分钟之后、约10分钟之后、约11分钟之后、约12分钟之后、约13分钟之后、约14分钟之后、约15分钟之后、约20分钟之后、约30分钟之后、约40分钟之后、约50分钟之后、约60分钟之后、约1小时之后、约2小时之后、约3小时之后、约4小时之后、约5小时之后、约6小时之后、约12小时之后、约18小时之后、约24小时之后、约36小时之后、约48小时之后、约72小时之后、约96小时之后、约5天之后、约7天之后、约10天之后、约14天之后、约21天之后、约4周之后、约6周之后、约8周之后、约12周之后、约16周之后、约20周之后或超过20周之后也从受试者中分离样品。
药物代谢动力学
在此描述的方法以及组合物涉及向受试者静脉内给予氯毒素缀合物的药物代谢动力学。通常使用模型描述药物代谢动力学，例如房室模型或非房室模型。房室模型包含但不限于单房室模型、二房室模型、多房室模型或类似物。模型通常分为不同房室并且通过对应方案进行描述。例如，一种方案是吸收、分布、代谢以及排泄(ADME)方案。再例如，另一种方案是释放、吸收、分布、代谢以及排泄(LADME)方案。在一些方面，代谢和排泄被归类为一个房室，被称为消除房室。例如，释放包括从释药系统中释放组合物的活性部分，吸收包括由受试者吸收组合物的活性部分，分布包括组合物通过血浆分布至不同组织，代谢包括组合物的代谢或失活，而最后排泄包括组合物或组合物的代谢产物的排泄或消除。通常，向受试者静脉内给予的组合物经受多相吸收，包括但不限于组织分布以及代谢/排泄的方面。这样，组合物的血浆浓度的减少通常是双相的，包括例如α相位以及β相位，偶尔观察到γ、δ或其他相位。在一些方面，在此描述的组合物的生物利用度是绝对生物利用度，通常1％或100％给予的静脉内给药。
药物代谢动力学包括确定至少一个与向受试者静脉内给予氯毒素缀合物相关的参数。在一些方面，参数包括至少剂量(D)、给药间隔(τ)、曲线下面积(AUC)、饱和浓度(C最大)、在给予随后的剂量之前达到的最低浓度(C最小)、最短时间(T最小)、达到C最大的最大时间(T最大)、分布体积(Vd)、时刻0处回推的浓度(C0)、稳态浓度(Css)、消除速率常数(ke)、输注速率(kin)、清除率(kin)、生物利用度(f)波动(％PTF)以及消除半衰期(T1/2)。在另一个方面中，C最大、C0、以及AUC以剂量依赖性的方式增加。
在此描述的化合物具有对于在此列出的药物代谢动力学参数中的至少一个的值并且是本领域普通技术人员已知的。通常，将对于药物代谢动力学参数的值作为数据记录、观察、测量、处理、分析等等。药物代谢动力学参数是任何适用于描述在此描述的氯毒素缀合物的血浆或血清曲线的参数。例如，通常在给药后例如，约0分钟、约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟、约21分钟、约22分钟、约23分钟、约24分钟、约25分钟、约26分钟、约27分钟、约28分钟、约29分钟、约30分钟、约31分钟、约32分钟、约33分钟、约34分钟、约35分钟、约36分钟、约37分钟、约38分钟、约39分钟、约40分钟、约41分钟、约42分钟、约43分钟、约44分钟、约45分钟、约46分钟、约47分钟、约48分钟、约49分钟、约50分钟、约51分钟、约52分钟、约53分钟、约54分钟、约55分钟、约56分钟、约57分钟、约58分钟、约59分钟、约60分钟、约0小时、约0.5小时、约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时、约5小时、约5.5小时、约6小时、约6.5小时、约7小时、约7.5小时、约8小时、约8.5小时、约9小时、约9.5小时、约10小时、约10.5小时、约11小时、约11.5小时、约12小时、约12.5小时、约13小时、约13.5小时、约14小时、约14.5小时、约15小时、约15.5小时、约16小时、约16.5小时、约17小时、约17.5小时、约18小时、约18.5小时、约19小时、约19.5小时、约20小时、约20.5小时、约21小时、约21.5小时、约22小时、约22.5小时、约23小时、约23.5小时、或约24小时获得药物代谢动力学曲线。
药物代谢动力学参数是任何适用于描述在此描述的氯毒素缀合物的血浆或血清曲线的参数。在一些方面，剂量(D)包括(通过举例但不限于)约0.01mg、约0.02mg、约0.03mg、约0.5mg、约0.07mg、约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.35mg、约0.375mg、约0.4mg、约0.5mg、约0.6mg、约0.7mg、约0.75mg、约0.8mg、约0.9mg、约1mg、约1.3mg、约1.4mg、约1.5mg、约1.8mg、约1.9mg、约2mg、约2.4mg、约3mg、约5mg、约6mg、约7mg、约12mg、约18mg或约60mg更多的氯毒素缀合物。在一些方面，给药间隔(τ)包括(通过举例但不限于)在手术之前约12小时、约24小时、约36小时、约48小时或约72小时。
药物代谢动力学参数是任何适用于描述在此描述的氯毒素缀合物的血浆或血清曲线的参数。在一些方面，曲线下面积(AUC)包括(通过举例但不限于)不少于约50hr*ng/mL、不少于约75hr*ng/mL、不少于约100hr*ng/mL、不少于约125hr*ng/mL、不少于约150hr*ng/mL、不少于约175hr*ng/mL、不少于约200hr*ng/mL、不少于约250hr*ng/mL、不少于约300hr*ng/mL、不少于约350hr*ng/mL、不少于约400hr*ng/mL、不少于约500hr*ng/mL、不少于约600hr*ng/mL、不少于约700hr*ng/mL、不少于约800hr*ng/mL、不少于约900hr*ng/mL、不少于约1000hr*ng/mL、不少于约2000hr*ng/mL、不少于约3000hr*ng/mL、不少于约4000hr*ng/mL、不少于约5000hr*ng/mL、不少于约6000hr*ng/mL、不少于约7000hr*ng/mL、不少于约8000hr*ng/mL、不少于约9000hr*ng/mL、不少于约10000hr*ng/mL、不少于约11000hr*ng/mL、不少于约12000hr*ng/mL、不少于约13000hr*ng/mL、不少于约14000hr*ng/mL、不少于约15000hr*ng/mL、不少于约16000hr*ng/mL、不少于约17000hr*ng/mL、不少于约18000hr*ng/mL、不少于约19000hr*ng/mL、不少于约20000hr*ng/mL、不少于约21000hr*ng/mL、不少于约22000hr*ng/mL、不少于约23000hr*ng/mL、不少于约24000hr*ng/mL、不少于约25000hr*ng/mL、不少于约26000hr*ng/mL、不少于约27000hr*ng/mL、不少于约28000hr*ng/mL、不少于约29000hr*ng/mL、不少于约30000hr*ng/mL、不少于约31000hr*ng/mL、不少于约32000hr*ng/mL、不少于约33000hr*ng/mL、不少于约34000hr*ng/mL、不少于约35000hr*ng/mL、不少于约40000hr*ng/mL、不少于约45000hr*ng/mL、不少于约50000hr*ng/mL、不少于约55000hr*ng/mL、不少于约60000hr*ng/mL、不少于约65000hr*ng/mL、不少于约70000hr*ng/mL、不少于约75000hr*ng/mL、不少于约80000hr*ng/mL、不少于约85000hr*ng/mL、不少于约90000hr*ng/mL、不少于约95000hr*ng/mL、不少于约100000hr*ng/mL、不少于约125000hr*ng/mL、不少于约150000hr*ng/mL、不少于约175000hr*ng/mL、不少于约200000hr*ng/mL、不少于约250000hr*ng/mL、不少于约300000hr*ng/mL、不少于约350000hr*ng/mL、不少于约400000hr*ng/mL、不少于约450000hr*ng/mL、不少于约500000hr*ng/mL、不少于约550000hr*ng/mL、不少于约600000hr*ng/mL、不少于约650000hr*ng/mL、不少于约700000hr*ng/mL、不少于约750000hr*ng/mL、不少于约800000hr*ng/mL、不少于约850000hr*ng/mL、不少于约900000hr*ng/mL、不少于约950000hr*ng/mL、不少于约1000000hr*ng/mL、不少于约1100000hr*ng/mL、不少于约1200000hr*ng/mL、不少于约1300000hr*ng/mL、不少于约1400000hr*ng/mL、不少于约1500000hr*ng/mL、不少于约1600000hr*ng/mL、不少于约1700000hr*ng/mL、不少于约1800000hr*ng/mL、不少于约1900000hr*ng/mL、不少于约2000000hr*ng/mL或适合于描述在此描述的氯毒素缀合物的药物代谢动力学曲线的任何其他AUC。
在此描述的氯毒素的AUC通过举例可以是，但不限于，约1,000hr*ng/mL至约1,250hr*ng/mL；约1,250hr*ng/mL至约1,500hr*ng/mL；约1,500hr*ng/mL至约1,750hr*ng/mL；约1,750hr*ng/mL至约2,000hr*ng/mL；约2,000hr*ng/mL至约2,500hr*ng/mL；约2,500hr*ng/mL至约3,000hr*ng/mL；约3,000hr*ng/mL至约3,500hr*ng/mL；约3,500hr*ng/mL至约4,000hr*ng/mL；约4,000hr*ng/mL至约4,500hr*ng/mL；约4,500hr*ng/mL至约5,000hr*ng/mL；约5,000hr*ng/mL至约5,500hr*ng/mL；约5,500hr*ng/mL至约6,000hr*ng/mL；约6,000hr*ng/mL至约6,500hr*ng/mL；约6,500hr*ng/mL至约7,000hr*ng/mL；约7,000hr*ng/mL至约7,500hr*ng/mL；约7,500hr*ng/mL至约8,000hr*ng/mL；约8,000hr*ng/mL至约8,500hr*ng/mL；约8,500hr*ng/mL至约9,000hr*ng/mL；约9,000hr*ng/mL至约9,500hr*ng/mL；约9,500hr*ng/mL至约10,000hr*ng/mL；约10,000hr*ng/mL至约20,000hr*ng/mL；约20,000hr*ng/mL至约30,000hr*ng/mL；约30,000hr*ng/mL至约40,000hr*ng/mL；约40,000hr*ng/mL至约50,000hr*ng/mL；约50,000hr*ng/mL至约60,000hr*ng/mL；约60,000hr*ng/mL至约70,000hr*ng/mL；约70,000hr*ng/mL至约80,000hr*ng/mL；约80,000hr*ng/mL至约90,000hr*ng/mL；约90,000hr*ng/mL至约100,000hr*ng/mL；约100,000hr*ng/mL至约150,000hr*ng/mL；约150,000hr*ng/mL至约200,000hr*ng/mL；约200,000hr*ng/mL至约250,000hr*ng/mL；约250,000hr*ng/mL至约300,000hr*ng/mL；约300,000hr*ng/mL至约350,000hr*ng/mL；约350,000hr*ng/mL至约400,000hr*ng/mL；约400,000hr*ng/mL至约450,000hr*ng/mL；约450,000hr*ng/mL至约500,000hr*ng/mL；约500,000hr*ng/mL至约550,000hr*ng/mL；约550,000hr*ng/mL至约600,000hr*ng/mL；约600,000hr*ng/mL至约650,000hr*ng/mL；约650,000hr*ng/mL至约700,000hr*ng/mL；约700,000hr*ng/mL至约750,000hr*ng/mL；约750,000hr*ng/mL至约800,000hr*ng/mL；约800,000hr*ng/mL至约850,000hr*ng/mL；约850,000hr*ng/mL至约900,000hr*ng/mL；约900,000hr*ng/mL至约950,000hr*ng/mL；约950,000hr*ng/mL至约1,000,000hr*ng/mL；约1,000,000hr*ng/mL至约1,100,000hr*ng/mL；约1,100,000hr*ng/mL至约1,200,000hr*ng/mL；约1,200,000hr*ng/mL至约1,300,000hr*ng/mL；约1,300,000hr*ng/mL至约1,400,000hr*ng/mL；约1,40,000hr*ng/mL至约1,500,000hr*ng/mL；或约1,50,000hr*ng/mL至约2,000,000hr*ng/mL。
药物代谢动力学参数是任何适用于描述在此描述的氯毒素缀合物的参数。C最大包括(通过举例但不限于)不少于约1ng/mL；不少于约5ng/mL；不少于约10ng/mL；不少于约15ng/mL；不少于约20ng/mL；不少于约25ng/mL；不少于约50ng/mL；不少于约75ng/mL；不少于约100ng/mL；不少于约200ng/mL；不少于约300ng/mL；不少于约400ng/mL；不少于约500ng/mL；不少于约600ng/mL；不少于约700ng/mL；不少于约800ng/mL；不少于约900ng/mL；不少于约1000ng/mL；不少于约1250ng/mL；不少于约1500ng/mL；不少于约1750ng/mL；不少于约2000ng/mL；不少于约2100ng/mL；不少于约2200ng/mL；不少于约2300ng/mL；不少于约2400ng/mL；不少于约2500ng/mL；不少于约2600ng/mL；不少于约2700ng/mL；不少于约2800ng/mL；不少于约2900ng/mL；不少于约3000ng/mL；不少于约3100ng/mL；不少于约32000ng/mL；不少于约3300ng/mL；不少于约3400ng/mL；不少于约3500ng/mL；不少于约3600ng/mL；不少于约3700ng/mL；不少于约3800ng/mL；不少于约3900ng/mL；不少于约4000ng/mL；不少于约4500ng/mL；不少于约5000ng/mL；不少于约5500ng/mL；不少于约6000ng/mL；不少于约6500ng/mL；不少于约2700ng/mL；不少于约7500ng/mL；不少于约8000ng/mL；不少于约8500ng/mL；不少于约9000ng/mL；不少于约9500ng/mL；不少于约10000ng/mL；不少于约11000ng/mL；不少于约12000ng/mL；不少于约13000ng/mL；不少于约14000ng/mL；不少于约15000ng/mL；不少于约16000ng/mL；不少于约17000ng/mL；不少于约18000ng/mL；不少于约19000ng/mL；不少于约20000ng/mL；不少于约25000ng/mL；不少于约30000ng/mL；不少于约35000ng/mL；不少于约40000ng/mL；不少于约45000ng/mL；不少于约50000ng/mL；不少于约55000ng/mL；不少于约60000ng/mL；不少于约65000ng/mL；不少于约70000ng/mL；不少于约750000ng/mL；不少于约80000ng/mL；不少于约85000ng/mL；不少于约90000ng/mL；不少于约95000ng/mL；不少于约100000ng/mL；或适合于描述在此描述的氯毒素缀合物的药物代谢动力学曲线的任何其他C最大。C最大是例如约1ng/mL至约100,000ng/mL；约1ng/mL至约95,00ng/mL；约1ng/mL至约90,000ng/mL；约1ng/mL至约8500ng/mL；约1ng/mL至约80000ng/mL；约1ng/mL至约7500ng/mL；约1ng/mL至约70,000ng/mL；约1ng/mL至约6500ng/mL；约1ng/mL至约60,000ng/mL；约1ng/mL至约55000ng/mL；约1ng/mL至约50000ng/mL；约1ng/mL至约40000ng/mL；约1ng/mL至约30000ng/mL；约1ng/mL至约20000ng/mL；约1ng/mL至约10000ng/mL；约1ng/mL至约5000ng/mL；约1ng/mL至约1000ng/mL；约1ng/mL至约500ng/mL；约1ng/mL至约500ng/mL；约1ng/mL至约1000ng/mL；约1ng/mL至约5000ng/mL；约10000ng/mL至约5,000ng/mL；约10ng/mL至约7,000ng/mL；约10ng/mL至约10,000ng/mL；约10ng/mL至约10,500ng/mL；约10ng/mL至约100,000ng/mL；约10ng/mL至约90000ng/mL；约10ng/mL至约80000ng/mL；约10ng/mL至约70000ng/mL；约10ng/mL至约60000ng/mL；约10ng/mL至约50000ng/mL；约10ng/mL至约40000ng/mL；约10ng/mL至约30000ng/mL；约10ng/mL至约20000ng/mL；约10ng/mL至约10000ng/mL；约10ng/mL至约5000ng/mL；约25000ng/mL至约50000ng/mL；约250ng/mL至约10000ng/mL；约500ng/mL至约50000ng/mL；约50ng/mL至约10000ng/mL；约100ng/mL至约50000ng/mL；约100ng/mL至约40000ng/mL；约100ng/mL至约30000ng/mL；或约100ng/mL至约20000ng/mL。
在此描述的氯毒素缀合物的血浆浓度包括(通过举例但不限于)不少于约1ng/mL、不少于约2ng/mL、不少于约3ng/mL、不少于约4ng/mL、不少于约5ng/mL、不少于约6ng/mL、不少于约7ng/mL、不少于约8ng/mL、不少于约9ng/mL、不少于约10ng/mL、不少于约11ng/mL、不少于约12ng/mL、不少于约13ng/mL、不少于约14ng/mL、不少于约15ng/mL、不少于约16ng/mL、不少于约17ng/mL、不少于约18ng/mL、不少于约19ng/mL、不少于约20ng/mL、不少于约21ng/mL、不少于约22ng/mL、不少于约23ng/mL、不少于约24ng/mL、不少于约25ng/mL、不少于约26ng/mL、不少于约27ng/mL、不少于约28ng/mL、不少于约29ng/mL、不少于约30ng/mL、不少于约31ng/mL、不少于约32ng/mL、不少于约33ng/mL、不少于约34ng/mL、不少于约35ng/mL、不少于约36ng/mL、不少于约37ng/mL、不少于约38ng/mL、不少于约39ng/mL、不少于约40ng/mL、不少于约41ng/mL、不少于约42ng/mL、不少于约43ng/mL、不少于约44ng/mL、不少于约45ng/mL、不少于约46ng/mL、不少于约47ng/mL、不少于约48ng/mL、不少于约49ng/mL、不少于约50ng/mL、不少于约51ng/mL、不少于约52ng/mL、不少于约53ng/mL、不少于约54ng/mL、不少于约55ng/mL、不少于约56ng/mL、不少于约57ng/mL、不少于约58ng/mL、不少于约59ng/mL、不少于约60ng/mL、不少于约61ng/mL、不少于约62ng/mL、不少于约63ng/mL、不少于约64ng/mL、不少于约65ng/mL、不少于约66ng/mL、不少于约67ng/mL、不少于约68ng/mL、不少于约69ng/mL、不少于约70ng/mL、不少于约71ng/mL、不少于约72ng/mL、不少于约73ng/mL、不少于约74ng/mL、不少于约75ng/mL、不少于约76ng/mL、不少于约77ng/mL、不少于约78ng/mL、不少于约79ng/mL、不少于约80ng/mL、不少于约81ng/mL、不少于约82ng/mL、不少于约83ng/mL、不少于约84ng/mL、不少于约85ng/mL、不少于约86ng/mL、不少于约87ng/mL、不少于约88ng/mL、不少于约89ng/mL、不少于约90ng/mL、不少于约91ng/mL、不少于约92ng/mL、不少于约93ng/mL、不少于约94ng/mL、不少于约95ng/mL、不少于约96ng/mL、不少于约97ng/mL、不少于约98ng/mL、不少于约99ng/mL、不少于约100ng/mL、不少于约105ng/mL、不少于约110ng/mL、不少于约115ng/mL、不少于约120ng/mL、不少于约125ng/mL、不少于约130ng/mL、不少于约135ng/mL、不少于约140ng/mL、不少于约145ng/mL、不少于约150ng/mL、不少于约155ng/mL、不少于约160ng/mL、不少于约165ng/mL、不少于约170ng/mL、不少于约175ng/mL、不少于约180ng/mL、不少于约185ng/mL、不少于约190ng/mL、不少于约195ng/mL、不少于约200ng/mL、不少于约205ng/mL、不少于约210ng/mL、不少于约215ng/mL、不少于约220ng/mL、不少于约225ng/mL、不少于约230ng/mL、不少于约235ng/mL、不少于约240ng/mL、不少于约245ng/mL、不少于约250ng/mL、或在此描述的氯毒素缀合物的任何其他血浆浓度。
血浆浓度包括(通过举例但不限于)约1ng/mL至约2ng/mL；约1ng/mL至约5ng/mL；约5ng/mL至约10ng/mL；约10ng/mL至约25ng/mL；约25ng/mL至约50ng/mL；约50ng/mL至约75ng/mL；约75ng/mL至约100ng/mL；约100ng/mL至约150ng/mL；约100ng/mL至约200ng/mL；约150ng/mL至约200ng/mL；约200ng/mL至约250ng/mL；约250ng/mL至约300ng/mL；约300ng/mL至约350ng/mL；约350ng/mL至约400ng/mL；约400ng/mL至约450ng/mL；约450ng/mL至约500ng/mL；约500ng/mL至约600ng/mL；约600ng/mL至约700ng/mL；约700ng/mL至约800ng/mL；约800ng/mL至约900ng/mL；约900ng/mL至约1,000ng/mL；约1,000ng/mL至约1,100ng/mL；约1,100ng/mL至约1,200ng/mL；约1,200ng/mL至约1,300ng/mL；约1,300ng/mL至约1,400ng/mL；约1,400ng/mL至约1,500ng/mL；约1,500ng/mL至约1,600ng/mL；约1,600ng/mL至约1,700ng/mL；约1,700ng/mL至约1,800ng/mL；约1,800ng/mL至约1,900ng/mL；约1,900ng/mL至约2,000ng/mL；约2,000ng/mL至约3,000ng/mL；约3,000ng/mL至约4,000ng/mL；约4,000ng/mL至约5,000ng/mL；约5,000ng/mL至约6,000ng/mL；约6,000ng/mL至约7,000ng/mL；约7,000ng/mL至约8,000ng/mL；约8,000ng/mL至约9,000ng/mL；或约9,000ng/mL至约10,000ng/mL。
在此描述的氯毒素缀合物的T最大包括(通过举例但不限于)不大于约0.5分钟、不大于约1分钟、不大于约1.5分钟、不大于约2分钟、不大于约2.5分钟、不大于约3分钟、不大于约3.5分钟、不大于约4分钟、不大于约4.5分钟、不大于约5分钟、或适合于描述在此描述的氯毒素缀合物的药物代谢动力学曲线的任何其他T最大。T最大进一步包括(通过举例但不限于)约0.1分钟至约24分钟；约0.1分钟至约0.5分钟；约0.5分钟至约1分钟；约1分钟至约1.5分钟；约1.5分钟至约2分钟；约2分钟至约2.5分钟；约2.5分钟至约3分钟；约3分钟至约3.5分钟；约3.5分钟至约4分钟；约4分钟至约4.5分钟；约4.5分钟至约5分钟；约5分钟至约5.5分钟；约5.5分钟至约6分钟；约6分钟至约6.5分钟；约6.5分钟至约7分钟；约7分钟至约7.5分钟；约7.5分钟至约8分钟；约8分钟至约8.5分钟；约8.5分钟至约9分钟；约9分钟至约9.5分钟；约9.5分钟至约10分钟；约10分钟至约10.5分钟；约10.5分钟至约11分钟；约11分钟至约11.5分钟；约11.5分钟至约12分钟；约12分钟至约12.5分钟；约12.5分钟至约13分钟；约13分钟至约13.5分钟；约13.5分钟至约14分钟；约14分钟至约14.5分钟；约14.5分钟至约15分钟；约15分钟至约15.5分钟；约15.5分钟至约16分钟；约16分钟至约16.5分钟；约16.5分钟至约17分钟；约17分钟至约17.5分钟；约17.5分钟至约18分钟；约18分钟至约18.5分钟；约18.5分钟至约19分钟；约19分钟至约19.5分钟；约19.5分钟至约20分钟；约20分钟至约20.5分钟；约20.5分钟至约21分钟；约21分钟至约21.5分钟；约21.5分钟至约22分钟；约22分钟至约22.5分钟；约22.5分钟至约23分钟；约23分钟至约23.5分钟；约23.5分钟至约24分钟；约24分钟至约25分钟；约25分钟至约25.5分钟；约25.5分钟至约26分钟；约26分钟至约26.5分钟；约26.5分钟至约27分钟；约27分钟至约28分钟；约28分钟至约28.5分钟；约28.5分钟至约29分钟；约29分钟至约29.5分钟；约29.5分钟至约30分钟；约30分钟至约31分钟；约31分钟至约31.5分钟；约31.5分钟至约32分钟；约32分钟至约32.5分钟；约32.5分钟至约33分钟；约33分钟至约34分钟；约34分钟至约35分钟；约35分钟至约36分钟；约36分钟至约37分钟；约37分钟至约38分钟；约38分钟至约39分钟；约39分钟至约40分钟；约40分钟至约41分钟；约41分钟至约42分钟；约42分钟至约43分钟；约43分钟至约44分钟；约45分钟至约46分钟；约46分钟至约47分钟；约47分钟至约48分钟；约48分钟至约49分钟；约49分钟至约50分钟；约50分钟至约51分钟；约51分钟至约52分钟；约52分钟至约53分钟；约53分钟至约55分钟；约55分钟至约56分钟；约56分钟至约57分钟；约57分钟至约58分钟；约58分钟至约59分钟；约59分钟至约60分钟；或在此描述的氯毒素缀合物的在此描述的氯毒素缀合物的任何其他T最大。
在此描述的氯毒素缀合物的T最大包括(通过举例但不限于)不大于约0.5小时、不大于约1小时、不大于约1.5小时、不大于约2小时、不大于约2.5小时、不大于约3小时、不大于约3.5小时、不大于约4小时、不大于约4.5小时、不大于约5小时、或适合于描述在此描述的氯毒素缀合物的药物代谢动力学曲线的任何其他T最大。T最大进一步包括(通过举例但不限于)约0.1小时至约24小时；约0.1小时至约0.5小时；约0.5小时至约1小时；约1小时至约1.5小时；约1.5小时至约2小时；约2小时至约2.5小时；约2.5小时至约3小时；约3小时至约3.5小时；约3.5小时至约4小时；约4小时至约4.5小时；约4.5小时至约5小时；约5小时至约5.5小时；约5.5小时至约6小时；约6小时至约6.5小时；约6.5小时至约7小时；约7小时至约7.5小时；约7.5小时至约8小时；约8小时至约8.5小时；约8.5小时至约9小时；约9小时至约9.5小时；约9.5小时至约10小时；约10小时至约10.5小时；约10.5小时至约11小时；约11小时至约11.5小时；约11.5小时至约12小时；约12小时至约12.5小时；约12.5小时至约13小时；约13小时至约13.5小时；约13.5小时至约14小时；约14小时至约14.5小时；约14.5小时至约15小时；约15小时至约15.5小时；约15.5小时至约16小时；约16小时至约16.5小时；约16.5小时至约17小时；约17小时至约17.5小时；约17.5小时至约18小时；约18小时至约18.5小时；约18.5小时至约19小时；约19小时至约19.5小时；约19.5小时至约20小时；约20小时至约20.5小时；约20.5小时至约21小时；约21小时至约21.5小时；约21.5小时至约22小时；约22小时至约22.5小时；约22.5小时至约23小时；约23小时至约23.5小时；约23.5小时至约24小时；约24小时至约25小时；约25小时至约25.5小时；约25.5小时至约26小时；约26小时至约26.5小时；约26.5小时至约27小时；约27小时至约28小时；约28小时至约28.5小时；约28.5小时至约29小时；约29小时至约29.5小时；约29.5小时至约30小时；约30小时至约31小时；约31小时至约31.5小时；约31.5小时至约32小时；约32小时至约32.5小时；约32.5小时至约33小时；约33小时至约34小时；约34小时至约35小时；约35小时至约36小时；约36小时至约37小时；约37小时至约38小时；约38小时至约39小时；约39小时至约40小时；约40小时至约41小时；约41小时至约42小时；约42小时至约43小时；约43小时至约44小时；约45小时至约46小时；约46小时至约47小时；约47小时至约48小时；约48小时至约49小时；约49小时至约50小时；约50小时至约51小时；约51小时至约52小时；约52小时至约53小时；约53小时至约55小时；约55小时至约56小时；约56小时至约57小时；约57小时至约58小时；约58小时至约59小时；约59小时至约60小时；约60小时至约61小时；约61小时至约62小时；约62小时至约63小时；约63小时至约64小时；约64小时至约66小时；约66小时至约67小时；约67小时至约68小时；约68小时至约69小时；约69小时至约70小时；约70小时至约71小时；约71小时至约72小时；约72小时至约73小时；约73小时至约74小时；约774小时至约75小时；约75小时至约77小时；约77小时至约78小时；约78小时至约79小时；约79小时至约80小时；约80小时至约81小时；约81小时至约82小时；约82小时至约83小时；约83小时至约84小时；约84小时至约85小时；约85小时至约87小时；约87小时至约88小时；约88小时至约89小时；约89小时至约90小时；约90小时至约91小时；约91小时至约92小时；约92小时至约93小时；约93小时至约94小时；约94小时至约95小时；约95小时至约97小时；约97小时至约99小时；约99小时至约100小时；或在此描述的氯毒素缀合物的在此描述的氯毒素缀合物的任何其他T最大。
在一些方面，氯毒素缀合物分布在受试者组织内。例如，相比于消除阶段，分布到组织内通常是迅速的。在一些方面，氯毒素缀合物从受试者组织中消除。例如，相比于分布阶段，从受试者组织中消除通常是缓慢的。通常，肾在清除和消除氯毒素缀合物中有重要作用，通常有助于消除阶段。
