CN105794801A

CN105794801A - 精油组合物对霉变菌的抑菌用途

Info

Publication number: CN105794801A
Application number: CN201610172937.6A
Authority: CN
Inventors: 白懋嘉; 刘布鸣
Original assignee: Nanning Wanjiahui Spice Co Ltd
Current assignee: Nanning Wanjiahui Spice Co Ltd
Priority date: 2016-03-24
Filing date: 2016-03-24
Publication date: 2016-07-27

Abstract

本发明涉及一种精油组合物对霉变菌的抑菌用途，该精油组合物为天然植物精油重整复配得到的组合物，主要成分含有柠檬烯、1,8‑桉叶素、对伞花烃和松油醇等，本发明选取霉变菌中的轮枝镰刀菌，黄曲霉，桔青霉，枯草芽孢杆菌，酵母菌和副干酪乳杆菌6种菌，进行精油组合物的抑菌活性试验，结果表明，在一定的浓度范围精油组合物对6种菌表现出较好的抑菌效果。对6种菌表现出明显抑制效果时的浓度范围为0.075μL/mL‑0.240μL/mL，而丙酸的浓度范围是0.045μL/mL‑0.263μL/mL，本发明精油组合物的有效浓度范围处于丙酸范围之内，对霉变菌的抗菌具有很好的应用潜力。

Description

精油组合物对霉变菌的抑菌用途

技术领域

本发明属于精油的应用领域，涉及精油组合物对霉变菌的抑菌用途，尤其涉及精油组合物在粮食、饲料和食品防霉变方面的用途，还涉及精油组合物在图书档案、博物馆藏纺织物、植物标本和医院药品防霉变方面的用途。

背景技术

霉变中含有多种霉菌，如轮枝镰刀菌SF-D22（Fusarium verticillioides ），黄曲霉HQM-1（Aspergillus flavus），桔青霉JQM-2-2（Penicillium citrinum），枯草芽孢杆菌Itb57（Bacillus subtilis），酵母菌JMJ-1-2（Saccharomyces cerevisiae），副干酪乳杆菌RSJ-C1 (Lactobacillus paracasei)，它们能利用粮食谷物、饲料、食品中的营养进行生长繁殖，降低和破坏原有的营养价值，影响人体、动物健康，干扰人和动物免疫系统。因此，粮食谷物、饲料、食品中常常添加化学杀菌剂作为防霉剂，在一定时期内防止霉变，保证食用的健康安全，如市售常用的化学防霉剂，其主要有效成分丙酸及其盐类对各种霉菌、需氧芽孢杆菌、革兰氏阳性杆菌均有较强的抑制作用，能对引起粮食谷物、饲料、食品发粘的枯草杆菌效果尤为显著，对防止黄曲霉素的产生有特效。然而化学类杀菌剂会对人体和环境造成一定的危害，加之病原菌对化学杀菌剂抗性不断增强，其防霉菌效果大大降低。

精油是存在于植物体内的一类可随水蒸气蒸馏、且具有一定气味的挥发油状液体的总称，其杀菌活性具有一定的普遍性。由于植物精油的化学组成复杂多样，其杀菌活性是通过各成分共同起作用，协同作用靶标菌群不易产生抗性，且具有天然、低毒、高效、易降解和对环境污染小的特点，植物精油具有对人畜安全、对环境有好等优点，而且研发成本相对较低，因此，研究并利用植物精油及天然产物作为化学杀菌剂替代化学药品来防治霉变中的菌群，逐渐成为国内外研究热点。如我们检索以下文献报道：

中国专利，申请号：201410761495.X；申请人：广西科技大学；发明名称：广林九号桉叶精油作为抑菌药物的应用；摘要：本发明公开了广林九号桉叶精油作为抑菌药物的应用。本发明开拓性的提供了一种广林九号桉叶精油的应用方法。

中国专利，申请号：03121122.4，申请人：李汉文；发明名称：药效芳香植物精油防霉抑菌系列产品及其生产方法；摘要：一种药效芳香植物精油防霉抑菌系列产品，由中药防霉抑菌制剂、芳香植物制剂及固态载体混合模压而成。本发明所提供的药效芳香植物精油芳香防霉抑菌系列产品，采用纯天然中草药制剂，资源丰富、对人体无毒副作用，且制造工艺简单，成本低。

中国专利，申请号：90109835.3；申请人：中国科学院科华高技术公司武汉联合公司；发明名称：一种天然防霉剂制备方法；摘要：一种天然防霉剂制备方法，利用中国特有的植物资源，用水蒸气蒸馏法，从植物的鲜叶中提取精油，配上乙醇，丙二醇或甘油。其特点是防霉效力高，抑菌、灭菌力强，用量极少，防霉时间长，安全无毒。特别适合于烟草、医药品、食品、水果蔬菜、粮棉仓库、日用化工品和图书档案等领域。

中国专利，申请号：201510277060.2；申请人：闭炳春；发明名称：一种含肉桂油的储粮驱虫防霉剂；摘要：本发明属于粮食储藏领域，具体涉及一种含肉桂油的储粮驱虫防霉剂，是由以下重量份数的原料制成的：肉桂油 10～15 份；大蒜精油 6～10份；丁香精油 3～5 份；柠檬草精油 0.5～2 份；花椒挥发油 1～3 份；八角茴香油 2～5 份；乙醇50～65份。本发明含肉桂油的储粮驱虫防霉剂是以天然植物精油为原料制备而成的，安全、环保、无污染而且所用的单种原料或组合物都有其独特的杀菌抑菌作用，单种原料或组合物都对储粮粮仓里常出现的害虫有明显的熏杀和触杀作用。

中国专利，申请号：201110025147.2；申请人：广东工业大学；发明名称：一种熏杀粮食黄曲霉的植物精油组合物；摘要：本发明公开了一种熏杀粮食黄曲霉的植物精油组合物，该组合物含肉桂醛、柠檬醛、百里香酚和水杨醛的植物或植物精油，或采用人工合成的等同物配制植物精油组合物，四种组分在组合物中的重量份数分别为：肉桂醛 5～20、柠檬醛15～35、百里香酚 35～60、水杨醛 10～35 ；该组合物取材天然、安全、无毒；挥发性的精油成分容易扩散；挥发性精油的气相熏杀使得其不用直接与粮食接触，而只需放在仓库或密闭容器的一角，就能起到对粮食的高效杀霉作用。

