CN105777769A - 一种7-乙基-10-羟基喜树碱的衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域。本发明通过ω-3不饱和脂肪酸对7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)的10位羟基进行修饰，形成一类新的7-乙基-10-羟基喜树碱的衍生物，本发明进一步提供了该类化合物的制备方法以及在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的化合物的脂溶性较高，有利成药，该类化合物对肿瘤组织有靶向作用，抗肿瘤效果好，毒副作用低。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种新的ω-3不饱和脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱衍生物，及其制备方法，以及作为抗肿瘤药物的应用。
背景技术
喜树碱(camptothecin，CPT)，是从植物喜树和青脆枝中分离出来的一种具优异抗肿瘤活性的生物碱，其化学结构中的内酯环(E环)、吡啶酮环(D环)以及20-羟基是喜树碱发挥拓扑异构酶Ⅰ抑制作用从而达到抗肿瘤效果的必需基团(SriramD,YogeeswariP,ThirumuruganR,etal.Camptothecinanditsanalogues:areviewontheirchemotherapeuticpotential[J].Naturalproductresearch,2005,19(4):393-412.)，通过在C7、C9和C10对喜树碱进行适当修饰，往往能增强喜树碱的抗肿瘤效果，而目前在各类喜树碱衍生物中，7-乙基-10-羟基喜树碱(结构式如式1所示)，即SN-38，其活性是最高的(VaskorB,ShashaRao,BenJ.Boyd,etal.ProdrugandnanomedicineapproachesforthedeliveryofthecamptothecinanalogueSN38[J].JournalofControlledRelease,2013,62(172):48-61.)。
SN-38的活性虽然很高，但是其本身的一些化学以及药理作用特点限制了其在临床上的应用：首先，SN-38的溶解性很差，在水中几乎不溶(11–38μg/ml)，在药剂学上可接受的溶剂以及油中的溶解度也不超过0.5％(w/w)(RogerE,LagarceF,BenoitJP.DevelopmentandcharacterizationofanovellipidnanocapsuleformulationofSn38fororaladministration[J].EuropeanJournalofPharmaceuticsandBiopharmaceutics,2011,79(1):181-188.)，因此成药性差，迄今为止未开发出成功的SN-38制剂；其次，SN-38的E环内酯环结构具有可逆的pH依赖型水解作用，在酸性条件下E环能保持稳定的内酯环结构，而在碱性条件下E环会迅速开环形成羧酸盐结构(结构式如式2所示)，从而导致SN-38失去抗肿瘤活性，而人生理条件是偏碱的(pH＝7.4)，这一特性也限制了SN-38在抗肿瘤方面的应用。SN-38在酸性、碱性条件下的结构平衡(转换)如下所示：
研究者们对SN-38进行了大量的改造研究，这类研究大部分着重在提高SN-38的水溶性以及稳定SN-38的内酯环结构等(AngenaultS,ThirotS,SchmidtF,etal.Cancerchemotherapy:aSN-38(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin)glucuronideprodrugfortreatmentbyaPMT(ProdrugMonoTherapy)strategy[J].Bioorganic&medicinalchemistryletters,2003,13(5):947-950.)(OkunoS,HaradaM,YanoT,etal.Completeregressionofxenograftedhumancarcinomasbycamptothecinanalogue-carboxymethyldextranconjugate(T-0128)[J].Cancerresearch,2000,60(11):2988-2995.)