药物代谢动力学参数是任何适用于描述在此描述的氯毒素缀合物的血浆曲线的参数并且通常与曲线相关。如本文中他处描述，剂量是缩放或固定的，所述缩放的剂量可用于对不同受试者缩放剂量，其中这些受试者是相同物种、不同物种、相同性别或不同性别的。曲线的各阶段通常代表获得自至少一个受试者的数据，有时多于一个受试者，并且曲线的各阶段和/或曲线的数据通常以类似于剂量缩放的方式进行缩放。
在一些方面，将曲线绘在图上，通常是具有x轴和y轴的图，被称为例如直角坐标曲线图、散点图等。图的每个轴都有存在于在此描述的受试者样品中的在此描述的氯毒素缀合物的单位，y轴通常具有时间单位，例如以小时计，而x轴通常具有浓度单位，例如以ng/mL计，并且代表单个量度、中位值、平均值、或任何合适于在一组数据中进行的其他数学计算。当进行合适的数学计算时，也计算统计数值，例如标准误差、平均标准误、标准差、平均标准差、或任何合适用于所描述的披露其他统计数值。
在一些方面，曲线具有多个阶段，例如分布阶段、代谢阶段以及消除阶段。在一些方面，分布阶段在约0小时的时候开始并且延续直至约0.01小时、约0.02小时、约0.03小时、约0.04小时、约0.05小时、约0.06小时、约0.07小时、约0.08小时、约0.09小时、约0.11小时、约0.12小时、约0.13小时、约0.14小时、约0.15小时、约0.16小时、约0.17小时、约0.18小时、约0.19小时、约0.20小时、0.21小时、约0.22小时、约0.23小时、约0.24小时、约0.25小时、约0.26小时、约0.27小时、约0.28小时、约0.29小时、约0.30小时、约0.31小时、约0.32小时、约0.33小时、约0.34小时、约0.35小时、约0.36小时、约0.37小时、约0.38小时、约0.39小时、约0.40小时、约0.41小时、约0.42小时、约0.43小时、约0.44小时、约0.45小时、约0.46小时、约0.47小时、约0.48小时、约0.49小时、约0.50小时、约0.51小时、约0.52小时、约0.53小时、约0.54小时、约0.55小时、约0.56小时、约0.57小时、约0.58小时、约0.59小时、约0.60小时、约0.61小时、约0.62小时、约0.63小时、约0.64小时、约0.65小时、约0.66小时、约0.67小时、约0.68小时、约0.69小时、约0.70小时、约0.71小时、约0.72小时、约0.73小时、约0.74小时、约0.75小时、约0.76小时、约0.77小时、约0.78小时、约0.79小时、约0.80小时、约0.81小时、约0.82小时、约0.83小时、约0.84小时、约0.85小时、约0.86小时、约0.87小时、约0.88小时、约0.89小时、约0.90小时、约0.91小时、约0.92小时、约0.93小时、约0.94小时、约0.95小时、约0.96小时、约0.97小时、约0.98小时、约0.99小时、约1.00小时、约1.01小时、约1.02小时、约1.03小时、约1.04小时、约1.05小时、约1.06小时、约1.07小时、约1.08小时、约1.09小时、约1.11小时、约1.12小时、约1.13小时、约1.14小时、约1.15小时、约1.16小时、约1.17小时、约1.18小时、约1.19小时、约1.20小时、1.21小时、约1.22小时、约1.23小时、约1.24小时、约1.25小时、约1.26小时、约1.27小时、约1.28小时、约1.29小时、约1.30小时、约1.31小时、约1.32小时、约1.33小时、约1.34小时、约1.35小时、约1.36小时、约1.37小时、约1.38小时、约1.39小时、约1.40小时、约1.41小时、约1.42小时、约1.43小时、约1.44小时、约1.45小时、约1.46小时、约1.47小时、约1.48小时、约1.49小时、约1.50小时、约1.51小时、约1.52小时、约1.53小时、约1.54小时、约1.55小时、约1.56小时、约1.57小时、约1.58小时、约1.59小时、约1.60小时、约1.61小时、约1.62小时、约1.63小时、约1.64小时、约1.65小时、约1.66小时、约1.67小时、约1.68小时、约1.69小时、约1.70小时、约1.71小时、约1.72小时、约1.73小时、约1.74小时、约1.75小时、约1.76小时、约1.77小时、约1.78小时、约1.79小时、约1.80小时、约1.81小时、约1.82小时、约1.83小时、约1.84小时、约1.85小时、约1.86小时、约1.87小时、约1.88小时、约1.89小时、约1.90小时、约1.91小时、约1.92小时、约1.93小时、约1.94小时、约1.95小时、约1.96小时、约1.97小时、约1.98小时、约1.99小时、约2.00小时、约2.20小时、约2.40小时、约2.60小时、约2.80小时、约3.00小时、约4.20小时、约4.40小时、约4.60小时、约4.80小时、约5.00小时、约5.20小时、约5.40小时、约5.60小时、约5.80小时、约6.00小时、约6.20小时、约6.40小时、约6.60小时、约6.80小时、约7.00小时、约7.20小时、约7.40小时、约7.60小时、约7.80小时、约8.00小时、约8.20小时、约8.40小时、约8.60小时、约8.80小时、约9.00小时、约9.20小时、约9.40小时、约9.60小时、约9.80小时、约10.00小时或超过约10.00小时的时间。
在一些方面，代谢阶段在约0.5小时的时候开始并且延续直至约0.50小时、约0.51小时、约0.52小时、约0.53小时、约0.54小时、约0.55小时、约0.56小时、约0.57小时、约0.58小时、约0.59小时、约0.60小时、约0.61小时、约0.62小时、约0.63小时、约0.64小时、约0.65小时、约0.66小时、约0.67小时、约0.68小时、约0.69小时、约0.70小时、约0.71小时、约0.72小时、约0.73小时、约0.74小时、约0.75小时、约0.76小时、约0.77小时、约0.78小时、约0.79小时、约0.80小时、约0.81小时、约0.82小时、约0.83小时、约0.84小时、约0.85小时、约0.86小时、约0.87小时、约0.88小时、约0.89小时、约0.90小时、约0.91小时、约0.92小时、约0.93小时、约0.94小时、约0.95小时、约0.96小时、约0.97小时、约0.98小时、约0.99小时、约1.00小时、约1.01小时、约1.02小时、约1.03小时、约1.04小时、约1.05小时、约1.06小时、约1.07小时、约1.08小时、约1.09小时、约1.11小时、约1.12小时、约1.13小时、约1.14小时、约1.15小时、约1.16小时、约1.17小时、约1.18小时、约1.19小时、约1.20小时、1.21小时、约1.22小时、约1.23小时、约1.24小时、约1.25小时、约1.26小时、约1.27小时、约1.28小时、约1.29小时、约1.30小时、约1.31小时、约1.32小时、约1.33小时、约1.34小时、约1.35小时、约1.36小时、约1.37小时、约1.38小时、约1.39小时、约1.40小时、约1.41小时、约1.42小时、约1.43小时、约1.44小时、约1.45小时、约1.46小时、约1.47小时、约1.48小时、约1.49小时、约1.50小时、约1.51小时、约1.52小时、约1.53小时、约1.54小时、约1.55小时、约1.56小时、约1.57小时、约1.58小时、约1.59小时、约1.60小时、约1.61小时、约1.62小时、约1.63小时、约1.64小时、约1.65小时、约1.66小时、约1.67小时、约1.68小时、约1.69小时、约1.70小时、约1.71小时、约1.72小时、约1.73小时、约1.74小时、约1.75小时、约1.76小时、约1.77小时、约1.78小时、约1.79小时、约1.80小时、约1.81小时、约1.82小时、约1.83小时、约1.84小时、约1.85小时、约1.86小时、约1.87小时、约1.88小时、约1.89小时、约1.90小时、约1.91小时、约1.92小时、约1.93小时、约1.94小时、约1.95小时、约1.96小时、约1.97小时、约1.98小时、约1.99小时、约2.00小时、约2.20小时、约2.40小时、约2.60小时、约2.80小时、约3.00小时、约4.20小时、约4.40小时、约4.60小时、约4.80小时、约5.00小时、约5.20小时、约5.40小时、约5.60小时、约5.80小时、约6.00小时、约6.20小时、约6.40小时、约6.60小时、约6.80小时、约7.00小时、约7.20小时、约7.40小时、约7.60小时、约7.80小时、约8.00小时、约8.20小时、约8.40小时、约8.60小时、约8.80小时、约9.00小时、约9.20小时、约9.40小时、约9.60小时、约9.80小时、约10.00小时、约10.20小时、约10.40小时、约10.60小时、约10.80小时、约12.00小时、约12.20小时、约12.40小时、约12.60小时、约12.80小时、约14.00小时、约14.20小时、约14.40小时、约14.60小时、约14.80小时、约16.00小时、约16.20小时、约16.40小时、约16.60小时、约16.80小时、约18.00小时、约18.20小时、约18.40小时、约18.60小时、约18.80小时、约20.00小时、约20.20小时、约20.40小时、约20.60小时、约20.80小时、约22.00小时、约22.20小时、约22.40小时、约22.60小时、约22.80小时、约24.00小时、约24.20小时、约24.40小时、约24.60小时、约24.80小时、约26.00小时、约26.20小时、约26.40小时、约26.60小时、约26.80小时、约28.00小时、约28.20小时、约28.40小时、约28.60小时、约28.80小时、约30小时或超过约30.00小时的时间。
在一些方面，消除阶段在约2小时的时候开始并且延续直至约2.00小时、约2.20小时、约2.40小时、约2.60小时、约2.80小时、约3.00小时、约4.20小时、约4.40小时、约4.60小时、约4.80小时、约5.00小时、约5.20小时、约5.40小时、约5.60小时、约5.80小时、约6.00小时、约6.20小时、约6.40小时、约6.60小时、约6.80小时、约7.00小时、约7.20小时、约7.40小时、约7.60小时、约7.80小时、约8.00小时、约8.20小时、约8.40小时、约8.60小时、约8.80小时、约9.00小时、约9.20小时、约9.40小时、约9.60小时、约9.80小时、约10.00小时、约10.20小时、约10.40小时、约10.60小时、约10.80小时、约12.00小时、约12.20小时、约12.40小时、约12.60小时、约12.80小时、约14.00小时、约14.20小时、约14.40小时、约14.60小时、约14.80小时、约16.00小时、约16.20小时、约16.40小时、约16.60小时、约16.80小时、约18.00小时、约18.20小时、约18.40小时、约18.60小时、约18.80小时、约20.00小时、约20.20小时、约20.40小时、约20.60小时、约20.80小时、约22.00小时、约22.20小时、约22.40小时、约22.60小时、约22.80小时、约24.00小时、约24.20小时、约24.40小时、约24.60小时、约24.80小时、约26.00小时、约26.20小时、约26.40小时、约26.60小时、约26.80小时、约28.00小时、约28.20小时、约28.40小时、约28.60小时、约28.80小时、约30.00小时、约30.20小时、约30.40小时、约30.60小时、约30.80小时、约32.00小时、约32.20小时、约32.40小时、约32.60小时、约32.80小时、约34.00小时、约34.20小时、约34.40小时、约34.60小时、约34.80小时、约36.00小时、约36.20小时、约36.40小时、约36.60小时、约36.80小时、约38.00小时、约38.20小时、约38.40小时、约38.60小时、约38.80小时、约40.00小时、约40.20小时、约40.40小时、约40.60小时、约40.80小时、约42.00小时、约42.20小时、约42.40小时、约42.60小时、约42.80小时、约44.00小时、约44.20小时、约44.40小时、约44.60小时、约44.80小时、约46.00小时、约46.20小时、约46.40小时、约46.60小时、约46.80小时、约48.00小时、约48.20小时、约48.40小时、约48.60小时、约48.80小时、约50.00小时、约50.20小时、约50.40小时、约50.60小时、约50.80小时、约52.00小时、约52.20小时、约52.40小时、约52.60小时、约52.80小时、约54.00小时、约54.20小时、约54.40小时、约54.60小时、约54.80小时、约56.00小时、约56.20小时、约56.40小时、约56.60小时、约56.80小时、约58.00小时、约58.20小时、约58.40小时、约58.60小时、约58.80小时、约60.00小时、约60.20小时、约60.40小时、约60.60小时、约60.80小时、约62.00小时、约62.20小时、约62.40小时、约62.60小时、约62.80小时、约64.00小时、约64.20小时、约64.40小时、约64.60小时、约64.80小时、约66.00小时、约66.20小时、约66.40小时、约66.60小时、约66.80小时、约68.00小时、约68.20小时、约68.40小时、约68.60小时、约68.80小时、约70.00小时、约70.20小时、约70.40小时、约70.60小时、约70.80小时、约72.00小时、约72.20小时、约72.40小时、约72.60小时、约72.80小时、约74.00小时、约74.20小时、约74.40小时、约74.60小时、约74.80小时、约76.00小时、约76.20小时、约76.40小时、约76.60小时、约76.80小时、约78.00小时、约78.20小时、约78.40小时、约78.60小时、约78.80小时、约80.00小时、约80.20小时、约80.40小时、约80.60小时、约80.80小时、约82.00小时、约82.20小时、约82.40小时、约82.60小时、约82.80小时、约84.00小时、约84.20小时、约84.40小时、约84.60小时、约84.80小时、约86.00小时、约86.20小时、约86.40小时、约86.60小时、约86.80小时、约88.00小时、约88.20小时、约88.40小时、约88.60小时、约88.80小时、约90.00小时或约超过90.00小时的时间。
在一些方面，单次固定静脉内推注剂量的氯毒素缀合物通常导致平均血清浓度在给药后长达约12小时、给药后约24小时、给药后长达约36小时、给药后长达约48小时或给药后超过约48小时是可测量的。通常，对于如大鼠的受试者，C最大以及C0参数以大约剂量比例性的方式增加。在一些方面，AUC0-t参数，对于如大鼠的受试者，在低于约1mg剂量水平处是大约剂量比例性的，而在大于约1mg剂量水平处是以大于剂量比例性的方式增加。通常，对于如大鼠的受试者，性别对于任何PK参数没有影响。在一些方面，大鼠中的PK参数是人类受试者的预测。
在一些方面，单独固定的单次剂量静脉内氯毒素缀合物通常导致平均血清浓度在给药后长达约12小时、给药后约24小时、给药后长达约36小时、给药后长达约48小时或给药后超过约48小时是可测量的.通常，对于如大鼠的受试者，C最大以及C0参数以大约剂量比例性的方式增加。在一些方面，AUC0-t参数，对于如猴的受试者，在大于约1mg剂量水平处是以大于剂量比例性的方式，例如使得氯毒素缀合物在猴中在较高剂量时显示出降低的清除率。通常，对于如猴的受试者，性别对于PK参数有影响，例如，雌性相对于雄性在C0以及AUC方面高出约5％至约30％。
如在此使用的，如果两个药物代谢动力学曲线由至少一个参数限定(该参数在两个曲线之间大致相当)那么两个药物代谢动力学曲线“大致相当”。这类参数的非限制性例子包括血浆浓度随时间曲线下面积(AUC)和给予一定剂量后所达到的最大血浆浓度(C最大)。
在一些方面，如果较小值是较大值的大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％，那么两个药物代谢动力学参数大致相当。
通过确定接受第一给药方案的受试者群中的平均药物代谢动力学曲线，确定接受第二给药方案的受试者群中的平均药物代谢动力学曲线以及然后比较这两个群的给药方案来比较两个给药方案的药物代谢动力学曲线。在一些方面，受试者群是一个受试者。在其他方面，受试者群是多于一个受试者，例如2个受试者、3个受试者、4个受试者、5个受试者、6个受试者、7个受试者、8个受试者、9个受试者、10个受试者、11个受试者、12个受试者、13个受试者、14个受试者、15个受试者、20个受试者、25个受试者、30个受试者、35个受试者、40个受试者、45个受试者、50个受试者或超过50个受试者。
在不同方面中，本披露提供了向人类受试者给予组合物的方法，该方法包括：经静脉内给予该人类受试者1mg至30mg剂量的化合物，该化合物包括与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段；并且在该人类受试者中产生至少110ng/mL至240ng/mL平均最大化合物血浆浓度(平均C最大)/1mg剂量给予的该化合物。
在不同方面中，本披露提供了检测人类受试者中癌细胞的方法，该方法包括：经静脉内给予该人类受试者1mg至30mg剂量的化合物，该化合物包括缀合至可检测标记物的、与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段；在该人类受试者中产生至少110ng/mL至240ng/mL平均最大化合物血浆浓度(平均C最大)/1mg剂量给予的该化合物；并且检测该可检测标记物在该人类受试者中的存在或不存在，其中该可检测标记物的存在表明该癌细胞的存在。
在不同方面中，本披露提供了诊断人类受试者中癌症的方法，该方法包括：经静脉内给予该人类受试者1mg至30mg剂量的化合物，该化合物包括缀合至可检测标记物的、与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段；在该人类受试者中产生至少110ng/mL至240ng/mL平均最大化合物血浆浓度(平均C最大)/1mg剂量给予的该化合物；并且检测该可检测标记物在该人类受试者中的存在或不存在，其中该可检测标记物的存在表明癌症的诊断。
在不同方面中，本披露提供了治疗人类受试者中癌症的方法，该方法包括：经静脉内给予该人类受试者1mg至30mg剂量的一种化合物，该化合物包括缀合至治疗剂的、与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段；在该人类受试者中产生至少110ng/mL至240ng/mL平均最大化合物血浆浓度(平均C最大)/1mg剂量给予的该化合物；并且减少或改善该人类受试者中与癌症相关的症状或病症。在一些方面中，该人类受试者对其有需要。在一些方面中，该方法包括向该人类受试者给予治疗有效剂量的化合物。
在不同方面中，本披露提供了向人类受试者给予组合物的方法，该方法包括：给予该人类受试者1mg至30mg剂量的化合物，该化合物包括与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段；并且在该人类受试者中产生图27的药物代谢动力学曲线。
在不同方面中，本披露提供了向人类受试者给予组合物的方法，该方法包括：经静脉内给予该人类受试者1mg至30mg剂量的本披露的任何适合化合物；并且在该人类受试者中产生至少110ng/mL至240ng/mL平均最大化合物血浆浓度(平均C最大)/1mg剂量给予的该化合物。
在一些方面中，达到平均C最大的平均时间(平均T最大)是在给予化合物之后5±4分钟。在一些方面中，平均化合物血浆浓度达到平均C最大的75％(平均C75)的平均时间(平均T75)是在给予化合物之后8±5分钟。在一些方面中，平均化合物血浆浓度达到平均C最大的50％(平均C50)的平均时间(平均T50)是在给予化合物之后20±8分钟。在一些方面中，平均化合物血浆浓度达到平均C最大的25％(平均C25)的平均时间(平均T25)是在给予化合物之后30±12分钟。
在一些方面中，这些方法进一步包括在人类受试者中产生50hr*ng/mL至120hr*ng/mL的平均氯毒素多肽血浆曲线下面积(平均AUC)/1mg剂量给予的氯毒素多肽。
在一些方面中，该方法进一步包括在人类受试者中产生60hr*ng/mL至110hr*ng/mL的平均氯毒素多肽血浆曲线下面积(平均AUC)/1mg剂量给予的氯毒素多肽。
在一些方面中，75％的平均AUC在给予化合物之后40±15分钟内出现。在一些方面中，50％的平均AUC在给予化合物之后21±8分钟内出现。在一些方面中，25％的平均AUC在给予化合物之后9±5分钟内出现。
在一些方面中，该化合物包括本披露中任何合适的化合物。
在不同方面中，本披露提供了用于检测受试者中癌细胞的方法，该方法包括：给予本披露的任何适合化合物；并且检测该化合物在该受试者中的存在或不存在，其中该化合物的存在表明癌细胞的存在。
在一些方面中，该方法进一步包括将该化合物作为组合物的一部分给予。
在一些方面中，癌症选自神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、脉络丛癌、室管膜瘤、脑肿瘤、成神经细胞瘤、腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、头颈部癌、肺癌、乳腺癌、肠癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤因氏肉瘤、上皮癌、黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、淋巴瘤、甲状腺癌、肛门癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、生殖细胞瘤、喉癌、多发性骨髓瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、胃癌、睾丸癌、以及肾母细胞瘤(Wilm’stumor)。在一些方面中，癌症选自神经胶质瘤、成神经细胞瘤、肉瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、或肠癌。在一些方面中，癌细胞表达天然氯毒素结合位点。
在一些方面中，该方法包括通过荧光成像检测化合物。
在一些方面中，该方法进一步包括使表达天然氯毒素结合位点的癌症病灶与非瘤组织区分。
在一些方面中，该方法进一步包括从受试者中手术移除检测到的癌细胞。
在一些方面中，该方法进一步包括在从受试者中手术移除癌细胞之前、在从受试者中手术移除癌细胞过程中、在从受试者中移除癌细胞之后或其组合确定癌细胞在受试者中的位置。
在一些方面中，该化合物结合至癌细胞。在一些方面中，该受试者是人类受试者。在一些方面中，该检测在体内或离体进行。
在不同方面中，本披露提供了向受试者给予本披露的任何适合化合物的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的该化合物。
在一些方面中，该受试者对其有需要。
在一些方面中，治疗有效量是足够在受试者中检测癌细胞的剂量。在一些方面中，剂量为0.1mg至100mg。在一些方面中，剂量为1mg至30mg。在一些方面中，剂量为3mg至30mg。
在不同方面中，本披露提供了治疗对其有需要的受试者的方法，该方法包括向该受试者给予本披露的任何适合化合物，该化合物进一步包含治疗剂，该治疗剂的量足以治疗该受试者的癌症。在某些方面，该治疗剂是细胞毒性剂。
在一些方面中，癌症选自神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、脉络丛癌、室管膜瘤、脑肿瘤、成神经细胞瘤、头颈部癌、肺癌、乳腺癌、肠癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤因氏肉瘤、上皮癌、黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、淋巴瘤、甲状腺癌、肛门癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、生殖细胞瘤、喉癌、多发性骨髓瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、胃癌、睾丸癌、以及肾母细胞瘤。在一些方面中，癌细胞选自神经胶质瘤、成神经细胞瘤、肉瘤、前列腺癌、或肠癌。在某些方面中，癌细胞表达天然氯毒素结合位点。在其他方面中，结合是选择性的。
在一些方面中，将该化合物胃肠外给予。在其他方面中，将该化合物静脉内给予。在其他方面中，将该化合物皮下给予。
用于分析以生成药物代谢动力学曲线的方法
在一些方面，分析样品以获得可以用于确定药物代谢动力学曲线的参数。通常将样品稀释，例如使用如在此所定义的缓冲剂或药学上可接受的载体。
通常使用如在此描述的氯毒素缀合物、血清以及药物载体生成药物代谢动力学标准曲线。每种氯毒素缀合物的比例、样品(例如血清、尿等)的集中源以及药物载体通常不同，例如，本披露的化合物的浓度通常在约10μg/mL与约4ng/mL之间。通常，将标准曲线用于计算样品中化合物的浓度。
在一些方面，使用标准药物代谢动力学数据分析方法分析药物代谢动力学参数或药物代谢动力学数据，包括氯毒素缀合物的浓度对时间。例如，使用软件程序(如PhoenixWinNonlin6.3)分析药物代谢动力学数据。在一些方面，药物代谢动力学数据分析使用静脉推注、静脉输注、或血管外输入(适当时)的标准非房室方法。在其他方面，药物代谢动力学数据分析使用静脉推注、静脉输注、或血管外输入(适当时)的非标准非房室方法。通常，通过平均血清浓度对比时间分析数据。还通过个体受试者随后群体概括统计量分析数据。
通常使用至少一种，有时多于一种生物学分析方法获得在此描述的组合物的药物代谢动力学曲线。在一些方面，生物学分析方法包括将化学品添加至含有组合物的样品中，该组合物的药物代谢动力学曲线是所期望的。将化学品添加至样品通常包括采用化学技术测量组合物或其代谢物在样品中或有时在生物基质中的浓度。例如，通常采用微量热迁移、质谱法(通常包括液相色谱以及三极四极质谱仪)、串联质谱法、用于微剂量研究高敏感性质谱法以及类似物。
本披露进一步描述向受试者给予本披露的化合物以及组合物的方法，通常方法包括向受试者静脉内给予氯毒素缀合物组合物。在一些方面，向受试者给予氯毒素多肽的方法包括向该受试者静脉内给予剂量为0.8至25mg的氯毒素多肽，其中该氯毒素多肽与MCMPCFTTDHQMARXCDDCCGGXGRGXCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性；在该受试者中产生50至120的平均氯毒素多肽血浆曲线下面积(平均AUC)/1mg剂量给予的氯毒素多肽；并且在该受试者中产生至少110至240平均最大氯毒素多肽血浆浓度(平均C最大)/1mg剂量给予的氯毒素多肽。在一些方面，该氯毒素多肽缀合至荧光剂。
本披露进一步描述在向受试者给药或接触从受试者中分离的肿瘤组织后用氯毒素缀合物组合物治疗和/或检测癌的方法，通常这些方法包括向受试者静脉内给予氯毒素缀合物组合物，体内接触肿瘤组织或离体接触来自受试者的肿瘤组织。在一些方面，披露了在向受试者给药或接触从受试者中分离的肿瘤组织后，用氯毒素缀合物组合物治疗和/或检测癌的方法，通常这些方法包括向受试者静脉内给予氯毒素缀合物组合物，体内接触肿瘤组织或离体接触来自受试者的肿瘤组织，包括向该受试者静脉内给予剂量为0.8至25mg的氯毒素多肽，其中该氯毒素多肽与MCMPCFTTDHQMARXCDDCCGGXGRGXCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性；在该受试者中产生50至120平均氯毒素多肽血浆曲线下面积(平均AUC)/1mg剂量给予的氯毒素多肽；并且在该受试者中产生至少110至240平均最大氯毒素多肽血浆浓度(平均C最大)/1mg剂量给予的氯毒素多肽。在一些方面，该氯毒素多肽缀合至荧光剂。
本披露进一步描述氯毒素缀合物的组合物，通常该氯毒素缀合物组合物包括生理有效量的氯毒素缀合物，其中该氯毒素缀合物包括与MCMPCFTTDHQMARXCDDCCGGXGRGXCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的氯毒素多肽，该氯毒素多肽缀合至荧光染料，例如，如在本披露中提供的或其衍生物，其中向受试者静脉内给予该组合物在该受试者中产生：50至120平均氯毒素多肽血浆曲线下面积(平均AUC)/1mg剂量给予的氯毒素多肽；以及至少110至240平均最大氯毒素多肽血浆浓度(平均C最大)/1mg剂量给予的氯毒素多肽。在一些方面，该氯毒素多肽缀合至荧光剂。
氯毒素缀合物的活性
本披露提供了但不限于用可被荧光成像检出的氯毒素缀合物对肿瘤进行术中成像和切除的方法，所述荧光成像允许癌组织的术中可视化；包括所述氯毒素缀合物的组合物、以及使用所述氯毒素缀合物的方法。该氯毒素是将缀合物指引至目的组织的靶向剂。在一方面，本披露的氯毒素缀合物包括一个或多个标记试剂。在另一方面，该标记试剂包括共价偶联到氯毒素上的荧光部分(例如红光或近红外发射荧光部分)。在另一方面，该标记试剂包括放射性核素。
在此描述的氯毒素缀合物通常用于肿瘤的检测和治疗(例如成像)、切除、诊断以及治疗。在一些方面，能够经使用本披露的氯毒素缀合物检测的肿瘤包括但不限于：腺癌、纤维肉瘤、血管肉瘤、肥大细胞瘤、鳞状细胞癌、软骨肉瘤、腺鳞状癌、血管外皮细胞瘤、滤泡性癌、脑膜瘤、粘膜的鳞状上皮细胞癌、神经胶质瘤、肉瘤(如软组织肉瘤)等。能够经使用本披露的氯毒素缀合物检测的软组织肉瘤包括但不限于：脂肪组织肿瘤、脂肉瘤、肌肉组织肿瘤(包括平滑肌肉瘤以及平滑肌肉瘤、骨骼肌肉瘤、横纹肌肉瘤)、周围神经肿瘤、纤维组织肿瘤、黏液纤维肉瘤、纤维瘤病、关节组织肿瘤、血管以及淋巴管肿瘤、血管肉瘤、周围神经的肿瘤(如恶性周围神经鞘瘤、恶性神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、纤维肉瘤、滑膜肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤(MFH)、血管肉瘤、淋巴管肉瘤)、胃肠道间质瘤、软组织腺泡状肉瘤、隆凸性皮肤纤维肉瘤(DFSP)、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、上皮样肉瘤、骨外黏液样软骨肉瘤(extraskeletalmyxoidchondrosarcoma)、以及巨细胞纤维母细胞瘤(GCF)。
在此描述的氯毒素缀合物可用于存在于任何器官以及任何解剖学部位中的肿瘤的检测和治疗，包括但不限于例如乳房、肺、脑、结肠、直肠、前列腺、头、颈、胃、肛门和/或阴道组织。通常通过在此描述的氯毒素缀合物检测本领域技术人员已知的任何程度或时期的肿瘤(包括低度肿瘤)。在一些方面，肿瘤检测包括成像、切除、诊断以及治疗。
在某些方面，本披露的化合物能够穿越血脑屏障。当检测或治疗脑中的癌细胞(例如神经胶质瘤细胞或脑肿瘤)时，穿越血脑屏障是有利的。
在一些方面，给予氯毒素缀合物的剂量使得在受试者中达到氯毒素缀合物的阈值量。例如，阈值量通常取决于患者的年龄、重量、身高、性别、总体医学状况以及先前医疗史。再例如，阈值量不取决于患者的年龄、重量、身高、性别、总体医学状况以及先前医疗史。