【题名】植物精油对档案窃蠹幼虫的毒力测定【作者】周理坤；唐欢；范文奇；王春；【机构】重庆中国三峡博物馆【刊名】香料香精化妆品2015(4):17-19【文摘】档案窃蠹（Falsogastrallus sauteri Pic.）是危害档案、文物、图书害虫种群中的优势虫种之一,分布广,危害重。化学农药虽可有效地控制其危害,但由于长期单一使用致使害虫抗药性增强,防治效果降低,而且对环境污染严重,对人体健康威胁极大。因此,为防止化学农药造成的公害,各国都在努力研制新型杀虫剂或寻找杀虫剂的替代物。植物精油即是可选的替代物之一,为探索它对档案窃蠹幼虫的熏杀效果,采用密闭熏蒸方法，测定了6种植物精油对档案窃蠹幼虫的熏杀活性。结果表明,供试植物精油之间对同一害虫的毒力存在着较大差异,其中冬青油、艾蒿油、桉叶油对该种害虫具有很高的熏杀毒力。

发明人也一直以来致力于天然植物精油的研究，于2013年6月6号申请了发明名称为“一种用于抗菌杀虫的精油组合物及其制备方法”的专利，该精油组合物具有抗炎、抑菌等药理作用，对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和白色念珠菌 6 种能引起皮肤感染的病原菌均有不同程度的抑菌作用。具体内容为：发明名称：一种用于抗菌杀虫的精油组合物及其制备方法；发明专利号：ZL 201310223275.7；摘要：本发明公开了一种以 4- 松油醇型的茶树油和巨尾桉精油为原料，采用精馏、复配加工制成精油组合物，提供了一种精油组合物的配方、制法和组成含量，用于抗菌、杀虫剂。采用气相色谱法测定主要含量，方法准确、稳定、操作简单，能适应工业生产的需要，可有效地控制精油组合物的质量。本发明精油组合物毒性小，对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和白色念珠菌 6 种能引起皮肤感染的病原菌均有不同程度的抑菌作用，具有抑菌、杀虫等活性作用，制备方法合理、稳定、生产周期短，适合工业化生产，具有良好的应用前景。该植物精油组合物经气相色谱检验其主要成份为：柠檬烯重量含量 15～25%；1,8-桉叶素重量含量7～20% ；对伞花烃重量含量 7～15%；4- 松油醇重量含量 25～35% ；α-松油醇重量含量5～15%。

发明内容

本发明的目的是利用南宁万家辉香料有限公司提供的精油组合物（精油组合物的成分和含量与发明专利号：ZL 201310223275.7相同）对霉变菌中的轮枝镰刀菌SF-D22（Fusarium verticillioides ），黄曲霉HQM-1（Aspergillus flavus），桔青霉JQM-2-2（Penicillium citrinum），枯草芽孢杆菌Itb57（Bacillus subtilis），酵母菌JMJ-1-2（Saccharomyces cerevisiae），副干酪乳杆菌RSJ-C1 (Lactobacillus paracasei) 抑菌的用途，得出霉变菌中6种主要菌群的总体抑制效果优于丙酸，说明作为一种新型防霉剂具有较好的潜力，极具开发价值的结论。

本发明的精油组合物（精油组合物的成分和含量与发明专利号：ZL201310223275.7相同）由南宁万家辉香料有限公司（地址：中国广西壮族自治区南宁市良庆区南晓镇老虎湾，网址：http://www.manylike99.com/）提供，与发明专利号：“ZL201310223275.7用于抗菌杀虫的精油组合物”为相同的精油组合物，是利用4- 松油醇型茶树油和巨尾桉精油为原料，采用精馏、复配加工制成的无色透明液体，具特有的精油芳香气味，用气相色谱法测定含有以下重量含量的化学成分：柠檬烯重量含量 15～25%；1,8-桉叶素重量含量 7～20%；对伞花烃重量含量 7～15%；4- 松油醇重量含量 25～35%；α-松油醇重量含量5～15%。

本发明人在发现植物精油组合物具有抗菌的作用以后，又对其进行抗霉菌的试验，本发明6种作为霉变菌中主要菌类的代表菌群：轮枝镰刀菌SF-D22（Fusariumverticillioides ），黄曲霉HQM-1（Aspergillus flavus），桔青霉JQM-2-2（Penicilliumcitrinum），枯草芽孢杆菌Itb57（Bacillus subtilis），酵母菌JMJ-1-2（Saccharomycescerevisiae），副干酪乳杆菌RSJ-C1 (Lactobacillus paracasei)，然后选用液体丙酸，与具有挥发性的精油组合物进行对比试验。

本发明抑菌试验是采用精油组合物，分别对轮枝镰刀菌SF-D22（Fusariumverticillioides ），黄曲霉HQM-1（Aspergillusflavus），桔青霉JQM-2-2（Penicilliumcitrinum），枯草芽孢杆菌Itb57（Bacillussubtilis），酵母菌JMJ-1-2（Saccharomyces cerevisiae），副干酪乳杆菌RSJ-C1 (Lactobacillusparacasei) 进行抑菌实验，菌种均由西南大学植物生态病理所提供。

本发明抑菌圈试验判定标准：抑菌圈直径大于20 mm为极度敏感；15～20 mm为高度敏感；10～15 mm为中度敏感；7～9 mm为低度敏感；小于7 mm为不敏感。

以下是具体技术方案：

1. 精油组合物对轮枝镰刀菌抑菌作用的研究

实验方法

将融化好的PDA培养基均匀倒入无菌培养皿中，每皿10 mL，冷却，倒置于35℃恒温培养箱中24h，备用。取活化培养的轮枝镰刀菌平板，用直径6mm的打孔器打取菌饼，将菌饼菌丝面朝下放置于PDA平板中央，每皿1块。按照待测样品液体体积所占培养皿空间体积比设置每个样品浓度梯度为，精油组合物：0μL/mL（即空白对照）、0.04 μL/mL、0.08μL/mL、0.10 μL/mL、0.12 μL/mL、0.16 μL/mL、0.20 μL/mL和0.24 μL/mL（所对应药剂绝对量分别是：0μL，3.6μL，7.2μL， 9μL，10.8μL，14.4μL，18μL，21.6μL。培养皿容积：100mL）。丙酸：0μL/mL、0.015μL/mL、0.03 μL/mL、0.045 μL/mL、0.06 μL/mL、0.075 μL/mL、0.09 μL/mL和0.10μL/mL（所对应药剂绝对量分别是：0μL，1.35μL，2.7μL， 4.05μL，5.4μL，6.75μL，8.1μL，9μL。培养皿容积：100mL）。每处理3次重复。用移液枪取相应适量待测药剂溶液，滴加到以上培养皿的皿盖内表面正中央，将培养皿倒置，并立即用封口膜将整个培养皿密封，放入28℃培养箱中培养5天后观察，并用十字交叉法测量菌落直径。

