CN105770880A - 采用免疫原性的疟原虫环子孢子蛋白表位的重组腺病毒的修饰 - Google Patents

采用免疫原性的疟原虫环子孢子蛋白表位的重组腺病毒的修饰 Download PDF

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Abstract

本公开涉及修饰腺病毒蛋白质以扩大对重组腺病毒的转基因的免疫反应，并规避前存的抗腺病毒免疫。一些实施方式涉及来源于重组腺病毒质粒载体的重组腺病毒，其中该重组腺病毒质粒载体包括编码疟原虫环子孢子蛋白或其抗原性部分的核苷酸序列，其可操作地和异源启动子以及被修饰的衣壳或芯蛋白相联，其中疟原虫环子孢子的免疫原性的表位被插入或替换至少一部分衣壳或芯蛋白。其它实施方式涉及药物组合物或疟疾疫苗组合物，其包括根据上述实施方式的重组腺病毒。进一步的实施方式包括治疗，预防，或诊断疟疾的方法，包括给药以治疗量的根据上述实施方式的药物组合物或疟疾疫苗组合物。

Description

采用免疫原性的疟原虫环子孢子蛋白表位的重组腺病毒的修饰
优先权声明
本申请为2009年8月18日递交的国际申请号PCT/US09/054212的部分继续申请，并要求其优先权，该国际申请以参考方式被全文合并于此，如同其被充分阐述于此。
关于联邦赞助研究的声明
此发明是在国家过敏和传染病学会(NIAID)授于的基金号为1R01AI081510-01A1的政府援助下作出的，该学会为国家健康学会的一部分。政府在此发明中拥有某些权利。
技术领域
此发明涉及药物和生物技术领域。更具体地，此发明涉及使用衣壳-经修饰的腺病毒载体诱导对疟疾寄生虫抗原(如疟原虫环子孢子蛋白)的有效免疫反应，其适用于抗疟疾疫苗。
背景技术
疟疾是排在全世界热带地区最普遍的感染中的严重疾病。每年约3-5亿人受感染，发病率和死亡率较高。特别在年幼孩童以及移居至疟疾流行地区而之前未经历疟疾暴露的成年人中，发病率和死亡率高。世界卫生组织(WHO)估计每年单独在非洲就有2-3百万孩童死于疟疾。在许多国家由抗药性寄生虫(镰状疟原虫近来还有间日疟原虫)和抗杀虫剂载体(疟蚊)所引起的蔓延传播以及渐增的疟疾发生率强调了对于发展控制此疾病的新方法的需求(NussenzweigandLong1994)。
疟疾寄生虫具有复杂的生命周期，包括前红细胞，红细胞和性别寄生形式，其代表了疟疾疫苗研制的潜在目标。前红细胞和红细胞形式发现于寄主体内，而性别形式发生在载体中。采用活的稀释已照射的子孢子(IrSp)的免疫已经显示在老鼠(Nussenzweig等人1967)，非人灵长类动物(Gwadz等人1979)和人类(Clyde等人1973，Edelman等人1993)中引起灭杀性防护(即，对寄生虫侵袭的完全抗性)。IrSp给予的防护由体液(B细胞)和细胞(T细胞)免疫反应的子孢子中和来调节(Tsuji等人2001)。尽管IrSp接种疫苗是有吸引力的方案，但获得子孢子的唯一方法是解剖蚊子的唾腺，当前没有已知技术在体外培殖大量的子孢子。因此，需要其它可以引起等价强度的对疟疾的保护性免疫的疫苗载体。
这种疫苗载体的一个有希望的目标是环子孢子(CS)蛋白，其被表达在该子孢子的表面上。有效的中和抗体被引导针对该环子孢子(CS)蛋白的免疫优势的，种特异性的，重复的结构域。在镰状疟原虫(人类疟疾寄生虫)中，该重复的(NANP)n存在于来自世界全部地区的分离物中。此种中心重复包含多个B细胞表位的重复，因此，该CS蛋白可以通过触发B细胞诱导强烈的体液免疫反应(Tsuji等人2001)。在该CS蛋白的C末端区域，有若干T细胞表位，其可以诱导显性的细胞免疫反应(Tsuji等人2001)。该体液(抗体)反应可以通过在进入肝细胞之前影响和中和子孢子(细胞外寄生虫)的感染性除去寄生虫，而细胞(T细胞)反应可以通过分泌干扰素-gamma攻击EEF(细胞内寄生虫)。这些免疫反应阻止EEF成熟和迅速分裂形成成千上万的裂殖性孢子，其可再进入血液并感染红细胞，来导致我们所知的疟疾疾病。
一种基于CS的目前在进行人体试验的疟疾疫苗是GlaxoSmithKline的RTS,S，乙型肝炎表面抗原和一部分镰状疟原虫环子孢子蛋白(PfCSP)的融合蛋白，其形式为病毒状颗粒(1992年11月11日申请的SmithKlineBeechamBiologicalsS.A.的国际专利申请PCT/EP1992/002591)，其已显示出在临床试验中减少疟疾感染(Alonso等人2004，Alonso等人2005，Bejon等人2008)。RTS,S诱导了抗PfCSP的体液免疫反应，但是相对弱的PfCSP特异性细胞(CD8+)反应(Kester等人2008)，这可能是RTS,S的防护相对较弱的原因。相反，基于腺病毒的疟疾疫苗可以诱导保护性的细胞免疫反应(2003年12月16日申请的国际专利申请PCT/EP2003/051019，罗德里格等人1997)。然而，目前有两个障碍限制了基于腺病毒的平台作为疟疾疫苗的使用：(1)缺乏针对转基因产品诱导有效体液反应的能力，和(2)对腺病毒，特别是腺病毒血清型5的前存免疫妨碍了基于腺病毒疫苗的致免疫力。
近来采用的用于增强腺病毒诱导的体液反应的一种方法是在腺病毒衣壳蛋白(如六邻体，纤突，五邻体和pIX)中插入B细胞抗原表位(例如，细菌性的或病毒性的表位)(Worgall等人2005，McConnell等人2006，Krause等人2006，Worgall等人2007)。
此外，为了规避对腺病毒血清型5(Ad5)的前存免疫，已经对其它血清阳性率更低的腺病毒(如腺病毒血清型11，35，26，48，49和50)作为疫苗平台进行评价，并显示出尽管存在抗Ad5免疫，但还是诱导对转基因的免疫反应(CrucellHollandB.V.于2005年10月12日申请的国际专利申请PCT/EP2005/055183，Abbink等人2007)。Ad5的六邻体作为中和抗体的靶标衣壳蛋白，被其它血清型的六邻体取代，以避免前存抗Ad5免疫(Wu等人2002，Roberts等人2006)。
然而，在将腺病毒载体应用于上述的疟疾疫苗时同时克服了这两个障碍的改进腺病毒载体未见报道。在疟疾流行地区对Ad5的血清阳性率较高的前提下(Ophorst等人2006)，需要有基于腺病毒的疟疾疫苗，其即使在前存对腺病毒免疫的条件下，也可以同时诱导保护性的体液和细胞免疫反应。
概要
本公开涉及几种腺病毒蛋白质修饰，以增强对重组腺病毒疫苗的转基因的免疫反应，及规避前存的抗腺病毒免疫。
具体而言，一个实施方式涉及来源于重组腺病毒质粒载体的重组腺病毒，其中该重组腺病毒质粒载体包括核苷酸序列，其编码(i)疟原虫环子孢子蛋白或其抗原性的部分，其可操作地与异源启动子相连；和(ii)经修饰的衣壳或芯蛋白，其中疟原虫环子孢子的免疫原性的表位已经被插入或已替换至少部分衣壳或芯蛋白。
在一些实施方式中，该疟原虫环子孢子蛋白进一步包括镰状疟原虫或约氏疟原虫环子孢子蛋白。该环子孢子蛋白可以进一步包括密码子优化的镰状疟原虫或约氏疟原虫环子孢子蛋白，并且在一些方面，其可以分别由SEQIDNO:2或SEQIDNO:1的核苷酸序列编码。
在其它实施方式中，该免疫原性的表位进一步包括疟原虫环子孢子蛋白的B细胞表位。该B细胞表位可以被并入经修饰的衣壳蛋白中，并且在一些方面，该衣壳蛋白可以包括六邻体高变区(HVR)。该HVR可以进一步包括HVR1或HVR5，其中HVR1或HVR5的一部分被B细胞表位取代。在其它方面，该衣壳蛋白可以进一步包括衣壳纤突蛋白，其中该B细胞表位被插入该纤突蛋白中。在一些方面，该B细胞表位是镰状疟原虫环子孢子蛋白的B细胞表位，其中该B细胞表位是重复序列，例如，(NANP)n(SEQIDNO:60)，其中该重复序列可以是(NANP)4，(NANP)6，(NANP)8，(NANP)10，(NANP)12，(NANP)14，(NANP)16，(NANP)18，(NANP)20，(NANP)22或(NANP)28。在其它方面，该B细胞表位是约氏疟原虫环子孢子蛋白的B细胞表位，其中该B细胞表位是重复序列，例如，(QGPGAP)n(SEQIDNO:59)，其中该重复序列可以是(QGPGAP)3，(QGPGAP)4，(QGPGAP)5，(QGPGAP)6，(QGPGAP)7，(QGPGAP)8，(QGPGAP)9，(QGPGAP)11，或(QGPGAP)12。