其他剂型是本领域技术人员设计的，如所示，例如，由Ansel(安塞尔)以及Popovich(波波维奇)，PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems(药物剂型以及药物递送系统)，第5版(Lea&Febiger1990)，Gennaro(热纳罗)(编辑)，Remington’sPharmaceuticalSciences(雷明顿的药物科学)，第19版，(MackPublishingCompany(Mack出版公司)，1995)以及由Ranade(兰特)以及Hollinger(霍林格)，DrugDeliverySystems(药物递送系统)(CRCPress(CRC出版社)1996)设计。
作为例证，药物组合物通常以试剂盒形式提供，该试剂盒包含容器，该容器包含氯毒素缀合物。氯毒素缀合物通常以用于单剂量或多剂量的注射溶液的形式、或作为无菌粉剂提供，该无菌粉剂将在注射前重构。可替代地，此类试剂盒通常包含干粉分散器、液体气雾剂发生器、或用于给予治疗缀合物的喷雾器。此类试剂盒进一步包含有关适应症的文字信息以及药物组合物的用法。
肿瘤预防、检测以及治疗的方法
受试者包括但不限于人类、非人类灵长动物、猴、奶牛、狗、兔、猪、豚鼠、大鼠、小鼠以及斑马鱼。
样品包括从受试者中分离出的任何样品，例如但不限于血液、血清、血浆、循环细胞、尿液、唾液和/或如在活组织检查中从身体上移除的组织。通常使用本领域普通技术人员已知的方法制备样品，例如，在离心之前收集血液样品并在室温下孵育约0.5小时至2小时，在至少约20℃下除血清和存储，但更经常为-70℃。
通常使用来自受试者的样品进行另外的测试，包括全血细胞计数、血清化学检测、以及尿液分析。
本披露提供了用于治疗可通过施用氯毒素来治疗的疾病或病症的方法。在一个实施例中，该方法包括向对其有需要的受试者给予有效量的本发明的修饰的氯毒素肽。
本文所用术语“有效量”指使所治疗疾病或病症的一种或多种症状得到某种程度缓解的试剂或化合物的充足给药量。结果可为征象、症状或疾病原因的减少和/或缓和，或者任何其他需要的生物系统变化。可以给予包含此类试剂或化合物的组合物用于预防性、增强性和/或治疗性处理。个案中的适当“有效”量可用诸如剂量增加研究等技术确定。
在一个实施例中，本发明提供了用于治疗在患者中表达氯毒素结合位点的癌的方法，该方法包括向对其有需要的患者给予有效量的本发明的氯毒素变体。
在一个实施例中，本发明提供了用于治疗表达氯毒素结合位点的癌的方法，该方法包括向对其有需要的患者给予有效量的包含本发明的氯毒素变体以及药学上可接受的载体的药物组合物。
在一个实施例中，本发明提供了用于治疗表达氯毒素结合位点的肿瘤的方法，该方法包括向对其有需要的患者给予有效量的本发明的氯毒素变体。
在一个实施例中，本发明提供了用于抑制表达氯毒素结合位点的细胞的侵袭活性的方法，该方法包括向表达氯毒素结合位点的细胞给予有效量的氯毒素变体。
本发明的治疗方法可适用于需要此治疗的人类以及动物受试者。
几乎每种表达氯毒素结合位点的恶性肿瘤可以通过氯毒素变体以及本发明的缀合物进行治疗。这些恶性癌包括神经胶质瘤、星型细胞瘤、髓母细胞瘤、脉络丛癌、室管膜瘤、脑膜瘤、恶性胶质瘤、神经节瘤、嗜铬细胞瘤、以及转移性脑瘤、其他脑瘤、神经母细胞瘤、头颈部癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、肠癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、肾癌、皮肤癌、肉瘤(超过30种)、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤因氏肉瘤、癌、黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、淋巴瘤、甲状腺癌、肛门癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、生殖细胞瘤、喉癌、多发性骨髓瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、胃癌、睾丸癌、以及肾母细胞瘤。
在某些方面，将氯毒素缀合物给予患有或疑似患有肿瘤的个体，这样使得缀合物特异性结合至该肿瘤。此类方法可用于降低个体发展肿瘤、个体中一个或多个肿瘤尺寸增大、个体中一个或多个肿瘤转移、和/或癌通过一些其他量度进展的可能性。如本文所用，术语“转移”意指肿瘤细胞从一个器官或组织扩散到另一个位置，并且还意指作为转移的结果，在新位置形成的肿瘤组织。
在一些方面，氯毒素缀合物可用于治疗和/或诊断神经外胚层瘤，如神经胶质瘤、髓母细胞瘤、成神经细胞瘤、嗜铬细胞瘤、黑素瘤、外周原始神经外胚叶瘤、小细胞肺癌、尤因肉瘤、以及脑中的转移性肿瘤。在一些方面，氯毒素缀合物可用于治疗和/或诊断脑肿瘤，包括但不限于神经胶质瘤，包括多形性成胶质细胞瘤、间变型星形细胞瘤、低级别神经胶质瘤、毛细胞性星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经节瘤、脑膜瘤、以及室管膜瘤。
在其他方面，本披露的化合物被用于检测和/或治疗软组织肉瘤。软组织肉瘤是一组形成于脂肪、肌肉、神经、关节、以及血管中的恶性肿瘤。2012年，据估计大约11,280美国人被诊断患有软组织肉瘤并且大约3,900人据期死于软组织肉瘤。软组织肉瘤和骨肉瘤发病率在过去的30年里稍有上升；然而，软组织肉瘤是更加致命的，可能是因为在疾病早期阶段缺乏特异的症状而可能导致延误诊断。
另外，某些遗传性疾病和过去用放射治疗进行治疗可以提高软组织肉瘤的风险。还未确定可改变的引发肉瘤的风险因素。软组织肉瘤的标准疗法包括外科手术、化学疗法、以及放射疗法。
由于软组织肉瘤的症状直到疾病晚前通常不出现，只有约50％的软组织肉瘤在早期阶段(在它们扩散之前)被发现。
本发明提供了此类用于对其检测、成像、可视化、分析以及治疗的方法，以及其他用途，这对于本领域的普通技术人员而言从本发明的教导中应该是显而易见的。
本发明部分基于诸位发明人的鉴定，即软组织肉瘤相比于其他肿瘤或正常组织具有高的缀合物吸收水平，并且尤其非常适于通过给予缀合至用于检测、可视化、成像、或分析的标记试剂的氯毒素进行检测。此类可视化可在手术(术中)切除过程中、或在初步鉴定肉瘤或与之相关过程中、或在与治疗相关的监测肉瘤或与之相关过程中。
实体瘤的实时术中可视化使能更加完全的切除，同时使周围的正常组织不受伤害。术中肿瘤可视化的改进将对任何可切除的实体瘤有利，因为它将使外科医师能更好地确定局部侵袭的程度，以及附近淋巴结以及脂肪组织中转移扩散的存在。此类信息将有助于做出外科决策，例如，关于在肉瘤的治疗中哪些患者将很好地对保肢手术方法作出反应的决策。
这对于脑肿瘤是极其重要的，因为摘除另外的组织可不必要地增加认知损害以及功能障碍，然而在切除数量上过于保守可能遗留下肿瘤组织。
专门从事人类乳腺癌手术的外科医师表示，在该适应症中精确边界较不重要，并且手术径路通常在四边上是具有0.2–1cm边界的广泛切除。仅使用白光和术前影像信息，外科医师很难获得宽边界。在20％-50％的乳腺癌手术中，无法获得清楚的边界导致二次手术。
本发明显示，当与氯毒素缀合物结合时软组织肉瘤是特别可识别的，其可有效地用于检测这些肉瘤，特别是在手术以及术中切除过程中或与其相关情况下。例如，氯毒素缀合物可以单独使用或与其他检测剂组合使用，用以在抗肿瘤治疗之前、期间或之后检测、成像、可视化或分析肿瘤，所述治疗可包括外科手术以及手术切除、化学治疗、放射治疗、以及免疫治疗。此外，氯毒素缀合物可以单独使用或与其他检测剂组合使用，用与治疗后的后续监控以及全身检查的全面监测。
低度肿瘤通常趋于生长缓慢、扩散较慢、并且经常比高度肿瘤具有更好的预后，这使得它们比高度肿瘤用手术切除能更好地治愈，而高度肿瘤可能需要更多全身疗法。诸位发明人表示，使用缀合至标记试剂的氯毒素在低度肿瘤(如脑膜瘤)的检测、成像、可视化、或分析中特别有效，这允许在它们转移或扩散之前将其完全切除。
不同肿瘤类型的术中切除可以取决于解剖学位置以及肿瘤的类型而变化。例如，当肿瘤位于脑组织中时，外科医师可能要求肿瘤成像或检测剂与肿瘤组织之间有完美或接近完美的专一性，这样仅使得患病组织被切除。从另一方面来说，当肿瘤位于通常较宽边界被切除的组织(如乳房或乳腺癌或结肠癌)中时，或在肿瘤可能局部扩散的的癌(如鳞状细胞癌)中时，对于外科医师能够使用肿瘤成像或检测剂以识别可能变成肿瘤组织的癌旁组织来说可能是有利的。
软组织肉瘤可从软组织(如脂肪、肌肉、神经、纤维组织、血管、或深层皮肤组织)发展而来。可以在身体的任何部位处发现它们。它们中的大部分在手臂和腿中发展。还可以在躯干、头部以及颈部区域、内脏器官、以及腹腔的背面(被称为腹膜后腔)中发现它们。
能够经使用本发明的氯毒素缀合物的检测所检验的软组织肉瘤包括但不限于：脂肪组织肿瘤、肌肉组织肿瘤、骨骼肌肉瘤、横纹肌肉瘤、周围神经肿瘤、纤维组织肿瘤、黏液纤维肉瘤、纤维瘤病、关节组织肿瘤、血管以及淋巴管肿瘤、血管肉瘤、胃肠道间质瘤、软组织腺泡状肉瘤、隆凸性皮肤纤维肉瘤(DFSP)、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、上皮样肉瘤、骨外黏液样软骨肉瘤(extraskeletalmyxoidchondrosarcoma)、以及巨细胞纤维母细胞瘤(GCF)。
起始于身体的脂肪细胞中肉瘤被称为脂肪肉瘤。它们可在身体中的任何部位生长并且最常见地影响50-65岁的人群。一些生长非常缓慢，需要很多年发展，而另一些生长更为快速。
肌组织肉瘤包括平滑肌肉瘤和骨骼肌肉瘤。平滑肌形成内脏器官(如胃、肠、子宫(子宫)、以及血管)的壁。肌肉导致这些器官收缩，而其发生不受我们的控制。平滑肌还被称为不随意肌。发展于平滑肌中的肉瘤被称为平滑肌肉瘤。它们是更为常见的肉瘤类型之一并且可以在身体中的任何部位发生，特别是在腹部的背面(腹膜后腔)。平滑肌肉瘤较不常见于腿或手臂的深、软组织中。它们易于发生在成年人中，特别是在老年人群中。骨骼肌是我们手臂和腿或身体其他部分中受我们控制的主动肌肉。它们是随意肌并且有时被称为横纹肌，因为当在显微镜下检视时细胞看起来有条纹。
在身体的随意肌中生长的肉瘤被称为横纹肌肉瘤。最多地在头部以及颈部发现它们，而还在器官(如膀胱、阴道以及手臂或腿)中有发现。相比于成年人，横纹肌肉瘤更常在儿童中确诊。
末梢神经肿瘤可见于周围神经系统中，周围神经系统由贯通身体的所有神经组成。周围神经的肉瘤在覆盖神经的细胞中发展。它们被称为恶性周围神经鞘肿瘤(MPNST)并且可在身体中的任何部位发生。MPNST有不同的类型，包括恶性神经鞘瘤和神经纤维肉瘤。它们最常见于患有被称为神经纤维瘤病(冯·雷克林霍曾氏病(vonRecklinghausen’sdisease))的罕见遗传性障碍的人群中。
纤维组织肿瘤发生在将肌肉连接至骨骼的组织中。该组织由被称为纤维细胞的细胞构成。纤维组织的肉瘤被称为纤维肉瘤。它们最常见于手臂、腿或躯干中，但也可发生在身体的更深处。它们可发生任何年龄，但更最常见于20-60岁的人群。大多数人最初视其为无痛的硬块。
十分接近于身体关节处发展的软组织肉瘤被称为滑膜肉瘤。它们通常在关节(如膝或肘)附近(而非内部)发展，但它们可在身体中的任何部位发生。它们通常表现为硬块并且更常见于儿童和年轻人中。
血管和淋巴管肿瘤包括起源于组成血管或淋巴管壁的细胞的肉瘤并且被称为血管肉瘤。血管瘤(Haemangiosarcomas)从血管发展而来而淋巴管肉瘤从淋巴管发展而来。
血管肉瘤是有时在许多年前已经用放射疗法治疗过的身体的部分中发生的肉瘤。
胃肠道间质瘤(GIST)是发展于消化系统的壁中的神经细胞中的软组织肉瘤。
诸位发明人还已经鉴别出，可以用缀合至标记试剂的氯毒素检测低度肿瘤。这特别有用，因为如果可以完全地将其切除低度肿瘤具有更好的预后。
此外，本发明部分地基于诸位发明人的鉴定，即对于狗中肿瘤成像的最佳剂量为至少约0.8mg/m2。本领域技术人员应认识到氯毒素缀合物的剂量将基于所给予的缀合物的量以及成像完成后给药后的时间来确定。在一些方面，用于肿瘤成像的最佳剂量在约0.85mg/m2至约1.2mg/m2范围内，或在约0.9mg/m2至约1.1mg/m2范围内。在剂量高达0.9mg/m2处，总肿瘤样品中信号随着剂量而增加。在剂量高达0.9mg/m2处，信号与剂量之间的相关性丧失，这意味着在该模型系统中，高于此剂量，肿瘤中的信号是最大的。然而，应认识到，在其他情况下，可给予更多缀合物，得到可以接受的成像。因此，在一些方面中，可以在约1.3mg/m2至约2.5mg/m2范围内、或在约2.6mg/m2至约3.5mg/m2范围内、或在约3.6mg/m2至约4.5mg/m2范围内、或在约4.6mg/m2至约5.5mg/m2范围内、或5.5mg/m2以上的量给予氯毒素缀合物。
成像方法
在本发明的另一方面，提供了使用氯毒素缀合物的方法。在一个实施例中，本发明提供了用于成像可通过氯毒素成像的组织的方法。在该方法中，将可通过氯毒素成像的组织与氯毒素缀合物接触。在一个实施例中，该成像方法是荧光成像法。用于制作以及使用荧光氯毒素缀合物的代表性方法描述于美国专利申请公开号20080279780A1，FluorescentChlorotoxinConjugateandMethodforIntra-OperativeVisualizationofCancer(荧光氯毒素缀合物以及用于术中可视化癌症的方法)，以及美国专利申请公开号20130195760，ChlorotoxinVariants,Conjugates,AndMethodsForTheirUse(氯毒素变体、缀合物、以及其使用方法)中，其二者全部内容通过引用明确地合并于此。
在许多情况下，可以将氯毒素缀合物例如与药学上可接受的载体一起给予人类以及动物受试者。在一些方面，该组合物包括药理学有效量的修饰的氯毒素缀合物。可通过已确立的程序常规地确定出有效量。有效量是足够占据癌细胞中氯毒素结合位点的量，但是足够低从而最小化非特异性结合至非肿瘤组织。针对术中成像的信噪比优化有效量。
本披露提供了用于通过使用氯毒素缀合物检测组织的方法。本发明的氯毒素缀合物靶向氯毒素结合位点并与之结合。应当理解，氯毒素结合位点可以有两种形式：结合氯毒素的位点以及结合本发明的氯毒素缀合物的位点。应当理解，氯毒素结合位点可不同于氯毒素缀合物结合位点。
在一些方面，提供了用于将表达氯毒素结合位点的癌病灶与非肿瘤组织区分的方法。该方法包括将感兴趣组织与对表达氯毒素结合位点的细胞具有亲和性以及特异性的氯毒素缀合物接触，其中该氯毒素缀合物包含一个或多个共价偶联到氯毒素上的红光或近红外发射荧光部分，并且测量氯毒素缀合物结合水平，其中相对于正常组织的升高的结合水平表明组织是肿瘤性的。
在一些方面，提供了用于检测表达氯毒素结合位点的癌的方法。该方法包括如下步骤：将感兴趣组织与对表达氯毒素结合位点的细胞具有亲和性以及特异性的氯毒素缀合物接触，其中该氯毒素缀合物包含一个或多个共价偶联到氯毒素上的红光或近红外发射荧光部分，并且测量氯毒素缀合物结合水平，其中相对于正常组织的升高的结合水平表明组织是肿瘤性的。
在一些方面，提供了用于在术中确定表达氯毒素结合位点的癌细胞在患者中位置的方法。该方法包括如下步骤：向患者给予药物组合物，其中该药物组合物包含药学上可接受的载体以及足够使表达氯毒素结合位点的癌细胞体内成像的氯毒素缀合物的量，其中该氯毒素缀合物包含一个或多个共价偶联到氯毒素上的红光或近红外发射荧光部分，通过荧光成像测量氯毒素缀合物结合水平以确定表达氯毒素结合位点的癌细胞的位置，其中相对于正常组织的升高的结合水平表明表达氯毒素结合位点的癌细胞的存在；并且从该患者中手术移除由荧光成像定位的、至少一些表达氯毒素结合位点的癌细胞。
在此披露的用于检测癌病灶的成像方法适用于患癌的小鼠及其他动物模型，并且适用于兽医实践。
本发明提供了用可被荧光成像检出的氯毒素缀合物对肿瘤进行术中成像和切除的方法，所述荧光成像允许癌组织的术中可视化；包括所述氯毒素缀合物的组合物、以及使用所述氯毒素缀合物的方法。该氯毒素是将缀合物指引至目的组织的靶向剂。在一个实施例中，本发明的氯毒素缀合物包括一个或多个标记试剂。在另一个实施例中，该标记试剂包括共价偶联到氯毒素上的荧光部分(例如红光或近红外发射荧光部分)。在另一个实施例中，该标记试剂包括放射性核素。
如本文所用，术语“红光或近红外发射荧光部分”意指具有荧光发射最大值大于约600nm的荧光部分。
在氯毒素缀合物的某些实施例中，荧光部分衍生自由发射波长最大大于约600nm表征的荧光化合物以避免自身荧光、穿过数毫米至一厘米的组织/血液/体液的发射、不被血红蛋白、其他血液成分、或人类或动物组织中的蛋白吸收的发射。在一些方面，发射波长最大值为大于600nm、大于650nm、大于700nm、大于750nm、大于800nm、大于850nm、大于900nm、或大于950nm。
荧光部分共价偶联到氯毒素上，以允许通过荧光成像对缀合物进行可视化。荧光部分衍生自荧光化合物。适合的荧光化合物是那些可以共价偶联到氯毒素上，而基本上不会不利地影响氯毒素缀合物的靶向以及结合功能。类似地，适合的荧光化合物在缀合至氯毒素之后保持其荧光特性。
一般来说，所给予的氯毒素缀合物的剂量可以变化，这取决于患者的年龄、重量、身高、性别、总体医学状况以及先前医疗史等因素。典型地，理想的是能够为受体提供缀合至能有效实现抑制、收缩、杀死、最小化、或预防转移的化学治疗剂、抗癌剂、或抗癌药的氯毒素的剂量。在许多情况下，理想的是能够为受体提供在约3mg至约6mg范围内的氯毒素缀合物的剂量，尽管也可根据情形给予较低或较高的剂量。
向受试者给予氯毒素缀合物可以通过区域导管或通过直接病灶内注射进行局部的、吸入的、静脉内的、动脉内的、腹膜内的、肌内注射的、皮下的、胸膜内的、鞘内的灌注。当通过注射给予缀合物时，可通过连续输注或通过单次或多次推注进行给药。
另外的给药途径包括口、粘膜、肺、以及经皮的给药。口服递送适合于聚酯微球体、玉米素微球体、类蛋白微球体、聚丙烯酸氰基酯微球体、以及基于脂质的系统(参见例如，DiBase以及Morrel，“OralDeliveryofMicroencapsulatedProteins,”inProteinDelivery:PhysicalSystems(蛋白质转运中的“微囊化的蛋白的口服输送”：物理系统)，Sanders(桑德斯)以及Hendren(亨德伦)(编辑)，第255-288页(PlenumPress(殷实出版社)1997))。鼻内递送的可行性通过胰岛素给药的这样一个模式进行示例(参见例如，Hinchcliffe(欣奇克利夫)以及Ilium(伊利昂)，Adv.DrugDeliv.Rev.(先进药物递送综述)35:199(1999))。可以制备包含氯毒素缀合物的干或液体颗粒并且可借助于干粉分散器、液体气雾剂发生器、或喷雾器被吸入(例如Pettit(佩蒂特)以及Gombotz，TIBTECH16:343(1998)；Patton(巴顿)等人，Adv.DrugDeliv.Rev.(先进药物递送综述)35:235(1999))。这种方法由AERX糖尿病管理系统说明，其为手提式的电子吸入器，可将雾化的胰岛素递送至肺中。使用电穿孔经皮递送提供了另一种给予氯毒素缀合物的方式。
根据已知方法，可以将包含氯毒素缀合物的药物组合物进行配制，以制备药学上有用的组合物，由此该缀合物与药学上可接受的载体组合。组合物被称为“药学上可接受的载体”，如果它的给药可以被受体患者所忍受的话。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上可接受的载体的一个实例。其他合适的载体是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Gennaro(詹纳罗)(编辑)，Remington’sPharmaceuticalSciences(雷明顿的药物科学)，第19版，(MackPublishingCompany(Mack出版公司)，1995)。
可将包含氯毒素缀合物的药物组合物制成液体形式、气雾剂、或固体形式。液体形式通过可注射溶液、气雾剂、滴剂、局部解剖学溶液以及口服混悬剂说明。示例性的固体形式包括胶囊剂、片剂、以及控释剂型。后者剂型通过微渗透泵以及植入物说明(Bremer(布雷默)等人，Pharm.Biotechnol.(药学生物技术)10:239(1997)；Ranade(罗纳德)，“ImplantsinDrugDelivery,”inDrugDeliverySystems(药物递送系统中的“药物递送中植入物”)，Ranade(兰特)以及Hollinger(霍林格)(编辑)，第95-123页(CRC出版社1995)；Bremer(布雷默)等人，“ProteinDeliverywithInfusionPumps,”inProteinDelivery:PhysicalSystems(“用输液泵递送蛋白”，在蛋白递送中：物理系统)，Sanders(桑德斯)以及Hendren(亨德伦)(编辑)，第239-254页(PlenumPress(殷实出版社)1997)；Yewey等人，“DeliveryofProteinsfromaControlledReleaseInjectableImplant,”inProteinDeliveryPhysicalSystems(“从控释可注射植入物中递送蛋白”，在蛋白递送中的物理系统)，Sanders(桑德斯)以及Hendren(亨德伦)(编辑)，第93-117页(PlenumPress(殷实出版社)1997)。其他固体形式包括乳膏、糊剂、其他局部解剖学施用等。
其他剂型可以是本领域技术人员设计的，如所示，例如，由Ansel(安塞尔)以及Popovich(波波维奇)，PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems(药物剂型以及药物递送系统)，第5版(Lea&Febiger1990)，Gennaro(热纳罗)(编辑)，Remington’sPharmaceuticalSciences(雷明顿的药物科学)，第19版，(MackPublishingCompany(Mack出版公司)，1995)以及由Ranade(兰特)以及Hollinger(霍林格)，DrugDeliverySystems(药物递送系统)(CRCPress(CRC出版社)1996)设计。
作为说明，药物组合物可以提供为试剂盒，该试剂盒包含容器，该容器包含氯毒素缀合物。治疗性缀合物可以用于单剂量或多剂量的可注射溶液的形式、或作为无菌粉剂提供，该无菌粉剂将在注射前重构。可替代地，此类试剂盒可包含干粉分散器、液体气雾剂发生器、或用于给予治疗缀合物的喷雾器。此类试剂盒可进一步包含有关适应症的文字信息以及药物组合物的用法。
本文中引用了不同的参考文献，包括专利申请、专利、以及科学出版物，通过引用将它们各自的公开内容全部结合在此。
本发明在范围方面不被在此说明的具体实施例限制。事实上，从以上说明和附图，除了在此所描述的内容以外，本发明的不同修改方案对于本领域的普通技术人员而言都将变得很清楚。这类改变旨在落入所附权利要求书的范围内。
关于此处任何方面或实施例的所讨论的所有特征可容易地适于此处其他方面以及实施例使用。在不同实施例中对于类似特征使用不同术语或参考号并不一定意味着区别，除明确提出之外。因此，本发明旨在仅通过参考所附权利要求书来描述，并且不局限于在此披露的实施例。
除非另外说明，可以以任何顺序进行本文所述的方法和程序。例如，描述步骤(a)、(b)、以及(c)的方法可以按首先步骤(a)、随后步骤(b)、然后步骤(c)进行。或者，可以以不同顺序进行该方法，如首先步骤(b)、随后步骤(c)、然后步骤(a)进行。此外，除非另外特别说明，这些步骤可以同时或分开进行。
此处所示细节仅是示例和为示例性讨论本发明优选的实施例，并且是为提供本发明不同实施例的原理和概念方面的被认为最有用和最容易被理解的描述而展示。在这方面，没有试图以比本发明基本理解所必需的更具体地显示本发明的结构细节，随同附图和/或实例的说明致使本发明的若干形式如何在实践中体现对于本领域那些技术人员来说是清楚的。
在提供了一系列值时，应理解每个中间值，到下限的第十个单位(除非上下文清晰地另外指示)，该范围的上限与下限之间以及任何其他陈述的或在该范围内的中间值均被涵盖在此处提供的披露之内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述较小的范围内，并且也包括在本发明内，服从所述范围中任何特别排除的限值。当所述范围包括一个或者两个限值时，排除那些包括的限值的任一个或者两个的范围也包括在此处提供的披露中。
关于此处的方面或实施例的所讨论的所有特征可容易地适于此处其他方面以及实施例使用。在不同实施例中对于类似特征使用不同术语或参考号并不一定意味着区别，除明确提出之外。因此，本发明旨在仅通过参考所附权利要求书来描述，并且不局限于在此披露的实施例。
虽然已经在此示出并描述了本发明的优选实施例，但是对本领域的普通技术人员而言应该显而易见是这样的实施例仅以举例方式提供。在不偏离本发明的情况下众多变化、改变和取代现在将被本领域的普通技术人员想到。应该理解的是，在实践本发明中可以采用在此描述的本发明的实施例的不同替代方案。旨在按照以下权利要求限定本发明的范围，并且在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物也包括在本发明的范围内。
实例
下面通过非限制性实施例进一步说明本发明。
实例1
具有乙酸铵盐的化合物16的稳定性
A＝MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR(K-27是附接点)
此实例证明了在不同pH和温度储存条件下，化合物16随时间的生产和稳定性。
化合物16的肽部分是缀合至荧光染料的靶向肽(修饰的氯毒素)。该靶向肽选择性地结合至癌性细胞并且染料部分促进通过成像检测。该肽是36个氨基酸的修饰的氯毒素(具有H-Met-Cys-Met-Pro-Cys-Phe-Thr-Thr-Asp-His-Gln-Met-Ala-Arg-Arg-Cys-Asp-Asp-Cys-Cys-Gly-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Lys-Cys-Tyr-Gly-Pro-Gln-Cys-Leu-Cys-Arg-OH的序列)其中天然氯毒素中三个赖氨酸氨基酸中的两个被精氨酸(K15R以及K23R)取代，以促进随后荧光团与单个残余赖氨酸(K27)残基的缀合，因此导致单标记的荧光活性药物成分。
方法和结果：在生产过程中，产品溶液储存在≤8℃下。所有分析使用过程中HPLC方法PR来确定产品在不同的缓冲液中的稳定性。
染料缀合：将化合物16(TFA盐)的500mg肽部分(净肽含量76.7，净肽384mg，0.095mmol)溶解于碳酸氢钠的溶液中。添加溶解在干DMSO(净染料126mg0.152mmol，0.152当量，基于90％的产品活性)中的DMSO和140mg的ICG-Sulfo-ATT，导致最终反应体积约为200mL。反应之后随后是RP-HPLC并且3小时后认为其完成，剩余～3.4％未反应的化合物16。
碳酸氢铵纯化：将反应溶液过滤并且然后用400mL的水稀释。将溶液加载于用0.1M碳酸氢铵平衡的RP-HPLC柱上，并且通过应用线性梯度的乙腈回收产物。
将产物作为单峰洗脱。收集多个级分并且通过分析型HPLC进行分析。在分析过程中，这些级分在≤8℃下避光储存。
每个级分中的产物纯度、估计浓度、以及估计量报告于表15中。估计值基于在水中在1mg/mL的浓度下在产物的溶液的释放分析过程中观察到的峰面积。
表15：碳酸氢铵纯化部分I
将主池(级分6-1-5至6-1-8，纯度97％)合并并且转移至盐交换步骤。将主池的样品分析5天的时间，在≤8℃下避光储存。在这些条件下，材料是稳定的。
乙酸铵盐交换：初纯化主池溶液(～200mL)用100mL的水进行稀释，并且将其加载于用0.1M碳酸氢铵平衡的RP-HPLC柱上。在加载样品之后，将该柱用4床体积的0.1M乙酸铵平衡，用氢氧化铵调节至pH7.6最后，将该柱用0.01M乙酸铵(pH7.6)平衡，并且通过应用在75％乙腈中的0.01M乙酸铵(pH7.6)的线性梯度回收产物。
在大约39％乙腈浓度下，将产物作为单峰洗脱。收集这些级分并且通过分析型HPLC进行分析。在分析过程中，这些级分在<8℃下避光储存。
每个级分中产物的纯度、估计浓度、以及估计量报告于表16中。估计值基于在水中在1mg/mL的浓度下在产物的溶液的释放分析过程中观察到的峰面积。
表16：碳酸氢铵纯化部分II
将主池(级分7-1-2至7-1-6，纯度97.2％)合并并且转移至冻干。将主池的样品分析5天的时间，在≤8℃下避光储存。在这些条件下，材料是稳定的。用等于主池体积大约一半的体积进行稀释提供了稳定的溶液，不存在沉淀。在制备规模下使用该稀释。
冻干：将处于阶段7的主池用100mL的水稀释并且使用瓶状冻干器冻干4天。稀释后溶解度没有问题，如已经观察到的碳酸氢铵主池；将样品稀释至15％乙腈没有观察到任何沉淀。在冻干过程中，产物形成稳定的自支撑饼。
重构：产物在1、5以及10mg/mL下易溶于水。水被选作重构溶液。另外，对最终材料进行LC-MS分析。
将处于阶段6的主池的样品(碳酸氢铵纯化)避光存储在≤8℃下5天、未稀释。每天对样品进行分析。结果报告于表17中。结果表明低水平的不稳定性。
表17：阶段6主池稳定性
将处于阶段7的主池的样品(乙酸铵纯化)避光存储在≤8℃下5天、未稀释。每天对样品进行分析。结果报告于表18中。结果表明低水平的不稳定性。
表18：阶段7主池稳定性
开发出了用于GMP生产的化合物16的经优化和可扩展的缀合生产流程。对两种不同的染料试剂进行评估：ICG-Sulfo-NHS酯以及ICG-Sulfo-ATT(均导致化合物16)。准备了试验设计(DOE)研究。
在化合物16缀合之后，用TFA和乙腈梯度洗脱通过RP-HPLC对粗肽缀合物进行纯化。针对纯度使用RP-HPLC测定对级分进行表征，在冻干成大块缀合产物之前汇集并且通过HPLC脱盐至乙酸盐。
化合物16在pH7.5以及8.5时稳定长达14天(当在4℃下在黑暗中、在10mMTris、5％右旋糖中存储时)并且对低pH和4℃以上温度敏感。
实例2
评估化合物16在不同缓冲剂中以及在不同pH下的稳定性
A＝MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR(K-27是附接点)
这个实例显示化合物16相对于pH值的稳定性并且提供了对使用替代缓冲剂和不同赋形剂和配置的评估。
这个实例进一步显示，不同种类的赋形剂保护化合物16不受热、光、氧化以及冷冻/融化压力。
在一些情况下，配制品在空气气氛中存储在微量离心管中并且在黑暗中在40℃下在2d和5d后、在黑暗(dk)中或在环境光(lt)下在室温(rt)下在3d后、以及在黑暗中在-20℃与室温之间在3X冷冻-融化(F/T)之后进行测定。通过视觉检查、离心、RP-HPLC、A786浓度、pH和SDS-PAGE对配制品进行评价。
在一些情况下，时间点为4、7、以及14天在室温下，通过视觉检查、离心、RP-HPLC、A786浓度、pH和SDS-PAGE进行评价。在保留额外的材料时，为了更多信息对额外的压力条件进行评价。将配制品在空气环境中容纳于微量离心管中。
方法：制备随后的储备液并且使其经过0.2μm过滤器(表19)。在使用之前立即通过将来自表19的储备液与鼓泡水(通过将用氩鼓泡15min-3h)结合而制备透析缓冲剂。
表19：储备缓冲溶液