(ZhangH,WangJ,MaoW,etal.NovelSN38conjugate-formingnanoparticlesasanticancerprodrug:Invitroandinvivostudies[J].JournalofControlledRelease,2013,166(2):147-158.)，这类研究取得了一定的成果，然而迄今只有伊立替康(irinotecan，CPT-11)作为SN-38的前药被批准上市。伊立替康本身基本不具有抗肿瘤活性，其进入人体后依靠主要存在于肝脏的羧酸酯酶水解为SN-38而发挥抗癌作用，但是伊立替康在体内转化成SN-38的比例非常低，有研究表明，经过90min静脉输注CPT-11，体内检测到SN-38的药时曲线下面积(AUC)只为CPT-11的2–8％，虽然口服给药后这一值有所提高，但也仅为11–15％(RowinskyEK,GrochowLB,EttingerDS,etal.PhaseIandpharmacologicalstudyofthenoveltopoisomeraseIinhibitorCPT-11administeredasaninety-minuteinfusionevery3weeks[J].Cancerresearch,1994,54(2):427-436.)(DrenglerRL,KuhnJG,SchaafLJ,etal.PhaseIandpharmacokinetictrialoforalirinotecanadministereddailyfor5daysevery3weeksinpatientswithsolidtumors[J].Journalofclinicaloncology,1999,17(2):685-685.)，另外，伊立替康有着严重的剂量依赖性毒性，如引起严重的骨髓抑制、呕吐、腹泻等。伊立替康的上述缺点严重限制了其在临床中的实际应用。所以，开发出一种能在体内有效转化并具较低副作用的SN-38前药，仍具有重大意义。
中国专利CN03818985.2公开了一种采用喜树碱衍生物与长链不饱和脂肪酸的共轭体的制备方法，公开号为CN1675219A，该专利虽然提到用长链不饱和脂肪酸修饰SN-38，但是该方法中要采用一种中间“衔接链”将SN-38与长链不饱和脂肪酸进行连接，而这种连接方式由于“衔接链”的存在，对于其合成的化合物相对于伊立替康而言是否能更加有效的转化为SN-38，该专利中并没有体现，并且由于中间“衔接链”的存在，其合成的化合物一定会在人体代谢过程中产生除长链不饱和脂肪酸与SN-38之外的其它物质，而这些“其它”物质是否对人体有害，专利中也没有进行说明，并且到目前为止也没有该合成方法合成的相关化合物用于临床研究，所以这种合成方法合成的化合物的有效性以及安全性值得商榷。
中国专利申请CN200410017128.5公开了一种羟基喜树碱及其衍生物的碳酸酯前药及其制备方法，公开号为CN1673226A，该专利中合成的化合物有提到SN-38与不饱和长链烷基采用碳酸酯的结构进行连接，尽管碳酸酯类化合物能在体内有效降解出原药，但是根据化学理论，这种结构化合物在水解时除了生成SN-38外，还会生成甲醛以及不饱和长链脂肪醇，在这些代谢化合物中，甲醛具有较高的毒性，属于致癌和致畸型物质，而不饱和长链脂肪醇的人体安全性肯定不如脂肪酸，更不如天然ω-3脂肪酸那样明确。
中国专利CN02112268.7公开了一类喜树硷衍生物及制备方法，公开号为CN1465577A，该专利采用羧酸酯或碳酸酯对喜树碱类化合物的10-OH以及20-OH同时进行修饰，其主要目的在于提高喜树碱类化合物水溶性，但是从该专利的发明内容来看，不能得出相关化合物水溶性较修饰前化合物有提高的结论。
因此，如何更有效提高SN-38衍生物的脂溶性、体内活性产物转化率，提高肿瘤靶向性，从而提高疗效，降低毒副作用，仍然是亟待需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一类脂溶性好、体内活性产物转化率高、肿瘤靶向的7-乙基-10-羟基喜树碱衍生物，本发明的另一目的是提供该类7-乙基-10-羟基喜树碱衍生物的制备方法，本发明的第三目的是提供该类7-乙基-10-羟基喜树碱衍生物在制备抗肿瘤药物中应用。
为了提高SN-38成药性、以及体内治疗效果，本发明通过大量的SN-38衍生物合成及其体内外相关性质的研究，意想不到地发现通过ω-3不饱和脂肪酸对7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)的10位羟基进行修饰，形成一类新的SN-38单ω-3不饱和脂肪酸酯化合物，这类化合物的亲脂性高，有利成药，体内活性产物转化率高，并对肿瘤组织具有明显靶向作用，从而提高了抗肿瘤效果，降低了毒副作用。
