CN105806979A - 狗咬胶中赭曲霉毒素a的液相色谱-串联质谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种狗咬胶中赭曲霉毒素A的液相色谱‑串联质谱检测方法，本发明能够准确测定狗咬胶中赭曲霉毒素A的含量。在狗咬胶样品中加入乙腈水溶液超声萃取得到待检液，待检液经HLB固相萃取柱净化，使用C18反相柱分离；目标分析物在多反应监测(MRM)模式下以保留时间和离子对信息比较进行定性分析，外标法定量，本方法分析速度快、灵敏度高、重现性和准确度好，为检测狗咬胶中赭曲霉毒素A提供了检测方法。

Description

狗咬胶中赭曲霉毒素A的液相色谱-串联质谱检测方法

技术领域

本发明属于狗咬胶检测领域，涉及固相萃取-液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)，具体是指一种狗咬胶中赭曲霉毒素A的液相色谱-串联质谱检测方法。

背景技术

赭曲霉毒素(Ochratoxin，OT)是由曲霉和青霉属产毒菌株的次级代谢产物，包含7种结构类似化合物。赭曲霉毒素一般污染谷类、大豆类，其中赭曲霉毒素A(OchratoxinA，OTA)毒性最大、产毒量最高、对农作物的污染最重、分布最广。OTA毒理学研究表明，OTA具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性，以及致畸、致癌和致突变作用等多种毒性。

温州作为全球重要狗咬胶加工基地，为了提高出口狗咬胶安全的质量，防止这类毒素的存在造成的严重后果，突破国外技术性贸易壁垒的限制，因此对狗咬胶中赭曲霉毒素A残留检测具有重要意义。因此，建立准确、可靠地测定狗咬胶中赭曲霉毒素A的含量非常重要。

目前针对赭曲霉毒素的检测对象主要集中在食品方面。食品中赭曲霉毒素残留检测方法主要集中在高效液相色谱法和酶联免疫吸附法等检测方法。还未见狗咬胶中赭曲霉毒素A的含量检测报道。

目前，常规的分析方法可分为定性分析、定量分析和定性定量分析技术。定量分析一般采用色谱技术和色谱质谱联用技术，色谱技术有气相色谱和液相色谱等方法，色谱质谱联用技术有液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联用等方法；定性定量分析则要兼具两种技术为一体，检测结果要同时提供目标物的结构信息和数量信息，根据欧盟委员会非强制执行法案2002/657/EC的规定，对化合物进行确证检测的方法必须能提供结构方面的信息，且要达到该法案规定的4个确证点。

本研究采用乙腈水溶液超声提取样品，固相萃取柱净化及液相色谱－串联质谱法测定，建立了测定狗咬胶中赭曲霉毒素A的分析方法，方法灵敏度高，适用性强，定性定量准确。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种狗咬胶中赭曲霉毒素A的液相色谱-串联质谱检测方法。该方法结合固相萃取-液相色谱-串联质谱法，能够对狗咬胶中赭曲霉毒素A的含量进行检测，该方法具有准确、快速、灵敏度高的优点，为狗咬胶中赭曲霉毒素A的快速检测提供了可靠的检测方法支持。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种狗咬胶中赭曲霉毒素A的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（一）待测样品的制备：称取4.9-5.1g混合均匀的狗咬胶，加入提取溶剂，经超声萃取后，离心过滤后加纯水定容得到待检液；

（二）待检液的净化：将固定相萃取柱进行预处理，将步骤（一）制备的待检液上固定相萃取柱，经水和甲醇/水溶液淋洗除去杂质，再用洗脱溶剂洗脱固定相萃取柱上的赭曲霉毒素A得到洗脱液，将洗脱液浓缩富集后，用甲醇溶剂稀释并经0.22μm微孔滤膜过滤后得到待测样品溶液；

（三）待测样品溶液的检测：配制赭曲霉毒素A溶液阶梯浓度的基质校准工作溶液，该基质标准工作溶液的浓度为0.1ng/mL,0.5ng/mL,1.0ng/mL,2.0ng/mL,5.0ng/mL，将步骤（二）中的待测样品溶液和基质校准工作溶液在液相色谱-串联质谱仪上分别进样，获得以基质校准工作溶液中赭曲霉毒素A的浓度为横坐标，再以基质校准工作溶液中赭曲霉毒素A的峰面积为纵坐标的工作曲线，还有获得可以确定母离子的赭曲霉毒素A的一级质谱图，确定母离子后，采用子离子扫描获得二级质谱图，然后从二级质谱图中选取定量离子和定性离子，然后用基质校准工作溶液曲线对定量离子进行定量计算获得待测样品溶液中赭曲霉毒素A的浓度。