在其它实施方式中，该免疫原性的表位进一步包括疟原虫环子孢子蛋白的CD4+或CD8+T细胞表位。该CD4+或CD8+T细胞表位可以被并入经修饰的衣壳或芯蛋白中。在一些方面，该衣壳蛋白可以包括六邻体高变区(HVR)。该HVR可以进一步包括HVR1，其中HVR1的一部分被该CD4+或CD8+T细胞表位代替。在其它方面，该芯蛋白进一步包括pVII蛋白，且CD4+T细胞表位被插入该pVII蛋白中。在一些方面，该CD4+T细胞表位为镰状疟原虫环子孢子的CD4+T细胞表位，其中该CD4+T细胞表位是EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQIDNO:62)。在其它方面，该CD4+T细胞表位是约氏疟原虫环子孢子的CD4+T细胞表位，其中该CD4+T细胞表位是YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK(SEQIDNO:61)。
其它实施方式涉及药物组合物或疟疾疫苗组合物，其包括根据上述实施方式的重组腺病毒。进一步的实施方式包括治疗，预防，或诊断疟疾的方法，包括给药以治疗量的根据上述实施方式的药物组合物或疟疾疫苗组合物。
在另一实施方式中，用于治疗的方法包括给药以初期激发接种疫苗，其中对象以给定时间间隔被给予一系列渐增剂量或相同剂量。该时间间隔可以是足以产生体液和/或细胞免疫反应的任何长度。例如，如下所述，该间隔可以是，但不限于每3周1次。
附图说明
图1是根据此公开的实施方式的衣壳经修饰的重组腺病毒的示意图。
图2是示意图，其示意了HVR1-经修饰的重组腺病毒质粒载体的HVR1-经修饰的腺病毒DNA的结构。
图3是示意图，其示意了HVR5-经修饰的重组腺病毒质粒载体的HVR5-经修饰的腺病毒DNA的结构。
图4是示意图，其示意了纤突-经修饰的重组腺病毒质粒载体的纤突-经修饰的腺病毒DNA的结构。
图5是示意图，其示意了HVR1和纤突-经修饰的重组腺病毒质粒载体的HVR1和纤突-经修饰的腺病毒DNA的结构。
图6是示意图，其示意了纤突和pVII-经修饰的重组腺病毒质粒载体的纤突和pVII-经修饰的腺病毒DNA的结构。
图7是示意图，其示意了HVR1和pVII-经修饰的重组腺病毒质粒载体的HVR1和pVII-经修饰的腺病毒DNA的结构。
图8是示意图，其示意了HVR1，纤突和pVII-经修饰的重组腺病毒质粒载体的HVR1，纤突和和pVII-经修饰的腺病毒DNA的结构。
图9是密码子优化的约氏疟原虫环子孢子蛋白(PyCS，SEQIDNO:1)的核苷酸序列和相应的氨基酸序列(SEQIDNO:30)。
图10是密码子优化的镰状疟原虫环子孢子蛋白(PfCSP，SEQIDNO:2)的核苷酸序列和相应的氨基酸序列(SEQIDNO:43)。
图11是HVR1中具有三个重复的PyCSB细胞表位序列(QGPGAP)n，(SEQIDNO:59；n＝3)的经修饰的六邻体的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:3，核苷酸；SEQIDNO:31，氨基酸)。被插入的(QGPGAP)3序列加下划线。
图12是HVR1中具有四个重复的PyCSB细胞表位序列(QGPGAP)n，(SEQIDNO:59；n＝4)的经修饰的六邻体的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:4，核苷酸；SEQIDNO:32，氨基酸)。被插入的(QGPGAP)4序列加下划线。
图13是HVR1中具有五个重复的PyCSB细胞表位序列(QGPGAP)n，(SEQIDNO:59；n＝5)的经修饰的六邻体的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:5，核苷酸；SEQIDNO:33，氨基酸)。被插入的(QGPGAP)5序列加下划线。
图14是HVR1中具有六个重复的PyCSB细胞表位序列(QGPGAP)n，(SEQIDNO:59；n＝6)的经修饰的六邻体的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:6，核苷酸；SEQIDNO:34，氨基酸)。被插入的(QGPGAP)6序列加下划线。
图15是HVR1中具有七个重复的PyCSB细胞表位序列(QGPGAP)n，(SEQIDNO:59；n＝7)的经修饰的六邻体的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:7，核苷酸；SEQIDNO:35，氨基酸)。被插入的(QGPGAP)7序列加下划线。
图16是HVR1中具有八个重复的PyCSB细胞表位序列(QGPGAP)n，(SEQIDNO:59；n＝8)的经修饰的六邻体的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:8，核苷酸；SEQIDNO:36，氨基酸)。被插入的(QGPGAP)8序列加下划线。
图17是HVR1中具有九个重复的PyCSB细胞表位序列(QGPGAP)n，(SEQIDNO:59；n＝9)的经修饰的六邻体的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:9，核苷酸；SEQIDNO:37，氨基酸)。被插入的(QGPGAP)9序列加下划线。
图18是HVR1中具有十一个重复的PyCSB细胞表位序列(QGPGAP)n，(SEQIDNO:59；n＝11)的经修饰的六邻体的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:10，核苷酸；SEQIDNO:38，氨基酸)。被插入的(QGPGAP)11序列加下划线。
图19是HVR1中具有十二个重复的PyCSB细胞表位序列(QGPGAP)n，(SEQIDNO:59；n＝12)的经修饰的六邻体的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:11，核苷酸；SEQIDNO:39，氨基酸)。被插入的(QGPGAP)12序列加下划线。
图20是HVR1中具有四个重复的PfCSPB细胞表位序列(NANP)n，(SEQIDNO:60；n＝4)的经修饰的六邻体的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:12，核苷酸；SEQIDNO:44，氨基酸)。被插入的(NANP)4序列加下划线。
图21是HVR1中具有六个重复的PfCSPB细胞表位序列(NANP)n，(SEQIDNO:60；n＝6)的经修饰的六邻体的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:13，核苷酸；SEQIDNO:45，氨基酸)。被插入的(NANP)6序列加下划线。
图22是HVR1中具有八个重复的PfCSPB细胞表位序列(NANP)n，(SEQIDNO:60；n＝8)的经修饰的六邻体的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:14，核苷酸；SEQIDNO:46，氨基酸)。被插入的(NANP)8序列加下划线。
图23是HVR1中具有十个重复的PfCSPB细胞表位序列(NANP)n，(SEQIDNO:60；n＝10)的经修饰的六邻体的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:15，核苷酸；SEQIDNO:47，氨基酸)。被插入的(NANP)10序列加下划线。
图24是HVR1中具有十二个重复的PfCSPB细胞表位序列(NANP)n，(SEQIDNO:60；n＝12)的经修饰的六邻体的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:16，核苷酸；SEQIDNO:48，氨基酸)。被插入的(NANP)12序列加下划线。
图25是HVR1中具有十四个重复的PfCSPB细胞表位序列(NANP)n，(SEQIDNO:60；n＝14)的经修饰的六邻体的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:17，核苷酸；SEQIDNO:49，氨基酸)。被插入的(NANP)14序列加下划线。