本发明的第一方面，提供了一类ω-3不饱和脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱衍生物，也即SN-38的ω-3长链不饱和脂肪酸单酯前药，其化学结构式如式(Ⅰ)、式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示：
本发明所述的ω-3不饱和脂肪酸为：α-亚麻酸(α—linolenicacid，α—LNA)、二十碳五烯酸(eicosapetaenoicacid，EPA)或二十二碳六烯酸(docosahexaeoic，DHA)。
本发明的化合物为：
式(Ⅰ)化合物：7-乙基-顺式-9,12,15-十八碳丙烯酰氧基喜树碱(LNA-SN38)；
式(Ⅱ)化合物：7-乙基-顺式-10-5,8,11,14,17-二十碳戊烯酰氧基喜树碱(EPA-SN38)；
式(Ⅲ)化合物：7-乙基-10-顺式-4,7,10,13,16,19-二十二己烯酰氧基喜树碱(DHA-SN38)。
本发明的第二方面，提供了上述的ω-3不饱和脂肪酸(PUFAs)修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱衍生物的制备方法，即SN-38的ω-3长链不饱和脂肪酸单酯前药的具体合成方法，其合成路线如下：
具体方法为：应用相应的ω-3长链不饱和脂肪酸(PUFAs)与7-乙基-10-羟基喜树碱在有或者没有催化剂的参与下通过缩合剂进行酯化反应，从而合成本发明化合物。
所述的R为：
所述的缩合剂选自以下一种：对硝基苯甲酰氯、N,N'-二环己基碳二亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、O-(5-氯苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐，或O-(苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐。
所述的催化剂选自以下一种或多种：1-羟基苯并三唑，4-二甲氨基吡啶、N-羟基琥珀酰亚胺、三乙胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺，N,N-二异丙基乙胺。
本发明化合物的合成方法包括以下步骤：
A、7-乙基-10-羟基喜树碱、ω-3长链不饱和脂肪酸以及缩合剂溶解在溶剂中；
B、催化剂溶解在溶剂中通过恒压滴定漏斗加入到溶解药物溶液中，加样完毕后反应12-24小时；
D、将反应液旋干得到药物粉末或者将反应液加入水中搅拌均匀后加入有机试剂萃取，保留有机相并旋干得到药物粉末；
E、将上述药物粉末用乙醚冲洗两次，烘干后溶解于氯仿中，重结晶得到纯的目标产物。
所述的溶剂选自以下一种或两种以上的组合：二甲基亚砜、二氯甲烷、氯仿、N,N-二甲基甲酰胺，N,N-二甲基乙酰胺。
所述的有机试剂选自以下一种：石油醚、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、乙醚。
本发明的第三方面，提供了上述的ω-3不饱和脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱衍生物，即SN-38的ω-3长链不饱和脂肪酸单酯前药，在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的肿瘤，优选为结肠癌、肺癌、乳腺癌等。
本发明所研制一种7-乙基-10-羟基喜树碱的衍生物具有以下优势：
⑴采用全顺式9,12,15-十八碳三烯酸、全顺式5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、全顺式4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸分别与SN-38形成三种单酯化合物，这三种化合物与SN-38相比，其油水分配系数较SN-38有了显著提高，从而增加了所研制化合物的成药性；
⑵全顺式9,12,15-十八碳三烯酸、全顺式5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、全顺式4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸分别与SN-38形成三种单酯化合物在体内转换成SN-38的暴露量显著高于CPT-11在体内转换成SN-38的暴露量，说明本发明化合物体内更能有效转化为活性产物；