2、精油组合物对黄曲霉抑菌作用的研究

实验方法

将融化好的PDA培养基均匀倒入无菌培养皿中，每皿20 mL，冷却，倒置于35℃恒温培养箱中24h，备用。取活化培养的黄曲霉平板，加入少量无菌水，轻轻将孢子洗脱，并将孢子悬浮液转入50mL的无菌锥形瓶，加入2滴吐温20，使孢子在水溶液中均匀分散，用无菌水将孢子悬浮液浓度调节为10⁵-10⁷个孢子/mL。用孢子喷雾器将孢子悬浮液均匀喷在平板上。用直径6mm的打孔器，在喷洒了孢子悬浮液的平板中央打孔，每皿1孔。按照待试药剂液体有效成分绝对量，以丙酮为稀释剂，设置每个样品浓度梯度为：精油组合物：0μL/mL,、240μL/mL、360μL/mL、480μL/mL、600μL/mL、720μL/mL、960μL/mL、1680μL/mL和1920μL/mL（所对应药剂绝对量分别是：0μL，4.8μL，7.2μL， 9.6μL，12μL，14.4μL，19.2μL，33.6μL和38.4μL。培养皿容积：100mL，培养基：20 mL）。丙酸：0μL/mL、240μL/mL、360μL/mL、480μL/mL、600μL/mL、720μL/mL、900μL/mL、1050μL/mL和1200μL/mL（所对应药剂绝对量分别是：0μL，4.8μL，7.2μL，9.6μL，12μL，14.4μL，18μL，21μL和24μL。培养皿容积：100mL，培养基：20 mL）。用移液枪取适量配制好的试剂溶液（1000μL/mL及以下，每一浓度取20μL；1000μL/mL以上，按每一浓度对1000μL/mL的倍数，再乘以20，取量），滴加到平板中央的孔里面，并立即用封口膜将整个培养皿密封，放入28 ℃培养箱中培养4天后观察，并用十字交叉法测量抑菌圈直径。

3、精油组合物对桔青霉抑菌作用的研究

实验方法

将融化好的PDA培养基均匀倒入无菌培养皿中，每皿20 mL，冷却，倒置于35℃恒温培养箱中24h，备用。取活化培养的桔青霉平板，加入少量无菌水，轻轻将孢子洗脱，并将孢子悬浮液转入50mL的无菌锥形瓶，加入2滴吐温20，使孢子在水溶液中均匀分散，用无菌水将孢子悬浮液浓度调节为105-107个孢子/mL。含菌平板的制备方法同黄曲霉。按照待试药剂液体有效成分绝对量，以丙酮为稀释剂，设置每个样品浓度梯度为：精油组合物：0μL/mL、240μL/mL、480μL/mL、600μL/mL、720μL/mL、840μL/mL和960μL/mL（所对应药剂绝对量分别是：0μL，4.8μL，9.6μL，12μL，14.4μL，16.8μL 和19.2μL。培养皿容积：100mL，培养基：20 mL）。丙酸：0μL/mL、150μL/mL、450μL/mL、750μL/mL、900μL/mL、1050μL/mL和1200μL/mL（所对应药剂绝对量分别是：0μL，3μL，9μL，15μL，18μL，21μL 和24μL。培养皿容积：100mL，培养基：20mL）。用移液枪取适量配制好的试剂溶液，滴加到平板中央的孔里面，并立即用封口膜将整个培养皿密封，放入28 ℃培养箱中培养5天后观察，并用十字交叉法测量抑菌圈直径。

4、精油组合物对枯草芽孢杆菌抑菌作用的研究

实验方法

将融化好的NA培养基均匀倒入无菌培养皿中，每皿20 mL，冷却，倒置于35℃恒温培养箱中24h，备用。取活化培养的Itb57平板，加入少量无菌水，轻轻将菌体洗脱，制得菌悬液，并将其转入50mL的无菌锥形瓶，加入2滴吐温20，使菌体在水溶液中均匀分散，用无菌水将菌悬液浓度调节为10⁵-10⁷个cfu/mL。含菌平板制备方法同黄曲霉，但喷的是菌悬液。按照待试药剂液体有效成分绝对量，以丙酮为稀释剂，设置每个样品浓度梯度为：精油组合物：0μL/mL、200μL/mL、400μL/mL、600μL/mL、700μL/mL、800μL/mL、900μL/mL和1000μL/mL（所对应药剂绝对量分别是：0μL，4μL，8μL，12μL，14μL，16μL 、18μL和20μL。培养皿容积：100mL，培养基：20 mL）。丙酸：0μL/mL、50μL/mL、150μL/mL、250μL/mL、350μL/mL、450μL/mL、550μL/mL和650μL/mL（所对应药剂绝对量分别是：0μL，1μL，3μL，5μL，7μL，9μL 、11μL和13μL。培养皿容积：100mL，培养基：20 mL）。用移液枪取适量配制好的试剂溶液，滴加到平板中央的孔里面，并立即用封口膜将整个培养皿密封，放入30℃培养箱中培养2天后观察，并用十字交叉法测量抑菌圈直径。