图26是HVR1中具有十六个重复的PfCSPB细胞表位序列(NANP)n，(SEQIDNO:60；n＝16)的经修饰的六邻体的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:18，核苷酸；SEQIDNO:50，氨基酸)。被插入的(NANP)16序列加下划线。
图27是HVR1中具有十八个重复的PfCSPB细胞表位序列(NANP)n，(SEQIDNO:60；n＝18)的经修饰的六邻体的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:19，核苷酸；SEQIDNO:51，氨基酸)。被插入的(NANP)18序列加下划线。
图28是HVR1中具有二十个重复的PfCSPB细胞表位序列(NANP)n，(SEQIDNO:60；n＝20)的经修饰的六邻体的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:20，核苷酸；SEQIDNO:52，氨基酸)。被插入的(NANP)20序列加下划线。
图29是HVR1中具有二十个重复的PfCSPB细胞表位序列(NANP)n，(SEQIDNO:60；n＝22)的经修饰的六邻体的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:21，核苷酸；SEQIDNO:53，氨基酸)。被插入的(NANP)22序列加下划线。
图30是HVR1中具有二十八个重复的PfCSPB细胞表位序列(NANP)n，(SEQIDNO:60；n＝28)的经修饰的六邻体的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:22，核苷酸；SEQIDNO:54，氨基酸)。被插入的(NANP)28序列加下划线。
图31是HVR1中具有三个重复的PyCSB细胞表位序列(QGPGAP)n，(SEQIDNO:59；n＝3)的经修饰的六邻体的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:23，核苷酸；SEQIDNO:40，氨基酸)。被插入的(QGPGAP)3序列加下划线。
图32是纤突中具有三个重复的PyCSB细胞表位序列(QGPGAP)n，(SEQIDNO:59；n＝3)的经修饰的纤突的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:24，核苷酸；SEQIDNO:41，氨基酸)。被插入的(QGPGAP)3序列加下划线。
图33是HVR1中具有四个重复的PfCSPB细胞表位序列(NANP)n，(SEQIDNO:60；n＝4)的经修饰的纤突的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:25，核苷酸；SEQIDNO:55，氨基酸)。被插入的(NANP)4序列加下划线。
图34是pVII的N末端处具有PyCSCD4+表位序列YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK，(SEQIDNO:61)的经修饰的pVII的核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNO:26，核苷酸；SEQIDNO:42，氨基酸)。被插入的YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK序列加下划线。
图35是pVII的C末端处具有PfCSPCD4+表位序列EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT，(SEQIDNO:62)的经修饰的pVII的核苷酸和氨基酸序列(pVII-1；SEQIDNO:27，核苷酸；SEQIDNO:56，氨基酸)。被插入的EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT序列加下划线。
图36是在pVII的第一核定位信号之前的具有PfCSPCD4+表位序列EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT，(SEQIDNO:62)的经修饰的pVII的核苷酸和氨基酸序列(pVII-2；SEQIDNO:28，核苷酸；SEQIDNO:57，氨基酸)。被插入的EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT序列加下划线。
图37是pVII的两个NLS之间具有PfCSPCD4+表位序列EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT，(SEQIDNO:62)的经修饰的pVII的核苷酸和氨基酸序列(pVII-3；SEQIDNO:29，核苷酸；SEQIDNO:58，氨基酸)。被插入的EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT序列加下划线。
图38显示了用PyCS-GFP/pShuttle-CMV瞬时转染后AD293细胞中的PyCS蛋白表达。用小鼠单克隆抗PyCS抗体(9D3)通过蛋白质印迹法检测PyCS蛋白。
图39显示了纯化的衣壳-经修饰的重组PyCS-GFP腺病毒的银染色和蛋白质印迹法(A)和ELISA分析(B)的结果，以确定该(QGPGAP)3表位(SEQIDNO:59；n＝3)插入腺病毒衣壳蛋白。在该ELISA分析中，直接用纯化的腺病毒涂覆ELISA板，并用抗PyCS抗体检测腺病毒颗粒中的被插入的表位。
图40显示了纯化的衣壳-经修饰的重组PyCS-GFP腺病毒的银染色和蛋白质印迹法(A)和ELISA分析(B)的结果，以确定该(QGPGAP)n表位(SEQIDNO:59)插入腺病毒衣壳蛋白。在该ELISA分析中，直接用纯化的腺病毒涂覆ELISA板，并用抗PyCS抗体检测腺病毒颗粒中的被插入的表位。
图41显示了单一免疫方式，其采用具有(QGPGAP)n重复片段(SEQIDNO:59，n3，4，5，6，9，12)的衣壳经修饰的PyCS腺病毒(A)，免疫两周后PyCS特异性CD8+反应(B)。
图42显示了初期和激发免疫方式，其采用具有(QGPGAP)n重复片段(SEQIDNO:59，n＝3)的衣壳经修饰的PyCS腺病毒(A)，10周时PyCS特异性体液反应(B)，和子孢子侵袭42小时后被携带于肝脏中的疟疾寄生虫(C)。
图43显示了通过间接免疫荧光分析(IFA)测定的抗子孢子抗体滴度(A)和以图42所示方式所得的小鼠中制备混合血清的体外子孢子中和活性(B)。
图44显示了初期和激发免疫方式，其采用在HVR1中具有(QGPGAP)n重复片段(SEQIDNO:59，n＝4，6)的衣壳经修饰的PyCS腺病毒(A)，9周时PyCS特异性体液反应(B)，子孢子侵袭42小时后被携带于肝脏中的疟疾寄生虫(C)，和具有混合血清样品的体外子孢子中和活性(D)。使用或者不用佐剂免疫小鼠。
图45显示了初期和激发免疫方式，其采用在HVR1具有(QGPGAP)n重复片段(SEQIDNO:59，n＝6，9，12)的衣壳经修饰的PyCS腺病毒(A)，第9周PyCS特异性的体液反应(B)，第9周PyCS特异性的CD8+T细胞反应(C)，和子孢子侵袭42小时后被携带于肝脏中的疟疾寄生虫(D)。使用或者不用佐剂免疫小鼠。
图46显示了用PfCSP/pShuttle-CMV瞬时转染后AD293细胞中的PfCSP蛋白表达。用小鼠单克隆抗NANP抗体(2A10)通过蛋白质印迹法检测PfCSP。
图47显示了纯化的衣壳-经修饰的重组PfCSP腺病毒的银染色和蛋白质印迹法(A)和ELISA分析(B)的结果，以确定该(NANP)4表位(SEQIDNO:60；n＝4)插入腺病毒衣壳蛋白。用小鼠单克隆抗NANP抗体(2A10)检测该被插入的(NANP)4表位(SEQIDNO:60；n＝4)。在该ELISA分析中直接用纯化的腺病毒涂覆ELISA板。
图48显示了纯化的衣壳-经修饰的重组PfCSP腺病毒的银染色和蛋白质印迹法(A)和ELISA分析(B)的结果，以确定该(NANP)n表位(SEQIDNO:60；n＝4，6，8，10，12，14，16，18，20，22)插入腺病毒衣壳蛋白。在该ELISA分析中，直接用纯化的腺病毒涂覆ELISA板，并且用抗PfCSP抗体(2A10)检测腺病毒颗粒中被插入的表位。。