进一步的，所述步骤（一）中的提取溶剂为乙腈水溶液。

进一步的，所述步骤（二）中的固定相萃取柱为WatersOasisHLBSPE柱，并通过甲醇、水对SPE柱进行活化处理。

进一步的，所述步骤（二）中的淋洗溶剂为体积比为1/2的甲醇/水混合溶液，洗脱溶剂为甲醇。

进一步的，所述的步骤（三）中液相色谱-串联质谱仪的检测参数为：

色谱柱：AgilentZORAAXEclipsePlusC₁₈反相柱；

流速：0.25mL/min；

流动相：A为0.1%甲酸的水溶液；A为乙腈；

进样量：10μL；

色谱柱温度：30oC；

电喷雾离子源：正离子扫描，电压为4500V；

离子源温度：450oC；

雾化气压力：50psi；

辅助气流速：40psi；

气帘气压力：20psi；

碰撞气压力：20psi。

采用上述方案，本发明具有以下有益效果：首先，本发明通过加入提取溶剂对样品进行超声萃取，提取步骤简单易行；

其次，本发明还对待检液进行净化处理，该净化处理包括纯化和富集的过程。第一步纯化：先将待检液通过固相萃取小柱，依次经过经水和甲醇/水溶液淋洗、甲醇洗脱；第二步富集：将第一步中纯化的待检液氮气浓缩近干，然后加入甲醇溶液溶解、经0.22μm微孔滤膜过滤，得到净化的待检液。该净化后的待检液则不会对检测仪器造成污染。本发明中固相萃取的SPE柱为WatersOasisHLBSPE柱，由于赭曲霉毒素A和萃取溶液中其他杂质的极性大小存在差异，在固相萃取柱上吸附产生保留差异，然后通过优选的淋洗条件和洗脱条件，达到净化富集赭曲霉毒素A的目的。

再次，本发明对于狗咬胶中的赭曲霉毒素A成分的定性定量检测分析是通过液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)分析。先配置一组阶梯形的基质校准工作溶液，然后将基质校准工作溶液和待检液在液相色谱-串联质谱仪上分别进样。待检液中出现的色谱峰保留时间与标准工作溶液一致，允许偏差小于±2.5%，该色谱峰所对应的质谱定性离子的相对丰度与浓度相当的基质校准工作溶液的相对丰度一致，而且相对丰度偏差不超过规定，则可确定该待检液中含有赭曲霉毒素A。

下面结合附图对本发明作进一步描述。

附图说明

图1为本发明具体实施例中的赭曲霉毒素A结构图；

图2为本发明具体实施例中赭曲霉毒素A标准溶液(1.0ng/mL)MRM色谱图；

图3为本发明具体实施例中赭曲霉毒素A扫描二级质谱图；

图4为本发明具体实施例中基质校准工作溶液曲线。

具体实施方式

本发明的具体实施例如图1-4所示是咬胶中赭曲霉毒素A的液相色谱-串联质谱检测方法，本发明不局限于上述具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。具体实施例如下所示：

实施例1

包括以下步骤：

（一）待测样品的制备：称取5.0g混合均匀的狗咬胶，加入20mL乙腈/水(1/1,v/v)溶液提取，漩涡振荡2min，超声提取30分钟，提取温度为30℃,于4000r?min^-1离心5min，过滤并用纯水定容到50mL容量瓶中，到待检液；

（二）待检液的净化：将固定相萃取柱进行预处理，将步骤（一）制备的待检液上固定相萃取柱，经水和甲醇/水溶液(1/2,v/v)淋洗除去杂质，再用洗脱溶剂甲醇洗脱固定相萃取柱上的赭曲霉毒素A得到洗脱液，将洗脱液浓缩富集后，用1mL甲醇溶剂稀释并经0.22μm微孔滤膜过滤后得到待测样品溶液；

（三）基质标准溶液的配置：准确称取赭曲霉毒素A标准品，用甲醇配制成质量浓度为400mg/L的单标储备液。使用时，用甲醇稀释上述标准储备液，配制成100ngmL^-1的标准工作溶液。基质校准工作溶液制备：分别称取4.9-5.1g空白狗咬胶样品6份，按照步骤（一）和步骤（二）方法进行样品处理，将洗脱液浓缩富集后得到空白基质溶液约1mL。依次加入5,25,50,100,250μL的100ngmL^-1的标准工作溶液，再用甲醇稀释至5mL，即得浓度分别为0.1,0.5,1.0,2.0,5.0ng/mL的基质校准工作溶液。