5、精油组合物对酵母菌抑菌作用的研究

实验方法

将融化好的YPD培养基均匀倒入无菌培养皿中，每皿20 mL，冷却，倒置于35℃恒温培养箱中24h，备用。取适量干酵母粉，加入少量无菌水，加入2滴吐温20，使酵母粉在水溶液中均匀分散，用无菌水将酵母溶液浓度调节为10⁵-10⁷个cfu/mL。取100μL菌悬液均匀涂抹平板，待平板晾干后，用直径6mm的打孔器，在涂抹了菌悬液的平板中央打孔，每皿1孔。按照待试药剂液体有效成分绝对量，以丙酮为稀释剂，设置每个样品浓度梯度为：精油组合物：0μL/mL（即空白对照）、50μL/mL、150μL/mL、300μL/mL、450μL/mL、600μL/mL、750μL/mL和900μL/mL（所对应药剂绝对量分别是：0μL，1μL，3μL，6μL，9μL，12μL 、15μL和18μL。培养皿容积：100mL，培养基：20 mL）。丙酸：0μL/mL、300μL/mL、600μL/mL、750μL/mL、900μL/mL、1200μL/mL、1350μL/mL和1500μL/mL（所对应药剂绝对量分别是：0μL，6μL，12μL，15μL，18μL，24μL 、27μL和30μL。培养皿容积：100mL，培养基：20 mL）。用移液枪取适量配制好的试剂溶液，滴加到平板中央的孔里面，并立即用封口膜将整个培养皿密封，放入30℃培养箱中培养2天后观察，并用十字交叉法测量抑菌圈直径。

6. 精油组合物对副干酪乳杆菌抑菌作用的研究

实验方法

将融化好的MRS培养基均匀倒入无菌培养皿中，每皿20 mL，冷却，倒置于35℃恒温培养箱中24h，备用。取适量分离自活性乳酸菌饮品的副干酪乳杆菌，加入2滴吐温20，使活性副干酪乳杆菌在水溶液中均匀分散，用无菌水将溶液浓度调节为10⁵-10⁷个cfu/mL。含菌平板制备方法同黄曲霉，但用菌悬液喷雾。按照待试药剂液体有效成分绝对量，以丙酮为稀释剂，设置每个样品浓度梯度：精油组合物：0μL/mL（即空白对照）、240μL/mL、480μL/mL、960μL/mL、1680μL/mL、1920μL/mL、2160μL/mL和2400μL/mL（所对应药剂绝对量分别是：0μL，4.8μL，9.6μL，19.2μL，33.6μL，38.4μL 、43.2μL和48μL。培养皿容积：100mL，培养基：20 mL）。丙酸：0μL/mL、750μL/mL、1050μL/mL、1200μL/mL、1350μL/mL、1500μL/mL、1650μL/mL和1800μL/mL（所对应药剂绝对量分别是：0μL，15μL，21μL，24μL，27μL，30μL 、33μL和36μL。培养皿容积：100mL，培养基：20 mL）。用移液枪取适量配制好的试剂溶液，滴加到平板中央的孔里面，并立即用封口膜将整个培养皿密封，放入37℃培养箱中培养2天后观察，并用十字交叉法测量抑菌圈直径。

上述选取镰刀菌，黄曲霉，桔青霉，芽孢杆菌，酵母菌及乳酸菌这6种菌，作为霉变中主要菌类的代表菌群，用精油组合物对6种霉菌进行抑菌作用的试验，并选用液体丙酸与具有挥发性的精油组合物同时进行对比试验。

本发明中，随着药剂浓度的增大，轮枝镰刀菌SF-D22在PDA平板上的菌落平均直径逐渐减少。从0.08μL/mL浓度开始，精油组合物已经表现出明显的抑菌效果，在0.10μL/mL浓度下，精油组合物处理后的菌落平均直径，接近对照处理菌落平均直径的一半，其抑菌率达49.3%，接近50%，可见此浓度下抑菌效果已较好。

本发明中，随着药剂浓度的增大，抑菌圈呈现一定梯度逐渐增大。从浓度480μL/mL开始，黄曲霉就对精油组合物表现出很高的敏感性，在此浓度下，精油组合物处理下产生的抑菌圈大，说明精油组合物对黄曲霉的抑制效果较好。从黄曲霉的菌落形态可看出，精油组合物不但可以使黄曲霉菌落产生一定抑菌圈，还在一定程度上影响黄曲霉的生长状态，菌落整体呈现黄色或黄绿色，高浓度下呈现白色状态，孢子保持未成熟阶段。

本发明中，从浓度240μL/mL开始，桔青霉就对精油组合物表现出极大的敏感性，且抑菌圈的平均直径大小在接近30mm及以上，表现出精油组合物对桔青霉的很好的抑制效果。

本发明中，从浓度400μL/mL开始，ITB57就对精油组合物表现出了高度的敏感性，但从浓度600μL/mL到1000μL/mL下，抑菌圈平均直径大小保持在30mm上下，增加幅度较小。从枯草芽孢杆菌的菌落形态可看出，精油组合物处理下的ITB57的菌落颜色，比丙酸处理下的菌落颜色要浅淡，说明精油组合物对ITB57生长状态有一定程度的影响。

本发明中，在浓度150μL/mL及其以下浓度时，酵母菌对精油组合物敏感度较低，或不敏感，从浓度300μL/mL开始，酵母菌对精油组合物表现出高度的敏感。且随着浓度的梯度增加，精油组合物处理下的抑菌圈的平均直径也逐渐增大。可见，随着精油组合物有效浓度的增大，其对酵母菌的抑制效果也逐渐增强。

本发明中，在精油组合物处理下，从浓度960μL/mL开始，副干酪乳杆菌对精油组合物表现出中度及其以上的敏感性，且从浓度1680μL/mL开始，抑菌圈的平均直径大小就保持在22mm上下，说明达到一定浓度后，随着浓度的增加，抑菌圈的大小缓慢增长，趋于稳定。在相当浓度下，丙酸处理下产生的抑菌圈大小，比精油组合物处理下的大，但精油组合物处理下的抑菌圈比丙酸处理下的抑菌圈更清晰整洁，说明总体效果而言，精油组合物对副干酪乳杆菌的抑制效果较好。

以上所述的精油组合物在粮食（如稻谷、小麦、玉米、马铃薯、红薯、小米等）、饲料（猪饲料、鸡饲料、鸭饲料、鱼饲料、牛饲料等）、食品（面包、馒头、月饼、蛋糕、饼干等）防霉变方面的用途。

以上所述的精油组合物在图书档案（还包括各种书籍、字画、历史纸质档案等）、博物馆藏纺织物（少数民族衣服、裙子、鞋子、帽子等）、植物标本（包括阔叶树、针叶树、草本植物、藤本植物等）和医院药品防霉变方面的用途。