图49显示了初期和激发免疫方式，其中衣壳-经修饰的重组PfCSP腺病毒具有(NANP)4(SEQIDNO:60；n＝4)(A)，和在第9周PfCSP特异性的体液反应(B)。
图50显示了初期和激发免疫方式，其采用在HVR1中具有(NANP)n(SEQIDNO:60；n＝4，6，8，10)的衣壳-经修饰的重组PfCSP腺病毒(A)，和第9周PfCSP特异性的体液反应(B)。
图51显示了初期和激发免疫方式，其采用在HVR1中具有(NANP)n(SEQIDNO:60；n＝10，16，22)的衣壳-经修饰的重组PfCSP腺病毒(A)，和第9周PfCSP特异性的体液反应(B)。使用或者不用佐剂免疫小鼠。
图52显示了纯化的(QGPGAP)3-经修饰的纤突和pVII-1((QGPGAP)3-Fib/CD4-pVII-1PyCS-GFP)腺病毒的银染色分析结果(A)和用图49所示的(QGPGAP)3-Fib/PyCS-GFP或(QGPGAP)3-Fib/CD4-pVII-1/PyCS-GFP免疫小鼠后在第10周的抗QGPGAP抗体滴度(B)。将两个独立实验的结果用B-Fib/PyCS-GFP-免疫组中的中值抗体滴度正态化后绘制成图。
图53显示了腺病毒pVII蛋白质的结构示意图，其中PfCSPCD4+表位序列EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQIDNO:62)被插入pVII的第一核定位信号(NLS)(PfCD4-pVII-2；SEQIDNO:28，核苷酸；SEQIDNO:57，氨基酸)之前，并位于该两个pVII的NLS(PfCD4-pVII-3；SEQIDNO:29，核苷酸；SEQIDNO:58，氨基酸)之间(A)，和确认表位插入pVII的银染色结果(B)。
图54显示了采用HVR1和pVII-经修饰的重组PfCSP腺病毒的初期和激发免疫方式(A)，第6周的PfCSP特异性体液反应(B)，和第9周的PfCSP特异性CD4+(EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT；SEQIDNO:62)反应(C)。
图55显示了重组腺病毒由人类血清样品进行的体外中和。用重组腺病毒在稀释的人类血清存在下感染AD293细胞过夜，并测量GFP表达作为感染的标记物。
图56显示了在体内通过衣壳-经修饰的PyCS-GFP腺病毒诱导PyCS特异性T细胞反应的抗腺病毒免疫效果。(A)为该研究设计的简要描述。(B)显示了用野生型(wt)/空腺病毒免疫两次，随后用衣壳-经修饰的PyCS-GFP腺病毒准备的小鼠体内的PyCS特异性CD8+T细胞反应。
图57显示了在体内通过衣壳-经修饰的PyCS-GFP腺病毒诱导PyCS特异性体液免疫反应的抗腺病毒免疫效果。(A)为该研究设计的简要描述。(B)显示了用野生型(wt)/空腺病毒免疫两次，随后用两剂量衣壳-经修饰的PyCS-GFP腺病毒免疫的小鼠体内的PyCS特异性体液免疫反应。
用于解决问题的手段
本发明人已经发现新型重组腺病毒，其具有新的，衣壳-经修饰的结构，其来源于重组腺病毒质粒载体。该重组腺病毒能够感染哺乳动物细胞，使该细胞表达疟原虫环子孢子蛋白。该重组腺病毒还具有一种或多种已经被修饰为具有期望的免疫原性的抗原(如疟原虫环子孢子蛋白B细胞表位，T细胞表位)的衣壳蛋白。该重组腺病毒通过用线性化的重组腺病毒质粒载体转染细胞的方法获得。本发明人用获得的重组腺病毒对于含有重组腺病毒作为活性成分的具有预防和治疗疟疾感染作用的药物进行了大量研究。由此，发明人发现所获得的重组腺病毒具有所期望的药物作用。
详细说明
以下说明提供了用于彻底了解此公开的实施方式，使其能够实施的具体细节。然而，本领域技术人员应当了解，此公开可以在不具备这些细节的情形下被实施。在其它情形下，已知的结构和功能未作详细显示和描述，以避免不必要地妨碍此公开的实施方式的说明。
此公开中用于氨基酸，肽，碱基序列，和核酸的缩写基于IUPAC-IUBCommunicationonBiochemicalNomenclature，Eur.J.Biochem.,138:9(1984)，"GuidelineforPreparingSpecificationsIncludingbasesequencesandAminoAcidSequences"(美国专利和商标局)，以及本技术领域常用的缩写。
本公开所述“核苷酸序列”，“多核苷酸”或“DNA分子”可以包括双链DNA或单链DNA(即，构成双链DNA的正义和反义链)，且不限于其全长。除非另作说明，编码免疫原性的异体基因的核苷酸序列(如此处在下文所公开的序列)包括含基因组DNA的双链DNA，含cDNA的单链DNA(正义链)，和正义链序列互补的单链DNA(反义链)，合成DNA，及其片段。
此处使用的“核苷酸序列”，“多核苷酸”或“DNA分子”不局限于功能区域，并且可以包括表达抑制区域，编码区，前导序列，外显子，和内含子。进一步地，核苷酸序列或多核苷酸的例子可以包括RNA或DNA。含特异性氨基酸序列的多肽和含特异性DNA序列的多核苷酸可以包括该多核苷酸的片段，同源染色体，衍生物，和突变体。核苷酸序列或多核苷酸的突变体(如突变体DNA)的例子包括自然发生的等位基因突变体；人工突变体；以及具有缺失，替换，添加，和/或插入的突变体。应当理解，这种突变体可编码和原始非变异的多核苷酸所编码的多肽具有基本上相同功能的多肽。
本公开涉及重组腺病毒，其可以表达疟原虫寄生虫的抗原决定簇，并包括一种或多种经修饰的衣壳和/或芯蛋白质。该重组腺病毒源自于重组腺病毒质粒载体，以下的例子中描述了其生成。进一步的下文中讨论了腺病毒作为载体的用途。此处描述的重组腺病毒质粒载体可以被用作疟疾疫苗或药物组合物，其中对于疟原虫寄生虫的体液和细胞免疫反应均被诱导。
疟原虫寄生虫可以选自任何已知的疟原虫(P.)物种，例如，P.falciparum，P.malariae，P.ovale，P.vivax，P.knowlesi，P.berghei，P.chabaudi和P.yoelii。在一些实施方式中，抗原决定簇源自于啮齿类特异性的约氏疟原虫或人类特异性的镰状疟原虫。
在一个实施方式中，重组腺病毒衣壳-经修饰的质粒载体(此处也称为重组腺病毒质粒载体)是质粒，其编码和产生具有含一种或多种经修饰的衣壳和/或芯蛋白结构的衣壳和/或芯-经修饰的重组腺病毒(此处也称为重组腺病毒)。根据此公开的实施方式，可以通过插入至少一个疟原虫环子孢子蛋白的免疫原性的表位完成该衣壳和/或芯蛋白的修饰。或者，至少部分该衣壳和/或芯蛋白可以被去除并由至少一个疟原虫环子孢子蛋白的免疫原性的表位替代。在一些实施方式中，该免疫原性的表位是疟原虫环子孢子蛋白的B细胞和/或T细胞表位。添加B细胞或T细胞表位可以通过建立或增强对CS蛋白的体液免疫反应用于增强腺病毒载体作为疟疾疫苗的功效。该经修饰的衣壳和芯蛋白及其在重组腺病毒中应用的有效性论述于进一步的下文中。
该一种或多种经修饰的衣壳和/或芯蛋白可以是经修饰的六邻体蛋白，经修饰的纤突蛋白，经修饰的pVII蛋白或其组合。在一个实施方式中，一部分六邻体高变区(HVR)和/或一部分纤突蛋白被至少一个疟原虫环子孢子蛋白的B细胞和/或T细胞表位替代。或者，疟原虫环子孢子蛋白的一个或多个B细胞和/或T细胞表位可以被插入该纤突蛋白或六邻体HVR。在一些方面，该经修饰的HVR可以是HVR1，HVR2，HVR3，HVR4，HVR5，HVR6或HVR7。在其它方面，该经修饰的HVR可以是HVR1或HVR5。在一些实施方式中，该HVR-经修饰的六邻体可以具有核苷酸序列：SEQIDNO:3(图11)，SEQIDNO:4(图12)，SEQIDNO:5(图13)，SEQIDNO:6(图14)，SEQIDNO:7(图15)，SEQIDNO:8(图16)，SEQIDNO:9(图17)，SEQIDNO:10(图18)，SEQIDNO:11(图19)，SEQIDNO:12(图20)，SEQIDNO:13(图21)，SEQIDNO:14(图22)，SEQIDNO:15(图23)，SEQIDNO:16(图24)，SEQIDNO:17(图25)，SEQIDNO:18(图26)，SEQIDNO:19(图27)，SEQIDNO:20(图28)，SEQIDNO:21(图29)，SEQIDNO:22(图30)，或SEQIDNO:23(图31)。在其它实施方式中，该经修饰的纤突蛋白可以具有核苷酸序列SEQIDNO:24(图32)或SEQIDNO:25(图33)。