在水中在3mg/mL下制备化合物16(见以下A786浓度)。将Slide-a-lyzer盒在水中预先浸泡，然后将化合物16分配到这些盒中(～11mL对于配制品1，～5mL对于配制品2-6，～2.7mL对于配制品7-12)。将这些盒置于含有550mL对应配制品缓冲液的烧杯中。通过在室温下伴随搅拌在黑暗中透析来配制样品(在多位置搅拌板上，由涂敷铝箔的盒覆盖)。1h后更换透析缓冲液、1.25h后再次更换并且允许继续过夜。
对于一些配制品，将配制品置于新鲜管中并且结合其他无菌0.25M或0.5M缓冲储备液以产出具有30mM浓度缓冲液的新配制品。然后将所有配制品分配至1.5mL微量离心管中，每管0.5mL。
在室温下，设计的稳定性时间点为4、7和14天。在保留额外的材料时，进行额外的测试。立即检测每种配制品的一个管(“t0”)。为了其他信息，然后将来自这些t0管中的剩余材料在-20℃下冷冻，然后在5℃下解冻，并且对于pH和浓度进行检测(“1xF/T”)。将其他管在黑暗中在室温下(大约22℃-23℃)孵育。将管移除并且在4、7以及14d在室温下(rt)(“4drt”、“7drt”、“14drt”)进行检测。为了其他信息，在7d室温下之后，检测样品，将剩余材料在光照中置于室温下一天并且然后再次进行检测(“7+1d光照”)。将这些管置于台式上它们的一侧。通过视觉检查、离心、RP-HPLC、A786、pH以及在一些情况下SDS-PAGE对稳定性样品进行评价。
用肉眼检验样品的澄清度、颜色、以及可见微粒。然后将它们混合、提取至玻璃巴斯德移液管，并且再次进行检验。将样品～10,000rpm离心～2min。然后用肉眼检验样品的任何可见小粒。
使用Zorbax_10方法通过RP-HPLC对样品进行分析。
表20：所测试的配制品
将100μl的样品置于HPLC小瓶插入物中，置于琥珀色HPLC小瓶中，并且在2μl注入之前保持在2-8℃。在每次运行开始时注射两次配制品缓冲液，并且在将样品注入新缓冲液中之前每次运行匹配的配制品缓冲液空白试验。
用匹配配制品缓冲液对分光光度计进行空白化。使用消光系数计算浓度。使用校准的微pH电极测定pH。
遵照制造商的推荐制备样品并且然后在70℃下加热10min。将10μL中的2μg加载至SDS-PAGE凝胶上并且然后在200V下跑胶大约35min。在电泳之后，将凝胶在室温下在水中洗涤5min、3次。然后，将它们在室温下染色1.5h，在水中脱色过夜，并且然后再次用水脱色并且在同一天成像。
结果。通过将化合物16的储备液(在水中3mg/mL)渗析至不同缓冲液中生产配制品。然后将配制品分配至微量离心管中，在空气中，并且在黑暗中在室温下存储多达14天。来自肉眼检查配制品的结果给于表21中。
表21：目测检查。C＝清澈；G＝翡翠绿；N＝基本上没有可见颗粒；F＝极少可见的颗粒或纤维；nt＝未检测的。
在表22中提供了离心后的结果。pH测量显示在表23中。
表22：离心后球粒分析。N＝无球粒；P＝球粒。
表23：pH稳定性分析。
通过RP-HPLC的％主峰在表24中给出。稳定性在pH≤6.5时快速下降。
表24：通过RP-HPLC的％主峰；Δ光照v黑暗＝(7+1d光照)-(7d黑暗)。
图1示出了在室温下14天之后配制品的SDS-PAGE分析。图1A以及1B示出了(分子量标准参照物)MWM、1、2、2B、4、6、6B、9、10以及参照(从左往右)的SDS-PAGE分析。图1A使用还原剂进行而图1B未使用还原剂进行。图1C示出了7、8、11、12、参照以及MWM(无还原剂)(从左往右)的SDS-PAGE分析。(参照＝试制批，子批#2.MWM：188k、98k、62k、49k、38k、28k、17k、14k、6k、3k。箭头指向较高的分子量种类。
通过其他手段配制化合物16。制备储备液并且将一些储备液的pH调整至接近6.8以避免在添加至配制品时pH移位(表25)。除了BHT、BHA、没食子酸丙酯以及聚山梨醇酯，所有储备液进行0.2μm过滤。用氩气包覆层存储聚山梨醇酯和Nal储备液。将His、Met、Nal、聚山梨醇酯、BHT、BHA、以及没食子酸丙酯储备液在黑暗中储存。
表25：储备缓冲溶液
在氩气鼓泡的水中以10mg/mL制备化合物16。将化合物16储备液与储备缓冲液、储备渗压剂、以及水结合以制成含有化合物16的母储备液A-E(表26)。用0.1NNaOH将每种可溶的母储备液的pH调整(从6.6-6.7的开始值)至6.8。
表26：母储备液配制品
然后通过将母储备液与其他赋形剂储备液和水结合生成最终配制品。将配制品通过0.2pm无菌针筒式滤器。保留0.4mL的配制品1、3、4、以及5用于“t0”分析。
将两个0.3mL管置于黑暗中的40℃恒温器中用于2d和5d后分析。在40h(1.7d)之后分析这些2d样品。将一个0.3mL管经受“3XF/T”。1XF/T包括在-20℃下冰冻该材料至少8h、在黑暗中在室温(rt)下解冻(～1h)、然后温和地混合、倒转、并且旋转以将该材料带回管底部。将该循环总共进行三次。将剩余的0.3mL管在5℃下保存。将0.5mL管中的一个在室温下置于黑暗中，并且将另外0.5mL管在室温下置于光照下。对于光照暴露，将这些管以其侧面放置并且暴露在环境光照中。选择0.5mL的体积进行光照暴露，如先前工作显示，0.3mL样品在此配置中在光照暴露后易于沉淀和降解。
通过视觉检查、离心、RP-HPLC、A786、pH以及在一些情况下，DS-PAGE对稳定性样品进行评价。当不使用时，将样品在黑暗中保持在5℃下。用肉眼检验样品的澄清度、颜色、以及可见微粒。将样品倒置三次并且再次检查。将样品温和地混合、然后～10,000rpm离心～2min。针对球粒用肉眼检验样品。在上清液上进行剩余的测定。
遵照制造商的推荐制备样品并且然后在70℃下加热10min。将10μL中的2.5μg加载至SDS-PAGE凝胶上并且然后在165-200V下跑胶。在电泳之后，将凝胶在室温下在水中洗涤5min、3次。将凝胶在室温下染色1h，在水中脱色过夜，并且然后再次用水脱色并且在同一天成像。
通过将化合物16以10mg/mL在水中溶解、稀释于缓冲液与渗压剂中、调节pH、必要时添加最终添加剂和水生产配制品(表27)。
表27：在3mg/mL化合物16下在6.8下测试的配制品
配制品#6(140mMNaCI)、#12(1mMEDTA)以及#18(0.2％Nal)具有立即的大量沉淀并且被丢弃。在所有其他配制品中，在所有测试的时间点，该材料是清澈、绿色、并且没有明显可见颗粒形成(表28)。
表28：目测检查。C＝清澈；G＝翡翠绿；N＝基本上没有可见颗粒；F＝极少可见的颗粒或纤维；P＝球粒，nt＝未检测的。
所有样品在pH6.8+/-0.1下(表29)。
表29:pH
通过RP-HPLC的％主峰在表30中给出。
表30：通过RP-HPLC的％主峰。Δ光照vs.黑暗＝在室温下在光照下3d后的％主峰减去在室温下在黑暗中3d后的％主峰。
在40℃下5天之后，通过还原以及非还原SDS-PAGE可见明显数量的较高分子量的种类(HMWS)的形成(图2)。图2示出了在40℃(以及在时间＝0时)下5天之后配制品的SDS-PAGE。样品为在40℃下5天之后，除非标记为时间＝0。配制品自左向右。图2A以及2B示出了(分子量标准参照物)MWM、3、4、5、8、9、10、11、13、14、15、16、17、19以及参照(从左往右)的SDS-PAGE分析。图2A使用还原剂进行而图2B未使用还原剂进行。图2C示出了1t0、3t0、5t0、1、2、3、参照、MWM、1t0、3t0、5t0、1、2、3、参照(从左往右)的SDS-PAGE分析。对于图2C，MWM左侧的泳道使用还原剂进行而MWM右侧的泳道未使用还原剂进行。参照＝试制批，子批#2(-20℃)。MWM(顶端至底部)：188k、98k、62k、49k、38k、28k、17k、14k、6k、3k。黑色箭头指向较高分子量的种类，绿色箭头指向配制品19中的新带，而红色箭头指向配制品5和15中可以被还原的材料。
在光照中在室温下3天后，较高分子量的种类形成明显(图3)。样品来自在光照中在室温下3天后，除非被标记为F/T。图2A以及2B示出了(分子量标准参照物)MWM、参照、3、4、5、8、9、10、11、13、14、15、16、17、19(从左往右)的SDS-PAGE分析。图3A使用还原剂进行而图3B未使用还原剂进行。图3C示出了3F/T、13F/T、14F/T、1、2、3、参照、MWM、3F/T、13F/T、14F/T、1、2、3、参照(从左往右)的SDS-PAGE分析。对于图3C，MWM左侧的泳道使用还原剂进行而MWM右侧的泳道未使用还原剂进行。参照＝化合物16，试制批，子批#2(-20℃)。MWM(顶端至底部)：188k、98k、62k、49k、38k、28k、17k、14k、6k、3k。黑色箭头指向HMWS。
通过用化合物16在碱缓冲液中测试不同赋形剂对化合物16稳定性的作用。配制品在空气气氛中存储在微量离心管中并且在黑暗中在40℃下在2天和5天后、在黑暗中或在环境光下在室温(rt)下在3天后、以及在黑暗中在-20℃与室温之间在3X冷冻/融化之后进行测定。
实例3
评估氯毒素缀合物在不同小瓶类型以及气氛中的稳定性
该实例描述了化合物16在不同小瓶类型以及在不同气氛(顶部空间)环境中的稳定性。
测试了KNTi-0303(BLZ-100的活性药物成分)在琥珀玻璃、透明玻璃、CZ以及1+型玻璃小瓶(具有空气或N2在顶部空间)中的稳定性。通过RP-HPLC测定样品的纯度，如表31中所示。在40℃下孵育后，所有样品显著降解。在一些情况下，在40℃下8d之后纯度值相似或甚至高于在40℃下5d之后的值。接下来一周将5d以及8d样品一起重新分析，并且纯度值以及层析谱形状与最初分析具有可比性。在同一天2d、5d、以及8d小瓶都在40℃恒温箱中，在设定天数之后移除这些小瓶，在黑暗中置于5℃下，并且然后在1d之内进行分析。
表31：通过RP-HPLC测的存储在不同小瓶类型中的化合物16的％纯度。
在在存储40℃下的所有小瓶中，当样品在N2下而不是空气中存储时通过RP-HPLC测的纯度损失显著减慢。在N2下，在琥珀玻璃小瓶中纯度损失显著快于透明玻璃、1+型玻璃、或CZ小瓶中。然而，在空气中，不同小瓶类型之间没有明显差异，尽管降解在1+型玻璃或CZ小瓶中更慢。
当暴露于光照中时，当样品在N2下而不是空气中存储时所有小瓶中通过RP-HPLC测的纯度损失再次显著减慢。在光照暴露下，在琥珀玻璃小瓶中存储纯度损失减慢，而非其他小类型。在N2下，在光照下3d后(每天8h的光照照射)在琥珀玻璃小瓶中纯度损失为0.8％而在透明玻璃小瓶中为1.2％。在空气中，在光照下3d后在琥珀玻璃小瓶中纯度损失为2.0％而在透明玻璃小瓶中为3.0％。因而，相比于透明玻璃小瓶，在光照下3d后在琥珀小瓶中存储在N2下纯度提高0.4％而在空气中提高1.0％。透明玻璃小瓶、1+型小瓶、以及CZ小瓶在光照暴露下类似地进行，除了CZ小瓶在N2下比其他在N2下的小瓶保护更少，可能是由于CZ小瓶增加的气体渗透率。
将来自在rt下在光照下相比于黑暗中样品的数据，显示由于超过3d光照暴露琥珀小瓶中的配制品经历极少降解。3d之后，由于光照暴露额外的纯度损失在N2下为0.2％而在空气中为0.8％。
通过RP-HPLC，化合物16对于测试的配制品以及配置中的摇动未表现出非常敏感。相比于在黑暗中不摇动rt储存，由于在N2下在琥珀小瓶中摇动持续3d，额外纯度损失为0.5％。在N2下摇动后不同小瓶类型之间没有明显差异，但透明玻璃或1+型玻璃小瓶中的稳定性可略微更高。摇动提供搅拌胁迫但也提供额外的对流，对流可增加与顶部空间或表面淋溶的氧接触。
通过RP-HPLC评价，在N2下任何小瓶类型中3XF/T之后没有明显降解。琥珀小瓶数值表现出略更低，1stRP-HPLC注射产生98.0％的值，但2nd注射产生98.8％的值。2nd注射与其他小瓶类型具有可比性；可能是由于先前注射的样品的作用1st注射人为降低。
实例4
用于冻干缀合物的候选配制品的开发
A＝MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR(K-27是附接点)
这个实例显示对于化合物16不同的冻干条件。
方法：将用于冻干化合物16的各种策略尝试用于化合物16的不同配制品。对于冷冻技术，将1.2mL的配制品添加至3mL玻璃小瓶中并且用单出口弗泰克(fluorotec)包衣塞塞住。对于速冻，在-40℃下使架平衡之后将小瓶置于架上。对于慢冻，以1℃/min的速率控制温度从4℃减低至-40℃。使用的肽-染料缀合物浓度为1、3、4、6、以及10mg/mL。
通过添加1.2mL的水重构冻干化合物16并且随后温和混合<1min。重构的化合物16是清澈的、翡翠绿色溶液、没有可见颗粒并且在离心(15,000xg，5min)后没有观察到球粒。如通过KF滴定法确定的，pH在6.8-6.95之间，而含水量为<1％。
在冻干之前，配制品体积为每个1.2mL而冻干的配制品用1.1mL的水重构随后温和混合<1min。在重构过程中或之后没有观察到可见凝聚体。
通过RP-HPLC分析重构的样品的氧化/纯度，通过RP-HPLC和/或OD786确定质量，离心、MFI和/或SDS-PAGE后通过小粒形成测量凝聚，通过cIEF确定电荷异质性，通过FTIR指示二级结构，pH测量如在此描述(pH在6.8-7.0之间)以及KF滴定法确定(残留水份为<0.5％)。
结果：不同冻干的化合物16配制品的总结数据提供在表32-33中。如通过RP-HPLC测定的，快速和慢速冻干具有8％甘露醇和2％海藻糖的配制品在总色谱峰面积方面没有产生实质性的差异(图4)。重构样品的FTIR光谱与还没有冻干的样品FTIR光谱具有可比性(表33)。由FTIR谱表示的二级结构在快速与慢速冷冻配制品之间没有差异(图5)。通过不同冻干制剂的SDS-PAGE没有检测到粒度的差异(图6)。如通过cIEF测定的，样品之间在电荷异质性方面也没有显著差异(等电点，pI)。
实例5
用于靶向神经胶质瘤肿瘤组织的化合物的制备与应用
化合物76
A＝(PEG)-MCMPCFTTDHQMARACDDCCGGAGRGKCYGPQCLCR(K-27是附接点)
这个实例显示与正常组织比较ICG在靶向肿瘤组织中的表现，通常作为信号/噪声比以及注射入受试者后24小时ICG缀合物的体内分布。
在与ICG缀合之前氯毒素(CTX)与化合物76的N末端聚乙二醇化作用最小化由潜在ICG缀合至除了K27位点之外的N端而产生的产物异质性(化合物76的肽序列具有H-Met-Cys-Met-Pro-Cys-Phe-Thr-Thr-Asp-His-Gln-Met-Ala-Arg-Ala-Cys-Asp-Asp-Cys-Cys-Gly-Gly-Ala-Gly-Arg-Gly-Lys-Cys-Tyr-Gly-Pro-Gln-Cys-Leu-Cys-Arg-OH的序列)。聚乙二醇化作用通常提高水性溶液中的溶解度以及在癌组织成像过程中的信噪比。
制备化合物76的三种衍生物，即2kD、5kD、以及40kD的PEG醛衍生物。分别通过对化合物76进行聚乙二醇化使用2kD、5kD、以及40kDPEG醛衍生物获得它们。通过对化合物76进行聚乙二醇化使用5kD多分散的PEG醛衍生物获得5kD-聚乙二醇化的修饰的氯毒素(化合物76-5kD)。
通过尾静脉(IV)将2nmol每个的基于氯毒素的缀合物注入携带U87胁部异种移植物的小鼠。注射24小时之后，使小鼠安乐死并且切除肿瘤和腿肌或收集脑、心、肝、肾、脾、以及血液。使用装备有745nm激发滤光片以及820nm发射光滤光器的IVIS光谱对肿瘤和腿肌切除组织成像。将所有组织在OCT中冷冻并保存。
用低温恒温器将组织切片到12μm厚部分并使用Li-Cor奥德赛(Odyssey)扫描分辨率设置为21μm，高质量、强度7.0、通道800nm(激发＝785nm)进行扫描。使用Li-Cor奥德赛(Odyssey)软件对图像进行量化，使用相同大小的感兴趣区域(ROI’s)并且以积分强度的单位中进行表达(计数/mm2)。将组织提交至FHCRC实验组织病理学核心(FHCRCExperimentalHistopathologycore)以H&E染色。
使用靛氰绿(Cardiogreen，ICG)(Sigma(西格马)，产品#I2633)进行自由染料实验。在H2O中制备200μM溶液并且过滤法消毒。在1XPBS中制备40μM稀释液。该程序过后ICG自由染料留在溶液并且在重构后后1小时内被使用。
结果奥德赛(Odyssey)分析显示各个缀合物的信号/噪声如下：化合物76-2kD，6.6+/-3.7(n＝8)；化合物76-5kD，8.8+/-1.6(n＝7)；化合物76-40kD，10.3+/-4.4(n＝8)。显示了来自各个缀合物的代表荧光图像(图8)。相比于肿瘤细胞，肿瘤组织周围的被膜有高水平的信号(图9)。
化合物76-2kD、化合物76-5kD、化合物76-40kD靶向肿瘤组织。注射之后24小时未在肿瘤中测出自由染料。缀合至荧光团ICG的聚乙二醇化的氯毒素结合肿瘤组织并且注射之后24小时被测出。肿瘤结合特异于聚乙二醇化的氯毒素的特性，因为自由染料24h后在肿瘤中不可检测。
注射24h之后生物分布图显示化合物76-5kD主要分布在肝和肾中，在脾和心中检测的低信号。正常的脑中很少或没有检测出信号(图10)。另外，心脏的大血管中没有检测到显著信号，在先前的实验中利用IR800与Cy5.5的缀合物已观察到这点(图11)。
ICG自由染料未在肝、肾、脾、或脑中检测到。自由染料在粪便物中是可检出的，这表明它被肝从血液中清除到胆汁中。缀合物的生物分布图因此更接近其他CTX缀合物所显示的，而自由染料生物分布类似于对于非缀合的ICG所报告的。
实例6
给予其他氯毒素缀合化合物以及靶向神经胶质瘤肿瘤组织
这个实例显示与正常组织比较在靶向肿瘤组织中化合物1-720的应用，作为信号/噪声比以及注射入受试者后24小时氯毒素缀合化合物1至720的生物分布。
使用的材料和方法描述于实例5中，但使用化合物1-720。
结果。化合物1-720优先靶向并且标记肿瘤组织以及围绕肿瘤的被膜。注射24h之后生物分布图显示化合物1-720主要分布在肝和肾中，在脾和心中检测的低信号。正常的脑中或心的大血管中很少或没有检测出信号。
实例7
使用化合物16检测模型中神经胶质瘤肿瘤的剂量间隔和成像间隔
这个实例显示在小鼠中化合物16的最佳成像时间和剂量并且进一步显示化合物16靶向植入小鼠脑中的U87人类神经胶质瘤细胞。使用全组织成像和切片组织分析，相比于正常脑而言肿瘤中化合物16信号(信号噪声比，SNR)与皮下U87胁部异种移植物中计算的SNR比较。
材料。化合物16以0.03mg/ml或6μM(0.6nmole/100μl)；0.1mg/ml或20μM(2nmole/100μl)；0.3mg/ml或60μM(6nmole/100μl)；0.5mg/ml或100μM(10nmole/100μl)；以及1mg/ml或200μM(20nmole/100μl)；10nmole/100μl(0.5mg/ml)的浓度在10mMTris以及5％甘露醇中。
方法。在胁部携带U87(使用标准培养条件于DMEM，10％胎牛血清(合格的#26140，Invitrogen)，Pen/Strep(Invitrogen)中培养的人类神经胶质瘤细胞系(Invitrogen))异种移植物的Nu/Nu雌性小鼠通过尾静脉以100μl的总体积注入0.6、2、6、10、或20nmol的化合物16。在注射之后1、2、或3天将小鼠安乐死。收集所有小鼠的肿瘤、肌肉、以及皮肤。解剖小鼠的亚组的脑、心、肝、以及肾。使用IVIS光谱(PerkinElmer)对组织成像并且使用活体图像软件(LivingImagesoftware)(PerkinElmer)进行量化。将肿瘤组织在OCT中干冰上冰冻，切为12μm切片，并且使用800nm通道(785nm激发)在奥德赛(Odyssey)CLx近红外成像法系统(利卡生物科学公司(Li-CorBiosciences))上扫描。使用“自动”强度设定以及21μm分辨率扫描组织。使用图像工作室软件(ImageStudiosoftware)(Li-Cor)分析图像，这是通过测量每个组织图像中绘制的感兴趣区域内(ROI)的荧光信号。
使用五周大的使用异氟醚麻醉的雌性Nu/Nu小鼠(Harlan实验室)生成正位异种移植物植入物。用聚维酮碘和醇擦拭头皮。使用手术刀，在头皮上沿大脑皮层区域的中线开一个切口。使用具有0.9mmbit的微钻穿过颅骨钻孔。钻孔置于右侧大脑半球，矢状缝的大约1mm侧(右)，人字形缝前2mm，并且2mm深。使用p20移液管和针尖，将悬浮在无血清DMEM(Invitrogen(英杰公司))中的100,000U87细胞注入脑。用明胶海绵(GelfoamSponge)(Pfizer(辉瑞公司))碎片覆盖钻孔并且用威特邦(Vetbond)组织粘合剂闭合切口(3M)。小鼠在注射部位接受布比卡因用于减轻疼痛。小鼠在植入大约4周后产生肿瘤。
三只具有常位U87脑肿瘤的小鼠以及三只具有U87胁部肿瘤的小鼠接受尾静脉注入100μl的10nmol/100μl剂量的化合物16。注射一天后，使用CO2吸入使小鼠安乐死。将携带常位异种移植物的脑、胁部肿瘤和正常脑切除，并且使用745nm激发和820nm发射光滤光器在Ivis光谱(PerkinElmer)上成像。然后，使用800nm通道(785nm激发)将全组织在奥德赛(Odyssey)CLx近红外成像法系统(利卡生物科学公司(Li-CorBiosciences))上成像。将肿瘤组织在最佳切片组织培养基(OCT)(TissueTek)中干冰上冰冻，切至12μm切片，置于带电的载玻片上(Fisherbrand)并且在奥德赛(Odyssey)上扫描。使用“自动”强度设定以及21μm分辨率扫描组织。使用图像工作室软件(ImageStudiosoftware)(Li-Cor)分析图像，这是通过测量每个组织图像中绘制的感兴趣区域内(ROI)的荧光信号。使用标准组织学方案将载玻片用苏木精和曙红(H&E)染色。
结果。在注射化合物16后1-3天对相比于肌肉(SNR)而言肿瘤中的信号进行分析。在胁部模型中，在6nmol剂量情况下在一天时间点的SNR最大而在20nmol剂量情况下在三天时间点的SNR最高(图12)。SNR是由正常肌肉中较低的信号驱动，注射后一天6nmol同龄组比20nmol组更低(图12)。在注射后三天肌肉中信号明显下降。在三天后肿瘤中的信号减少而肿瘤与肌肉中的信号比例提高。
评估亚组动物中的正常脑、皮肤、心、肝、以及肾。在注射后一天或三天切除组织并且使用IVIS光谱体离体像(图57)。所有组织随着剂量增加而信号增加。信号在皮肤、肝、以及肾中最高。
所有组织中信号到三天时间点下降(图13)。20nmol组中肾中的信号下降5.6倍，而皮肤中的信号下降了3.7倍。全身活体动物成像显示注射后6小时化合物16快速分布，然后在接下来的三天信号下降(图14)。
为了规范组织厚度，组织切为12μm切片、扫描并且分析。常位样品中SNR为12.7-200而胁部异种移植物组织的SNR为246-344。全组织和切片组织分析之间的更高的SNR比率最有可能由于在正常脑组织中检测到非常低水平的信号，其通常低于12μm切片中检测到的水平。
与正常肌肉相比肿瘤组织中的信号是剂量和时间依赖性的。一天成像时间的最佳剂量确定为6nmol，而三天时间的最佳剂量为20nmol。注射后信号在正常组织中迅速分布，其中注射后一天化合物16在肾、肝、以及皮肤中累积最高。三天后，化合物16在正常组织中清除，其中残留量的化合物16在肾、肝和皮肤中剩余。
针对0.6-20nmol之间的剂量，在注射化合物16后评估最佳成像时间。在注射1、2或3天后对携带U87胁部异种移植物的小鼠成像。对于一天成像，肿瘤中信号相比于肌肉(信噪比，SNR)在6nmol剂量处最大。对于三天成像，SNR在20nmol剂量处最大。
评估神经胶质瘤的U87常位脑异种移植物小鼠模型中化合物16的肿瘤靶向以及成像功效。用10nmole的化合物16注射携带植入脑或胁部的U87人类神经胶质瘤的小鼠。注射后1天将脑和肿瘤组织切除并且成像。评估全组织图像以及冷冻的切为12μm切片的组织中相比于正常脑而言肿瘤中的信号。对于常位异种移植物样品，相比于正常脑而言肿瘤中信号(SNR)为11.6-60，而对于胁部异种移植物样品为131-138(图13)。因为大多数的肿瘤组织粘着至颅骨，常位样品#1不包括在定量分析中。在脑中检测到残余的肿瘤细胞(图13)。
使用IVIS光谱从三分之二U87常位脑肿瘤中检测出化合物16(图15)。来自常位#1的脑肿瘤在Ivis光谱上不具有信号。缺乏信号是由于肿瘤组织附着至颅骨的下侧，后来在尸体剖检过程中其被取出脑。在奥德赛(Odyssey)上进行全组织成像过程中检测到化合物16信号(图15)。
实例8
使用其他氯毒素缀合化合物检测模型中神经胶质瘤肿瘤的剂量间隔和成像间隔
这个实例评估在小鼠中化合物1-720的最佳成像时间和剂量并且进一步显示化合物1-720靶向植入小鼠脑中的U87人类神经胶质瘤细胞。使用全组织成像和切片组织分析，相比于正常脑而言肿瘤中化合物1-720信号(SNR)与皮下U87胁部异种移植物中计算的SNR比较。
材料和方法如实例7中所描述。
结果。在注射化合物1-7200后1-3天相比于肌肉(SNR)而言对肿瘤中的信号进行分析。在6nmol剂量情况下在一天时间点的SNR最大而在20nmol剂量情况下在三天时间点的SNR最高。SNR是由正常肌肉中较低的信号驱动，注射后一天6nmol同龄组比20nmol组低。在注射后三天肌肉中信号明显下降。在三天后肿瘤中的信号减少而肿瘤与肌肉中的信号比例提高。
评估正常脑、皮肤、心、肝、以及肾。所有组织随着剂量增加而信号增加。信号在皮肤、肝、以及肾中最高。用高达100X标准成像剂量的化合物1-720处理的小鼠、大鼠和非人类灵长动物的组织病理学分析发现没有与测试品相关的毒性。
所有组织中信号到三天时间点下降。全身活体动物成像显示注射后6小时化合物1-720快速分布，然后在接下来的三天信号下降。
与正常肌肉相比而言的肿瘤组织中的信号是剂量和时间依赖性的。一天成像时间的最佳剂量确定为6nmol，而三天时间的最佳剂量为20nmol。注射后信号在正常组织中迅速分布，其中注射后一天化合物1-720在肾、肝、以及皮肤中累积最高三天后，化合物1-720在正常组织中清除，残留量的化合物1-720在肾、肝和皮肤中剩余物。
针对0.6-20nmol之间的剂量，在注射化合物1-720后评估最佳成像时间。在注射1、2或3天后对携带U87胁部异种移植物的小鼠成像。对于一天成像，当三天后成像时，相比于肌肉而言的肿瘤中的信号(信噪比，SNR)在相比于对于高SNR最佳剂量更低剂量处最大。
评估神经胶质瘤的U87常位脑异种移植物小鼠模型中化合物1-720的肿瘤靶向以及成像功效。用10nmole的化合物1-720注射携带植入脑或胁部的U87人类神经胶质瘤的小鼠。注射后1天将脑和肿瘤组织切除并且成像。评估全组织图像以及冷冻的切为12μm切片的组织中相比于正常脑而言的肿瘤中的信号。使用全组织成像和切片组织分析，常位脑肿瘤中的信号高于正常脑组织。使用全组织成像和切片组织分析，胁部肿瘤中的信号高于正常脑组织。
实例9
狗中离体图象分析以及用于成像的最佳剂量的确定
该实例描述了确定具有天然发生肿瘤的狗中最佳的BLZ-100成像剂量。这个分析是利用来自参与实例19中描述的研究中狗的组织。最佳临床成像剂量是肿瘤的总体荧光强度的函数，其影响检测的方便性、以及相比于信号驻留的正常组织而言肿瘤组织中信号的比率。使用在全部肿瘤以及切片上离体成像进行肿瘤信号强度以及信号与背景的比较。
在剂量递增方案中BLZ-100以固定的剂量0.1-1.5mg静脉注射，随后在明显的最佳剂量处扩大。为了使个体尺寸变化标准化，对于所有标准化都按mg/m2计算。剂量(mg/m2)为0.25-0.8(7只狗)、0.8-1.2(16)以及1.2-1.6(5)。
奥德赛(Odyssey)近红外扫描器(Li-Cor)是平坦扫描器，其优化用于检测800nm荧光。它具有21微米的分辨率并且给出高达9数量级强度的定量数据。这台仪器能够测量荧光，即使是在来自用最低剂量治疗的患者的非常早期的样品。来自总肿瘤奥德赛(Odyssey)扫描的数据用于比较在给予的所有剂量中的整体荧光。分析表明，在低剂量处，肿瘤强度与剂量水平相关。在剂量高达0.8mg/m2处，总肿瘤样品中信号随着剂量而增加。在剂量高于0.8mg/m2处，在这些条件下荧光明显没有继续增长。因此，在至少这些条件下用于成像犬肿瘤的最佳剂量范围具有下限。
在剂量大于0.8mg/m2时，肿瘤类型是成像强度中的最重要的变量。总共有21只狗治疗剂量超过这个阈值。为了比较样品中的总荧光强度，使用总肿瘤的奥德赛(Odyssey)扫描进行感兴趣区域分析。软组织肉瘤的亚型具有最高的整体吸收，随后是癌(腺癌和鳞状细胞癌)。口腔的纤维肉瘤具有最低整体吸收，但目前尚不清楚这是否是由于组织学亚型或解剖学位置。信号和其他研究变量之间没有关联，如品种和体重。数据显示，软组织肉瘤作为一个分类具有最高的荧光，中值强度是癌的几乎三倍，而最大值高出7倍。
在用0.8mg/m2或更高治疗的狗中(总共21只狗)，肿瘤与正常外围组织的荧光比率的范围从<1(无特殊的信号，3只狗)至>200，在一些肿瘤类型中具有良好的分化，包括脑膜瘤、癌(肺、甲状腺、以及乳腺)以及肉瘤。最高的信号和总肿瘤与背景比率见于软组织肉瘤的亚型中，暗示在这些肿瘤类型中优先吸收缀合物。
软组织肉瘤在总体成像中显示出最强的荧光，所以这些肿瘤被选用于进行肿瘤与背景比率的组织病理学以确定最佳剂量范围的上限值。据推测，当肿瘤吸收最大时，进一步剂量给予将导致更高的背景染色和肿瘤与背景比率(TBR)的降低。软组织肉瘤的分析显示事实确实是这样的。
四个软组织肉瘤病例可供用于此分析(患者11、12、13、以及19)。将组织在低温恒温器中切片，并且将30微米切片在奥德赛(Odyssey)扫描器上成像。将这些切片或连续切片用H&E染色并且由对该荧光数据一无所知的组织病理学专家阅读。将网格覆盖在荧光图像上，并且使用由奥德赛(Odyssey)扫描仪提供的图像工作室(Li-Cor)软件对每个网格方块中的总荧光进行测量。有得分的H&E图像与荧光图像的叠加使得能够调用每个网格方块的肿瘤对比非肿瘤。区域中所有肿瘤和非肿瘤网格方块的荧光强度的平均值被用来计算每个病人的TBR。TBR随着这四个肿瘤样品剂量增加而下降，这表示高剂量可能导致增加的背景染色和特异性损失。剂量和成像之间的时间也可以影响TBR。
狗13(TBR207)在剂量给予后48小时进行手术，而狗11(TBR0.44)、12(TBR16)和19(TBR4)在剂量给予后24小时进行手术.排除狗13，在24小时情况下TBR的比较显示了相同的趋势，这支持总体结论。
一起考虑，这些数据暗示，用于狗中肿瘤成像最佳成像剂量在0.8-1.2mg/m2的范围内。
实例10
使用化合物16离体图象分析以及用于成像的最佳剂量的确定
A＝MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR(K-27是附接点)
该实例描述了确定具有天然发生肿瘤的狗中最佳的氯毒素缀合化合物16成像剂量。
在剂量递增方案中氯毒素缀合化合物16以固定的剂量0.1-1.5mg静脉注射，随后在明显的最佳剂量处扩大。在每一个感兴趣区域(ROI)内绘制作为剂量的函数的总荧光(图16)。软组织肉瘤的亚型具有最高的整体吸收，随后是癌(腺癌和鳞状细胞癌)。口腔的纤维肉瘤具有最低整体吸收，但目前尚不清楚这是否是由于组织学亚型或解剖学位置。最高的信号和总肿瘤与背景比率见于软组织肉瘤的亚型中(图17)，暗示在这些肿瘤类型中优先吸收缀合物。
软组织肉瘤在总体成像中显示出最强的荧光，所以这些肿瘤被选用于进行肿瘤与背景比率的组织病理学以确定最佳剂量范围的上限值。区域中所有肿瘤和非肿瘤网格方块的荧光强度的平均值被用来计算每个病人的TBR。结果示于图18中。TBR随着剂量增加而下降，这表示高剂量可能导致增加的背景染色和特异性损失。
一起考虑，这些数据暗示，用于使用化合物16的狗中肿瘤成像最佳成像剂量在0.8-1.1mg/m2的范围内。
实例11
使用其他氯毒素缀合化合物的离体图象分析以及用于成像的最佳剂量的确定