⑶全顺式9,12,15-十八碳三烯酸、全顺式5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、全顺式4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸分别与SN-38形成三种单酯化合物在肿瘤组织中的分布量、及抗肿瘤效果均高于CPT-11，说明本发明制剂具有明显肿瘤靶向作用；
⑷全顺式9,12,15-十八碳三烯酸、全顺式5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、全顺式4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸分别与SN-38形成三种单酯化合物对荷瘤鼠在抗肿瘤期间的平均体重均较CPT-11组要高，说明这三种化合物的毒副作用均低于CPT-11，增加了用药安全性。
附图说明
图1为CPT-11、DHA-SN38、EPA-SN38、LNA-SN38代谢出SN-38的血药浓度-时间曲线。
图2为CPT-11、DHA-SN38、EPA-SN38、LNA-SN38血药浓度-时间曲线。
图3为CPT-11、DHA-SN38、EPA-SN38、LNA-SN38抗肿瘤实验中荷瘤鼠体重动态变化。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。
本发明SN38购自成都兰贝植化科技有限公司；DHA、EPA、LNA购自Sigma-Aldrich公司；CPT-11购自江苏恒瑞医药股份有限公司。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：7-乙基-10-顺式-4,7,10,13,16,19-二十二己烯酰氧基喜树碱的制备
1mol7-乙基-10-羟基喜树碱、1.2mol顺式4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸和1.2mol对硝基苯甲酰氯溶解在2L氯仿中，反应24小时后旋干溶剂，将得到的药物粉末用乙醚冲洗两次，烘干后溶解于氯仿中，重结晶得到纯的目标产物。产率：82％。
1HNMR(CDCl3，400MHz,ppm)δ:8.73(1H，d，J＝9.14Hz)，8.22(1H，d，J＝2.46Hz)，8.15(1H，s)，7.75(1H，dd，J＝9.14and2.46Hz)，5.41-5.38(10H，m)，5.10-5.05(2H，m)，4.76-4.64(2H，m)，4.25-4.20(2H，m)，2.73-2.48(18H，m)，1.27-1.14(6H，m)，1.02(3H，t)，0.87(3H，t)
MS(ESI+)m/z:703(M+H+，100％)
实施例2：7-乙基-10-顺式-4,7,10,13,16,19-二十二己烯酰氧基喜树碱的制备
1mol7-乙基-10-羟基喜树碱、1.1mol顺式4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸和1.5molN,N'-二环己基碳二亚胺溶解在2L氯仿中，2.1molN,N-二异丙基乙胺加入少量氯仿溶解后采用恒压滴定漏斗加入到溶解药物溶液中，加样完毕后反应15小时，旋干溶剂，将得到的药物粉末用乙醚冲洗两次，烘干后溶解于氯仿中，重结晶得到纯的目标产物。产率：74％。
实施例3：7-乙基-10-顺式-4,7,10,13,16,19-二十二己烯酰氧基喜树碱的制备
1mol7-乙基-10-羟基喜树碱、1.5mol顺式4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸和1.5mol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶解在2L二氯甲烷中，2.1molN-羟基琥珀酰亚胺与1.2mol三乙胺加入少量二氯甲烷溶解后采用恒压滴定漏斗加入到溶解药物溶液中，加样完毕后反应10小时，旋干溶剂，将得到的药物粉末用乙醚冲洗两次，烘干后溶解于氯仿中，重结晶得到纯的目标产物。产率：92％。
实施例4：7-乙基-10-顺式-4,7,10,13,16,19-二十二己烯酰氧基喜树碱的制备
1mol7-乙基-10-羟基喜树碱、1.1mol顺式4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸和1.5mol2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物溶解在2L二氯甲烷中，2mol三乙胺加入少量二氯甲烷溶解后采用恒压滴定漏斗加入到溶解药物溶液中，加样完毕后反应24小时，旋干溶剂，将得到的药物粉末用乙醚冲洗两次，烘干后溶解于氯仿中，重结晶得到纯的目标产物。产率：86％。