在另一实施方式中，疟原虫环子孢子蛋白的T细胞表位可以在任何以下位点被插入pVII蛋白的腺病毒芯中：C末端，位于该第一核定位信号(NLS)之前或该两个NLS之间。或者，疟原虫环子孢子蛋白的T细胞表位可以替换一部分该pVII蛋白。在一些实施方式中，该经修饰的pVII蛋白可以具有核苷酸序列SEQIDNO:26(图34)，SEQIDNO:27(图35)，SEQIDNO:28(图36)或SEQIDNO:29(图37)。
在该重组中，腺病毒可以表达转基因蛋白或重组转基因蛋白。在一些实施方式中，该转基因蛋白或重组转基因蛋白是疟原虫环子孢子蛋白或此处所述的重组腺病毒质粒载体所编码的，并且由所述重组腺病毒质粒载体在感染一个或多个寄主细胞后生成的重组腺病毒表达的抗原决定簇。
因此，在一些实施方式中，该重组腺病毒质粒载体包括编码重组转基因蛋白的核苷酸序列。在一个实施方式中，该重组转基因蛋白可以包括P.yoelii的啮齿类特异性的寄生虫的抗原决定簇，其中该抗原决定簇包括P.yoelii环子孢子(CS)蛋白基因或其抗原性的部分。在另一实施方式中，该重组转基因蛋白可以包括P.falciparum的人类特异性寄生虫的抗原决定簇，其中该抗原决定簇包括P.falciparum环子孢子基因(CS)蛋白或其抗原性的部分。该P.falciparumCS蛋白已经证实了在被用作人抗蚊子携带感染的主动免疫的基底时可预防疟疾。该抗原决定簇可以进一步包括免疫原性的表位，如B细胞和/或T细胞表位。
在一些实施方式中，该CS蛋白经密码子优化，用于在对象中增强表达。密码子优化基于所需的氨基酸含量，总体的优化密码子在感兴趣对象中的利用率，以及任何应避免以确保适当表达的方面。这些方面可以是剪接供体或受体位点，终止密码子，聚腺苷酸化(pA)信号，GC-和AT-富集序列，内部TATA框，或现有技术已知的任何其它方面。在一些实施方式中，密码子优化的CS转基因的DNA序列显示于图9(SEQIDNO:1，P.yoelii)和图10(SEQIDNO:2，P.falciparum)。
在一些实施方式中，该重组腺病毒质粒载体可以是以下经修饰的P.falciparum重组腺病毒质粒载体之一：HVR1-经修饰的腺病毒载体(NANP-HVR1/PfCSP)，其构造如图2所示，采用编码序列(NANP)n(SEQIDNO:60)的B细胞表位；纤突-经修饰的腺病毒载体(NANP-Fib/PfCSP)，其构造如图4所示，采用编码序列(NANP)n(SEQIDNO:60)的B细胞表位；HVR1和纤突-经修饰的腺病毒载体(NANP-HVR1/B-Fib/PfCSP)，其构造如图5所示，采用编码序列(NANP)n(SEQIDNO:60)的B细胞表位；HVR1和pVII-经修饰的腺病毒载体(NANP-HVR1/CD4-pVII/PfCSP)，其构造如图7所示，采用(NANP)n(SEQIDNO:60)的B细胞表位和编码序列EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQIDNO:62)的CD4表位；纤突和pVII-经修饰的腺病毒载体(NANP-Fib/CD4-pVII/PfCSP)，其构造如图6所示，采用(NANP)n(SEQIDNO:60)的B细胞表位和编码序列EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQIDNO:62)的CD4表位；和HVR1，纤突和pVII-经修饰的腺病毒载体(NANP-HVR1/Fib/CD4-pVII/PfCSP)，其构造如图8所示，采用(NANP)n(SEQIDNO:60)的B细胞表位和编码序列EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQIDNO:62)的CD4表位。
在其它实施方式中，该重组腺病毒质粒载体可以是以下经修饰的P.yoelii重组腺病毒质粒载体之一：HVR1-经修饰的腺病毒载体(QGPGAP-HVR1/PyCS)，其构造如图2所示，采用编码序列(QGPGAP)n(SEQIDNO:59)的B细胞表位；纤突-经修饰的腺病毒载体(QGPGAP-Fib/PyCS)，其构造如图4所示，采用编码序列(QGPGAP)n(SEQIDNO:59)的B细胞表位；HVR1和纤突-经修饰的腺病毒载体(QGPGAP-HVR1/B-Fib/PyCS)，其构造如图5所示，采用编码序列(QGPGAP)n(SEQIDNO:59)的B细胞表位；HVR1和pVII-经修饰的腺病毒载体(QGPGAP-HVR1/CD4-pVII/PyCS)，其构造如图7所示，采用(QGPGAP)n(SEQIDNO:59)的B细胞表位和编码序列YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK(SEQIDNO:61)的CD4表位；纤突和pVII-经修饰的腺病毒载体(QGPGAP-Fib/CD4-pVII/PyCS)，其构造如图6所示，采用(QGPGAP)n(SEQIDNO:59)的B细胞表位和编码序列YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK(SEQIDNO:61)的CD4表位；以及HVR1,纤突和pVII-经修饰的腺病毒载体(QGPGAP-HVR1/Fib/CD4-pVII/PyCS)，其构造如图8所示，采用(QGPGAP)n(SEQIDNO:59)的B细胞表位，和编码序列YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK(SEQIDNO:61)的CD4表位。
在其它实施方式中，重组腺病毒可以通过以下经修饰的P.falciparum或P.yoelii重组腺病毒质粒载体之一生成：NANP-HVR1/PfCSP或QGPGAP-HVR1/PyCS(图2)，NANP-Fib/PfCSP或QGPGAP-Fib/PyCS(图4)，NANP-HVR1/B-Fib/PfCSP或QGPGAP-HVR1/B-Fib/PyCS(图5)，NANP-HVR1/CD4-pVII/PfCSP或QGPGAP-HVR1/CD4-pVII/PyCS(图7)，NANP-Fib/CD4-pVII/PfCSP或QGPGAP-Fib/CD4-pVII/PyCS(图6)，NANP-HVR1/Fib/CD4-pVII/PfCSP或QGPGAP-HVR1/Fib/CD4-pVII/PyCS(图8)。该重组腺病毒可以根据此处所述的用于产生能够在哺乳动物寄主细胞中表达重组转基因蛋白(例如疟原虫CS蛋白)的重组腺病毒质粒载体的方法生成。
可以用已知的病毒纯化方法进行重组腺病毒的纯化。例如，通过接种昆虫细胞(1x107细胞/10cm皿)，如AD293细胞产生重组腺病毒蛋白的方法获得的0.5至1.0毫升原料病毒的纯化。然后在感染若干天后收集培养上清液，将离心获得的病毒小粒悬浮在缓冲液，如PBS(磷酸盐缓冲液盐水)中。所得悬浮液用10至60％的蔗糖梯度处理，随后离心(25,000转/分，60分钟，4℃)，以收集病毒段。收集到的病毒被进一步悬浮在PBS中，随后在如上相同条件下离心，将所得的纯化重组病毒小粒在4℃下存储于缓冲液，如PBS中。
另一实施方式涉及药物组合物，其主要包括至少一种活性成分。在一个实施方式中，该药物组合物的活性成分可以包括重组腺病毒，其可以通过此处描述的基因工程技术获得。更具体地，该活性成分可以是包括经修饰的衣壳和/或芯蛋白的重组腺病毒，其中一部分六邻体高变区(HVR)，一部分纤突蛋白，一部分pVII蛋白或其组合被至少一个疟原虫环子孢子蛋白的免疫原性的表位替代。或者疟原虫环子孢子蛋白的一个或多个B细胞和/或T细胞表位可以被插入该纤突蛋白，六邻体HVR或pVII蛋白。该重组腺病毒质粒载体进一步包括该重组腺病毒在感染一个或多个寄主细胞后表达的转基因蛋白重组转基因蛋白。该转基因蛋白或重组转基因蛋白可以是疟原虫环子孢子蛋白或疟原虫环子孢子蛋白的疟疾抗原，其中该疟疾抗原包括疟原虫环子孢子蛋白的至少一个免疫原性的表位(例如，B细胞或T细胞表位)。