该实例描述了确定具有天然发生肿瘤的狗中化合物1-720的最佳成像剂量。
经静脉内按固定剂量给予化合物1-720，随后在明显的最佳剂量处扩大。
材料和方法如在实例9中，但具有化合物1-720。
分析表明，在低剂量处，肿瘤强度与剂量水平相关。在较高剂量时，肿瘤类型是成像强度中的最重要的变量。信号和其他研究变量之间没有关联，如品种和体重。
软组织肉瘤被选用于进行肿瘤与背景比率的组织病理学以确定最佳剂量范围的上限值。当肿瘤吸收最大时，进一步剂量给予导致更高的背景染色和肿瘤与背景比率(TBR)的降低。
TBR随着用于肿瘤样品剂量增加而下降，这表示高剂量可能导致增加的背景染色和特异性损失。剂量和成像之间的时间也可能影响TBR。
一起考虑，这些数据针对在狗中用化合物1-720进行肿瘤成像而建立最佳成像剂量。
实例12
通过肿瘤类型进行荧光定量
该实例描述了用于量化用BLZ-100标记的不同肿瘤类型的荧光的方法。在该研究中对多种犬肿瘤类型进行了探讨，以确定使用氯毒素缀合物是否较之其他更易于特定的肿瘤类型的成像，并且以获得关于由不同解剖学位置和组织类型产生的肿瘤的广泛经验。
作为总荧光强度的初步研究，对于每个总肿瘤样品的最高像素强度如上所述进行绘制。除脑膜瘤之外的所有肿瘤(见下文)可供用于该分析。按照解剖学位置对肿瘤进行分组，这显示对于大多数肿瘤，相比于解剖学位置，总信号与剂量更加相关。肿瘤的例外发生在骨中；在每个剂量范围这些都是持续低的，这意味着对于BLZ-100吸收可能有一些组织特异性的影响。
通过肿瘤类型对肿瘤分组，这显示软组织肉瘤作为一组显示出最高的荧光以及在总成像中最大的可变性。软组织肉瘤包括种类繁多的组织学类型以及分级，因此此类中所见的可变性可能是由于组织学和/或分级方面的变化。它们也可具有高瘤内可变性(见下文)，因此奥德赛(Odyssey)数据中的一些变化可能是由于取样的肿瘤的部分不同。该组中用有效成像剂量进行治疗的两位患有纤维肉瘤的患者具有颌中发生的肿瘤。由于发生于颌中的肿瘤通常具有差的吸收，目前尚不清楚解剖部位是否在有限的吸收以及在这些肿瘤中的特异性方面具有作用。
对于所有用0.8mg/m2或更高剂量进行治疗的病例，对软组织肉瘤(所有亚型)与癌(腺癌以及鳞状细胞癌)的强度值进行比较。该分析表明，软组织肉瘤之间具有高水平的可变性，而癌之间具有较弱但更加一致的强度。
在用0.8mg/m2或更高剂量进行治疗的狗(总共21只狗)中，肿瘤与正常外围组织中荧光的比率在<1(无特异信号)至>200的范围内。
一起考虑，总的组织成像数据表示，软组织肉瘤是对氯毒素的临床应用具有很高潜质的肿瘤类型。
实例13
使用氯毒素缀合化合物16通过肿瘤类型进行荧光定量
A＝MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR(K-27是附接点)
该实例描述了用于量化用氯毒素缀合化合物16标记的不同肿瘤类型的荧光的方法。对多种犬肿瘤类型进行了探讨。对于所有用0.8mg/m2或更高剂量进行治疗的病例，对软组织肉瘤(所有亚型)与癌(腺癌以及鳞状细胞癌)的强度值进行比较。这项分析显示了软组织肉瘤之间的可变性，以及癌之间较低但相对一致的强度(图19)。
肿瘤与正常外围组织中荧光的比率在<1(无特异信号)至>200的范围内，如表34中所示。
表34：对于用0.8mg/m2或更高剂量进行治疗的狗的总的成像数据的概述(N＝21)。TBR：肿瘤与背景比率
实例14
使用其他氯毒素缀合化合物通过肿瘤类型进行荧光定量
该实例描述了用于用化合物1-720标记的不同肿瘤类型的荧光进行量化的方法。在该研究中对多种肿瘤类型进行了探讨，以确定使用氯毒素缀合物是否较之其他更易于特定的肿瘤类型的成像，并且以获得关于由不同解剖学位置和组织类型产生的肿瘤的广泛经验。
使用的材料和方法如在实例12中，但使用化合物1-720。按照解剖学位置对肿瘤进行分组，这显示对于大多数肿瘤，相比于解剖学位置，总信号与剂量更加相关。
通过肿瘤类型对肿瘤分组，这显示软组织肉瘤作为一组显示出最高的荧光以及在总成像中最大的可变性。软组织肉瘤包括种类繁多的组织学类型以及分级，因此此类中所见的可变性可能是由于组织学和/或分级方面的变化。它们也可具有高瘤内可变性，因此奥德赛(Odyssey)数据中的一些变化可能是由于取样的肿瘤的部分不同。
对于所有用0.8mg/m2或更高剂量进行治疗的病例，对软组织肉瘤(所有亚型)与癌(腺癌以及鳞状细胞癌)的强度值进行比较。这项分析显示了软组织肉瘤之间的可变性，以及癌之间较低但相对一致的强度。
一起考虑，总的组织成像数据表示软组织肉瘤是对化合物1-720的临床应用具有很高潜质的肿瘤类型。
实例15
正常小鼠中化合物16的耐受性
这个实例显示正常CD-1小鼠中化合物16的耐受性的实验分析。
方法。将化合物16以5、0.5、0.05mg/ml的浓度配制在10mM组氨酸、5％右旋糖中。无氯毒素肽(KNT-01)由Alamone实验室制造并且以1mM的浓度(200nmole/200μl)配制在10mM组氨酸、5％右旋糖中。无化合物76的肽(KNT-02)由美国肽公司(AmericanPeptideCompany)制造并且以1mM的浓度(200nmole/200μl)配制在10mM组氨酸、5％右旋糖中(化合物76的肽组分具有H-Met-Cys-Met-Pro-Cys-Phe-Thr-Thr-Asp-His-Gln-Met-Ala-Arg-Ala-Cys-Asp-Asp-Cys-Cys-Gly-Gly-Ala-Gly-Arg-Gly-Lys-Cys-Tyr-Gly-Pro-Gln-Cys-Leu-Cys-Arg-OH的序列)。无化合物16的肽由巴亨公司(Bachem)制造并且以1mM、0.1mM以及0.01mM的浓度配制在10mM组氨酸、5％右旋糖中(化合物16的肽组分具有H-Met-Cys-Met-Pro-Cys-Phe-Thr-Thr-Asp-His-Gln-Met-Ala-Arg-Arg-Cys-Asp-Asp-Cys-Cys-Gly-Gly-Arg-Gly-Arg-Gly-Lys-Cys-Tyr-Gly-Pro-Gln-Cys-Leu-Cys-Arg-OH的序列)。
用在200μl的10mM组氨酸、5％右旋糖中稀释的2、20、或200nmol的化合物16注入6-10周大的雌性CD-1小鼠的尾静脉。这些剂量水平分别相当于0.01、0.1以及1mg的缀合物。运载体仅用作对照组。在注射后10min、1小时、以及4小时观察小鼠，并且然后每日直到给药后3或14天处死为止。使用改进的体况评分(BCS)以及通过目测的活性水平对小鼠评分。每3天测量体重。使用末端心穿刺收集血液并且置于血清分离器管(SST微量试管)中。普通化学筛选由Phoenix中央试验室完成。解剖主要的器官(脑、心、肾、肝、肺、肠、皮肤、以及脾)置于10％缓冲的福尔马林中，石蜡包埋，用苏木精和曙红染色，并且由专业认证兽医病理学家进行评估。
用在200μl的10mM组氨酸、5％右旋糖中稀释的0.008、0.08、或0.8mg(缀合物的摩尔当量)的天然氯毒素(KNT-01)、化合物16(KNT-02)、或无化合物16(KNT-03)肽注射6-10周大的雌性CD-1小鼠的尾静脉。在注射后1小时观察小鼠的活性水平。
结果。在注射后10min、1小时、以及4小时评估小鼠，并且然后每日一次直到治疗后3或14天处死为止。运载体对照组以及0.01mg剂量组中的小鼠在所有观测时间点均为正常。0.1mg组中的三分之二的小鼠以及1mg剂量组中的全部六只动物在注射大约1-3分钟后表现出自发性运动的减少、嗜睡、以及虚弱。在一些小鼠中发现上睑下垂。活动减退的行为持续30-60分钟，而经过4个小时观测时间点所有小鼠完全恢复。小鼠没有意识丧失或瘫痪。呼吸保持正常。毛色保持正常，没有青紫、红眼、或流泪的体征。运动活性行为的减少在注射后大约持续30-60分钟。
为了确定运动性活动水平的减少是否是由于化合物16缀合物，用无KNT-03肽、或相关的无KNT-01或无KNT-02肽注射另外的小鼠。类似于化合物16缀合物，以高剂量(200nmol)游离肽注射的所有小鼠在注射后3分钟开始表现出活动水平的减少、嗜睡、以及虚弱。这表明，活动减退的效应是由肽骨架引起的。因为在用自然序列的游离肽中观察到该效应，该暂时的活动减退并不是由突变的化合物16肽和/或缀合至染料产生的新性质。此外，该暂时的行为仅在小鼠观察的到。用类似的高剂量的化合物16注射的大鼠和非人类灵长动物没有表现出异常的活动水平。
除注射后即刻的暂时的低活动性之外，在研究持续期间通过目测所有小鼠在临床上是正常的。在每次身体观察中所有小鼠获得BCS3得分，这表示小鼠是健康的。每三天称量小鼠的体重直到处死。没有观察到与剂量相关的体重变化(图67)。
在处死后(注射后3天和14天时)从每只小鼠中收集血液。用普通化学筛选对血清进行分析。没有观察到与剂量相关的变化。表35示出对于肾和肝功能试验的血清值。没有小鼠具有大于40mg/dl的BUN水平。在肝以及肾中检测出化合物16，其在尿中消失。这些试验显示，即使是高剂量的化合物16也没有损害肾和肝。
表35：肝和肾血清化学分析
注射后3天和14天解剖主要的器官。由认证的兽医病理学家分析所有组织。没有可归因于在第3天或第14天给予化合物16的组织学的发现。
实例16
正常小鼠中其他氯毒素缀合化合物的耐受性
这个实例显示正常CD-1小鼠中化合物1-720的耐受性的实验分析。
材料和方法如在实例15中，但使用化合物1-720。
结果。在注射后10min、1小时、以及4小时评估小鼠，并且然后每日一次直到治疗后3或14天处死为止。一些小鼠在注射大约1-3分钟后表现出自发性运动的减少、嗜睡、以及虚弱。为了确定运动性活动水平的减少是否是由于化合物1-720，用游离肽注射另外的小鼠。用游离肽注射的所有小鼠在注射后3分钟开始表现出活动水平的减少、嗜睡、以及虚弱。这表明，活动减退的效应是由肽骨架引起的。因为在用自然序列的游离肽中观察到该效应，该暂时的活动减退并不是由化合物1-720和/或缀合至染料产生的新性质。此外，该暂时的行为仅在小鼠观察的到。用类似的高剂量的化合物1-720注射的大鼠和非人类灵长动物没有表现出异常的活动水平。
除注射后即刻的暂时的低活动性之外，在研究持续期间通过目测所有小鼠在临床上是正常的。在每次身体观察中所有小鼠获得BCS3得分，这表示小鼠是健康的。每三天称量小鼠的体重直到处死。没有观察到与剂量相关的体重变化。
在处死后(注射后3天和14天时)从每只小鼠中收集血液。用普通化学筛选对血清进行分析。没有观察到与剂量相关的变化。没有小鼠具有大于40mg/dl的BUN水平。在肝以及肾中检测出化合物1-720，其在尿中消失。这些试验显示，即使是高剂量的化合物1-720也没有损害肾和肝。
注射后3天和14天解剖主要的器官。由认证的兽医病理学家分析所有组织。没有可归因于在第3天或第14天给予化合物1-720的组织学的发现。
实例17
在患有髓母细胞瘤肿瘤的ND2:SmoA1小鼠中化合物16的成像
这个实例显示使用化合物16对ND2:SmoA1小鼠模型中的髓母细胞瘤肿瘤和细胞的靶向以及阐明，并且进一步显示高剂量的化合物16的临床与病理疗效。
髓母细胞瘤是儿童中最常见的恶性实体肿瘤。当前疗法包括最大安全手术切除、放射以及化学治疗。完全的肿瘤手术切除严重影响患有髓母细胞瘤的患者的预后，赋予比具有残余疾病的患者的存活率提高30％。具有残余疾病的患者被认为具有高风险的进行性肿瘤并且用高剂量的放射和化疗的进行治疗。这些患者有更大的风险遭受侵蚀性治疗的有害副作用，同时面临着极低的疾病存活率。几乎完全手术切除的目标与临床精确的肿瘤摘除相平衡，因为破坏健康脑组织可能严重损害正常的神经功能。需要比如化合物16指导的外科手术的策略以改善患有脑癌的患者中完全并且精确的肿瘤切除，增加患者存活并且降低发病率。
C57BL/6背景上的患有髓母细胞瘤的ND2:SmoA1(缩写SmoA1)小鼠模型被用于评估化合物16与髓母细胞瘤肿瘤的结合。这些小鼠在小脑中发展自发髓母细胞瘤肿瘤，这十分类似于人类疾病。这些基因工程化的转基因小鼠表达由神经D2启动子的1-kb片段驱动的组成型活性的smoothened突变蛋白(SmoA1)。该启动子主要在脑中的小脑颗粒神经元前体中被激活。该小鼠模型模拟髓母细胞瘤的音速刺途径(sonic-hedgehogpathway)亚型。在这些研究中选用转基因为纯合的有症状的小鼠。使用开放的田间罩笼评估来检测脑癌的临床症状。症状包括头部倾斜、弓背姿势、共济失调、颅骨突出、以及体重丧失。
为了评估正常脑中的化合物16信号，Nu/Nu小鼠接受静脉注射6nmol的化合物16。通过尾静脉(n＝6)给予小鼠60μL的0.5mg/ml(10nmol/100μI)。注射一天后，使用CO2吸入使小鼠安乐死。然后，将正常的脑摘除并且使用具有745nm/820nm激发和发射光滤光器组的IVIS光谱(PerkinElmer)进行成像。使用活体图像软件(LivingImagesoftware)(PerkinElmer)通过在脑组织内绘制等尺寸的“感兴趣区域”(ROI’s)分析信号。使用非注射ROI以及正常注射的脑的平均数计算SNR(信噪比)。
具有中等程度髓母细胞瘤症状的SmoA1小鼠接受静脉注射10nmol的化合物16。通过尾静脉给予小鼠100μL的0.5mg/ml(10nmol/100μ1)化合物16。注射一天后，使用CO2吸入使小鼠安乐死。使用具有745nm/820nm激发和发射光滤光器组的IVIS光谱(PerkinElmer)，并且使用800nm设置(785nm激发激光)在奥德赛(Odyssey)CLx(利卡生物科学公司(Li-CorBiosciences))近红外扫描器上进行离体全脑成像。然后将该组织冷冻于在干冰上的最佳切片温度培养基(OCT，TissueTek)中或固定于10％中性缓冲福尔马林中。将冷冻的组织切成12μm切片。根据标准组织学的方案，使用奥德赛(Odyssey)CLx扫描器扫描组织或用苏木精和曙红(H&E)染色。对于固定于10％中性缓冲福尔马林中的脑，根据组织学咨询服务(HistologyConsultationService)的标准方案，将组织处理、包埋、切片、并且H&E染色。以20x放大倍率在AperioScanscopeAT(LeicaBiosystems)上扫描切片。使用活体图像软件(LivingImagesoftware)(PerkinElmer)或图像工作室软件(ImageStudiosoftware)(利卡生物科学公司(Li-CorBiosciences))分析图像，这是通过测量每个组织图像中绘制的感兴趣区域内(ROI)的荧光信号。使用来自同一个脑的肿瘤和皮层测量值计算相比于正常组织(SNR)而言肿瘤中的信号。同时还在背侧和腹侧方向进行分析，这是由于脑内肿瘤定位的变化。将来自整个组织ROI的信号测量值用于统计分析。使用不等方差的单尾T-检验计算显著值。
用化合物16注射患有髓母细胞瘤的SmoA1小鼠并且在一天后成像。在该研究使用的所有8只SmoA1小鼠中，相比于正常的脑，肿瘤组织中的化合物16更高。与正常的脑相比，肿瘤组织中的信号在5.9与47之间。八个样品中的四个在肿瘤中具有显著更低的信号，其在用于IVIS光谱以及奥德赛(Odyssey)扫描器的更低检测水平附近。在未受影响的皮层中信号是2.7-3.6倍更高而来自Nu/Nu小鼠正常的脑中信号与未注射的动物相同。使用化合物16检测转移性的柔脑脊膜扩散的小型病灶。
评估小鼠中由于非特异性结合或不完全的清除的正常脑中的本底信号，该小鼠已经注射有6nmol的化合物16。未注射的动物具有由辐射效率表示的3.17x107的本底信号。在给予化合物16一天后，平均辐射效率为3.26x107+/-2.5x106(n＝6)，这不比未接受具有1.03的SNR的注射液的脑样品相当可观地更高。在注射一天后，将化合物16充分地从无非特异性结合的正常的脑组织中清除。
在注射一天后，分析用10nmol剂量的荷瘤SmoA1小鼠(n＝8)中的化合物16。在奥德赛(Odyssey)上使用全脑分析，所有8个样品在肿瘤中有高于正常皮层(p＝0.03)的信号。荧光信号在8个肿瘤中的4个中显著更低并且在IVIS光谱以及奥德赛(Odyssey)扫描器检测下限附近(图20)。与正常的脑(SNR)相比，肿瘤中的信号在5.9与47.3之间(图20)。在SmoA1脑的皮层中的信号高于未注射的动物2.7-3.6倍，而Nu/Nu正常的脑中的信号与未注射的动物在相同时间点是相同的(图20)。更高的信号可能是由在SmoA1小鼠中使用的高剂量的化合物16或影响整个SmoA1脑的异常性导致的。SmoA1小鼠经常有轻微至严重脑积水，这通常影响从非肿瘤组织中清除化合物16。
在SmoA1小鼠中偶尔观察到柔脑脊膜扩散。这些小鼠，像30％-35％的人类患者，在脑膜的膜中发展肿瘤细胞的小型病灶。使用化合物16检测小鼠中的柔脑脊膜扩散。显示出SmoA1-1的全脑荧光扫描(图21)。该扫描说明了对应于H&E染色的载玻片中突出显示的小簇肿瘤细胞的小型荧光病灶(图21)。
所有患有髓母细胞瘤的小鼠在肿瘤中具有高于正常皮层的信号，在给予化合物16之后，SNR范围在5.9-47之间。在所有小鼠中肿瘤中的信号高于正常，组织中4个样品具有显著更低的信号。在具有正常脑组织(Nu/Nu小鼠)的小鼠中未检测出化合物16信号，而未受影响的SmoA1皮层中信号高于未注射的动物2.7-3.6倍。非肿瘤组织中的残留本底信号可能是由脑积水引起的，而脑积水经常发生在这些小鼠中。在小鼠中使用化合物16检测转移细胞的小型病灶，强调化合物16检测甚至小簇的癌组织的能力。
实例18
在患有髓母细胞瘤肿瘤的ND2:SmoA1小鼠中其他氯毒素缀合化合物的成像
这个实例显示使用化合物1-720对ND2:SmoA1小鼠模型中的髓母细胞瘤肿瘤和细胞的靶向以及阐明，并且进一步显示高剂量的化合物1-720的临床与病理疗效。
C57BL/6背景上的患有髓母细胞瘤的ND2:SmoA1(缩写SmoA1)小鼠模型被用于评估化合物1-720与髓母细胞瘤肿瘤的结合。
材料和方法如在实例17中。
用化合物1-720注射患有髓母细胞瘤的SmoA1小鼠并且在一天后成像。在该研究使用的所有8只SmoA1小鼠中，相比于正常的脑，肿瘤组织中的化合物1-720更高。评估小鼠中由于非特异性结合或不完全的清除造成的正常的脑中的本底信号，该小鼠已经注射有6nmol的化合物1-720。在注射一天后，将化合物1-720充分地从无非特异性结合的正常的脑组织中清除。
在荷瘤SmoA1小鼠中分析的化合物1-720具有高于正常皮层的肿瘤内信号。
在SmoA1小鼠中偶尔观察到柔脑脊膜扩散并且使用化合物1-720进行检测。
患有髓母细胞瘤的小鼠在肿瘤中具有高于正常皮层的信号。在具有正常脑组织(Nu/Nu小鼠)的小鼠中未检测出化合物1-720而信号
使用化合物1-720检测转移细胞的小型病灶，强调化合物1-720检测甚至小簇的癌组织的能力。
实例19
狗中天然发生的实体瘤的检测
该实例描述了使用荧光标记的氯毒素缀合物BLZ-100检测狗中天然发生的实体瘤的方法。
许多类型的犬肿瘤类似于人类疾病，包括肉瘤、乳房以及肺癌、粘膜鳞状上皮细胞癌、以及神经胶质瘤。这些自发肿瘤在大小以及形状、外围组织、以及患者体重方面的多样性提供了优于小鼠的模型，表现在预测氯毒素缀合物(如BLZ-100)的临床特点方面，所述临床特点包括肿瘤渗透、背景染色、以及有效成像剂量。
方法：
在该研究中使用了28只正接受计划的实体瘤切除术的狗。所有选项经过讨论并且在IACUC批准的操作方案下获得客户的同意。狗接受的护理标准包括为了控制或治疗局部病的肿瘤切除术。在手术前24-48小时狗接受静脉内BLZ-100，并且在手术后将组织进行体外成像。使用IVIS光谱(PerkinElmer)以及奥德赛(Odyssey)NIR扫描器(Li-Cor)在全部组织样品上进行离体成像，以确定肿瘤中的总信号以及总的信号背景比。将组织包埋在OCT中，在低温恒温器中切片，并且在奥德赛(Odyssey)上进行扫描。用H&E对连续切片染色，并且将与荧光扫描的比较用于确认BLZ-100对于肿瘤组织的特异性。使用原型开放的NIR成像装置，在若干病例中实施术中成像。
剂量制备：
将BLZ-100在配制品缓冲液(100mM组氨酸/5％右旋糖、10mMTris/5％右旋糖、或10mMTris/5％甘露醇)中制备。对于所有剂量批次，将冻干的缀合物悬浮在配制品缓冲液中。将材料吸入无菌注射器中，并且然后通过无菌的0.44微米过滤器等分至预先加帽的无菌琥珀玻璃小瓶中。将这些小瓶在-20℃下储存，并且在干冰上运输至研究地点。
患者与剂量给予：
在该研究使用了28只患有自发实体瘤的狗。肿瘤类型包括肉瘤的若干亚型；口以及皮肤鳞状细胞癌；肥大细胞瘤；腺癌，包括肺、乳腺、以及甲状腺；以及脑膜瘤。
在手术前24-48小时静脉内给予BLZ-100。评估来自注射前以及注射后24-48小时的全血计数、血清化学、以及尿液分析数据的变化，这些变化可能指示来自CTX的毒性。血清BUN、钙、以及钾水平，以及尿pH有小幅下降，达到统计显著性(双尾的t检验)；然而，它们很好地保持在正常范围内并且未被认为是临床上显著的。没有其他的显著性差异，而且没有注意到明显的安全性问题。
几乎所有狗在给药10分钟内经历了立即的假性过敏/超敏反应，其特征为红斑、中度至严重的瘙痒、以及不常见地鼻口部与四肢远端膨胀。反应的严重程度不与剂量水平或给药速率相关。反应是自限制的、通过苯海拉明改善，并且在所有病例中在4个小时之内完全转变。这些观察与组胺的全身性释放一致，已报道组胺用于多种多样的药品。一些狗(肥大细胞瘤以及CNS肿瘤患者)正接受皮质激素作为它们标准管理的一部分，但在任何患者中皮质激素不需要反应管理。没有鉴定出其他的全身性变化。所有狗正常地耐麻醉和手术。没有与BLZ-100相关联的明显手术并发症。
在给予BLZ-1002天后，患者13-17进行手术。这是为了评估时间对于肿瘤与背景比率的影响而进行的。由于没有发现一致的改进，在给予BLZ-1001天后，余下的患者进行手术。
药物代谢动力学：
在剂量给予之后的时间点处收集血清样品。使用荧光测定计算BLZ-100的血清浓度。数据显示快速分布进入组织，随后是较缓慢的消除阶段。这些数据类似于那些获得自实验室小鼠、大鼠、狗以及非人类灵长动物的数据。
实例20
使用氯毒素缀合化合物对狗中天然发生的实体瘤的检测
A＝MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR(K-27是附接点)
该实例描述了使用化合物16检测狗中天然发生的实体瘤的方法。
使用的材料和方法如在实例19中。患者特征、肿瘤类型和部位、体重、以及剂量信息汇总在表36中。
表36：肿瘤特征、患者数据以及给药的剂量的概述
在剂量给予之后的时间点处收集血清样品。使用荧光测定计算化合物16的血清浓度。数据显示快速分布进入组织，随后是较缓慢的消除阶段(表37)。
表37：给药后不同时间点处通过荧光的标准曲线分析来测量狗中血清化合物16水平。将来自各个时间点的血清样品在配制品缓冲液中按1:1稀释。制备化合物16(10mcg/ml至4ng/ml)在50％血清/50％配制品缓冲液中的标准曲线。在奥德赛(Odyssey)扫描器上(765nm激发/800nm发射)测量荧光。使用标准曲线反算产品的血清浓度。
实例21
使用其他氯毒素缀合化合物对狗中天然发生的实体瘤的检测
该实例描述了使用化合物1-720检测狗中天然发生的实体瘤的方法。
材料和方法如在实例19中，但使用化合物1-720。
在剂量给予之后的时间点处收集血清样品。使用荧光测定计算化合物1-720的血清浓度。数据显示快速分布进入组织，随后是较缓慢的消除阶段。这些数据类似于实验室小鼠、大鼠、狗以及非人类灵长动物。
实例22
化合物16的药物代谢动力学以及耐受性
此实例证明了在小鼠、大鼠、狗、以及猴中单次静脉内(IV)注射之后，化合物16的药物代谢动力学(PK)曲线。在所有四个物种中进行的探索性研究被用于估计暴露并且用于为确定性GLP研究的研究设计提供信息。使用基于研究的方法分析来自这些研究的PK样品。在IV给药之后化合物16的PK被作为大鼠与猴中GLP单次剂量毒性研究的一部分进行评估。在GLP研究中，使用验证过的基于LC/MS的方法来确定血清化合物16浓度。
在本实例中，化合物16作为单次使用术中荧光成像剂经静脉内给予至特异标记肿瘤组织。在中性的pH下，按2mg/mL以液体形式将化合物16无菌地在Tris/甘露醇缓冲液中配制。染料通过CTX肽上的单个赖氨酸残基化学地连接。化合物16不含有新颖的赋形剂或接头分子。表38中提供了单次剂量非临床的毒性研究的列表，进行这些研究是为了支持化合物16首次在人类中(FIH)的临床试验的启动。
表38：化合物16的单次剂量毒性研究的列表
基于与CTX肽靶的高度序列同源性，所有用于非临床安全评价的物种与化合物16是药理学相关的。基于与CTX肽靶的序列同源性(分别为97％以及100％)、用于安全评价的物种适合性(即相对于小鼠优选大鼠)、以及缺少潜在的混杂效应(假性过敏/超敏反应已在狗中观察到但未在猴中观察到)，选出大鼠和猴作为用于GLP毒理学研究的主要物种。根据实验室质量管理规范(GLP)规则进行毒理学研究。在开发化合物的过程中参照适用的国际协调会议(ApplicableInternationalConferenceonHarmonization，ICH)与食品与药品管理局(FoodandDrugAdministration，FDA)指导文件，最主要是ICHS6(R1)、S9与M3(R2)以及FDA行业指南文件“DevelopingMedicalImagingDrugandBiologicalProductsPart1:ConductingSafetyAssessments(开发医学成像药物以及生物制品第一部分：进行安全评价)”。
剂量水平和给药方式的选择是基于最初的小鼠药理学模型，其中0.01mg的剂量水平产生一致的肿瘤成像。由于临床试验中剂量给予的优选方法在固定基础上(即不以体重或表面面积而调整)，使用对每个物种估计的身体表面积，非临床安全性研究中的剂量水平被转换为固定剂量水平。使用小鼠和狗中成像数据估计对于人类的剂量水平(表39)。
表39：不同物种间估算的成像剂量水平
在单次剂量非GLP探索性研究中，在静脉内(IV)给予0.1以及1mg的化合物16之后，小鼠显示出自发性运动减少、嗜睡以及虚弱。在IV给予0.03、0.3、或1.5mg的化合物160IV之后，暂时的流涎是雄性大鼠的先导性研究中唯一的发现。在雄性狗中，在IV给予1mg化合物16过程中或立即之后，2只治疗的狗中的所有2只在先导性研究中值得注意的发现包括假性过敏/超敏反应(即瘙痒/擦伤、温暖的耳朵等)。在IV给予1mg化合物16之后，进一步在3只雄性比格犬中研究假性过敏的机理。注意到所有的狗中血浆组胺水平快速上升，同时有临床症状的出现。没有发现补体水平的变化，这意味着化合物16直接作用于狗的肥大细胞/嗜碱性细胞。在雄性猕猴的先导性研究中，在IV给予0.6mg化合物16之后，没有异常的临床观察。
在单次剂量GLP毒理学研究中，大鼠和猴对化合物16很好地耐药。没有化合物16相关的不利发现。无观察性不利作用水平(NOAEL)在大鼠中为高剂量7mg，大约28mg/kg，而在猴中为高剂量60mg，大约20mg/kg。
在安全药理学研究中，用0.2μM、0.6μM或2.0μM化合物16治疗对人胚肾细胞中hERG电流振幅有极小的作用，而响应于给予0.6mg、6mg以及60mg化合物16，对有意识的猕猴的心血管参数或呼吸速率没有作用。在具有安全性评价端点的肿瘤成像药理学研究中，在IV给予0.1mg至1.5mg化合物16之后，大多数患有自发性肿瘤的狗展现出假性过敏/超敏反应。
单剂量毒性：
CD1小鼠中化合物16以及非缀合的化合物16的先导耐受性。这个实例的目的是为了评估雌性CD-1组中对化合物16的耐受性。以0.01mg、0.1mg或1mg的固定剂量水平给予小鼠(n＝3小鼠/组/时间点)单次IV推注的化合物16，其相当于小鼠中1、10以及100倍的肿瘤成像剂量。通过临床观察、血清化学和几个主要器官的组织病理学对耐受性进行评价。在研究的第3天和第14天将小鼠安乐死。
在剂量为0.01mg时，在所有观测时间点小鼠在临床上是正常的。在0.1mg处小鼠的亚组与在1mg处所有小鼠在给药1分钟后马上出现自发性运动减少、嗜睡、以及虚弱。活动减退持续大约30至60分钟。经过4个小时观察时间所有小鼠恢复正常并且在研究持续期间保持正常。当用等摩尔量的化合物16肽骨架注射小鼠时，发现相似的临床症状。
化合物16在雄性斯普拉-道来大鼠中的毒理学与毒代动力学研究。以0.03、0.3或1.5mg的固定剂量水平给予雄性大鼠(n＝3/组)单次静脉推注的化合物16。直到给药后48小时对大鼠进行观察并且在研究的第3天安乐死。通过临床观察、血液学、血清化学和宏观病理学对耐受性进行评价。
暂时的治疗相关的临床征象限于流涎，在0.03mg剂量处在给药后20分钟和1小时在2只大鼠中、在0.03mg剂量处在给药后20分钟在2只大鼠中、以及在1.5mg剂量处在给药后20分钟、1小时、与2小时在1只大鼠中观察到。在0.03mg剂量(n＝3只大鼠)与0.3mg剂量(n＝2只大鼠)处，给药后1小时或2小时观察到清晰的口腔染色。没有明显的剂量响应关系，而且在给药后2小时以及给药后4小时之前临床征象消失。在任何剂量水平上，没有明显的测试品相关的血液学、临床化学、或宏观病理学发现。
化合物16在斯普拉-道来大鼠中的单剂量静脉内毒性与毒代动力学研究。以0、0.07、0.7、或7mg的固定剂量水平给予大鼠(n＝10/性别/组)单次静脉推注的化合物16。对这些动物中的一半进行观察直到研究的第3天并且然后将它们安乐死。观察剩余的动物直到研究的第15天并且然后将它们安乐死(表40)。
表40：对于大鼠中单剂量毒理学研究的剂量组
化合物16在斯普拉-道来大鼠中的单次剂量静脉内毒性与毒代动力学研究。在任何剂量水平下基于临床观察(例如包括详细的旷场评估)、死亡率、体重、食物消耗、眼科学、临床病理学(例如包括血液学、凝结、临床化学以及尿液分析)、器官重量以及组织病理学(例如包括注射位点)，没有化合物16相关的不利发现。在0.07mg剂量处，在旷场评估过程中在给药后大约15分钟在1只雄性大鼠中发现少量、瞬时的流涎。这项观察最可能与化合物16相关；然而，没有明显的剂量响应关系。
在7mg剂量处，宏观病理学发现限于在研究的第3和15天肾变绿。如以上所指出，在任何剂量水平下，没有关于器官重量的与化合物16相关的发现或显微发现。肾中变绿的发现不被认为是不利的。如此，NOAEL被认为是高剂量7mg，或大约28mg/kg。
使用犬体外试验系统，化合物16在补体激活和嗜碱/肥大细胞激活中的作用的评 价。将来自比格犬(n＝5)的血液用于制备高补体容器血清。将化合物16，以0(阴性对照)、100、1000、以及10000ng/mL的浓度，在37℃下在于96孔板中的狗血清中孵育30、60与120分钟。将含有天然CTX的眼镜蛇毒因子用作阳性对照。通过将完整的狗C3转化为稳定的终产物人类sC5b-9来测定补体激活，通过ELISA对上述终产物进行量化。通过在不同时间点处从残留的C3中减去在添加化合物16之前的基线处补体的总量而测定在狗血清中化合物16对补体的激活。
在分离自狗的全血样品(n＝3)中测量嗜碱性细胞活化。将以100、1000、10000ng/mL浓度的化合物16与全血样品孵育10或60分钟。将抗犬IgE和N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰-苯丙氨酸(fMLP)用作阳性对照。如用ELISA测定的组胺在血液样品中的存在被用于评估嗜碱性细胞活化。
IV给药至雄性非人类灵长动物(猕猴)后化合物16的先导药物代谢动力学研究。以0.6mg的固定剂量水平给予猕猴(n＝2只雄性/组)单次静脉推注的化合物16。在给药前、给药之后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、24、48、72、以及96小时收集血液样品用于药物代谢动力学。在各时间点进行临床观察。直到给药后96个小时没有异常的临床观察。