本发明的原理是：

本发明采用的精油组合物含有以下重量含量的化合物：柠檬烯重量含量 15～25%；1,8-桉叶素重量含量 7～20% ；对伞花烃重量含量 7～15%；4- 松油醇重量含量 25～35% ；α-松油醇重量含量5～15%。

柠檬烯，别名苎烯，单萜类化合物，分子式为C₁₀H₁₆，分子量为136.23，无色油状液体，有类似柠檬的香味。柠檬烯有3种异构体，即D-柠檬烯、L-柠檬烯和DL-柠檬烯，一般以D-柠檬烯得形式存在。由于柠檬烯具有抑菌、增香、抗癌、止咳、平喘等生理功能，已被广泛应用于食品、香料、日化、医药等行业。尤其是D-柠檬烯对很多细菌和真菌都具有较强的抗菌活性，如D-柠檬烯能有效抑制黑曲霉、枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌等食品腐败菌的生产。

1,8-桉叶素，分子量为154.25，分子式为C₁₀H₁₈O，无色油状透明液体，有樟脑气息和清凉的草药味道。1,8-桉叶素在低于MIC浓度时能破坏大肠杆菌的细胞膜。通过研究茶树油及其组分松油烯-4-醇、r-松油烯、1,8-桉叶素对小麦、大麦易感染的茄病镰刀菌、曲霉、青霉、灰霉病和根霉等真菌生长具有抑制作用，得出茶树油及其组分可作为潜在的天然杀菌剂的结论。1,8-桉叶素主要存在于桉叶油中，具有抗菌、杀虫、疏风解热、祛风解毒作用，同时对药物具有良好的透皮渗透作用。茶树油的最有效的抑菌成分均为1,8-桉叶素，而4-松油醇，α-松油醇等能够协同促进1,8-桉叶素的抑菌能力，并且茶树油在化妆品实际配方中表现出良好的配伍性和优异的实际抑菌效果。由于茶树油具有抗菌消炎、抗紫外和抗氧化作用，使其在化妆品、医药、食品行业具有广泛的应用。

对伞花烃，又名对异丙基甲苯、1-甲基-4-异丙基苯，分子式为C₁₀H₁₄，分子量为134.22，无色透明油状物，有特异香味，存在于多种精油中，本身是一种祛痰、止咳、平咳药物；用于制取对甲苯酚、丙酮，也可用作染料、医药、香料的中间体，还可作为食用香料。

α-松油醇，别称α-萜品醇，分子式为 C₁₀H₁₈O，分子量为154.25，为无色透明粘稠状液体，具有明显清香气味，是植物精油中的重要成分，具有清洁、湿润、去臭及渗透能力，因其含醇量不同可作为洗涤剂、印染剂、调香剂和消毒剂等。松油醇对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念球菌等常见的病原菌具有一定的杀灭作用。

松油烯-4-醇，分子式为C₁₀H₁₈O，分子量为154.25，无色油状液体，呈暖的胡椒香、较淡的泥土香和陈腐的木材气息。松油烯-4-醇是由天然植物香料油樟油衍生产品而得的天然萜烯醇，具有令人愉悦的肉豆蔻气味，广泛应用于调配日用、食用香精及复配玫瑰、薰衣草和天竺葵精油。松油烯-4-醇还具有强烈的杀菌、消毒及防腐作用，可用作家用、医用杀菌消毒剂，亦可做为外用药物用来治疗皮肤创伤和烧伤。

本发明由南宁万家辉香料有限公司提供的精油组合物，是利用4-松油醇型茶树油和巨尾桉精油为原料，采用精馏、复配加工制成的，该精油组合物的抑菌机理是：精油组合物以一种膜破坏剂的形式发挥作用，通过破坏膜结构，使霉菌细胞内物质泄漏，刺激细胞自溶，导致细胞形态发生变化。发明人研究还发现精油组合物还能抑制微生物呼吸途径中内线粒体酶、脱氢酶的活性，从而影响细胞呼吸作用及一些代谢物质的合成，使微生物不能正常生长繁殖。

本发明的积极效果是：

1、本发明的精油组合物充分利用了各有效成分各自具备的特性，合理组配协同作用，使其发挥综合抑菌作用，并通过实验研究，得出以下结论：精油组合物对霉变菌中的轮枝镰刀菌SF-D22（Fusarium verticillioides ），黄曲霉HQM-1（Aspergillus flavus），桔青霉JQM-2-2（Penicillium citrinum），枯草芽孢杆菌Itb57（Bacillus subtilis），酵母菌JMJ-1-2（Saccharomyces cerevisiae），副干酪乳杆菌RSJ-C1 (Lactobacillusparacasei)均有抑制作用。

2、对于供试的6种菌，精油组合物对它们的作用从开始出现明显抑制效果时，其绝对量的范围是为6.0-9.0μL，占有效空间（除去培养基占据的体积）的浓度范围为0.075μL/mL-0.24μL/mL。而丙酸对它们的作用从开始出现明显抑制效果时，其绝对量的范围是3.0-21.0μL，占有效空间的浓度范围是0.045μL/mL -0.263μL/mL。可见精油组合物的有效浓度范围更小，更集中，便于确定统一的有效抑制浓度，且考虑到贮藏运输的便捷，及丙酸的强酸性，相较而言，精油组合物对菌的抑制效果更安全，理想。

3、本发明选取镰刀菌，黄曲霉，桔青霉，芽孢杆菌，酵母菌，及乳酸菌这6种菌，作为霉变菌中主要菌类的代表菌群。选用液体丙酸，与具有挥发性的精油组合物进行对比试验，结果表明，丙酸对镰刀菌和芽孢杆菌的抑制效果优于精油组合物，但就霉变菌中6种主要菌群的总体抑制效果，精油组合物的作用更好，说明精油组合物作为一种新型防霉剂具有较好的潜力，极具开发价值。

4、本发明利用天然植物精油的挥发性，在相对理想条件下的室内抑菌试验测试，获得的较为理想的抑菌效果，因此还可以根据植物精油的挥发性及较好的安全性进行更为广泛的抑菌领域研究，如粮食、饲料、食品、图书档案、博物馆藏纺织物、植物标本和医院药品等防霉变方面的用途，再详细一点则如稻谷、小麦、猪饲料、鸡饲料、面包、馒头、明、各种书籍、字画、历史纸质档案等馆藏文物、少数民族衣服、裙子、鞋子、阔叶树、针叶树、草本植物、藤本植物和医院药品等的防霉处理等。