在一些实施方式中，该药物组合物的活性成分是来源于重组腺病毒质粒载体的重组腺病毒，其中该重组腺病毒为以下经修饰的P.falciparum或P.yoelii重组腺病毒质粒载体之一：NANP-HVR1/PfCSP或QGPGAP-HVR1/PyCS(图2)，NANP-Fib/PfCSP或QGPGAP-Fib/PyCS(图4)，NANP-HVR1/B-Fib/PfCSP或QGPGAP-HVR1/B-Fib/PyCS(图5)，NANP-HVR1/CD4-pVII/PfCSP或QGPGAP-HVR1/CD4-pVII/PyCS(图7)，NANP-Fib/CD4-pVII/PfCSP或QGPGAP-Fib/CD4-pVII/PyCS(图6)，NANP-HVR1/Fib/CD4-pVII/PfCSP或QGPGAP-HVR1/Fib/CD4-pVII/PyCS(图8)。这些重组腺病毒质粒载体能够在被转染进入细胞(例如，AD293细胞)时产生重组腺病毒，并且其中该重组转基因蛋白可以在哺乳动物细胞，包括人类细胞中被表达。
当被给予对象时，具有此处所述的重组腺病毒作为活性成分的药物组合物可增强对疟疾感染性的抗原的疟疾感染预防作用，并降低感染性滴度，在以下实施例中对此有进一步描述。由此，该重组腺病毒可以被用于治疗与靶细胞和组织的感染有关的疟疾感染。受这种疟疾感染影响的靶细胞的例子包括血细胞，肝细胞，肾细胞，脑细胞，肺细胞，上皮细胞，和肌肉细胞。组织的例子包括肺，肝，肾，大脑，脉管，胃，肠，尿道，皮肤，和肌肉。
在一些方面，该药物组合物可以增强对感染性的抗原的疟疾感染预防作用，例如，疟疾抗原，如疟疾寄生虫的子孢子表面抗原(环子孢子蛋白(CSP)和血小板反应蛋白相关粘蛋白(TRAP)，裂殖性孢子表面膜蛋白(MSPl)，由感染疟疾的红细胞分泌的疟疾S抗原，和存在于感染疟疾的红细胞的结节(knob)中的P.falciparum红细胞膜蛋白-1(PfEMPl)蛋白。该药物组合物可以通过减少感染性滴度增强对疟原虫寄生虫的疟疾感染预防作用，该疟原虫寄生虫选自任何已知的疟原虫(P)物种，例如，P.falciparum，P.malariae，P.ovale，P.vivax，P.knowlesi，P.berghei，P.chabaudi和P.yoelii。当被给药至对象时，相比于未被给药的对象，该药物组合物导致的感染性滴度的减少增加了存活，无疾病存活，或无感染存活周期以及存活，无疾病存活，或无感染存活率。因此，在一些方面，该药物组合物可用于由病原体如疟原虫引起的疟疾感染作为预防或治疗剂。在进一步的方面，该药物组合物可用于由病原体如疟原虫引起的并发症作为预防或治疗剂。
本发明的重组腺病毒在对象中的感染预防作用可以，例如，通过给药以含本发明的衣壳-经修饰的重组腺病毒的药物组合物以及添加剂而被提供，其用于向脊椎动物，特别是哺乳动物，包括人类，通过肌内(i.m.)，皮下(s.c.)，皮内(i.c.)，真皮内(i.d.)，腹膜内(i.p.)，鼻，或呼吸路径进行药物给药，随后用含有此处描述的重组腺病毒作为活性成分的药物组合物免疫该脊椎动物若干次。为评价感染预防作用，可以将用该药物组合物免疫若干次，随后由靶标病原体(如选定的疟原虫物种)感染的对象的存活率，无疾病存活率，或无感染存活率与不给予该药物组合物的对象的存活率，无疾病存活率，或无感染存活率相比较。
在一些实施方式中，该药物组合物可以额外包括药学上有效量的此处所述的衣壳和/或芯-经修饰的重组腺病毒以及药学上可接受的载体，其被描述如下。
另一实施方式涉及疫苗组合物，其主要包括至少一种活性成分。在一个实施方式中，该疫苗组合物的活性成分可以包括来源于此处所述的重组腺病毒质粒载体的重组腺病毒。更具体地，该活性成分可以是包括经修饰的衣壳或芯蛋白的重组腺病毒，其中一部分六邻体高变区(HVR)，一部分纤突蛋白，一部分pVII蛋白或其组合被至少一个疟原虫环子孢子蛋白的免疫原性的表位替代。或者，至少一个疟原虫环子孢子蛋白的免疫原性的表位可以被插入该pVII蛋白，纤突蛋白或六邻体HVR，或其组合。在一些实施方式中，该疫苗组合物的活性成分可以来源于图2-8所示的重组腺病毒质粒载体，例如，NANP-HVR1/PfCSP或QGPGAP-HVR1/PyCS(图2)，NANP-Fib/PfCSP或QGPGAP-Fib/PyCS(图4)，NANP-HVR1/B-Fib/PfCSP或QGPGAP-HVR1/B-Fib/PyCS(图5)，NANP-HVR1/CD4-pVII/PfCSP或QGPGAP-HVR1/CD4-pVII/PyCS(图7)，NANP-Fib/CD4-pVII/PfCSP或QGPGAP-Fib/CD4-pVII/PyCS(图6)，NANP-HVR1/Fib/CD4-pVII/PfCSP或QGPGAP-HVR1/Fib/CD4-pVII/PyCS(图8)。
在一些方面，该疫苗组合物在被给予对象时，其首先包括重组腺病毒，其具有被插入或替代至少一部分衣壳或芯蛋白的具有疟原虫CS蛋白的一个或多个抗原性的部分(即，B细胞表位，T细胞表位或它们两者)。该疫苗组合物即可表达重组转基因蛋白，其中该重组转基因蛋白是包括B细胞表位，T细胞表位或两者的疟原虫CS蛋白。该疟原虫CS蛋白的抗原性部分被发现于该重组转基因蛋白中，并且该经修饰的衣壳或芯蛋白促进或增强获得性体液免疫，细胞免疫，或两者，如以下实施例所述。因此，在一些方面，此处所述的该重组腺病毒可作为疫苗用于激发或增强体液免疫，细胞免疫，或两者。
在进一步的实施方式中，该疫苗组合物可以增强对感染性的抗原的感染预防作用，例如，疟疾抗原，如疟疾寄生虫的子孢子表面抗原(CSP和TRAP)，裂殖性孢子表面膜蛋白(MSPl)，由感染疟疾的红细胞分泌的疟疾S抗原，和存在于感染疟疾的红细胞的结节(knob)中的PfEMPl蛋白，富丝氨酸抗原(SERA)蛋白，富酪氨酸酸式基质蛋白(TRAMP)，和顶膜抗原-1(AMAl)蛋白。此外，相比于未被给药以该疫苗组合物的对象，由此处所述的疫苗组合物的给药导致的感染性滴度(例如，病毒感染性滴度)降低可以增加存活，无疾病存活，或无感染存活周期以及存活，无疾病存活，或无感染存活率。因此，在一些方面，该疫苗组合物也可用于由病原体如疟原虫引起的疟疾感染作为预防或治疗剂。在进一步的方面，该疫苗组合物也可用于由病原体如疟原虫引起的并发症作为预防或治疗剂。
此处所述的疫苗组合物可以包括治疗有效量的此处所述的重组腺病毒，并进一步包括根据标准方法的药学上可接受的载体。可接受的载体的例子包括生理可接受的溶液，如无菌盐水和无菌缓冲盐水。
在一些实施方式中，该疫苗或药物组合物可以和药学有效量的佐剂组合使用，以增强抗疟疾作用。任何可以刺激免疫系统并增加对疫苗的反应，而没有本身没有任何特异性抗原作用的免疫佐剂均可被用作佐剂。许多免疫佐剂模仿被称为病原体相关分子模式(PAMP)的改良保守分子，并被称为Toll类受体(TLR)的一组免疫受体识别。可以根据此处描述的实施方式被使用的佐剂的例子包括弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，双链RNA(TLR3配位体)，LPS，LPS类似物(如单磷酰脂A(MPL)(TLR4配位体))，鞭毛蛋白(TLR5配位体)，脂蛋白，脂肽，单链RNA，单链DNA，咪唑喹啉类似物(TLR7和TLR8配位体)，CpGDNA(TLR9配位体)，里比氏佐剂(单磷酰脂A/海藻糖dicorynoycolate)，糖脂(α-GalCer类似物)，非甲基化CpG岛，油乳剂，脂质体，病毒体，皂草苷(皂草苷的活性部位，如QS21)，胞壁酰二肽，矾，氢氧化铝，角鲨烯，BCG，细胞因子(如GM-CSF和IL-12)，趋化因子(如MIP1-α和RANTES)，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(MDP)，胸腺素αl和MF59。佐剂的用量可以根据症状程度适当选择，如皮肤的软化，疼痛，红斑，发热，头痛，和肌肉疼痛，在这类疫苗给药后，其可能在人类或动物中被表现为部分免疫反应。
在一些实施方式中，此处所述的疫苗或药物组合物可以和其它已知的药物产品组合使用，如免疫反应激发肽和抗菌剂(合成抗菌剂)。该疫苗或药物组合物可以进一步包括其它药物和添加剂。可以和此处所述的疫苗或药物组合物组合使用的药物或添加剂包括有助于本发明的重组腺病毒或重组转基因蛋白的胞内摄入的药物，激发转染的脂质体及其它药物和/或添加剂，(例如，碳氟化合物乳化剂，蜗形管，细管，金颗粒，可生物降解的微球体，和阳离子聚合物)。