在猕猴中化合物16的单剂量14-天静脉内毒性研究。以0、0.6、6、或60mg的固定剂量水平给予猕猴(n＝3只/性别/组)单次静脉推注的化合物16并且观察14天(表41)。在给药前研究开始第-7天以及研究第11天进行眼科检查。在研究第15天将动物安乐死并且进行总的尸体检验。
在任何剂量水平下基于死亡率、临床观察、体重、眼科学、临床病理学(包括血液学、凝结、血清化学以及尿液分析)、器官重量以及组织病理学(例如包括注射位点)，没有化合物16相关的不利发现。神经学和肌骨骼的评估是添加至该项研究的另外参数，而且在每周一次的评估后未发现试验样品相关的变化。
表41：对于猴中单剂量毒理学研究的剂量组
在60mg处，在研究的第3天通过一般检查注意到1只雄性和3只雌性中绿色的尿，而没有对泌尿参数或肾病理学的相应的影响。使所有动物的尿液都经受探索性的荧光测定，这显示了相比于未用化合物16进行治疗的对照组，在研究的第3天在用化合物16进行治疗的所有组中荧光信号强度出现剂量依赖的增加。在研究的第15天，荧光信号相比于第3天较低，但是仍然可在大多数中剂量及高剂量动物中检测到，但相比于对照组在低剂量动物中检测不到。这些结果提示，药物存在于尿中，这可能是高剂量动物中尿的绿色外观的原因。因此，NOAEL被认为是高剂量60mg，或大约20mg/kg。
静脉内单推注剂量的化合物16在小鼠、大鼠以及猴中是耐受良好的。在小鼠中观察到的与治疗有关的变化包括在0.1以及1mg化合物16的剂量时自发性运动减少、嗜睡、以及虚弱。活动减退是暂时的并且在给药后30至60分钟发生。到4个小时时所有小鼠都是正常的。这些变化至今并没有在临床试验或除小鼠之外的其他物种中观察到。在以0.03、0.3、或1.5mg化合物16的剂量静脉内给药后，在雄性大鼠的先导性研究中观察到暂时流涎的临床征象。然而，在雄性以及雌性大鼠中进行的以高达7mg的化合物16的剂量静脉内给药的后续的单剂量研究中没有观察到流涎，而在其他物种中也没有观察到流涎。除毒性评价之外，在有意识的猴的安全药理学研究中，没有观察到对心率、血压、呼吸率或ECG描图有影响。
尚未进行体外溶血和局部耐受性研究。化合物16是与常用赋形剂(如Tris缓冲剂和D-甘露醇)配制的生物技术衍生的药物候选物。重要的是，(1)在已完成的非临床安全研究中或在来自患有皮肤癌的受试者中正在进行的1阶段临床安全研究的初步数据中，没有鉴定出与治疗有关的血液学发现，以及(2)通过肉眼检查或通过大鼠和猴中单剂量、静脉内给药、或毒理学研究中的组织病理学，在注射位点没有鉴定出刺激或病损。
未使用化合物16进行遗传毒理学研究，因为预期它不与DNA反应并且该配制品不含有任何新颖的赋形剂。染料通过稳定、共价的酰胺键附接到肽上。肽、染料或附接点的结构中没有暗示致突变性的可能性。此外，典型的临床应用和暴露于化合物16将持续时间短，由每个受试者单次注射组成，可能是在生命期中唯一的注射，估算的人血浆终末半衰期为大约1-2天，进入临床上诊断为癌的受试者中。对来自LC/MS药物代谢动力学方法的色谱的检查没有显示化合物16的任何主要代谢物的存在。
化合物16的肽组分类似于天然CTX。已经在小鼠和绒猴中研究了CTX肽(TM-601)的合成型式而且它是耐受良好的。在小鼠中单次IV剂量之后对于TM-601的NOAEL是6.4mg/kg(最高的测试剂量)，而在绒猴中是2.0mg/kg(最高的测试剂量)。在小鼠中以2和5mg/kg的剂量反复7周静脉内给药导致给药后1小时内暂时上睑下垂和活动减退的临床征象。没有观察到对血液学或组织病理学的影响。
ICG的典型剂量随适应症而变化，但通常在25至50mg范围内。通过比较，化合物16包含大约0.15mg染料/mg药物产品。化合物16成像剂量当前估算在3至12mg、或0.45至1.8mg当量的ICG范围内。
在先导性研究中，在IV给药之后化合物16PK曲线显示出双指数下降，在所有物种中具有快速的初始阶段和更长的终末阶段。在小鼠和大鼠中，终末阶段不能被良好定义是由于低浓度以及研究设计/测定的限制。然而，总体全身性暴露似乎可很好地表征，因为IV给药之后第一个4至8小时导致大部分的全身性暴露。在狗和猴的先导性研究中，在两个物种中的表观t1/2大约是55个小时。
在大鼠和猴单剂量GLP毒理学研究中IV给药化合物16之后，在所有测试的范围中基于C最大以及C0的暴露以大致剂量比例性的方式增长。AUC0-t值以剂量比例性或高于剂量比例性的方式增长。这些观察表明，化合物16清除率在较高剂量下降低了。
在猴中60mg化合物16的最高药量组中，血清浓度对比时间曲线被充分定义以估算依赖于终末阶段的表征的另外的PK参数。总平均值t1/2、CL、以及Vss值分别为33.7hr、50.6mL/hr、以及211mL。
分析方法：
临床前物种中量化化合物16的分析方法。已使用两种主要方法来量化血清中的化合物16。使用基于荧光的方法以支持小鼠、狗以及猴中的非GLP研究。该方法仅供研究目的并且不经历方法验证。在96孔规格中分析样品，并且通过样品中测定的荧光与标准曲线进行比较完成量化。使用奥德赛(Odyssey)CLx近红外扫描器(利卡生物科学公司(Li-CorBiosciences))测量来自样品和标准物的信号，使用800nm通道(785nm激发)。使用该方法的研究在表42中列出。
表42：化合物16的量化分析方法的研究列表
开发LC/MS方法并且将其用于分析来自非GLP大鼠研究以及来自大鼠和猕猴中GLP研究的血清。在GLP研究样品分析之前，验证LC/MS方法。在大鼠和猴血清中用于化合物16的最低量化水平(LLOQ)分别为10ng/mL和5ng/mL。使用这些方法的研究在表43中列出。
表43：血清中化合物16的LC/MS分析的研究列表
储存在-70℃下的大鼠血清样品的稳定性至少为9个月。在-70℃下，来自猴的稳定性数据支持血清样品储存长达1个月。对来自大鼠和猴GLP研究的样品进行已发生样品重分析(Incurredsamplereanalysis)(ISR)。大鼠ISR评价通过了，然而猴ISR没有通过。后续进行了关于调查猴中ISR失败的研究，以试图确定ISR失败的根本原因和评估对研究数据的影响。没有确认出单独的根本原因，然而关于来自各种大量的对照物血清和基质的样品稳定性和可变性的问题可能是原因。注意到，具有相对低浓度的化合物16的样品中失败率最高。
人类中量化化合物16的分析方法。基于用于检测大鼠和猴血清中化合物16的方法，开发了用于检测人血清中化合物16的LC/MS测定。该方法不同于在几个方面中在大鼠和猴中使用的经过验证的临床前方法。首先，人类方法中使用的内标为化合物16的同位素标记型式，该型式比临床前标准化合物76大约重30Da(化合物76的肽组分具有H-Met-Cys-Met-Pro-Cys-Phe-Thr-Thr-Asp-His-Gln-Met-Ala-Arg-Ala-Cys-Asp-Asp-Cys-Cys-Gly-Gly-Ala-Gly-Arg-Gly-Lys-Cys-Tyr-Gly-Pro-Gln-Cys-Leu-Cys-Arg-OH的序列)。其次，已经将牛血清白蛋白添加至标准和质量对照溶液中以改进稳定性。再次，使用ABSciexQTrap5500质谱仪代替SciexAPI5000。人类测定的LLOQ为10ng/mL。
药物代谢动力学方法。使用静脉内推注、静脉输注、或血管外输入(适当时)的标准非房室方法，将化合物16血清浓度对比时间的数据下载至PhoenixWinNonlin6.3(Pharsight，凯里(Cary)，北卡罗来纳州)用于分析。使用平均血清浓度对比时间的数据，分析小鼠和大鼠PK数据。通过个体动物分析狗和猴PK数据，并且然后计算组群汇总统计。没有分析化合物16浓度的样品是由于样品数量不足或浓度值低于测定量化的限度。这些样品被视为没有用于计算毒物动力学(TK)参数的目的，并且没有被包括在组群平均数的计算中。将标称剂量和样品收集时间用于估计参数中。
吸收。因为期望的临床给药途径为IV，通过IV给予化合物16。
分布：
雌性CD-1小鼠中化合物16的静脉内给药的药物代谢动力学。静脉内或皮下地向雌性小鼠给予单固定剂量的0.02mg的化合物16。将化合物16配制在10mMTris/5％右旋糖中。在给药后0.25、2、6以及24小时从小鼠中收集血清(图22)。使用基于荧光的方法以测量化合物16血清浓度。
化合物16在雄性斯普拉-道来大鼠中的耐受性与毒代动力学研究。在雄性斯普拉-道来大鼠中评估毒代动力学(TK)作为单剂量耐受性研究的一部分。以标称剂量水平二者中之一(0.03或0.3mg)静脉内给予大鼠单固定推注剂量的化合物16。将化合物16配制在10mMTris、5％甘露醇中，pH7.2。在注射后0.083、0.33、1、2、4、8、24、以及48小时将动物(n＝每个时间点3只)以交错取样方案放血。使用LC/MS方法以测量化合物16血清浓度。
单IV推注之后，在0.03mg组中血清浓度可测量至长达4个小时而在0.3mg组中长达8个小时(图23)。基于C0以及AUC0-t的化合物16暴露以大致剂量比例性的方式增长。由于PK曲线中可供使用的可测量的浓度有限，无法计算基于终末阶段的参数。
通过测量来自静脉内给药后48小时安乐死时收集的器官中组织切片的荧光强度，对生物分布进行评估。收集肾、肝、心、以及主动脉并且将其固定在10％福尔马林中。在4℃下将组织存储在10％福尔马林中直到处理。将组织在PBS中洗涤两次然后通过10％蔗糖/PBS的蔗糖梯度处理5个小时，随后在4℃下20％蔗糖/PBS过夜以超低温保护。然后将组织总体切割并且在干冰上冷冻于OCT中。将冷冻的组织段切成12μm切片并且置于涂敷明胶的载玻片上。使用奥德赛(Odyssey)CLx成像系统(利卡生物科学公司(Li-CorBiosciences))使用800nm通道(785nm激发)对载玻片进行扫描。使用图像工作室软件(ImageStudiosoftware)(利卡生物科学公司(Li-CorBiosciences))分析图像，这是通过测量每个样品的感兴趣区域内(ROI)的信号。对于每个动物计算三到四个切片的平均信号。
发射自化合物16的信号是肾中最高的，这与产品的肾清除率是一致的。在肝和主动脉中观察到的荧光较不强烈。心脏中的信号低。在所有测试的组织中信号随着剂量上升而增加，然而，即使在高剂量下心脏中的信号仍然是低的。相比于心脏，主动脉和心脏的大血管中的信号相对较高并且随着剂量上升而增加。化合物16分布进入肾、肝、心、以及主动脉似乎不具有毒理学意义。血清化学或组织病理学方面没有相应变化。
静脉内给药至雄性比格犬后化合物16的先导药物代谢动力学。静脉内给予两只雄性比格犬标称剂量1mg的化合物16。第一只狗接受以IV推注给药，而第二只狗接受以15分钟IV输注给药。将化合物16配制在10mMTris、5％甘露醇中，pH7.2。在给药前、给药(推注)后或输注起动后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、24、48、72、以及96小时将动物放血用于PK分析。使用基于荧光的方法以测量化合物16血清浓度。(表44)。
在向狗X1单IV推注之后，狗中的C0值与0.36mg(0.36mg/515mL)体积的给药剂量一致。t1/2大约为54个小时，CL为1100mL/hr，而Vss为29900mL，这大约是体内总水量(DaviesandMorris1993)的两倍。(表44)。
表44：在单剂量静脉内(推注或输注)给予雄性狗1mg后，与标准曲线对比计算化合物16(ng/ml)的血清浓度。BLQ＝低于定量限度。时间＝0是给药前。
在15分钟IV输注给狗X2之后，57小时处的t1/2与狗X1的一致。然而，C最大比IV推注C最大低大约40％。输注后基于AUC的总体暴露比IV推注给药之后所观察到大约低55％。相对于IV推注给药，这对应于更快的CL以及更高的Vss值。尚不知道CL以及Vss中所观察到的区别是由于动物或给药途径之间的真实PK差异，还是由于给药溶液的人为问题与输注线潜在的不完全灌注，从而导致低于所期望的给药剂量。(表44)。
IV给药至雄性非人类灵长动物后化合物16的先导药物代谢动力学。以IV推注向两只猕猴给予标称剂量0.6mg的化合物16。将化合物16配制在10mMTris、5％甘露醇中，pH7.2。在给药前、给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、24、48、72、以及96小时将动物放血用于PK分析。使用基于荧光的方法以测量化合物16血清浓度(图24)。
在单IV推注给药之后，猴NHP1的血清浓度对比时间曲线的形状不是所期望的那样(表44)。原因未知，而这些数据无法用于计算PK参数，PK参数需要终末阶段的浓度对比时间曲线的定义。对于NHP2的t1/2大约为55个小时，CL为170mL/hr，而Vss为6580mL。
化合物16在斯普拉-道来大鼠中的单剂量静脉内毒性与毒代动力学研究。以0.07、0.7、以及7mg的固定剂量给予雄性和雌性斯普拉-道来大鼠单IV推注剂量的化合物16。将化合物16配制在10mMTris、5％甘露醇中，pH7.2。使用交错取样方案获得PK样品，其中在给药前、给药后0.25、1、3、6、12、24、以及48小时每个时间点每组3只雄性和3只雌性(图25)。针对房室化合物16浓度通过验证过的基于LC/MS的方法分析血清样品，并且使用所得浓度对比时间的数据使用非分析以估计TK参数。
在单固定IV推注剂量的化合物16之后，在0.07与0.7mg剂量组中平均血清浓度可测量至给予后12个小时，LLOQ为10ng/mL，而在7mg剂量组中可测量至给予后48个小时。在测试的剂量范围内，基于C最大以及C0的暴露以大致剂量比例性的方式增长。AUC0-t在0.07与0.7mg剂量水平之间是大致剂量比例性的，并且在较低剂量组对比7mg剂量水平之间以高于剂量比例性的方式增长(见表45)。尽管C最大或C0值在雄性和雌性之间有变化，基于可指示性别作用的这些参数，没有明显总体趋势。在所有剂量组中AUC0-t在雄性和雌性之间是一致的。
表45：在雄性和雌性斯普拉-道来大鼠单IV推注剂量之后，平均非房室化合物16PK参数。注：由于在某些时间点雄性和雌性之间具有可测量的化合物16浓度的样品组数不等，一些总剂量组(雄性+雌性)暴露参数不等于对应的雄性和雌性暴露值的平均数。
在猕猴中化合物16的单剂量14-天静脉内毒性研究。以0.6、6、以及60mg的固定剂量给予雄性和雌性猕猴(n＝每组3只雄性以及3只雌性)单IV剂量的化合物16。将化合物16配制在10mMTris、5％甘露醇中，pH7.2。在给药前、给药后0.083、0.25、1、2、4、8、12、24、36、48、72、96、以及120小时获得PK样品。针对化合物16浓度通过验证过的基于LC/MS的方法分析血清样品，并且使用所得浓度对比时间的数据使用非房室分析以估计TK参数。
在给药后8、48、以及120小时分别在0.6、6、与60mg剂量组中测量到大于5ng/mL的平均血清浓度(图26)。在所测试的剂量水平中，相对于雄性，雌性中基于C0以及AUC0-t的暴露高出6％至29％(见表46)。这可能是由于雌性猴体型相对于雄性猴较小，因为是以固定剂量而非基于体重给予化合物16。然而，暴露中的所有剂量依赖性趋势在两性之间是一致的。
表46：在向雄性和雌性猕猴单IV推注剂量之后，平均非房室化合物16PK参数。ND：无法确定，由于终末阶段中有限的浓度对比时间的数据。
基于C最大以及C0的暴露通常以剂量比例性的方式增长，尽管6mg剂量水平具有高于期望C最大以及C0的值。基于AUC0-t值的暴露在所有剂量组中以大于剂量比例性的方式增加，这意味着化合物16清除率在较高剂量下降低了(见表46)。这也可能部分由于在最低剂量水平下由于测定限制，TK曲线的表征不完全。相对于0.6mg剂量组，6mg剂量组中在给药0.25至4小时后化合物16浓度下降的速率也似乎变慢。
另外的非房室TK参数能够对于60mg剂量组进行估计。雄性和雌性之间的TK参数没有实质性的差别。总平均值t1/2、CL、以及Vss值分别为33.7小时、50.6mL/hr、以及211mL。
代谢(物种间比较)。尚未使用化合物16进行代谢研究。已知分子的ICG部分大体上不经改变就排入胆汁，并且不经历任何可评估的代谢。
排泄。尚未正式评估尿排泄物。基于从单剂量小鼠肿瘤模型以及非GLP单剂量大鼠研究中选择正常组织中的生物分布数据，肾似乎是清除和消除化合物16中所涉及的重要器官。这另外由来自单剂量GLP大鼠研究的数据支持，其中在最高剂量组中注射2天后发现变绿的肾，而在单剂量GLP猴研究中出现变绿的尿。
药物代谢动力学药物相互作用。尚未使用化合物16进行药物相互作用研究。
在IV给药之后化合物16PK曲线显示出双指数下降，在所有物种中具有快速的初始阶段和更长的终末阶段。基于来自大鼠和猴单剂量GLP研究的PK数据，基于C0或C最大值的化合物16暴露似乎在测试的剂量范围内是大致与剂量成比例的。相比之下，以剂量比例性或高于剂量比例性的方式增长的AUC值意味着化合物16清除率在较高剂量下降低了。终末阶段可以在猕猴的高剂量组(60mg)中表征，从而允许t1/2、CL、以及Vss参数的估算。平均值t1/2、CL、以及Vss值分别为33.7小时、50.6mL/hr、以及211mL。
性别对于大鼠中的化合物16PK没有明显影响，但是相比于雄性猴，雌性猴中的暴露一致更高。该发现可能是由于雄性与雌性之间的体型差异，因为是以固定剂量给予化合物16的。
实例23
其他氯毒素缀合化合物的药物代谢动力学
此实例证明了在小鼠、大鼠、犬和猴体内单次静脉(IV)注射后化合物1-720的药物代谢动力学(PK)曲线。
材料和方法如实例22中所描述，但使用化合物1-720。
向雄性非人类灵长动物(猕猴)IV给药随后，化合物1-720的先导药物代谢动力学 研究。向猕猴静脉内给予单次推注固定剂量水平的化合物1-720。在每个时间点进行临床观察。
在先导性研究中，在IV给药后，化合物1-720的药物代谢动力学(PK)曲线在所有物种中显示双指数下降，具有快速初始阶段和较长的终末阶段。
在单剂量GLP毒理学研究中在IV给予大鼠和猴化合物1-720之后，基于C最大以及C0的暴露在测试范围内以大致剂量比例性的方式增加。AUC0-t值以剂量比例性或高于剂量比例性的方式增加。这些观察表明缀合化合物1至720的清除率在更高剂量降低。
静脉内给予1-720化合物的药物代谢动力学。在不同的实验中，向小鼠、大鼠、狗和猴以IV推注或IV输注进行静脉内给予化合物1-720。在给药后，在多个时间点收集血清。使用一种基于荧光的方法来测量化合物1-720血清浓度。从结果数据中获得C最大、C0、t1/2和AUC0-t值。静脉内给药后，通过测量来自于在安乐死的时间点采集的器官的组织切片中的荧光强度，评估生物分布。化合物1-720的分布通常对器官而言不具有毒理学意义，在血清化学或组织病理学中没有相应的变化。
实例24
化合物16在人类中的药物代谢动力学
此实例证明了化合物16在非黑变病的皮肤癌人类受试者中的药物代谢动力学。这项研究的主要目的在于评估化合物16的单IV给药的安全性和耐受性。
在提交申请时，这项研究正在进行中。此实例概括了来自已评估的第一研究组的中期数据。
在单IV给药后，在输注结束时观察最大的血清化合物16浓度。输注数小时后药物水平是可检测。基于C最大以及AUC0-t的暴露以剂量依赖的方式增加。结果表明，使用动物模型获得的药物代谢动力学数据可预测的在人类患者中的药物代谢动力学。
总体而言，化合物16的单IV注射的耐受性良好。没有观察到显著的或明显的毒性模式。
实例25
氯毒素缀合化合物在人类中的药物代谢动力学
此实例证明了氯毒素缀合物在人类受试者中的药物代谢动力学。
研究设计：
给予受试者静脉(IV)推注1毫克、3毫克、12毫克或30毫克的氯毒素缀合物如化合物16。在注射前(时间＝0小时)以及注射后30、60、90、120、180和240分钟时采集血液样品。用荧光法和液相色谱/质谱(LC/MS)的方法分析样品以确定氯毒素缀合物在人类中的药物代谢动力学曲线(图27)。
初始血药浓度和曲线数据下面积与动物模型的预测相一致(表47、表48)。
表47：向人类患者IV推注1毫克剂量的化合物16后，在不同的时间点的初始血药浓度(C0)和曲线下面积(AUC)百分位数值。
表48：向人类患者静脉推注1毫克剂量的化合物16后，达到不同的曲线下面积(AUC)百分位数值的时间。
实例26
术中成像以及肿瘤鉴定
该实例描述了BLZ-100的肿瘤结合特异性和BLZ-100结合的肿瘤和背景之间的比率。
术中成像
实例9描述的研究中，原型术中成像系统被用于患者17至28。在手术中其用途是肿瘤床成像以及原位肿瘤成像以及切除后即刻肿瘤成像。数据显示总肿瘤和周围组织之间的良好的区别。瘤周皮肤趋于具有背景荧光，而未涉及的皮肤具有较弱的荧光。粘膜组织也显示背景荧光，导致患者17中缺乏特异性并且导致残留的非肿瘤荧光。肿瘤床成像显示，在“内部”组织，如气管、肌肉和脂肪中，有很少或没有背景染色。术中成像显示出与使用奥德赛(Odyssey)扫描仪进行的定量的离体图像分析具有良好的主观一致性。在离体具有整体高强度和肿瘤/正常组织的良好比率的肿瘤也显示了高对比度且易于术中检测(表49)。
表49：术中成像观察概述。由于仪器的技术问题，没有对患者25进行成像。当肿瘤和正常组织同时进行成像时，计算TBR。ND＝未确定。
几种情况表示为术中成像的氯毒素缀合物的临床应用的实例。
患者19，软组织肉瘤
患者19的前腿有二级软组织肉瘤。肿瘤已经临床上明显的几个月，没有治疗。瘤周皮肤肿胀和溃疡(图28A)。原位肿瘤的术中成像在肿瘤中显示出不同的荧光，有些荧光在肿胀和溃疡的瘤周皮肤中，而其他区域很少或没有背景荧光(图28B、28C)。肿瘤立即切除后成像显示肿瘤内荧光强度大约8倍的变化(图28D、28E)。肿瘤内的变化与病理报告是一致的，约50％的肿块被替换为嗜酸粒碎片(坏死)。肿瘤床的成像显示瘤周皮肤中的荧光；这一皮肤的样品被切除并送去进行进一步的成像和组织病理学检查。在肿瘤床或在周围未涉及的皮肤中没有残留的荧光(图28F)。切除的瘤周皮肤的样品进一步送至成像和组织病理学检查，证实没有肿瘤侵袭。
患者22，乳腺癌
患者22具有复发性乳腺癌。肿瘤与覆盖的皮肤和周围的脂肪组织全部切除。从底部进行肿瘤成像显示透过正常脂肪组织～0.5厘米可测量肿块(图29A)。荧光的弥漫性外观是由发射光的组织散射导致的。从皮肤侧移走了用于进一步成像的切片，使大部分的肿块和周围组织暴露。由于缺少介入组织，肿瘤和周围组织的对比度提高了(图29B、29C)。
为进一步成像收集的组织片包含总肿瘤(白色区域，图29D)及邻近组织。荧光成像显示，与邻近组织相比，总肿瘤区的荧光约2.5倍更亮于邻近组织(图29E)。肿瘤床显示无残留荧光(图29F)。请注意，在F图中出现的皮肤中的荧光比C图中的更亮；这是由于在肿瘤床的调查中使用的增加的敏感性，以确保检测到任何残留的荧光。
患者23，皮肤鳞状细胞癌
患者23具有尾部皮肤鳞状细胞。癌病变已侵入了皮肤，皮肤已严重的肿胀和溃疡(图30A)。病变由浆液细胞痂覆盖。术前荧光成像显示很少的荧光穿透浆液细胞痂，而瘤周皮肤较明亮的染色(图30B)。注意两个荧光的“手指”，其延伸至尾部相对侧(图30C)。
除去尾部后，对组织进行成像以及移除各段用于进一步成像。一段中央肿瘤(图30D、30E、右)显示出较强烈的荧光。剩余的中央肿瘤，从侧面观察，而不是通过浆液细胞痂，显示荧光强度与中央肿瘤相似。瘤周皮肤没有肿瘤本身那么强烈(图30F)，但比未涉及的皮肤强烈约3倍。将来自肿瘤的相对侧上的荧光区的皮肤样品进行组织病理学检查，它们不包含肿瘤。
患者20，甲状腺癌
患者20具有甲状腺癌。切除整个甲状腺连同肿大的淋巴结。甲状腺的术中成像显示大部分腺体有荧光，在整体信号强度中约有2倍的变化(图31)。淋巴结的荧光区与原发性肿瘤具有可比性。该肿瘤床无残留荧光。此外，在包括气管、神经和动脉的内部结构中没有观察到显着的非特异性背景荧光。组织病理学显示甲状腺95％被肿瘤占据，具有大面积的血液填充空间和坏死。这些可以解释在原发性肿瘤中观察到的染色的变化。淋巴结证实包含转移性疾病。
实例27
其他氯毒素缀合化合物的特异性以及肿瘤与背景比率
该实例描述了化合物1-720的肿瘤结合特异性和化合物1-720结合的肿瘤和背景之间的比率。
术中成像
使用的方法和材料描述于实例26中，但使用化合物1-720。使用原型术中成像系统。在手术中其用途是肿瘤床成像以及原位肿瘤成像以及切除后即刻肿瘤成像。数据显示总肿瘤和周围组织之间的良好的区别。瘤周皮肤趋于具有背景荧光，而未涉及的皮肤具有较弱的荧光。肿瘤床成像显示，在“内部”组织，如气管、肌肉和脂肪中，有很少或没有背景染色。术中成像显示出与使用奥德赛(Odyssey)扫描仪进行的定量的离体图像分析具有良好的主观一致性。在离体具有整体高强度和肿瘤/正常组织的良好比率的肿瘤也显示了高对比度且易于术中检测(表49)。
实例28
组织病理学评分、敏感性以及特异性
该实例描述了肿瘤和邻近组织在细胞水平的评估，以对氯毒素缀合化合物的敏感性和特异性进行评定，如针对癌细胞的BLZ-100。
为了评定针对癌细胞的BLZ-100的敏感性和特异性，对犬肿瘤及其邻近组织进行细胞水平的评估。对于此分析，包括两种皮肤鳞状细胞癌，三种乳腺癌和四种皮下软组织肉瘤。对30微米冰冻切片进行网格分析来计算敏感性和特异性。分析每个荧光图像与由组织病理学家评为肿瘤或正常的相应的H&E染色图像的叠加图。对每一种情况单独进行此分析。
数据按单独切片分组，并为每个患者标绘该数据。皮下软组织肉瘤显示高特异性肿瘤荧光。逻辑回归分析用来为检测皮下软组织肉瘤的肿瘤确定合理的阈值强度。非皮肤组织被用来计算的敏感性和特异性，其中使用阈值强度为30000作为截止值。网格正方形基于荧光强度和基于病理学家称呼而被称为肿瘤或无肿瘤。使用一致与不一致的称呼来计算敏感性和特异性。使用30000的阈值网格正方形荧光时的敏感性(95％)和特异性(85％)是非常好的。在所有网格正方形中患者19的瘤周皮肤高于此阈值；如实例26中所讨论的，此患者的肿块紧邻有溃烂的肿瘤以及严重浮肿的皮肤。在此分析中，该患者的皮肤样品中的升高信号解释所有超过阈值的数据点。
皮肤鳞状细胞癌具有来自肿瘤和下层真皮的荧光信号。在大多数情况下，在下层真皮中的信号更亮，导致“反向”肿瘤对比正常强度。虽然这些肿瘤中的组织特异性低，在患者23术中成像过程中和以及患者14离体成像过程中可见的真正未涉及的皮肤未见荧光。乳腺肿瘤的分析显示，如皮肤一样，临近肿瘤的乳腺组织占据BLZ-100。在这两种肿瘤类型中，总肿瘤具有比未涉及的组织更高的荧光。
对于此分析，包括两种皮肤鳞状细胞癌，三种乳腺癌和三种皮下软组织肉瘤。将组织在低温恒温器中切片，并且将30微米切片在奥德赛(Odyssey)扫描器上成像。将这些切片或连续切片用H&E染色并且由对该荧光数据一无所知的组织病理学专家阅读。将网格叠加在荧光图像上，并且使用由奥德赛(Odyssey)扫描仪提供的图像工作室(Li-Cor)软件对每个网格方块中的总荧光进行测量。荧光图像与评分的H&E图像的叠加使得能够针对每个网格方块称呼肿瘤非肿瘤。
针对每一肿瘤，当可用时，对肿瘤、相邻非肿瘤组织以及未涉及的组织的样品的不同区域的切片进行网格分析。如上文所讨论，患者19的肿胀、溃烂皮肤中的背景染色导致手术过程中的肿瘤浸润的嫌疑。该皮肤切片中的荧光分析将导致相同的结论。请注意，患者12和13的未涉及的皮肤样品远低于被错误地鉴定为肿瘤组织的阈值。
实例29
氯毒素缀合化合物的组织病理学评分、敏感性以及特异性
该实例描述了肿瘤和邻近组织在细胞水平的评估，以对氯毒素缀合化合物的敏感性和特异性进行评定，如针对癌细胞的化合物16。
使用的材料和方法如实例28中所描述。图32示出了来自多个患者并且针对每一分析的组织切片的网格方块中的荧光强度的盒须图(T，肿瘤。NT，相邻非肿瘤组织。PS，瘤周皮肤。S，未涉及的皮肤)。使用30000(任意单位)的阈值时敏感性(95％)和特异性(85％)是非常好的。在所有网格正方形中患者19的瘤周皮肤高于此阈值。此患者的肿块紧邻有溃烂的肿瘤以及严重浮肿的皮肤。在此分析中，该患者的皮肤样品中的升高信号解释所有超过阈值的数据点。
网格正方形基于荧光强度和基于病理学家称呼而被称为肿瘤或无肿瘤。使用一致与不一致的称呼来计算敏感性和特异性。结果示于表50中。
表50：对于皮下软组织肉瘤样品的敏感性和研究特异性分析。κ系数(95％CI)：0.730(0.543，0.917)；敏感性(95％CI)：94.1％(88.2％，97.6％)；特异性(95％CI)：100.0％(71.5％，100.0％)。
实例30
其他氯毒素缀合化合物的组织病理学评分、敏感性以及特异性
该实例描述了肿瘤和邻近组织在细胞水平的评估，以对氯毒素缀合物的敏感性和特异性进行评定，如针对癌细胞的化合物1-720。
为了评定针对癌细胞的化合物1-720的敏感性和特异性，对犬肿瘤及其邻近组织进行细胞水平的评估。对30微米冰冻切片进行网格分析来计算敏感性和特异性。分析每个荧光图像与由组织病理学家评为肿瘤或正常的相应的H&E染色图像的叠加图。对每一种情况单独进行此分析。评估皮肤鳞状细胞癌、乳腺癌以及皮下软组织肉瘤。肿瘤组织和邻近肿瘤的组织与正常组织相比具有更高的平均荧光。
实例31
其他类型肿瘤的标记
该实例描述了BLZ-100用于标记前述实例中未描述的其他杂类肿瘤类型。除了上述描述的肿瘤类型外，由于患者数量不足，有若干肿瘤类型不能进行有意义的敏感性和特异性分析。这些包括肥大细胞瘤(N＝1，有效剂量)、肺癌(N＝1)和脑膜瘤(N＝1)。有两例甲状腺癌，其中30微米切片中的信号太低无法进行分析。口腔肿瘤被确定在总成像上为非特异性的。
肺癌具有潜在的临床价值。犬肺癌总成像的结果表明特异性肿瘤摄取，与相邻肺或与未涉及的皮肤相比，有3:1的TBR。在邻近的肺组织中可见少量的可疑转移。根据组织病理学分析，信号强度低但是可测量的，但对在原发肿块方面针对肿瘤具有特异性。由于冰冻切片伪影而不能确认可疑转移。
脑肿瘤对氯毒素缀合物的临床和商业化发展具有非常高的价值。在这项研究中包含一例脑肿瘤案例，脑膜瘤。脑膜瘤是犬类以及人类中具有典型低组织学分级的髓外肿瘤。术中成像显示出氯毒素缀合物标记的肿瘤中具有2.5倍的肿瘤与背景(正常脑)比的信号。手术入路通过窦，所以鼻黏膜出现在影像中。粘膜组织是已知的背景的来源，并在这种情况下，提供了针对荧光强度的阳性对照。肿瘤以片段被切除；被分析的片段被嵌入OCT中并迅速冷冻。30微米切片的成像显示低的但可检测的信号。血脑屏障内产生的CNS肿瘤的最佳剂量需要由另外的受试者来确定，包括恶性肿瘤的情况，如神经胶质瘤。然而，此情况为正常脑组织成像提供了一个机会，它证实低度脑肿瘤可以成功地被成像。这是有意义的，因为在低度肿瘤进行完全切除是治愈性的。
实例32
使用氯毒素缀合化合物标记其他类型肿瘤
该实例描述了化合物16用于标记其他肿瘤类型。
犬类脑膜瘤的术中成像显示出化合物16标记的肿瘤(图33A)中具有2.5倍的肿瘤与背景(正常脑)比的信号。手术入路通过窦，所以鼻黏膜出现在影像中。粘膜组织是已知的背景的来源，并在这种情况下，提供了针对荧光强度的阳性对照。肿瘤以片段被切除；被分析的片段被嵌入OCT中并迅速冷冻。30微米切片的成像显示出低的但可检测的信号(图33B、33C)。H&E染色的切片被示出用于对比(图33D、33E)。此情况证实低度脑肿瘤可以成功地被成像。
实例33
使用其他氯毒素缀合化合物标记其他类型肿瘤
此实例描述了化合物1-720用于标记杂类肿瘤类型，如肥大细胞瘤、肺癌、脑膜瘤、甲状腺肿瘤、口腔肿瘤。
术中肿瘤成像显示出化合物1-720所发出的信号。肿瘤以片段被切除；被分析的片段被嵌入OCT中并迅速冷冻。30微米切片的成像显示出低的但可检测的信号。H&E染色切片被用于对比。使用化合物1-720成功地鉴定了肿瘤并且确定了最佳剂量。