附图说明

图1精油组合物对轮枝镰刀菌SF-D22的抑菌效果；

图2丙酸对轮枝镰刀菌SF-D22的抑菌效果；

图3精油组合物对黄曲霉的抑菌效果；

图4丙酸对黄曲霉的抑菌效果；

图5精油组合物对桔青霉的抑菌效果；

图6精油组合物对桔青霉的抑菌效果；

图7精油组合物对枯草芽孢杆菌Itb57的抑菌效果；

图8精油组合物对枯草芽孢杆菌Itb57的抑菌效果；

图9精油组合物对酵母菌的抑菌效果；

图10精油组合物对酵母菌的抑菌效果；

图11精油组合物对副干酪乳杆菌的抑菌效果；

图12精油组合物对副干酪乳杆菌的抑菌效果。

具体实施方式

为了更好的验证精油组合物对霉变菌中的轮枝镰刀菌SF-D22（Fusariumverticillioides ），黄曲霉HQM-1（Aspergillus flavus），桔青霉JQM-2-2（Penicilliumcitrinum），枯草芽孢杆菌Itb57（Bacillus subtilis），酵母菌JMJ-1-2（Saccharomycescerevisiae），副干酪乳杆菌RSJ-C1 (Lactobacillus paracasei)均有抑制作用，并与丙酸进行对照，发明人得到了精油组合物抑菌的数据。

本实验中，精油组合物由南宁万家辉香料有限公司提供，经气相色谱法测定含有以下重量含量的化学成分：柠檬烯重量含量 15～25%；1,8-桉叶素重量含量 7～20% ；对伞花烃重量含量 7～15%；4- 松油醇重量含量 25～35% ；α-松油醇重量含量5～15%。本实验中，轮枝镰刀菌SF-D22（Fusariumverticillioides ），黄曲霉HQM-1（Aspergillusflavus），桔青霉JQM-2-2（Penicilliumcitrinum），枯草芽孢杆菌Itb57（Bacillussubtilis），酵母菌JMJ-1-2（Saccharomyces cerevisiae），副干酪乳杆菌RSJ-C1(Lactobacillusparacasei)，均有西南大学植物生态病理所提供。

本实验抑菌圈试验判定标准：抑菌圈直径大于20 mm为极度敏感；15～20 mm为高度敏感；10～15 mm为中度敏感；7～9 mm为低度敏感；小于7 mm为不敏感。

1. 精油组合物对轮枝镰刀菌抑菌作用的研究

实验方法

将融化好的PDA培养基均匀倒入无菌培养皿中，每皿10 mL，冷却，倒置于35℃恒温培养箱中24h，备用。取活化培养的轮枝镰刀菌平板，用直径6mm的打孔器打取菌饼，将菌饼菌丝面朝下放置于PDA平板中央，每皿1块。按照待测样品液体体积所占培养皿空间体积比设置每个样品浓度梯度为精油组合物：0μL/mL（即空白对照）、0.04 μL/mL、0.08μL/mL、0.10 μL/mL、0.12 μL/mL、0.16 μL/mL、0.20 μL/mL和0.24 μL/mL（所对应药剂绝对量分别是：0μL，3.6μL，7.2μL， 9μL，10.8μL，14.4μL，18μL，21.6μL。培养皿容积：100mL）。丙酸：0μL/mL、0.015μL/mL、0.03 μL/mL、0.045 μL/mL、0.06 μL/mL、0.075 μL/mL、0.09 μL/mL和0.10μL/mL（所对应药剂绝对量分别是：0μL，1.35μL，2.7μL， 4.05μL，5.4μL，6.75μL，8.1μL，9μL。培养皿容积：100mL）。每处理3次重复。用移液枪取相应适量待测药剂溶液，滴加到以上培养皿的皿盖内表面正中央，将培养皿倒置，并立即用封口膜将整个培养皿密封，放入28℃培养箱中培养5天后观察，并用十字交叉法测量菌落直径。

1.2 结果与分析

从表1-1数据中可以看出，随着药剂浓度的增大，轮枝镰刀菌SF-D22在PDA平板上的菌落平均直径逐渐减少。从0.08μL/mL浓度开始，精油组合物已经表现出明显的抑菌效果，在0.10μL/mL浓度下，精油组合物处理后的菌落平均直径，接近对照处理菌落平均直径的一半，其抑菌率达49.3%，接近50%，可见此浓度下抑菌效果已较好。在丙酸处理下，从0.015μL/mL开始，就逐渐显露明显的抑菌效果，0.045μL/mL下的菌落平均直径，接近对照处理菌落平均直径的一半。由此可看出，精油组合物和丙酸在一定浓度梯度内，都对轮枝镰刀菌产生了较好的抑制效果，丙酸总体抑制效果相对较好。

由图1和图2可以看出，一定药剂浓度梯度处理下，菌落直径大小的依次变化，明显看出药剂呈现一定梯度的抑菌效果。

2. 精油组合物对黄曲霉抑菌作用的研究

2.1 实验方法

将融化好的PDA培养基均匀倒入无菌培养皿中，每皿20 mL，冷却，倒置于35℃恒温培养箱中24h，备用。取活化培养的黄曲霉平板，加入少量无菌水，轻轻将孢子洗脱，并将孢子悬浮液转入50mL的无菌锥形瓶，加入2滴吐温20，使孢子在水溶液中均匀分散，用无菌水将孢子悬浮液浓度调节为105-107个孢子/mL。用孢子喷雾器将孢子悬浮液均匀喷在平板上。用直径6mm的打孔器，在喷洒了孢子悬浮液的平板中央打孔，每皿1孔。按照待试药剂液体有效成分绝对量，以丙酮为稀释剂，设置每个样品浓度梯度为：精油组合物：0μL/mL、240μL/mL、360μL/mL、480μL/mL、600μL/mL、720μL/mL、960μL/mL、1680μL/mL和1920μL/mL（所对应药剂绝对量分别是：0μL，4.8μL，7.2μL， 9.6μL，12μL，14.4μL，19.2μL，33.6μL和38.4μL。培养皿容积：100mL，培养基：20 mL）。丙酸：0μL/mL、240μL/mL、360μL/mL、480μL/mL、600μL/mL、720μL/mL、900μL/mL、1050μL/mL和1200μL/mL（所对应药剂绝对量分别是：0μL，4.8μL，7.2μL，9.6μL，12μL，14.4μL，18μL，21μL和24μL。培养皿容积：100mL，培养基：20 mL）。用移液枪取适量配制好的试剂溶液（1000μL/mL及以下，每一浓度取20μL；1000μL/mL以上，按每一浓度对1000μL/mL的倍数，再乘以20，取量），滴加到平板中央的孔里面，并立即用封口膜将整个培养皿密封，放入28 ℃培养箱中培养4天后观察，并用十字交叉法测量抑菌圈直径。