（四）待测样品溶液的检测：将步骤（二）中的待测样品溶液和步骤（三）中的基质标准工作溶液在液相色谱-串联质谱仪上分别进样，获得以基质标准溶液中赭曲霉毒素A的浓度为横坐标，再以基质标准溶液中赭曲霉毒素A的峰面积为纵坐标的工作曲线，结果表明，赭曲霉毒素A在0.1-5.0ng/mL范围内具有良好的线性关系，R²≥0.99，以10倍信噪比(S/N)为方法定量限即LOQ，经样品添加试验确定赭曲霉毒素A的定量限为0.1ng/g。还有获得可以确定母离子的赭曲霉毒素A的一级质谱图，确定母离子后，采用子离子扫描获得二级质谱图，然后从二级质谱图中选取定量离子和定性离子，然后用基质校准工作溶液曲线对定量离子进行定量计算获得待测样品溶液中赭曲霉毒素A的浓度。

参见表1，其为赭曲霉毒素A的LC-MS/MS检测条件

表1赭曲霉毒素A的LC-MS/MS检测条件

^*MS/MS定量离子对

参见表2，其为赭曲霉毒素A的线性方程、相关系数、定量限

表2赭曲霉毒素A的线性方程、相关系数、定量限

参见表3，其为空白样品中赭曲霉毒素A添加回收率、精密度(n=6)

表3空白样品中赭曲霉毒素A添加回收率、精密度(n=6)

Claims (5)

1.一种狗咬胶中赭曲霉毒素A的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（一）待测样品的制备：称取4.9-5.1g混合均匀的狗咬胶，加入提取溶剂，经超声萃取后，离心过滤后加纯水定容得到待检液；

（二）待检液的净化：将固定相萃取柱进行预处理，将步骤（一）制备的待检液上固定相萃取柱，经水和甲醇/水溶液淋洗除去杂质，再用洗脱溶剂洗脱固定相萃取柱上的赭曲霉毒素A得到洗脱液，将洗脱液浓缩富集后，用甲醇溶剂稀释并经0.22μm微孔滤膜过滤后得到待测样品溶液；

（三）待测样品溶液的检测：配制赭曲霉毒素A溶液阶梯浓度的基质校准工作溶液，该基质标准工作溶液的浓度为0.1ng/mL,0.5ng/mL,1.0ng/mL,2.0ng/mL,5.0ng/mL，将步骤（二）中的待测样品溶液和基质校准工作溶液在液相色谱-串联质谱仪上分别进样，获得以基质校准工作溶液中赭曲霉毒素A的浓度为横坐标，再以基质校准工作溶液中赭曲霉毒素A的峰面积为纵坐标的工作曲线，还有获得可以确定母离子的赭曲霉毒素A的一级质谱图，确定母离子后，采用子离子扫描获得二级质谱图，然后从二级质谱图中选取定量离子和定性离子，然后用基质校准工作溶液曲线对定量离子进行定量计算获得待测样品溶液中赭曲霉毒素A的浓度。

2.根据权利要求1所述的一种狗咬胶中赭曲霉毒素A的液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于：所述步骤（一）中的提取溶剂为乙腈水溶液。

3.根据权利要求1所述的一种狗咬胶中赭曲霉毒素A的液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于：所述步骤（二）中的固定相萃取柱为WatersOasisHLBSPE柱，并通过甲醇、水对SPE柱进行活化处理。

4.根据权利要求1所述的一种狗咬胶中赭曲霉毒素A的液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于：所述步骤（二）中的淋洗溶剂为体积比为1/2的甲醇/水混合溶液，洗脱溶剂为甲醇。

5.根据权利要求1所述的一种狗咬胶中赭曲霉毒素A的液相色谱-串联质谱检测方法，其特征在于：所述的步骤（三）中液相色谱-串联质谱仪的检测参数为：

色谱柱：AgilentZORAAXEclipsePlusC₁₈反相柱；

流速：0.25mL/min；

流动相：A为0.1%甲酸的水溶液；A为乙腈；

进样量：10μL；

色谱柱温度：30oC；

电喷雾离子源：正离子扫描，电压为4500V；

离子源温度：450oC；

雾化气压力：50psi；

辅助气流速：40psi；

气帘气压力：20psi；

碰撞气压力：20psi。