实施例5：7-乙基-10-顺式-4,7,10,13,16,19-二十二己烯酰氧基喜树碱的制备
2mol7-乙基-10-羟基喜树碱、2.1mol顺式4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸和2molO-(5-氯苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐溶解在1LN,N-二甲基乙酰胺中，2molN,N-二异丙基乙胺，1.1mol三乙胺加入少量N,N-二甲基乙酰胺溶解后采用恒压滴定漏斗加入到溶解药物溶液中，加样完毕后反应24小时，反应液加入水中搅拌均匀后加入2L石油醚分两次萃取，保留有机相，旋干，将得到的药物粉末用乙醚冲洗两次，烘干后溶解于氯仿中，重结晶得到纯的目标产物。产率：79％。
实施例6：7-乙基-顺式-10-5,8,11,14,17-二十碳戊烯酰氧基喜树碱的制备
1mol7-乙基-10-羟基喜树碱、2mol顺式4,7,10,13,16,19-二十碳五烯酸和1.5mol六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷溶解在1L甲苯中，加样完毕后反应24小时，旋干溶剂，将得到的药物粉末用乙醚冲洗两次，烘干后溶解于氯仿中，重结晶得到纯的目标产物。产率：65％。
1HNMR(CDCl3，400MHz,ppm)δ:8.73(1H，d，J＝9.14Hz)，8.22(1H，d，J＝2.46Hz)，8.15(1H，s)，7.75(1H，dd，J＝9.14and2.46Hz)，5.41-5.38(8H，m)，5.10-5.05(2H，m)，4.76-4.64(2H，m)，4.25-4.20(2H，m)，2.73-2.48(18H，m)，1.27-1.14(6H，m)，1.02(3H，t)，0.87(3H，t)。
MS(ESI+)m/z:699(M+Na+，100％)
实施例7：7-乙基-顺式-10-5,8,11,14,17-二十碳戊烯酰氧基喜树碱的制备
1mol7-乙基-10-羟基喜树碱、1.1mol顺式4,7,10,13,16,19-二十碳五烯酸和1.2mol2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物溶解在2L二氯甲烷中，2.1mol4-二甲氨基吡啶加入少量二氯甲烷溶解后采用恒压滴定漏斗加入到溶解药物溶液中，加样完毕后反应18小时，旋干溶剂，将得到的药物粉末用乙醚冲洗两次，烘干后溶解于氯仿中，重结晶得到纯的目标产物。产率：92％。
实施例8：7-乙基-顺式-10-5,8,11,14,17-二十碳戊烯酰氧基喜树碱的制备
1mol7-乙基-10-羟基喜树碱、1.3mol顺式4,7,10,13,16,19-二十碳五烯酸和1.2mol2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物溶解在0.5L二甲基亚砜中，2molN,N-二异丙基乙胺加入少量二甲基亚砜溶解后采用恒压滴定漏斗加入到溶解药物溶液中，加样完毕后反应22小时，反应液加入水中搅拌均匀后加入1L乙酸乙酯分两次萃取，保留有机相，旋干，将得到的药物粉末用乙醚冲洗两次，烘干后溶解于氯仿中，重结晶得到纯的目标产物。产率：60％。
实施例9：7-乙基-顺式-10-5,8,11,14,17-二十碳戊烯酰氧基喜树碱的制备
2mol7-乙基-10-羟基喜树碱、2.2mol顺式4,7,10,13,16,19-二十碳五烯酸和2.2molN,N'-二环己基碳二亚胺溶解在2L氯仿中，2.1molN-羟基硫代琥珀酰亚胺加入少量二氯甲烷溶解后采用恒压滴定漏斗加入到溶解药物溶液中，加样完毕后反应18小时，旋干溶剂，将得到的药物粉末用乙醚冲洗两次，烘干后溶解于氯仿中，重结晶得到纯的目标产物。产率：90％。
实施例10：7-乙基-顺式9,12,15-十八碳丙烯酰氧基喜树碱的制备
1mol7-乙基-10-羟基喜树碱、1.3mol顺式9,12,15-十八碳三烯酸和1.2molO-(苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐溶解在2L二氯甲烷中，2.1mol4-二甲氨基吡啶加入少量二氯甲烷溶解后采用恒压滴定漏斗加入到溶解药物溶液中，加样完毕后反应18小时，旋干溶剂，将得到的药物粉末用乙醚冲洗两次，烘干后溶解于氯仿中，重结晶得到纯的目标产物。产率：91％。1HNMR(CDCl3，600MHz,ppm)δ:8.73(1H，d，J＝9.14Hz)，8.22(1H，d，J＝2.46Hz)，8.15(1H，s)，7.75(1H，dd，J＝9.14and2.46Hz)，5.41-5.38(4H，m)，5.10-5.05(2H，m)，4.76-4.64(2H，m)，4.25-4.20(2H，m)，2.73-2.48(28H，m)，1.27-1.14(3H，m)，1.31(3H，t)。