2.2 结果与分析

从表2-1数据中可以看出，随着药剂浓度的增大，抑菌圈呈现一定梯度逐渐增大。从浓度480μL/mL开始，黄曲霉就对精油组合物和丙酸表现出很高的敏感性，在此浓度下，精油组合物处理下产生的抑菌圈比丙酸处理下的大，说明精油组合物对黄曲霉的抑制效果较好。但随着浓度的增大，精油组合物处理下产生的抑菌圈增大幅度较小，而丙酸处理下产生的抑菌圈增大幅度较大，说明随着药剂浓度的增加，丙酸的抑制效果较好。

但从图3和图4中，黄曲霉的菌落形态可看出，精油组合物不但可以使黄曲霉菌落产生一定抑菌圈，还在一定程度上影响黄曲霉的生长状态，菌落整体呈现黄色或黄绿色，高浓度下呈现白色状态，孢子保持未成熟阶段。但丙酸处理下，黄曲霉的孢子成熟，变为褐色，说明丙酸对黄曲霉的生长状态影响不大。

3.精油组合物对桔青霉抑菌作用的研究

3.1 实验方法

3.2 结果与分析

从表3-1数据中可知，从浓度240μL/mL开始，桔青霉就对精油组合物表现出极大的敏感性，且抑菌圈的平均直径大小在接近30mm及以上，表现出精油组合物对桔青霉的很好的抑制效果。而在丙酸处理下，到浓度450μL/mL时，桔青霉才对其产生极大的敏感性。且相当浓度下，其抑菌圈平均直径的大小总体小于精油组合物处理下的抑菌圈平均直径。可见，精油组合物对桔青霉的抑制效果比丙酸好。

4.精油组合物对枯草芽孢杆菌抑菌作用的研究

4.1 实验方法

4.2 结果与分析

从表4-1数据中可看出，精油组合物和丙酸对ITB57都表现出了一定的抑制作用。从浓度400μL/mL开始，ITB57就对精油组合物表现出了高度的敏感性，但从浓度600μL/mL到1000μL/mL下，抑菌圈平均直径大小保持在30mm上下，增加幅度较小。而在丙酸处理下，从浓度150μL/mL开始，ITB57就对丙酸表现出了极度敏感，且随着丙酸有效浓度的增大，抑菌圈的平均直径也逐渐增大，增加幅度也较大。可知，在一定浓度范围内，精油组合物对ITB57有较明显的抑制效果，但不及丙酸的抑制效果，且随着浓度增大，丙酸的抑制效果更加显著。

从图中可看出两种药剂的抑菌效果：精油组合物处理下的ITB57的菌落颜色，比丙酸处理下的菌落颜色要浅淡，说明精油组合物对ITB57生长状态有一定程度的影响。

5.精油组合物对酵母菌抑菌作用的研究

5.1 实验方法

5.2 结果与分析

从表5-1数据中可看出，在浓度150μL/mL及其以下浓度时，酵母菌对精油组合物敏感度较低，或不敏感，从浓度300μL/mL开始，酵母菌对精油组合物表现出高度的敏感。且随着浓度的梯度增加，精油组合物处理下的抑菌圈的平均直径也逐渐增大。可见，随着精油组合物有效浓度的增大，其对酵母菌的抑制效果也逐渐增强。而在丙酸处理下，从浓度300μL/mL开始，酵母菌才对丙酸产生中度敏感，且随着浓度的增加，丙酸处理下的抑菌圈平均直径则缓慢增大。在相同浓度下，精油组合物处理下产生的抑菌圈平均直径，比丙酸处理下的大。说明精油组合物对酵母菌的抑制效果比丙酸好。

6. 精油组合物对副干酪乳杆菌抑菌作用的研究

6.1 实验方法

将融化好的MRS培养基均匀倒入无菌培养皿中，每皿20 mL，冷却，倒置于35℃恒温培养箱中24h，备用。取适量分离自活性乳酸菌饮品的副干酪乳杆菌，加入2滴吐温20，使活性副干酪乳杆菌在水溶液中均匀分散，用无菌水将溶液浓度调节为10⁵-10⁷个cfu/mL。含菌平板制备方法同黄曲霉，但用菌悬液喷雾。按照待试药剂液体有效成分绝对量，以丙酮为稀释剂，设置每个样品浓度梯度为：精油组合物：0μL/mL（即空白对照）、240μL/mL、480μL/mL、960μL/mL、1680μL/mL、1920μL/mL、2160μL/mL和2400μL/mL（所对应药剂绝对量分别是：0μL，4.8μL，9.6μL，19.2μL，33.6μL，38.4μL 、43.2μL和48μL。培养皿容积：100mL，培养基：20 mL）。丙酸：0μL/mL、750μL/mL、1050μL/mL、1200μL/mL、1350μL/mL、1500μL/mL、1650μL/mL和1800μL/mL（所对应药剂绝对量分别是：0μL，15μL，21μL，24μL，27μL，30μL 、33μL和36μL。培养皿容积：100mL，培养基：20 mL）。用移液枪取适量配制好的试剂溶液，滴加到平板中央的孔里面，并立即用封口膜将整个培养皿密封，放入37℃培养箱中培养2天后观察，并用十字交叉法测量抑菌圈直径。