根据上文，应当理解，尽管本文出于解释说明的目的已经描述了本发明的具体实施例，但仍可以在不偏离本发明的精神和范围的条件下做出多种修改。因此，除了所附权利要求书以外，本发明并受限。
虽然已经在此示出并描述了本发明的优选实施例，但是对本领域的普通技术人员而言应该显而易见是这样的实施例仅以举例方式提供。在不偏离本发明的情况下众多变化、改变和取代现在将被本领域的普通技术人员想到。应该理解的是，在实践本发明中可以采用在此描述的本发明的实施例的不同替代方案。旨在按照以下权利要求限定本发明的范围，并且在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物也包括在本发明的范围内。
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14.Veiseh,O.,Sun(孙)，C.,Fang(方)，C.,Bhattarai(巴塔拉伊)，N.,Gunn(耿)，J.,Kievit,F.,Du(杜)，K.,Pullar(普拉)，B.,Lee(李)，D.,Ellenbogen(埃伦博根)，R.G.,Olson(奥尔森)，J.,以及Zhang(张)，M.(2009)Specifictargetingofbraintumorswithanoptical/magneticresonanceimagingnanoprobeacrosstheblood-brainbarrier(穿越血脑屏障用视觉/磁共振成像纳米探针进行脑肿瘤的特异性靶向).CancerRes.(癌症研究)69,6200-6207
15.Hockaday(霍克迪)，D.C.,Shen(沈)，S.,Fiveash,J.,Raubitschek,A.,Colcher,D.,Liu(刘)，A.,Alvarez(阿尔瓦雷斯)，V.，以及Mamelak,A.N.(2005)Imaginggliomaextentwith131I-TM-601(用131I-TM-601成像神经胶质瘤范围).TheJournalofNuclearMedicine(核医学杂志)46,580-586
16.Mamelak,A.N.,Rosenfeld(罗森菲尔德)，S.,Bucholz(布霍尔茨)，R.,Raubitschek,A.,Nabors(内伯斯)，L.B.,Fiveash,J.B.,Shen(沈)，S.,Khazaeli,M.B.,Colcher,D.,Liu(刘)，A.,Osman(奥斯曼)，M.,Guthrie(格思里)，B.,Schade-Bijur(沙德-贝奇尔)，S.,Hablitz,D.M.,Alvarez(阿尔瓦雷斯)，V.L.,以及Gonda(贡达)，M.A.(2006)PhaseIsingle-dosestudyofintracavitary-administerediodine-131-TM-601inadultswithrecurrenthigh-gradeglioma(在患有复发高度神经胶质瘤的成体中腔内给予碘-131-TM-601的相I单次剂量研究).JournalofClinicalOncology(临床肿瘤学杂志)24,3644-3650

Claims (345)

1.一种具有化学式(I)的结构的化合物，或其药学上可接受的盐：
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R15、以及R16各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6亚烷基-COOH、磺酸酯、-COOH、-SO2-NH2、C1-C6烷氧基、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-O-、或C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-NR10-；
R9是氢、磺酸酯、-COOH、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-O-、或C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-NR10-；
L1是C3-C6亚烷基；
L2是C1-C10亚烷基；
L3是键、-O-、-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-、-O-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-(O-C1-C6亚烷基)n-、-NR10-L4-、-NR10-C1-C6亚烷基-NR11-(C(＝O)-C1-C6亚烷基-O-)m-、或-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-；
L4是键、-杂环基-、或-杂环基-C1-C6亚烷基-；
R10是氢或C1-C6烷基；
R11是氢或C1-C6烷基；
R12和R13各自独立地选自氢、C1-C6烷基，或R12和R13连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R14是氢或C1-C6亚烷基、-(L5)-芳基、-(L5)-芳基-A5、-(L5)-杂芳基、-(L5)-杂芳基-A5、-NR17R18，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
L5是键、C1-C10亚烷基、-O-、或-NR10-；
R17和R18各自独立地是氢或芳基；
R19和R20各自独立地选自氢、C1-C6烷基，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
n是0、1、2或3；
m是0、1、2或3；
p是0、1、2或3；
q是0、1、2或3；
x是0或1；并且
A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段，并且A1、A2、A3、A4、或A5中其他项各自独立地不存在、是氢、-COOH、或磺酸酯。
2.如权利要求1所述的、具有化学式(II)的结构的化合物，或其药学上可接受的盐：
3.如权利要求1或2中任一项所述的、具有化学式(III)的结构的化合物，或其药学上可接受的盐：
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R15、以及R16各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6亚烷基-COOH、磺酸酯、-COOH、-SO2-NH2、或C1-C6烷氧基；
R9是氢、磺酸酯、或-COOH；
L1是C3-C6亚烷基；
L2是C1-C10亚烷基；
L3是键、-O-、-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-、-O-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-(O-C1-C6亚烷基)n-、-NR10-L4-、-NR10-C1-C6亚烷基-NR11-(C(＝O)-C1-C6亚烷基-O-)m-、或-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-；
L4是键、-杂环基-、或-杂环基-C1-C6亚烷基-；
R10是氢或C1-C6烷基；
R11是氢或C1-C6烷基；
R12和R13独立地选自氢、C1-C6烷基，或R12和R13连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R14是氢或C1-C6亚烷基、-(L5)-芳基、-(L5)-杂芳基、-NR17R18，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
L5是键、C1-C10亚烷基、-O-、-NR10-；
R17和R18各自独立地是氢或芳基；
R19和R20独立地选自氢、C1-C6烷基，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
n是0、1、2或3；
m是0、1、2或3；
p是0、1、2或3；
q是0、1、2或3；并且
A4是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段。
4.如权利要求1或2中任一项所述的、具有化学式(IV)的结构的化合物，或其药学上可接受的盐：
其中：
R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8、R15、以及R16各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6亚烷基-COOH、磺酸酯、-COOH、-SO2-NH2、或C1-C6烷氧基；
R3选自C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-O-、或C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-NR10-；
R9是氢、磺酸酯、或-COOH、或C1-C10烷基；
L1是C3-C6亚烷基；
L2是C1-C10亚烷基；
L3是氢、磺酸酯、-COOH、C1-C10烷基；
L4是键、-杂环基-、或-杂环基-C1-C6亚烷基-；
R10是氢或C1-C6烷基；
R11是氢或C1-C6烷基；
R12和R13独立地选自氢、C1-C6烷基，或R12和R13连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R14是氢或C1-C6亚烷基、-(L5)-芳基、-(L5)-杂芳基、-NR17R18，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
L5是键、C1-C10亚烷基、-O-、-NR10-；
R17和R18各自独立地是氢或芳基；
R19和R20独立地选自氢、C1-C6烷基，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
n是0、1、2或3；
m是0、1、2或3；
p是0、1、2或3；
q是0、1、2或3；
x是0或1；并且
A1是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段。
5.如权利要求1或2中任一项所述的、具有化学式(V)的结构的化合物，或其药学上可接受的盐：
其中：
R1、R2、R3、R4、R6、R7、R8、R15、以及R16各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6亚烷基-COOH、磺酸酯、-COOH、-SO2-NH2、或C1-C6烷氧基；
R5选自C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-O-、或C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-NR10-；
R9是氢、磺酸酯、或-COOH、或C1-C10烷基；
L1是C3-C6亚烷基；
L2是C1-C10亚烷基；
L3是氢、磺酸酯、-COOH、或C1-C10烷基；
L4是键、-杂环基-、或-杂环基-C1-C6亚烷基-；
R10是氢或C1-C6烷基；
R11是氢或C1-C6烷基；
R12和R13独立地选自氢、C1-C6烷基，或R12和R13连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R14是氢或C1-C6亚烷基、-(L5)-芳基、-(L5)-杂芳基、-NR17R18，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
L5是键、C1-C10亚烷基、-O-、-NR10-；
R17和R18各自独立地是氢或芳基；
R19和R20独立地选自氢、C1-C6烷基，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
n是0、1、2或3；
m是0、1、2或3；
p是0、1、2或3；
q是0、1、2或3；
x是0或1；并且
A2是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段。
6.如权利要求1或2中任一项所述的、具有化学式(VI)的结构的化合物，或其药学上可接受的盐：
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R15、以及R16各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6亚烷基-COOH、磺酸酯、-COOH、-SO2-NH2、或C1-C6烷氧基；
R9选自C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-、C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-O-、或C1-C10亚烷基-(C(＝O))x-NR10-；
L1是C3-C6亚烷基；
L2是C1-C10亚烷基；
L3是氢、磺酸酯、-COOH、或C1-C10烷基；
L4是键、-杂环基-、或-杂环基-C1-C6亚烷基-；
R10是氢或C1-C6烷基；
R11是氢或C1-C6烷基；
R12和R13独立地选自氢、C1-C6烷基，或R12和R13连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R14是氢或C1-C6亚烷基、-(L5)-芳基、-(L5)-杂芳基、-NR17R18，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R17和R18各自独立地是氢或芳基；
R19和R20独立地选自氢、C1-C6烷基，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
n是0、1、2或3；
m是0、1、2或3；
p是0、1、2或3；
q是0、1、2或3；
x是0或1；
L5是键、C1-C10亚烷基、-O-、-NR10-；
A3是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段。
7.如权利要求1或2中任一项所述的、具有化学式(III)的结构的化合物，或其药学上可接受的盐：
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R15、以及R16各自独立地选自氢、C1-C6烷基、C1-C6亚烷基-COOH、磺酸酯、-COOH、-SO2-NH2、或C1-C6烷氧基；
R9是氢、磺酸酯、或-COOH；
L1是C3-C6亚烷基；
L2是C1-C10亚烷基；
L3是键、-O-、-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-、-O-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-(O-C1-C6亚烷基)n-、-NR10-L4-、-NR10-C1-C6亚烷基-NR11-(C(＝O)-C1-C6亚烷基-O-)m-、或-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-NR10-C1-C6亚烷基-；
L4是键、-杂环基-、或-杂环基-C1-C6亚烷基-；
R10是氢或C1-C6烷基；
R11是氢或C1-C6烷基；
R12和R13独立地选自氢、C1-C6烷基，或R12和R13连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
R14是-(L5)-芳基-A5、或-(L5)-杂芳基-A5；
L5是键、C1-C10亚烷基、-O-、-NR10-；
R17和R18各自独立地是氢或芳基；
R19和R20独立地选自氢、C1-C6烷基，R14以及R19连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环，或R14以及R20连同它们所附接的其他原子连接在一起形成5元或6元碳环或杂环；
n是0、1、2或3；
m是0、1、2或3；
p是0、1、2或3；
q是0、1、2或3；
x是0或1；
A4是氢、-COOH、或磺酸酯；并且
A5是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段。
8.如权利要求1至7中任一项所述的化合物，其中A1、A2、以及A3不存在。
9.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中A5是氢。
10.如权利要求1到9中任一项所述的化合物，其中R3、R4、R5和R6各自独立地是C1-C6烷基。
11.如权利要求1到9中任一项所述的化合物，其中R3、R4、R5、R6各自独立地是甲基。
12.如权利要求1到11中任一项所述的化合物，其中R1、R2、R7、R8、R15、以及R16各自独立地选自氢或磺酸酯。
13.如权利要求1到11中任一项所述的化合物，其中R1、R2、R7、R8、R15、以及R16各自独立地是氢。
14.如权利要求1到13中任一项所述的化合物，其中R12、R13、R14、R19、R20各自独立地是氢。
15.如权利要求1到14中任一项所述的化合物，其中R12以及R13连同它们所附接的原子连接在一起形成六元碳环。
16.如权利要求1到15中任一项所述的化合物，其中R12以及R13连同它们所附接的原子连接在一起形成五元碳环。
17.如权利要求1到16中任一项所述的化合物，其中R14以及R19连同它们所附接的原子连接在一起形成六元碳环。
18.如权利要求1到17中任一项所述的化合物，其中R14以及R20连同它们所附接的原子连接在一起形成六元碳环。
19.如权利要求1至18中任一项所述的化合物，其中L1是C3-C6亚烷基。
20.如权利要求1至18中任一项所述的化合物，其中L1是C3-C5亚烷基。
21.如权利要求1至18中任一项所述的化合物，其中L1是亚丙基。
22.如权利要求1至18中任一项所述的化合物，其中L1是亚丁基。
23.如权利要求1至18中任一项所述的化合物，其中L1是亚戊基。
24.如权利要求1至23中任一项所述的化合物，其中L2是C3-C6亚烷基。
25.如权利要求1至23中任一项所述的化合物，其中L2是亚丙基。
26.如权利要求1至23中任一项所述的化合物，其中L2是亚丁基。
27.如权利要求1至23中任一项所述的化合物，其中L2是亚戊基。
28.如权利要求1至27中任一项所述的化合物，其中R9是磺酸酯。
29.如权利要求1至27中任一项所述的化合物，其中R9是氢。
30.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中R14是氢。
31.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中R14是-(L5)-芳基。
32.如权利要求1至29中任一项所述的化合物，其中R14是-(L5)-芳基-A5。
33.如权利要求1至31中任一项所述的化合物，其中R1是氢。
34.如权利要求1至32中任一项所述的化合物，其中R2是氢。
35.如权利要求1至33中任一项所述的化合物，其中R3是甲基。
36.如权利要求1至34中任一项所述的化合物，其中R4是甲基。
37.如权利要求1至35中任一项所述的化合物，其中R5是甲基。
38.如权利要求1至37中任一项所述的化合物，其中R6是甲基。
39.如权利要求1至38中任一项所述的化合物，其中R7是氢。
40.如权利要求1至39中任一项所述的化合物，其中R8是氢。
41.如权利要求1至40中任一项所述的化合物，其中R12是氢。
42.如权利要求1至41中任一项所述的化合物，其中R13是氢。
43.如权利要求1至42中任一项所述的化合物，其中R14是氢。
44.如权利要求1至43中任一项所述的化合物，其中R19是氢。
45.如权利要求1至44中任一项所述的化合物，其中R20是氢。
46.如权利要求1至45中任一项所述的化合物，其中R17和R18独立地是苯基。
47.如权利要求1至46中任一项所述的化合物，其中L3选自键、-O-、-NR10-、-NR10-C1-C6亚烷基-、-O-NR10-、或-NR10-L4-。
48.如权利要求1至47中任一项所述的化合物，其中L3是键。
49.如权利要求1至48中任一项所述的化合物，其中R10是氢。
50.如权利要求1至49中任一项所述的化合物，其中L4是-杂环基-或-杂环基-C1-C6亚烷基-。
51.如权利要求1至50中任一项所述的化合物，其中L4是-哌嗪基-(C1-C6亚烷基)-。
52.如权利要求1至51中任一项所述的化合物，其中L4是
53.如权利要求1至52中任一项所述的化合物，其中R11是氢。
54.如权利要求1至53中任一项所述的化合物，其中p是1。
55.如权利要求1至54中任一项所述的化合物，其中q是1。
56.如权利要求1或2中任一项所述的化合物，具有化学式(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)、或(XIV)中任一项的结构：
57.如权利要求1至55中任一项所述的化合物，其中A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少87％序列一致性的多肽或其片段。
58.如权利要求1至55中任一项所述的化合物，其中A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少90％序列一致性的多肽或其片段。
59.如权利要求1至55中任一项所述的化合物，其中A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少92％序列一致性的多肽或其片段。
60.如权利要求1至55中任一项所述的化合物，其中A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少95％序列一致性的多肽或其片段。
61.如权利要求1至55中任一项所述的化合物，其中A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少97％序列一致性的多肽或其片段。
62.如权利要求1至55中任一项所述的化合物，其中A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有100％序列一致性的多肽或其片段。
63.如权利要求1至55中任一项所述的化合物，其中A1、A2、A3、A4、或A5中之一是具有序列MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR的多肽或其片段。
64.如权利要求1至63中任一项所述的化合物，其中A1、A2、A3、A4、或A5的片段具有至少25个氨基酸残基的长度。
65.如权利要求1至63中任一项所述的化合物，其中A1、A2、A3、A4、或A5的片段具有至少27个氨基酸残基的长度。
66.如权利要求1至63中任一项所述的化合物，其中A1、A2、A3、A4、或A5的片段具有至少29个氨基酸残基的长度。
67.如权利要求1至63中任一项所述的化合物，其中A1、A2、A3、A4、或A5的片段具有至少31个氨基酸残基的长度。
68.如权利要求1至63中任一项所述的化合物，其中A1、A2、A3、A4、或A5的片段具有至少33个氨基酸残基的长度。
69.如权利要求1至68中任一项所述的化合物，其中A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段，该多肽或其片段具有天然氯毒素的肿瘤细胞结合亲和力。
70.如权利要求1至68中任一项所述的化合物，其中A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段，该多肽或其片段具有与天然氯毒素基本相同的肿瘤细胞结合亲和力。
71.如权利要求1至70中任一项所述的化合物，其中A1、A2、A3、A4、或A5中之一是与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段，该多肽或其片段具有天然氯毒素的肿瘤细胞结合亲和力，其中A1、A2、A3、A4、或A5中之一具有选自SEQIDNO:1-481的序列。
72.如权利要求1至71中任一项所述的化合物，其中该多肽包括至少一个赖氨酸氨基酸残基。
73.如权利要求1至72中任一项所述的化合物，其中该多肽包括单个赖氨酸氨基酸残基。
74.如权利要求1至72中任一项所述的化合物，其中该多肽包括一个、两个或三个赖氨酸氨基酸残基。
75.如权利要求1至74中任一项所述的化合物，其中该多肽在与天然氯毒素的K-27对应的位置处包括赖氨酸残基。
76.如权利要求1至75中任一项所述的化合物，其中该多肽在与天然氯毒素的K-23对应的位置处包括赖氨酸残基。
77.如权利要求1至76中任一项所述的化合物，其中该多肽在与天然氯毒素的K-15对应的位置处包括赖氨酸残基。
78.如权利要求1至77中任一项所述的化合物，其中该多肽的一个或多个氨基酸被非天然存在的氨基酸残基取代。
79.如权利要求1至78中任一项所述的化合物，其中赖氨酸被非天然存在的氨基酸替代。
80.如权利要求78所述的化合物，其中该非天然存在的氨基酸残基是瓜氨酸氨基酸残基。
81.如权利要求80所述的化合物，其中L3在A4的瓜氨酸氨基酸残基处附接到该多肽。
82.如权利要求1至81中任一项所述的化合物，其中L3在A4的赖氨酸氨基酸残基处附接到该多肽。
83.如权利要求1至81中任一项所述的化合物，其中L3在A4的N-端处附接到该多肽。
84.如权利要求1至81中任一项所述的化合物，其中L3在A4的C-端处附接到该多肽。
85.如权利要求1至81中任一项所述的化合物，其中该R3在A1的赖氨酸氨基酸残基、A1的瓜氨酸氨基酸残基、A1的N-端、或A1的C-端处附接到该多肽。
86.如权利要求1至81中任一项所述的化合物，其中该R5在A2的赖氨酸氨基酸残基、A2的瓜氨酸氨基酸残基、A2的N-端、或A2的C-端处附接到该多肽。
87.如权利要求1至81中任一项所述的化合物，其中该R9在A3的赖氨酸氨基酸残基、A3的瓜氨酸氨基酸残基、A3的N-端、或A3的C-端处附接到该多肽。
88.如权利要求1至81中任一项所述的化合物，其中该芳基在A5的赖氨酸氨基酸残基、A5的瓜氨酸氨基酸残基、A5的N-端、或A5的C-端处附接到该多肽。
89.如权利要求1至88中任一项所述的化合物，具有如见于表2-13中化合物1至720中任一项的结构。
90.如权利要求1至89中任一项所述的化合物，其中该化合物缀合至聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉、聚乙烯醇、水溶性聚合物、两性离子水溶性聚合物、水溶性聚(氨基酸)、白蛋白衍生物、或脂肪酸。
91.如权利要求1至90中任一项所述的化合物，其中该多肽具有从7.5至9.0的等电点。
92.如权利要求1至90中任一项所述的化合物，其中该多肽具有从8.0至9.0的等电点。
93.如权利要求1至90中任一项所述的化合物，其中该多肽具有从8.5至9.0的等电点。
94.如权利要求1至93中任一项所述的化合物，其中该多肽包括至少八个半胱氨酸氨基酸残基。
95.如权利要求1至93中任一项所述的化合物，其中该多肽包括八个半胱氨酸氨基酸残基。
96.如权利要求1至95中任一项所述的化合物，其中该多肽包括四个二硫键。
97.如权利要求1至93中任一项所述的化合物，其中该多肽包括从六个至七个半胱氨酸氨基酸残基。
98.如权利要求1至93中任一项所述的化合物，其中该多肽包括三个二硫键。
99.如权利要求1至98中任一项所述的化合物，其中该多肽是碱性的并且具有大于7.5的等电点。
100.如权利要求1至99中任一项所述的化合物，其中该多肽中半胱氨酸氨基酸残基之间的间隔与天然氯毒素中的基本相同。
101.如权利要求1至100中任一项所述的化合物，其中该多肽表面的电荷分布与天然氯毒素中的基本相同。
102.如权利要求1至101中任一项所述的化合物，其中一个或多个甲硫氨酸氨基酸残基被选自异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、甘胺酸、丙氨酸、或其组合的氨基酸残基替代。
103.如权利要求1至102中任一项所述的化合物，其中该化合物能够穿越血脑屏障。
104.如权利要求1至103中任一项所述的化合物，进一步包括附接到A上的治疗剂。
105.如权利要求104所述的化合物，其中该治疗剂是细胞毒性剂。
106.一种组合物，包含如权利要求1至105中任一项所述的化合物以及药学上可接受的载体。
107.如权利要求106所述的组合物，其中该组合物被配制成用于胃肠外给药。
108.如权利要求106至107中任一项所述的组合物，其中该组合物被配制成用于静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药或其组合。
109.如权利要求106至108中任一项所述的组合物，其中该药学上可接受的载体包括渗压剂。
110.如权利要求109所述的组合物，其中该渗压剂包括糖、糖醇或其组合。
111.如权利要求110所述的组合物，其中该糖醇选自山梨糖醇、肌醇、甘露醇、木糖醇以及丙三醇或其组合。
112.如权利要求110至111中任一项所述的组合物，其中该糖醇包括甘露醇。
113.如权利要求111至112中任一项所述的组合物，包含从2％至20％(wt/vol％)的甘露醇。
114.如权利要求111至112中任一项所述的组合物，包含从2％至10％(wt/vol％)的甘露醇。
115.如权利要求111至112中任一项所述的组合物，基本上包含5％(wt/vol％)的甘露醇。
116.如权利要求110所述的组合物，其中该糖选自海藻糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖、果糖、右旋糖或其组合。
117.如权利要求110所述的组合物，其中该糖选自海藻糖、蔗糖或其组合。
118.如权利要求116至117中任一项所述的组合物，包含从1％至40％(wt/vol％)的海藻糖、蔗糖、或海藻糖和蔗糖的组合。
119.如权利要求116至117中任一项所述的组合物，包含从1％至20％(wt/vol％)的海藻糖、蔗糖、或海藻糖和蔗糖的组合。
120.如权利要求116至117中任一项所述的组合物，包含2％(wt/vol％)的海藻糖、蔗糖、或海藻糖和蔗糖的组合。
121.如权利要求96所述的组合物，其中该渗压剂选自甘氨酸、肉毒碱、乙醇胺、它们的磷酸化物、单糖、或其组合。
122.如权利要求106至121中任一项所述的组合物，其中该组合物是等渗的。
123.如权利要求106至121中任一项所述的组合物，其中该组合物基本上是等渗的。
124.如权利要求106至123中任一项所述的组合物，其中该组合物的离子强度小于50mM。
125.如权利要求106至123中任一项所述的组合物，其中该组合物的离子强度小于10mM。
126.如权利要求106至125中任一项所述的组合物，其中该药学上可接受的载体包括缓冲剂。
127.如权利要求126所述的组合物，其中该缓冲剂选自tris、HEPES、组氨酸、乙二胺或其组合。
128.如权利要求126所述的组合物，其中该缓冲剂选自tris、组氨酸或其组合。
129.如权利要求126所述的组合物，其中该缓冲剂包括组氨酸。
130.如权利要求129所述的组合物，其中该组氨酸是L-组氨酸。