MS(ESI+)m/z:653(M+H+,100％)。
实施例11：7-乙基-顺式9,12,15-十八碳丙烯酰氧基喜树碱的制备
1mol7-乙基-10-羟基喜树碱、1.1mol顺式9,12,15十八碳-三烯酸和1.2mol2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯溶解在0.5LN,N-二甲基甲酰胺中，2.1molN,N-二异丙基乙胺加入少量N,N-二甲基甲酰胺溶解后采用恒压滴定漏斗加入到溶解药物溶液中，加样完毕后反应16小时，反应液加入水中搅拌均匀后加入1L乙醚分两次萃取，保留有机相，旋干，将得到的药物粉末用乙醚冲洗两次，烘干后溶解于氯仿中，重结晶得到纯的目标产物。产率：71％。
实施例12：7-乙基-顺式9,12,15-十八碳丙烯酰氧基喜树碱的制备
1mol7-乙基-10-羟基喜树碱、1.1mol顺式9,12,15-十八碳三烯酸和1.2molN,N'-二异丙基碳二亚胺溶解在2L氯仿中，2.1mol1-羟基苯并三唑加入少量氯仿溶解后采用恒压滴定漏斗加入到溶解药物溶液中，加样完毕后反应18小时，旋干溶剂，将得到的药物粉末用乙醚冲洗两次，烘干后溶解于氯仿中，重结晶得到纯的目标产物。产率：93％。
实施例13：7-乙基-顺式9,12,15-十八碳丙烯酰氧基喜树碱的制备
1mol7-乙基-10-羟基喜树碱、2mol顺式9,12,15-十八碳三烯酸和1.2molN,N'-二环己基碳二亚胺溶解在2L氯仿中，2.1mol1N-羟基硫代琥珀酰亚胺加入少量氯仿溶解后采用恒压滴定漏斗加入到溶解药物溶液中，加样完毕后反应18小时，旋干溶剂，将得到的药物粉末用乙醚冲洗两次，烘干后溶解于氯仿中，重结晶得到纯的目标产物。产率：87％。
实施例14：7-乙基-顺式9,12,15-十八碳丙烯酰氧基喜树碱的制备
1mol7-乙基-10-羟基喜树碱、2mol顺式9,12,15-十八碳三烯酸和1.2mol对硝基苯甲酰氯溶解在1.7L二氯甲烷中，2.1mol三乙胺加入少量二氯甲烷混合均匀后采用恒压滴定漏斗加入到溶解药物溶液中，加样完毕后反应10小时，旋干溶剂，将得到的药物粉末用乙醚冲洗两次，烘干后溶解于氯仿中，重结晶得到纯的目标产物。产率：92％。
实施例15：7-乙基-顺式9,12,15-十八碳丙烯酰氧基喜树碱的制备
1mol7-乙基-10-羟基喜树碱、1.1mol顺式9,12,15十八碳-三烯酸和1.2mol六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷溶解在0.5L二甲基亚砜中，2.1molN,N-二异丙基乙胺加入少量二甲基亚砜溶解后采用恒压滴定漏斗加入到溶解药物溶液中，加样完毕后反应10小时，反应液加入水中搅拌均匀后加入1L乙酸乙酯分两次萃取，保留有机相，旋干，将得到的药物粉末用乙醚冲洗两次，烘干后溶解于氯仿中，重结晶得到纯的目标产物。产率：87％。
实施例16：本发明化合物油水分配系数实验
取实施例2、6、11中制备的7-乙基-10-顺式-4,7,10,13,16,19-二十二己烯酰氧基喜树碱(DHA-SN38)，7-乙基-顺式-10-5,8,11,14,17-二十碳戊烯酰氧基喜树碱(EPA-SN38)，7-乙基-顺式-9,12,15-十八碳丙烯酰氧基喜树碱(LNA-SN38)以及SN-38进行油水分配系数测定。
取pH3.0的枸橼酸缓冲液与正辛醇以体积比1:1，1:2，2:1的比例进行混合，并置恒温水浴振荡器中，保持25℃，100rpm，振摇3天至平衡。取适量上述药物分别溶解于饱和的正辛醇—缓冲液体系中，置恒温水浴振荡器中，保持25℃，100rpm，振摇2天至溶解分配平衡。将上述溶液在25℃条件下静置24小时，分离正辛醇相与缓冲液相，经0.22μm滤膜过滤后，采用高效液相法对两相中药物含量进行测试。油水分配系数的logP值计算公式如下：
logp＝log(正辛醇中药物浓度/缓冲液中药物浓度)
实验结果如表1所示。
表1油水分配系数测定结果
实验结果表明，通过ω-3不饱和脂肪酸对7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)的10位羟基进行修饰，形成的化合物DHA-SN38,EPA-SN38,LNA-SN38的亲脂性相比较于SN-38而言都有了较大提高。
实施例17：本发明化合物的药代动力学实验