6.2 结果与分析

由表6-1数据中可看出，精油组合物和丙酸都对副干酪乳杆菌表现出了一定的抑制作用。在精油组合物处理下，从浓度960μL/mL开始，副干酪乳杆菌对精油组合物表现出中度及其以上的敏感性，且从浓度1680μL/mL开始，抑菌圈的平均直径大小就保持在22mm上下，说明达到一定浓度后，随着浓度的增加，抑菌圈的大小缓慢增长，趋于稳定。而在丙酸处理下，从浓度1200μL/mL开始，副干酪乳杆菌才对丙酸表现出高度的敏感性，随着浓度的增加，抑菌圈的平均直径也逐渐增大。在相当浓度下，丙酸处理下产生的抑菌圈大小，比精油组合物处理下的大，但精油组合物处理下的抑菌圈比丙酸处理下的抑菌圈更清晰整洁，说明总体效果而言，精油组合物对副干酪乳杆菌的抑制效果较好。

应用效果

1、精油组合物在粮食防霉变方面的效果

1.1试验方法：粮食以稻谷为例，利用太阳光自然干燥稻谷，分别将400公斤的稻谷装入两个木桶中，然后将两个装有稻谷的木桶分别入粮仓储藏，试验组为：在放置稻谷的粮仓中放入本发明的精油组合物，精油组合物用敞口玻璃容器装好，对照组为：在放置稻谷的粮仓中不放入本发明的精油组合物。

1.2试验效果：观察不放入本发明的精油组合物和放入本发明的精油组合物的两个粮仓中的稻谷的情况，结果见表7。

从上表可知，通过观察稻谷堆发热时间和稻谷堆开始发生霉变时间的变化可发现，稻谷堆发热时间和稻谷堆开始发生霉变时间明显延长，本发明的精油组合物很好的起到了防止稻谷发生霉变的作用。而且在试验过程中发现不放入本发明的精油组合物的粮仓中的稻谷堆在60天时有油麦蛾、玉米象等虫子出现，而放入本发明的精油组合物粮仓中稻谷堆在160天内未出现虫子，说明本发明的精油组合物对粮食起到很好的驱虫、杀虫以及防霉的作用。

2、精油组合物在饲料防霉变方面的效果

本发明人将常温下不加任何防腐剂的猪饲料放置15天，长出霉菌以后将其分成两组，一组在猪饲料表面用喷雾器喷上雾状的精油组合物，另一组喷雾状的自来水，使用量相同，2天后，喷上雾状的精油组合物的猪饲料霉菌消失，而喷雾状自来水的猪饲料霉菌生长数量更多。说明精油组合物能够作为添加剂防止猪饲料变质。

3、精油组合物在食品防霉变方面的效果

本发明人将常温下不加任何防腐剂的月饼和馒头放置15天，长出霉菌以后将其分成两组，一组在月饼和馒头表面用喷雾器喷上雾状的精油组合物，另一组喷雾状的自来水，使用量相同，2天后，喷上雾状的精油组合物的月饼和馒头霉菌消失，而喷雾状自来水的月饼和馒头霉菌生长数量更多。说明精油组合物能够防止食品变质。

4、精油组合物在图书档案防霉变方面的效果

本发明人将图书档案分别密闭在两个一样的玻璃容器中，其中一个玻璃容器中放入敞开瓶口的本发明所使用的精油组合物，另一个玻璃容器则什么都不放。一个月后，什么都不放的容器中的图书档案则渐渐长出了霉菌，而放入精油组合物的容器中的图书档案则不长出霉菌。说明精油组合物应用于图书档案具有防霉变的效果。

5、精油组合物在博物馆藏纺织物防霉变方面的效果

本发明人从广西博物馆借用了一双苗族90年代当时流行的鞋子进行试验，将鞋子分为两只，同时密闭在两个一样的玻璃容器中，其中一个玻璃容器中放入敞开瓶口的本发明所使用的精油组合物，另一个玻璃容器则什么都不放。一个月后，什么都不放的玻璃容器中的鞋子则渐渐长出了霉菌，而放入精油组合物的玻璃容器中的鞋子则不长出霉菌。说明精油组合物应用于博物馆藏纺织物具有防霉变方面的效果。

6、精油组合物在植物标本防霉变方面的效果

本发明人将广西壮族自治区中医药研究院保藏的植物标本-枫叶进行试验，将该植物标本平均分成两个组，分别密闭在两个一样的标本箱中，其中一个标本箱中放入敞开瓶口的本发明所使用的精油组合物，另一个标本箱则什么都不放。一个月后，什么都不放的标本箱中的植物标本则渐渐长出了霉菌，而放入精油组合物的标本箱中的植物标本则不长出霉菌。说明精油组合物应用于植物标本具有防霉变方面的效果。

7、精油组合物在医院药品防霉变方面的效果

本发明人将自主研发的治疗感冒的中药药片平均分成两组分别搁置于两个一样的陶瓷器中，再将两个陶瓷器分别密闭在两个一样的玻璃容器中，其中一个玻璃容器中放入敞开瓶口的本发明所使用的精油组合物，另一个玻璃容器则什么都不放。一个月后，什么都不放的玻璃容器中的中药药片则渐渐长出了霉菌，而放入精油组合物的容器中的中药药片则不长出霉菌。说明精油组合物应用于医院药品具有防霉变的效果。

Claims

1.精油组合物对霉变菌的抑菌用途，其特征在于：精油组合物对霉变菌中的轮枝镰刀菌SF-D22（Fusariumverticillioides ），黄曲霉HQM-1（Aspergillusflavus），桔青霉JQM-2-2（Penicilliumcitrinum），枯草芽孢杆菌Itb57（Bacillussubtilis），酵母菌JMJ-1-2（Saccharomyces cerevisiae），副干酪乳杆菌RSJ-C1 (Lactobacillusparacasei)的抑制方面的应用；

所述的精油组合物含有以下重量含量的化学成分：柠檬烯重量含量 15～25%；1,8-桉叶素重量含量7～20% ；对伞花烃重量含量 7～15%；4- 松油醇重量含量 25～35% ；α-松油醇重量含量5～15%。

2.根据权利要求1所述的精油组合物对霉变菌的抑菌用途，其特征在于：所述的精油组合物在粮食、饲料和食品防霉变方面的用途。

3.根据权利要求1所述的精油组合物对霉变菌的抑菌用途，其特征在于：所述的精油组合物在图书档案、博物馆藏纺织物、植物标本和医院药品防霉变方面的用途。