在一些实施方式中，包含于此处所述的疫苗或药物组合物中的活性成分可以选自大范围的浓度，病毒颗粒单元(VPU)，斑块形成单元(PFU)，重量体积百分比(w/v％)或活性成分含量的其它定量标准，只要其为治疗或药学有效量。该疫苗或药物组合物的剂量可以根据期望的治疗作用，给药方法(给药途经)，治疗周期，患者的年龄，性别，及其它条件等等选自宽泛的范围。
在一些方面中，当重组腺病毒被给药至人类对象作为该疫苗或药物组合物的活性成分时，该重组腺病毒的剂量可以按照该重组病毒的PFU计算的大约相当于每患者102至1014PFU的量进行给药，优选每患者105至1012PFU，更优选每患者106至1010PFU。
在更多的方面，当重组腺病毒被给药至对象作为该疫苗或药物组合物的活性成分时，在被引入该疫苗寄主的可表达DNA的量或者转录RNA的量上，该剂量可以在大范围内进行选择。该剂量也依赖于转录本和用于任何转移载体的转译启动子的强度。
在一些实施方式中，此处所述的疫苗组合物或药物组合物可以通过直接注射将该重组腺病毒悬浮在PBS(磷酸盐缓冲盐水)或盐水中制备的重组腺病毒悬浮液进入局部位点(例如，进入肺组织，肝，肌肉或大脑)，通过鼻或呼吸吸入，或通过血管内(i.v.)(例如，动脉注射，静脉注射，和静脉输送)，皮下(s.c.)，皮内(i.c.)，真皮内(i.d.)，或腹膜内(i.p.)给药。本发明的疫苗或药物组合物可以给药超过一次。更具体地，在初次给药后，可以给予额外的一次或多次接种，作为激发。一次或多次激发给药可以增强预期的效果。在该疫苗或药物组合物给药后，可以用此处所述的包含该重组腺病毒的药物组合物进行激发免疫。
在更多的实施方式中，与如上所述的本发明的疫苗一起使用各种其它佐剂，药物或添加剂可以增强该疫苗或药物组合物给药实现的治疗作用。该药学上可接受的载体可以包括痕量的添加剂如增强等渗压性和化学稳定性的物质。这种添加剂在使用的剂量和浓度下应对人类或其它哺乳动物无毒性，其例子包括缓冲剂，如磷酸，柠檬酸，琥珀酸，乙酸，及其它有机酸，及其盐；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(例如，低于10个残基)的多肽(例如聚精氨酸和三肽)蛋白(例如，血清白蛋白，明胶，和免疫球蛋白)；氨基酸(例如，甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，和精氨酸)；单糖，二糖，及其它糖类(例如，纤维素及其衍生物，葡萄糖，甘露糖，和糊精)，螯合剂(例如EDTA)；糖醇(例如甘露糖醇和山梨糖醇)；平衡离子(例如钠)；非离子型表面活性剂(例如聚山梨酸酯和泊洛沙姆)；和PEG。
此处所述的包含重组腺病毒的疫苗或药物组合物可以作为水溶液或冻干制品在单位剂量或多剂量容器中存储，如密封的安瓿或瓶中。
另一实施方式进一步提供预防疟疾感染的方法，或治疗疟疾的方法，其包括给药以有效量的该重组腺病毒疫苗，制剂，或药物组合物。本发明进一步提供免疫刺激方法，其包括给药以有效量的重组腺病毒疫苗组合物，制剂，药物组合物或其组合至对象。对象可以包括人类，动物(如哺乳动物，鸟类，爬行动物，鱼，和两栖动物)，或任何其它可以感染疟疾寄生虫的对象。疟疾寄生虫可以包括疟原虫寄生虫，其选自任何已知的疟原虫(P)物种，例如，P.falciparum，P.malariae，P.ovale，P.vivax，P.knowlesi，P.berghei，P.chabaudi和P.yoelii。
在一些实施方式中，此处所述的重组腺病毒可以被单独形成，或者和药学上可接受的载体一起组成疫苗组合物，制剂，或药物组合物，并被给药至对象。给药途经可以是，例如，任何上述的给药途经。用于本发明的药学上可接受的载体可以适当地根据要被生成的药物组合物的形式选自通常用于此技术领域的载体。例如，当该药理学组合物被形成为水溶液时，纯水(无菌水)或生理缓冲溶液可被用作载体。当该药物组合物被形成为其它适当的溶液时，能被注射的有机酯(如乙二醇，丙三醇和橄榄油)可以被用作载体。该组合物可以包含稳定剂，赋形剂及其它在此技术领域，特别是在疫苗配制领域通常使用的物质。
在进一步的实施方式中，用于疫苗组合物，制剂，或药物组合物的重组腺病毒的量可以合适地选自大范围的浓度，VPU，PFU，重量体积百分比(w/v％)或其它活性成分含量的定量标准。在一些方面，该组合物中的重组腺病毒的适合范围优选为约0.0002至约0.2(w/v％)，更优选0.001至0.1(w/v％)。根据一些实施方式的重组腺病毒疫苗组合物，制剂，或药物组合物的给药方法可以根据剂型，患者年龄，性别及其它条件，如疾病严重程度合适地选择。适合的剂量形式为用于肠胃外给药形式，如注射，滴注，滴鼻，和吸入。当该组合物被形成为注射剂或滴注剂时，该注射剂可以被静脉内给药，并酌情和置换流体如葡萄糖溶液或氨基酸溶液混合，或可以被肌内(i.m.)，皮内(i.c.)，皮下(s.c.)，皮内(i.d.)，或腹腔内(i.p.)给药。
在其它实施方式中，重组腺病毒疫苗组合物，制剂，或药物组合物的每日剂量可以根据对象的症状，体重，年龄，性别等变化。在一些方面，重组腺病毒的剂量为每公斤体重每天约0.001至100毫克。此发明的疫苗，制剂，或组合物可以每天给药一次或多次。
在进一步的实施方式中，当重组腺病毒被给药至人类对象作为该疫苗组合物，制剂或药物组合物的活性成分时，该重组腺病毒的剂量按照以该重组病毒颗粒的PFU计算的大约相当于每患者102至1014PFU的量进行给药，优选每患者105至1012PFU，更优选每患者106至1010PFU。本发明的疫苗组合物应根据良好医疗实践给药，考虑每一患者的临床状况(例如，要进行预防或治疗的状况)，包含该重组腺病毒的疫苗组合物的输送位点，靶组织，给药方法，剂量方案，及其它本领域技术人员所了解的因素。因此，此处的疫苗组合物的适当剂量是考虑上述内容确定的。
此公开的又一个实施方式涉及在对象中治疗或预防疟疾感染的方法，该方法包括给药以免疫或治疗量的含重组腺病毒的疟疾疫苗组合物。该疟疾疫苗的重组腺病毒可以包括疟原虫寄生虫的抗原决定簇，并可以进一步包括一种或多种经修饰的衣壳或芯蛋白。免疫，药理学或治疗量可以是任何适合的量，其可以产生对该(CS)蛋白的一个或多个抗原性部分(即，转基因，B细胞表位，或CD4+T细胞表位)的有效免疫反应，使疟疾感染被阻止或严重程度降低。
当对象首次暴露或“初次”至腺病毒载体时，免疫系统产生抗该特异性载体的中和抗体。对该腺病毒的免疫反应总体上导向该衣壳蛋白。因此，后续的对相同腺病毒载体的暴露，或“激发”，可以减少转基因表达的效力。因此在一些实施方式中，如上所述的治疗或预防疟疾感染的方法可以包括使用第一重组腺病毒载体的初始步骤，其后是使用一种或多种不同的重组腺病毒载体的激发步骤。此方法可以被用于从未暴露至野生型腺病毒的对象，或先前曾暴露于野生型腺病毒载体的对象，其中该初始准备步骤的重组腺病毒载体被用于规避已经存在的腺病毒免疫。进一步的实施方式和例子描述如下。
腺病毒作为载体
腺病毒是非包封的DNA病毒，其包括一组病毒壳体蛋白(如下所述)和病毒基因组，其已经广泛地被用于在体外和体内输送一种或多种治疗或抗原性的转基因至各种细胞。存在许多腺病毒血清型。在已知的腺病毒血清型中，血清型5(Ad5)由于其强烈的体内感染性优选被用作外源基因转导的载体(Abbink等人2007)。可以通过现有技术已知的任何启动子或增强子元件控制抗原性的转基因的表达。可被用于控制基因表达的启动子包括但不限于，巨细胞病毒即刻早期启动子(CMV)，猿猴病毒40(SV40)早期启动子，细胞多肽链伸长因子1α(EF1)启动子，劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子，和四环素调节(TR)启动子。该编码序列后的聚腺苷酸化(pA)信号也可以被用于有效转录和转译。此处所述的重组腺病毒载体可以是复制有缺陷的，其至少在该腺病毒基因组的E1区域有缺失，因为该E1区域为复制，转录，转译和包装过程所需。在一些方面，该E2，E3和/或E4区域也可以被删去。在进一步的方面，可以将Kozak交感序列用于更有效的转译(Kozak1987)。
出于很多理由，腺病毒(Ad)系统是研制重组疫苗的有吸引力的载体。一个理由是重组腺病毒载体感染多数哺乳动物细胞类型(复制型和非复制型)，包括，但不限于，小鼠和人类细胞类型。因此，相同的载体可以成功用于小鼠模型和相似的人类临床试验。另一理由是任何被转移的遗传信息保持不与寄主染色体整合，避免了插入诱变和细胞基因型的改变(Crystal1995)。又一个理由是该转基因在相继的病毒复制循环后保持不变。采用腺病毒的其它优点包括，重组腺病毒：1)具有高毒粒稳定性，2)耐受好，3)可以在高滴度下成长，4)可以容纳大的转基因，5)具有已被广为研究多年的基因组，若干血清型的完整DNA序列是已知的，这有助于通过重组DNA技术的Ad基因组操作(Graham和Prevec1992)。