药品配制：取实施例1、7、12中制备的7-乙基-10-顺式-4,7,10,13,16,19-二十二己烯酰氧基喜树碱(DHA-SN38)，7-乙基-顺式-10-5,8,11,14,17-二十碳戊烯酰氧基喜树碱(EPA-SN38)，7-乙基-顺式-9,12,15-十八碳丙烯酰氧基喜树碱(LNA-SN38)以及市售盐酸伊立替康注射液(规格：100mg，江苏恒瑞医药股份有限公司，产品批号14021915，CPT-11)作为对比制剂，进行药代动力学实验。将本发明制备的3种化合物溶解在吐温-80中后分别采用生理盐水临用前稀释至2mg/ml，市售伊立替康临用前用生理盐水直接稀释成2mg/ml。
给药：取Wister种大鼠24只，雌雄各半，随机分成4组，每组6只。实验前禁食一夜，给药剂量按SN-38计均为20mg/kg，尾静脉给药，给药后分别在5、15、30、60、90min以及2、3、4、6、8、11h于眼眶处取血0.5mL，放入经肝素处理过的1.5mL尖底离心试管中，以4000r·min-1转速离心15min，精密吸取上层血浆200μL，置于另一干净的尖底离心试管中，放于冰箱中冷冻保存备用。
样品处理：取100μl内标溶液(喜树碱，1mg/ml)和300μl酸化甲醇溶液(甲醇：盐酸＝9：1，V/V)在冷冻至4℃后加入到100μl血浆中，涡旋1min后，14000rpm离心10min，取上清液，高效液相分析药物含量，计算血药浓度，建立各个药品本身以及各个药品在体内降解为SN-38的血药浓度-时间曲线(如图1、图2所示)，采用软件kinetic4.0以非隔模型分析药代动力学参数，结果如表2所示。
表2血液中CPT-11、DHA-SN38、EPA-SN38、LNA-SN38及其代谢的SN-38的AUC结果
#:与CPT-11组的CPT-11比较，p<0.05；
*:与CPT-11组的SN-38比较，p<0.05。
实验结果表明，DHA-SN38、EPA-SN38、LNA-SN38等在体内均能更加有效的降解为SN-38，并且在体内降解为SN-38的量均较CPT-11有了显著提高。
实施例18：本发明化合物的组织分布实验
取生长旺盛期的HT-29瘤组织剪成2.0mm3左右小块，在无菌条件下，接种于裸鼠右侧腋窝下，用游标卡尺测量移植瘤瘤径，待肿瘤长至400mm3左右随机分为4组：CPT-11组、DHA-SN38组、EPA-SN38组、LNA-SN38组，各组以20mg/kg的剂量(以SN-38计)经尾静脉给药，给药后于0.5h，1h，3h，5h处死小鼠，取肿瘤组织，保存于-80℃冰箱，待测。
将各肿瘤组织以5倍量的生理盐水匀浆后，精密吸取匀浆液50μl，加内标50μl，甲醇100μl，涡旋混合1min后，加入pH7.4磷酸盐缓冲液50μl，二氯甲烷500μl，涡旋混合2min，14000rpm离心5min，吸取下层溶液，于37℃下氮气吹干，加流动相100μl复溶，涡旋混合2min，14000rpm离心5min，取上清液进样，记录峰面积。计算药物浓度，建立组织浓度-时间曲线，计算各曲线AUC(药时曲线下面积)，结果如表3所示。
表3肿瘤组织中CPT-11、DHA-SN38、EPA-SN38、LNA-SN38及其代谢的SN-38的AUC结果
#:与CPT-11组的CPT-11比较，p<0.05；
*:与CPT-11组的SN-38比较，p<0.05。
实验结果表明，DHA-SN38、EPA-SN38、LNA-SN38在肿瘤组织的蓄积量较CPT-11要高40-45倍，显示出这三种化合物对肿瘤组织的特异靶向性，另外DHA-SN38、EPA-SN38、LNA-SN38在肿瘤组织中降解形成的SN-38也较CPT-11组有显著提高。
实施例19：本发明化合物的抗肿瘤药效实验
取生长旺盛期的HT-29瘤组织剪成2.0mm3左右小块，在无菌条件下，接种于裸鼠右侧腋窝下，用游标卡尺测量移植瘤瘤径，待肿瘤长至100mm3左右随机分为5组：阴性对照组、CPT-11组、DHA-SN38组、EPA-SN38组和LNA-SN38组，各组以20mg/kg的剂量(以SN-38计)经iv，q2d×3给予相应药物，阴性对照组按相同方案给予等体积生理盐水。并开始动态测试荷瘤鼠体重，三周后处死各组动物，剖取肿瘤称重，按下列公式计算肿瘤抑制率：
肿瘤抑制率％＝[(对照组平均瘤重—给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％
实验结果如表4所示。
表4CPT-11、DHA-SN38、EPA-SN38、LNA-SN38的抑瘤率实验结果。
与生理盐水阴性对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。
实验结果表明：DHA-SN38、EPA-SN38、LNA-SN38的抑瘤率较CPT-11组均有显著提高，显示了更优的抗肿瘤效果。