131.如权利要求129至130中任一项所述的组合物，包含至少100mM组氨酸。
132.如权利要求129至130中任一项所述的组合物，包含至少50mM组氨酸。
133.如权利要求129至130中任一项所述的组合物，包含至少20mM组氨酸。
134.如权利要求129至130中任一项所述的组合物，包含10mM至100mM组氨酸。
135.如权利要求129至130中任一项所述的组合物，包含10mM至20mM组氨酸。
136.如权利要求106至135中任一项所述的组合物，其中该药学上可接受的载体包括抗氧化剂、自由基清除剂、淬灭剂、抗氧化剂协同剂或其组合。
137.如权利要求136所述的组合物，其中该抗氧化剂选自甲硫氨酸、丁羟甲苯、丁羟茴醚、没食子酸丙酯或其组合。
138.如权利要求137所述的组合物，其中该抗氧化剂包括甲硫氨酸。
139.如权利要求138所述的组合物，其中该甲硫氨酸是L-甲硫氨酸。
140.如权利要求137至139中任一项所述的组合物，包含至少20mM甲硫氨酸。
141.如权利要求137至139中任一项所述的组合物，包含至少10mM甲硫氨酸。
142.如权利要求106至141中任一项所述的组合物，其中该药学上可接受的载体包括表面活性剂。
143.如权利要求142所述的组合物，其中该表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80、普朗尼克、聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯、聚乙烯单月桂酸酯、N-乙酰葡萄糖苷或其组合。
144.如权利要求142所述的组合物，其中该表面活性剂是聚山梨酯20。
145.如权利要求143至144中任一项所述的组合物，包含从0.0001％至0.1％(wt/vol％)的聚山梨酯20。
146.如权利要求106至145中任一项所述的组合物，其中该药学上可接受的载体包括环糊精。
147.如权利要求146所述的组合物，其中该环糊精是(2-羟丙基)-β-环糊精。
148.如权利要求106至147中任一项所述的组合物，其中该药学上可接受的载体包括重构稳定剂。
149.如权利要求148所述的组合物，其中该重构稳定剂包括水溶性聚合物。
150.如权利要求149所述的组合物，其中该水溶性聚合物选自泊洛沙姆、多元醇、聚乙二醇、聚乙烯醇、羟乙基淀粉、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮聚(丙烯酸)或其组合。
151.如权利要求106至150中任一项所述的组合物，进一步包括金属螯合剂。
152.如权利要求151所述的组合物，其中该金属螯合剂选自EDTA、甲磺酸去铁胺、EGTA、富马酸、以及苹果酸，其盐，或其组合。
153.如权利要求151至152中任一项所述的组合物，其中该金属螯合剂包括EDTA或其盐。
154.如权利要求153至154中任一项所述的组合物，具有约0.0001mg/ml至约0.01mg/ml的EDTA浓度。
155.如权利要求106至154中任一项所述的组合物，具有从6至7.5的pH。
156.如权利要求106至154中任一项所述的组合物，具有从6.5至7.0的pH。
157.如权利要求106至155中任一项所述的组合物，其中该化合物的浓度为从1mg/mL至40mg/mL。
158.如权利要求106至155中任一项所述的组合物，其中该化合物的浓度为从1mg/mL至20mg/mL。
159.如权利要求106至155中任一项所述的组合物，其中该化合物的浓度为从4mg/mL至10mg/mL。
160.如权利要求106至155中任一项所述的组合物，其中该化合物的浓度为从5mg/mL至8mg/mL。
161.如权利要求106至155中任一项所述的组合物，其中该化合物的浓度为从5mg/mL至6mg/mL。
162.如权利要求106至161中任一项所述的组合物，其中该药学上可接受的载体包括tris、D-甘露醇、以及基本上6.8的pH。
163.如权利要求106至161中任一项所述的组合物，其中该药学上可接受的载体基本上由tris、D-甘露醇、以及6.8的pH组成。
164.如权利要求106至161中任一项所述的组合物，其中该药学上可接受的载体包括L-组氨酸、D-甘露醇、L-甲硫氨酸、以及基本上6.8的pH。
165.如权利要求106至161中任一项所述的组合物，其中该药学上可接受的载体基本上由L-组氨酸、D-甘露醇、L-甲硫氨酸、以及6.8的pH组成。
166.如权利要求106至161中任一项所述的组合物，其中该药学上可接受的载体包括L-组氨酸、D-甘露醇、聚山梨酯20、以及基本上6.8的pH。
167.如权利要求106至161中任一项所述的组合物，其中该药学上可接受的载体包括L-组氨酸、D-甘露醇、以及基本上6.8的pH。
168.如权利要求106至161中任一项所述的组合物，其中该药学上可接受的载体包括L-组氨酸、D-甘露醇、聚山梨酯20、海藻糖、以及基本上6.8的pH。
169.如权利要求106至168中任一项所述的组合物，其中该组合物是冻干的。
170.一种产生如权利要求169所述的组合物的方法，该方法包括：
提供该组合物；并且
冻干该组合物，从而生产该冻干组合物。
171.如权利要求106至170中任一项所述的组合物，其中该组合物从冻干形式重构。
172.一种产生如权利要求171所述的组合物的方法，该方法包括：
提供如权利要求169所述的冻干组合物；并且
用溶液重构该组合物，以生产重构组合物。
173.如权利要求171所述的组合物，其中该溶液包括水。
174.一种组合物，包含缀合至荧光染料以及组氨酸上的多肽。
175.如权利要求174所述的组合物，其中该组氨酸是L-组氨酸。
176.如权利要求174至175中任一项所述的组合物，包含至少50mM组氨酸。
177.如权利要求174至175中任一项所述的组合物，包含至少20mM组氨酸。
178.如权利要求174至175中任一项所述的组合物，包含10mM至100mM组氨酸。
179.如权利要求174至175中任一项所述的组合物，包含10mM至20mM组氨酸。
180.如权利要求174至179中任一项所述的组合物，其中缀合至荧光染料的该多肽是如权利要求1至105中任一项所述的化合物。
181.一种试剂盒，包括：
被构造成包含流体的容器；
包含在该容器中的如权利要求106至180中任一项所述的组合物；以及
附着于该容器的弹性封堵物。
182.如权利要求181所述的试剂盒，进一步包括遮光物。
183.如权利要求182所述的试剂盒，其中该遮光物是物理屏障，该物理屏障被构造成为该组合物阻挡至少部分入射到该容器上的光。
184.如权利要求183所述的试剂盒，其中该物理屏障包括不透明或半透明的材料。
185.如权利要求181至184中任一项所述的试剂盒，其中该容器是玻璃小瓶。
186.如权利要求185所述的试剂盒，其中该玻璃小瓶包括透明玻璃或琥珀玻璃。
187.如权利要求181至186中任一项所述的试剂盒，其中该玻璃小瓶是未处理的玻璃容纳器。
188.如权利要求185至187中任一项所述的试剂盒，其中该玻璃小瓶包括USPI型、II型、III型、或IV型玻璃。
189.如权利要求181至188中任一项所述的试剂盒，其中该容器的内部进一步包括二氧化硅(SiO2)涂层或硅酮涂层。
190.如权利要求187至189中任一项所述的试剂盒，其中该未处理的玻璃容纳器选自安瓿瓶、小瓶、即用型注射器、或圆柱状管。
191.如权利要求181至190中任一项所述的试剂盒，其中该弹性封堵物是卤代丁基橡胶塞。
192.如权利要求191所述的试剂盒，其中该卤代丁基橡胶塞选自氯丁基橡胶塞或溴丁基橡胶塞。
193.如权利要求181至192中任一项所述的试剂盒，其中用弗泰克、B2或其组合涂覆该弹性封堵物。
194.如权利要求181至193中任一项所述的试剂盒，进一步包括围绕该容器的不透明的次级包装。
195.如权利要求194所述的试剂盒，其中该不透明的次级包装包括不透明的盒、不透明的铝箔小袋或其组合。
196.如权利要求194至195中任一项所述的试剂盒，其中该不透明的次级包装被构造成为组合物阻挡至少90％入射到包装外部上的光。
197.如权利要求194至195中任一项所述的试剂盒，其中该不透明的次级包装被构造成为组合物阻挡至少95％入射到包装外部上的光。
198.如权利要求194至195中任一项所述的试剂盒，其中该不透明的次级包装被构造成为组合物阻挡至少99％入射到包装外部上的光。
199.如权利要求194至195中任一项所述的试剂盒，其中该不透明的次级包装被构造成为组合物阻挡至少99.9％入射到包装外部上的光。
200.如权利要求181至199中任一项所述的试剂盒，其中该容器包括与该组合物接触的减氧环境。
201.如权利要求181至200中任一项所述的试剂盒，其中该容器包括与该组合物接触的惰性气体。
202.如权利要求200至201中任一项所述的试剂盒，其中该组合物用惰性气体进行喷淋，从而在该容器中产生减氧环境。
203.如权利要求201至202中任一项所述的试剂盒，其中该惰性气体包括氮气或氩气。
204.一种包括化合物的组合物，该化合物包括与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段，其中当将该组合物按从1mg至30mg的剂量经静脉内给予人类受试者时，该组合物在该人类受试者中产生至少从110ng/mL至240ng/mL平均最大化合物血浆浓度(平均C最大)/1mg剂量给予的该化合物。
205.如权利要求188所述的组合物，其中该化合物包括如权利要求1至105中任一项所述的化合物。
206.如权利要求204至205中任一项所述的组合物，其中该组合物包括如权利要求106至180中任一项所述的组合物。
207.一种向人类受试者给予组合物的方法，该方法包括：
经静脉内给予该人类受试者从1mg至30mg剂量的以下化合物，该化合物包括与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段；并且
在该人类受试者中产生至少从110ng/mL至240ng/mL平均最大化合物血浆浓度(平均C最大)/1mg剂量给予的该化合物。
208.一种检测人类受试者中癌细胞的方法，该方法包括：
经静脉内给予该人类受试者从1mg至30mg剂量的以下化合物，该化合物包括缀合至可检测标记物的、与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段；
在该人类受试者中产生至少从110ng/mL至240ng/mL平均最大化合物血浆浓度(平均C最大)/1mg剂量给予的该化合物；并且
检测该可检测标记物在该人类受试者中的存在或不存在，其中该可检测标记物的存在表明该癌细胞的存在。
209.一种诊断人类受试者中癌症的方法，该方法包括：
经静脉内给予该人类受试者从1mg至30mg剂量的以下化合物，该化合物包括缀合至可检测标记物的、与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段；
在该人类受试者中产生至少从110ng/mL至240ng/mL平均最大化合物血浆浓度(平均C最大)/1mg剂量给予的该化合物；并且
检测该可检测标记物在该人类受试者中的存在或不存在，其中该可检测标记物的存在表明癌症的诊断。
210.一种治疗人类受试者中癌症的方法，该方法包括：
经静脉内给予该人类受试者从1mg至30mg剂量的以下化合物，该化合物包括缀合至治疗剂的、与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段；
在该人类受试者中产生至少从110ng/mL至240ng/mL平均最大化合物血浆浓度(平均C最大)/1mg剂量给予的该化合物；并且
减少或改善该人类受试者中与癌症相关的症状或病症。
211.如权利要求210所述的方法，其中该人类受试者对其有需要。
212.如权利要求210至211中任一项所述的方法，包括向该人类受试者给予治疗有效剂量的该化合物。
213.一种向人类受试者给予组合物的方法，该方法包括：
经静脉内给予该人类受试者从1mg至30mg剂量的以下化合物，该化合物包括与MCMPCFTTDHQMARRCDDCCGGRGRGKCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的多肽或其片段；并且
在该人类受试者中产生图27的药物代谢动力学曲线。
214.一种向人类受试者给予组合物的方法，该方法包括：
经静脉内给予该人类受试者从1mg至30mg剂量的如权利要求1至105中任一项所述的化合物；并且
在该人类受试者中产生至少从110ng/mL至240ng/mL平均最大化合物血浆浓度(平均C最大)/1mg剂量给予的该化合物。
215.如权利要求207至214中任一项所述的方法，其中达到该平均C最大的平均时间(平均T最大)是在给予该化合物之后5±4分钟。
216.如权利要求207至215中任一项所述的方法，其中该平均化合物血浆浓度达到该平均C最大的75％(平均C75)的平均时间(平均T75)是在给予该化合物之后8±5分钟。
217.如权利要求207至216中任一项所述的方法，其中该平均化合物血浆浓度达到该平均C最大的50％(平均C50)的平均时间(平均T50)是在给予该化合物之后20±8分钟。
218.如权利要求207至217中任一项所述的方法，其中该平均化合物血浆浓度达到该平均C最大的25％(平均C25)的平均时间(平均T25)是在给予该化合物之后30±12分钟。
219.如权利要求207至218中任一项所述的方法，进一步包括在该人类受试者中产生从50hr*ng/mL至120hr*ng/mL平均氯毒素多肽血浆曲线下面积(平均AUC)/1mg剂量给予的氯毒素多肽。
220.如权利要求219所述的方法，进一步包括在该人类受试者中产生从60hr*ng/mL至110hr*ng/mL平均氯毒素多肽血浆曲线下面积(平均AUC)/1mg剂量给予的氯毒素多肽。
221.如权利要求220所述的方法，其中75％的该平均AUC在给予该化合物之后40±15分钟内出现。
222.如权利要求220至221中任一项所述的方法，其中50％的该平均AUC在给予该化合物之后21±8分钟内出现。
223.如权利要求220至222中任一项所述的方法，其中25％的该平均AUC在给予该化合物之后9±5分钟内出现。
224.如权利要求207至223中任一项所述的方法，其中该化合物包括如权利要求1至105中任一项所述的化合物。
225.如权利要求207至223中任一项所述的方法，其中该组合物包括如权利要求106至180中任一项所述的组合物。
226.一种用于检测受试者中癌细胞的方法，该方法包括：
给予该受试者如权利要求1至105中任一项所述的化合物；并且
检测该化合物在该受试者中的存在或不存在，其中该化合物的存在表明癌细胞的存在。
227.如权利要求226所述的方法，进一步包括将该化合物作为如权利要求106至180中任一项所述的组合物的一部分进行给予。
228.如权利要求207以及227中任一项所述的方法，其中该癌症选自神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、脉络丛癌、室管膜瘤、脑肿瘤、成神经细胞瘤、腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、头颈部癌、肺癌、乳腺癌、肠癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤因氏肉瘤、上皮癌、黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、淋巴瘤、甲状腺癌、肛门癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、生殖细胞瘤、喉癌、多发性骨髓瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、胃癌、睾丸癌、以及肾母细胞瘤。
229.如权利要求207以及227中任一项所述的方法，其中该癌症选自神经胶质瘤、髓母细胞瘤、肉瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、或肠癌。
230.如权利要求207至229中任一项所述的方法，其中该癌细胞表达天然氯毒素结合位点。
231.如权利要求207至230中任一项所述的方法，包括利用荧光成像来检测该化合物。
232.如权利要求207至230中任一项所述的方法，进一步包括使表达天然氯毒素结合位点的癌症病灶与非瘤组织区分。
233.如权利要求207至232中任一项所述的方法，进一步包括从该受试者中手术移除检测到的癌细胞。
234.如权利要求207至233中任一项所述的方法，进一步包括在从该受试者中手术移除癌细胞之前、在从该受试者中手术移除癌细胞过程中、在从该受试者中移除癌细胞之后或其组合确定该癌细胞在该受试者中的位置。
235.如权利要求207至234中任一项所述的方法，其中该化合物结合至该癌细胞。
236.如权利要求207至235中任一项所述的方法，其中该受试者是人类受试者。
237.如权利要求208至236中任一项所述的方法，其中该检测在体内或离体进行。
238.一种向受试者给予如权利要求1至105中任一项所述的化合物的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的该化合物。
239.如权利要求207至238中任一项所述的方法，其中该受试者对其有需要。
240.如权利要求238至239中任一项所述的方法，其中治疗有效量是足够在该受试者中检测癌细胞的剂量。
241.如权利要求207至240中任一项所述的方法，其中该剂量为从0.1mg至100mg。
242.如权利要求207至240中任一项所述的方法，其中该剂量为从1mg至30mg。
243.如权利要求207至240中任一项所述的方法，其中该剂量为从3mg至30mg。
244.一种治疗对其有需要的受试者的方法，该方法包括按足以治疗该受试者的癌症的量向该受试者给予如权利要求104至105中任一项所述的组合物。
245.如权利要求244所述的方法，其中该癌症选自神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、脉络丛癌、室管膜瘤、脑肿瘤、成神经细胞瘤、头颈部癌、肺癌、乳腺癌、肠癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤因氏肉瘤、上皮癌、黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、淋巴瘤、甲状腺癌、肛门癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、生殖细胞瘤、喉癌、多发性骨髓瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、胃癌、睾丸癌、以及肾母细胞瘤。
246.如权利要求244所述的方法，其中该癌细胞选自神经胶质瘤、髓母细胞瘤、肉瘤、前列腺癌、或肠癌。
247.如权利要求207至246中任一项所述的方法，其中该癌细胞表达天然氯毒素结合位点。
248.如权利要求247所述的方法，其中该结合是选择性的。
249.如权利要求207至248中任一项所述的方法，其中将该化合物胃肠外给予。
250.如权利要求226至249中任一项所述的方法，其中将该化合物静脉内给予。
251.如权利要求226至249中任一项所述的方法，其中将该化合物皮下给予。
252.一种检测个体中的软组织肉瘤的方法，该方法包括以下步骤：
a)向该个体给予氯毒素缀合物，其中该氯毒素缀合物结合至该软组织肉瘤；并且
b)对该结合的氯毒素缀合物进行成像、可视化、或分析。
253.如权利要求252所述的方法，其中该检测包括体内或离体检测。
254.如权利要求252所述的方法，其中该成像、可视化、或分析包括对该氯毒素缀合物进行光学可视化。
255.如权利要求252所述的方法，其中该成像、可视化、或分析包括体内或离体成像、可视化、或分析。
256.如权利要求255所述的方法，其中该成像、可视化、或分析包括对该肉瘤进行光学成像。
257.如权利要求252所述的方法，其中该氯毒素缀合物包括一个或多个标记试剂。
258.如权利要求257所述的方法，其中该标记试剂包括荧光部分。
259.如权利要求258所述的方法，其中该荧光部分包括近红外荧光部分。
260.如权利要求257所述的方法，其中该标记试剂包括放射性核素。
261.如权利要求252所述的方法，其中该软组织肉瘤在皮下脂肪组织中。
262.如权利要求252所述的方法，其中在手术或切除过程中或与其相关情况下进行该检测。
263.一种检测并且移除个体中的软组织肉瘤的方法，该方法包括以下步骤：
a)向该个体给予氯毒素缀合物，其中该氯毒素缀合物结合至鳞状细胞癌或皮肤细胞癌；并且
b)对该结合的氯毒素缀合物进行成像、可视化、或分析；并且
c)移除与该氯毒素缀合物结合的组织。
264.一种检测个体中的皮肤鳞状细胞癌的方法，该方法包括以下步骤：
a)向该个体给予氯毒素缀合物，其中该氯毒素缀合物结合至该皮肤鳞状细胞癌；并且
b)对该结合的氯毒素缀合物进行成像、可视化、或分析。
265.如权利要求264所述的方法，其中该检测包括体内或离体检测。
266.如权利要求264所述的方法，其中该成像、可视化、或分析包括对该氯毒素缀合物进行光学可视化。
267.如权利要求266所述的方法，其中该成像、可视化、或分析包括体内或离体成像、可视化、或分析。
268.如权利要求267所述的方法，其中该成像、可视化、或分析包括对该皮肤鳞状细胞癌进行光学成像。
269.如权利要求264所述的方法，其中该氯毒素缀合物包括一个或多个标记试剂。
270.如权利要求269所述的方法，其中该标记试剂包括荧光部分。
271.如权利要求270所述的方法，其中该荧光部分包括近红外荧光部分。
272.如权利要求269所述的方法，其中该标记试剂包括放射性核素。
273.一种检测并且移除个体中的皮肤鳞状细胞癌的方法，该方法包括以下步骤：
a)向该个体给予氯毒素缀合物，其中该氯毒素缀合物结合至该皮肤鳞状细胞癌；并且
b)对该结合的氯毒素缀合物进行成像、可视化、或分析；并且
c)移除与该氯毒素缀合物结合的组织。
274.如权利要求273所述的方法，其中在手术过程中或与其相关情况下移除该皮肤鳞状细胞癌或其部分。
275.一种检测个体中的低度肿瘤的方法，该方法包括以下步骤：
a)向该个体给予氯毒素缀合物，其中该氯毒素缀合物结合至该低度肿瘤；并且
b)对该结合的氯毒素缀合物进行成像、可视化、或分析。
276.如权利要求275所述的方法，其中该检测包括体内或离体检测。
277.如权利要求275所述的方法，其中该成像、可视化、或分析包括对该氯毒素缀合物进行光学可视化。
278.如权利要求277所述的方法，其中该成像、可视化、或分析包括体内或离体成像、可视化、或分析。
279.如权利要求278所述的方法，其中该成像、可视化、或分析包括对该低度肿瘤进行光学成像。
280.如权利要求275所述的方法，其中该氯毒素缀合物包括一个或多个标记试剂。
281.如权利要求280所述的方法，其中该标记试剂包括荧光部分。
282.如权利要求281所述的方法，其中该荧光部分包括近红外荧光部分。
283.如权利要求280所述的方法，其中该标记试剂包括放射性核素。
284.如权利要求275所述的方法，其中在手术或切除过程中或与其相关情况下进行该检测。
285.一种检测并且移除个体中的低度肿瘤的方法，该方法包括以下步骤：
a)向该个体给予氯毒素缀合物，其中该氯毒素缀合物结合至该低度肿瘤；并且
b)对该结合的氯毒素缀合物进行成像、可视化、或分析；并且
移除与该氯毒素缀合物结合的组织。
286.如权利要求275所述的方法，其中该低度肿瘤选自下组，该组由以下各项组成：
a)脑组织中的或来自脑组织的低度肿瘤；
b)皮下脂肪组织中的或来自皮下脂肪组织的低度肿瘤；以及
c)乳房或乳腺组织中的或来自乳房或乳腺组织的低度肿瘤。
287.一种检测个体中的肿瘤的方法，该方法包括以下步骤：
a)向该个体给予氯毒素缀合物，其中该氯毒素缀合物结合至该肿瘤，并且其中以约3mg至约6mg之间的量给予该氯毒素缀合物；并且
b)对该结合的氯毒素缀合物进行成像、可视化、或分析。
288.如权利要求287所述的方法，其中该检测包括体内或离体检测。
289.如权利要求288所述的方法，其中该成像、可视化、或分析包括对该氯毒素缀合物进行光学可视化。
290.如权利要求289所述的方法，其中该成像、可视化、或分析包括体内或离体成像、可视化、或分析。
291.如权利要求289所述的方法，其中该成像、可视化、或分析包括对该肿瘤进行光学成像。
292.如权利要求287所述的方法，其中该氯毒素缀合物包括一个或多个标记试剂。
293.如权利要求292所述的方法，其中该标记试剂包括荧光部分。
294.如权利要求293所述的方法，其中该荧光部分包括近红外荧光部分。
295.如权利要求292所述的方法，其中该标记试剂包括放射性核素。
296.如权利要求287所述的方法，其中在手术或切除过程中或与其相关情况下进行该检测。
297.如权利要求296所述的方法，其中在手术过程中或与其相关情况下移除该肿瘤或其部分。
298.一种检测并且移除个体中的肿瘤的方法，该方法包括以下步骤：
a)向该个体给予氯毒素缀合物，其中该氯毒素缀合物结合至该肿瘤，并且其中以约0.9mg/m2至约1.1mg/m2之间的量给予该氯毒素缀合物；
b)对该结合的氯毒素缀合物进行成像、可视化、或分析；并且
c)移除与该氯毒素缀合物结合的组织。
299.一种检测并且移除个体中的肿瘤的方法，该方法包括以下步骤：
a)向该个体给予氯毒素缀合物，其中该氯毒素缀合物结合至该肿瘤，并且其中以约3mg至约6mg之间的量给予该氯毒素缀合物；
b)对该结合的氯毒素缀合物进行成像、可视化、或分析；并且
c)移除与该氯毒素缀合物结合的组织。
300.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该氯毒素缀合物包括氯毒素以及可检测标记物。
301.如权利要求300所述的方法，其中该氯毒素包含与MCMPCFTTDHQMARXCDDCCGGXGRGXCYGPQCLCR的序列具有至少85％序列一致性的序列，其中X选自K、A以及R。
302.如权利要求300或301所述的方法，其中该可检测标记物包括荧光部分。
303.如权利要求302所述的方法，其中该荧光部分包括近红外荧光部分。
304.如权利要求300所述的方法，其中该可检测标记物包括放射性核素。
305.如权利要求300所述的方法，其中该可检测标记物包括近红外染料。
306.如权利要求300所述的方法，其中该可检测标记物包括菁染料。
307.如权利要求305所述的肽，其中该近红外染料选自下组，该组由以下各项组成：Cy5.5、DyLight750、吲哚菁绿(ICG)以及IRdye800。
308.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该检测包括体内或离体检测。
309.如权利要求252至308中任一项所述的方法，其中对该结合的氯毒素缀合物的成像、可视化、或分析在样品上进行。
310.如权利要求252至309中任一项所述的方法，其中该成像、可视化、或分析包括对该氯毒素缀合物进行光学可视化。
311.如权利要求252至310中任一项所述的方法，其中该成像、可视化、或分析包括对该肿瘤进行光学成像。
312.如权利要求311所述的方法，其中该肿瘤是肉瘤。
313.如权利要求312所述的方法，其中该肉瘤是软组织肉瘤。
314.如权利要求252至313中任一项所述的方法，其中该氯毒素缀合物包括一个或多个标记试剂。
315.如权利要求313所述的方法，其中该软组织肉瘤在皮下脂肪组织中。
316.如权利要求252至315中任一项所述的方法，其中在手术或切除过程中或与其相关情况下进行该检测。
317.如权利要求252至316中任一项所述的方法，其中能以约90％敏感性以及约90％特异性将该肿瘤与相邻的或未涉及的组织区分开。
318.如权利要求252至317中任一项所述的方法，其中能以至少94％敏感性以及约100％特异性将该肿瘤与相邻的或未涉及的组织区分开。
319.如权利要求317或318所述的方法，其中该肿瘤是肉瘤。
320.如权利要求319所述的方法，其中该肉瘤是软组织肉瘤。
321.如权利要求252至320中任一项所述的方法，其中该肿瘤选自下组，该组由以下各项组成：
a)脑组织中的或来自脑组织的肿瘤；
b)皮下脂肪组织中的或来自皮下脂肪组织的肿瘤；以及
c)乳房或乳腺组织中的或来自乳房或乳腺组织的肿瘤。
322.如权利要求321所述的方法，其中a)、b)或c)的肿瘤是低度肿瘤。
323.如权利要求252至322中任一项所述的方法，其中该氯毒素缀合物包括氯毒素以及可检测标记物。
324.如权利要求323所述的方法，其中该氯毒素包含与MCMPCFTTDHQMARXCDDCCGGXGRGXCYGPQCLCR的序列具有至少85％序列一致性的序列，其中X选自K、A以及R。
325.如权利要求323所述的方法，其中该可检测标记物包括荧光部分。
326.如权利要求325所述的方法，其中该荧光部分包括近红外荧光部分。
327.如权利要求323所述的方法，其中该可检测标记物包括放射性核素。
328.如权利要求323所述的方法，其中该可检测标记物包括近红外染料。
329.如权利要求323所述的方法，其中该可检测标记物包括菁染料。
330.如权利要求328所述的肽，其中该近红外染料选自下组，该组由以下各项组成：Cy5.5、DyLight750、吲哚菁绿(ICG)以及IRdye800。
331.如权利要求252至330中任一项所述的方法，其中该检测包括体内或离体检测。
332.如权利要求252至331中任一项所述的方法，其中对该结合的氯毒素缀合物的成像、可视化、或分析在样品上进行。
333.如权利要求252至332中任一项所述的方法，其中该成像、可视化、或分析包括对该氯毒素缀合物进行光学可视化。
334.如权利要求252至333中任一项所述的方法，其中该氯毒素缀合物包括一个或多个标记试剂。
335.如权利要求252至334中任一项所述的方法，其中在手术或切除过程中或与其相关情况下进行该检测。
336.一种检测个体中的软组织肉瘤的方法，该方法包括：
a)向该个体给予氯毒素缀合物，其中该氯毒素缀合物包含可检测试剂以及与MCMPCFTTDHQMARXCDDCCGGXGRGXCYGPQCLCR具有至少85％序列一致性的氯毒素多肽；
b)将该氯毒素缀合物结合至该软组织肉瘤；并且
c)检测该结合的氯毒素缀合物，其中结合的氯毒素缀合物的水平升高表明软组织肉瘤的存在。
337.如权利要求252所述的方法，其中给予该氯毒素缀合物预防该肿瘤的扩散或转移。
338.如权利要求253所述的方法，其中该氯毒素缀合物包括化学治疗剂、抗癌剂、或抗癌药。
339.如权利要求252所述的方法，其中给予该氯毒素缀合物连同地检测中央或原发性肿瘤。
340.如权利要求256所述的方法，其中给予该氯毒素缀合物预防该肿瘤的扩散或转移。
341.如权利要求257所述的方法，其中该氯毒素缀合物包括化学治疗剂、抗癌剂、或抗癌药。
342.如权利要求256所述的方法，其中给予该氯毒素缀合物连同地检测中央或原发性肿瘤。
343.如权利要求261所述的方法，其中给予该氯毒素缀合物预防该肿瘤的扩散或转移。
344.如权利要求261所述的方法，其中该氯毒素缀合物包括化学治疗剂、抗癌剂、或抗癌药。
345.如权利要求261所述的方法，其中给予该氯毒素缀合物连同地检测中央或原发性肿瘤。
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