根据荷瘤小鼠的体重变化结果显示(图3)，DHA-SN38、EPA-SN38、LNA-SN38组裸鼠在治疗期间的平均体重均较CPT-11组高，说明DHA-SN38、EPA-SN38、LNA-SN38的毒性较CPT-11要低，具有良好的给药安全性。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (10)
1.一类ω-3不饱和脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱衍生物，其化学结构式如式(Ⅰ)、式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示：
2.如权利要求1所述的一类ω-3不饱和脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱衍生物的制备方法，其特征在于，所述的ω-3不饱和脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱衍生物是通过ω-3不饱和脂肪酸与7-乙基-10-羟基喜树碱进行酯化反应获得。
3.根据权利要求2所述的一类ω-3不饱和脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱衍生物的制备方法，其特征在于，所述的酯化反应，在有或者没有催化剂的参与下通过缩合剂进行。
4.根据权利要求3所述的一类ω-3不饱和脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱衍生物的制备方法，其特征在于，所述的缩合剂选自以下一种：对硝基苯甲酰氯、N,N'-二环己基碳二亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、O-(5-氯苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐，或O-(苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐。
5.根据权利要求3或4所述的一类ω-3不饱和脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱衍生物的制备方法，其特征在于，所述的催化剂选自以下一种或两种以上的组合：1-羟基苯并三唑，4-二甲氨基吡啶、N-羟基琥珀酰亚胺、三乙胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺，N,N-二异丙基乙胺。
6.根据权利要求3或4所述的一类ω-3不饱和脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱衍生物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：
A、7-乙基-10-羟基喜树碱、ω-3不饱和脂肪酸以及缩合剂溶解在溶剂中；
B、催化剂溶解在溶剂中通过恒压滴定漏斗加入到溶解药物溶液中，加样完毕后反应12-24小时；
D、将反应液旋干得到药物粉末或者将反应液加入水中搅拌均匀后加入有机试剂萃取，保留有机相并旋干得到药物粉末；
E、将上述药物粉末用乙醚冲洗两次，烘干后溶解于氯仿中，重结晶得到纯的目标产物。
7.根据权利要求6所述的一类ω-3不饱和脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱衍生物的制备方法，其特征在于，所述的的溶剂选自以下一种或两种以上的组合：二甲基亚砜、二氯甲烷、氯仿、N,N-二甲基甲酰胺，N,N-二甲基乙酰胺。
8.根据权利要求6所述的一类ω-3不饱和脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱衍生物的制备方法，其特征在于，所述的有机试剂选自以下一种：石油醚、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、乙醚。
9.如权利要求1所述的一类ω-3不饱和脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的一类ω-3不饱和脂肪酸修饰的7-乙基-10-羟基喜树碱衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为结肠癌、肺癌、乳腺癌。
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