在一个实施方式中，该腺病毒疫苗平台被用作以前红细胞疟疾寄生虫为靶标，并提供疟疾感染防护的疫苗研发的病毒载体。在已知的重组病毒载体(Rodrigues等人1997，等人2001，Anderson等人2004，Tao等人2005)之中，腺病毒已经被证明为适合的用于疟疾疫苗的病毒载体，因为它可以对红细胞疟疾寄生虫诱导强烈的保护性的细胞免疫反应(Rodrigues等人1997)。该疟疾寄生虫可以是任何一个疟原虫家族。在一些实施方式中，被靶向的寄生虫可以是P.yoelii或P.falciparum。
表达PyCS作为转基因的腺病毒载体引起疟疾特异性CD8+T细胞反应
腺病毒是用于诱导对疟疾的明显的CD8+T细胞调节的保护性免疫的有吸引力的载体(Rodrigues等人1997，Rodrigues等人1998)。采用啮齿类疟疾模型测定表达P.yoelii(啮齿类疟疾寄生虫)CS蛋白，AdPyCS的重组腺病毒的致免疫力。用AdPyCS对小鼠的接种以明显的在小鼠中的比例诱导完全的免疫，预防了寄生物血症的发生(Rodrigues等人1997)。此种保护效应主要由CD8+T细胞调节，T细胞群的消耗可以证明这一点，并且AdPyCS不能对疟疾寄生虫诱导高滴度的抗体反应可以印证这一点。
为了定量地测量衣壳-经修饰的腺病毒的感染性，该穿梭载体可以包含用于转基因的GFP表达盒和克隆位点。所得穿梭载体(GFP/pShuttle-CMV)具有用于转基因的双pCMV启动子和SV40pAs，以及来自pmaxGFP的GFP(Amaxa，德国)。优化的PyCS片段被插入GFP/pShuttle-CMV的KpnI和HindIII位点中。
通过测量CS特异性的CD8+T细胞反应的量级和对疟原虫的肝脏阶段的保护性免疫的水平，测定Ad(PyCS+GFP)的致免疫力。通过不同的途径以适量1010病毒颗粒(v.p.)进行的Ad(PyCS+GFP)给药引起相同的抗疟疾保护性反应模式，显示AdPyCS引起，在受活P.yoelii子孢子侵袭的小鼠中，诱导最强反应的s.c.和i.m.途径导致最高程度的肝脏阶段抑制。这显示了作为疫苗，Ad(PyCS+GFP)与AdPyCS表现相当(Rodrigues等人1997)，并且其为潜在性的可用于体内测定AdPyCS向性的工具。
腺病毒衣壳和芯蛋白
以上研究确认了表达CS蛋白的重组腺病毒载体可通过CD8+T细胞引起强烈的细胞免疫反应，但没有明显的体液反应。因此，由于对野生型腺病毒的体液反应常常可以归因于衣壳蛋白，构造了具有经修饰的衣壳和芯蛋白的重组腺病毒载体，以1)通过B细胞活化增强体液免疫，2)通过T辅助细胞活化增强体液免疫，和3)规避现存的腺病毒免疫。
腺病毒是非包封的裸露双链DNA病毒，其具有二十个等边三角形面的廿面体形状。该腺病毒衣壳由252个衣壳体组成，其中240个是六邻体三聚物，12个是五邻体五聚物。从每一个五邻体底部伸出的纤突蛋白通过与细胞受体的相互作用调节连接至寄主细胞。二级相互作用发生在该五邻体底部具有αvβ3，αvβ5和类似的整联蛋白的RGD(Asp-Arg-Gly)基序之间，其促进后续的腺病毒进入该细胞的内在化(Mathias等人1994，Wickham等人1993)。大部分腺病毒使用coxsackie-腺病毒受体，CAR，作为细胞受体(Bergelson等人1997)。此外，MHC类别I分子，VCAM，和硫酸乙酰肝素，据显示可调节Ad5的连接和进入(Chu等人2001，Hong等人1997)。通过胞吞进入之后，Ad5迅速脱离内吞隔室进入细胞液(Meier和Greber2003，Leopold和Crystal2007)。然后该毒粒用微管转至细胞核。该纤突蛋白在该过程中被蜕变为最早的衣壳蛋白(Nakano等人2000，Hong等人2003)。不同血清型的腺病毒证明了不同的通行模式(Miyazawa等人1999，Miyazawa等人2001)。变换或修饰该纤突蛋白可以影响通行，其对于抗原递呈细胞(APC)感染后的抗原处理和呈递可能特别重要。
该腺病毒纤突是三聚体，分成纤突尾部，轴和结节域(Henry等人1994，Rux和Burnett2004，Chroboczek等人1995)。该结节域的三维结构是已知的，并且和诱变研究一起，这些研究使涉及CAR相互作用和三元聚合的区域变得直观(Kirby等人1999，Xia等人1995)。该纤突轴从该毒粒伸出，且该纤突结节包含Coxsackie和腺病毒受体(CAR)相互作用域(Roelvink等人1999，Bewley等人1999)。该纤突结节的CAR结合部位主要由AB环和CD环的残基组成，并二次延伸至该FG和HI环和该B，E和Fβ片(Roelvink等人1999，Bewley等人1999)。该HI环已经是经研究的在该纤突结节上最好的插入位点(Worgall等人2004，Mizuguchi和Hayakawa2004，Koizumi等人2003，Belousova等人2002，Noureddini和Curiel2005，Nicklin等人2001)，并且将表位结合进入该HI环(残基543和544)导致有效抗表位免疫(Krause等人2006)。因此，免疫优势的CS衍生的B细胞表位初始被插入该纤突蛋白的HI环。
六邻体是每毒粒720拷贝的腺病毒衣壳的最大量的蛋白。在成熟的病毒中，六邻体以同源三聚体衣壳体存在，其组成该廿面体毒粒的小平面(Rux和Burnett2004)。腺病毒血清型2和5(Ad2和Ad5)六邻体的晶体结构已经解决，其揭示复杂的分子构造(Athapilly等人1994，Roberts等人1986，Rux和Burnett2000)。每一单体亚单位的底部由两个存在于许多二十面体病毒的衣壳蛋白中的β-筒(beta-barrel)基序组成。三个大环(DE1，FG1，和FG2)从该基座伸出，以形成每一分子的塔区域(Rux和Burnett2004)。这些环区域内的序列伸出该衣壳的表面，以形成该毒粒的外部。来自不同的腺病毒血清型的对比表明位于该衣壳外部的序列极少被保持于长度和氨基酸序列两者中(Crawford-Miksza和Schnurr1996)。此外，已经证明位于这些极少保持域，称为高变区(HVR)的序列包含生成哪个血清型的特异性抗体的决定因子(Top1975，Rux和Burnett2000，Top等人1971)。
根据早期序列对比，确定七个HVR贯穿该六邻体分子(Crawford-Miksza和Schnurr1996，罗伯特等2006)。因为该HVR极少保存于血清型之间，并且看起来不参与保持六邻体的结构完整性，可以对这些域进行小的改变，而不影响该病毒的存活力(Rux和Burnett2000)。例如，六聚组氨酸标记可以被插入HVR2，HVR3，HVR5，HVR6，和HVR7，而不牺牲病毒存活力(Wu等人2005)。因此，六邻体HVR常常被用作靶标来有效诱导对于六邻体HVR中的肽的抗体反应(Worgall等人2005，Crompton等人1994)。由于其在血清型之间的长度极少的保存，以及其在该腺病毒衣壳的最外层表面上的位置(Rux和Burnett2000，Crawford-Miksza和Schnurr1996)，六邻体HVR5先被选作表位插入位点。进一步地，六邻体的晶体结构指示HVR5是在该衣壳表面上的弹性环，提示HVR5可以容纳相对大的肽，而不牺牲该衣壳的结构完整性(Roberts等人1986)。六邻体特异性的CD4+和CD8+表位近来已经被确认(Leen等人2008)，并且反应腺病毒的CD4+T细胞被集中针对人类的六邻体蛋白中所保存的残基(Onion等人2007，Heemskerk等人2006)。
该腺病毒芯由病毒基因组和四个芯蛋白组成。该末端蛋白(TP)以每毒粒两拷贝通过共价键连接每一个线性病毒DNA链的5'端。通过富精氨酸部分非共价和非特异性结合该病毒DNA的是三个其它的芯蛋白mu(μ)，V(pV)和VII(pVII)。pVII是主要的芯蛋白，其大致作用于每毒粒700-800拷贝，并作为组蛋白状的中心，病毒DNA以其为中心被包裹形成核粒结构。
修饰腺病毒衣壳蛋白以增强体液免疫
在一些实施方式中，描述了在腺病毒衣壳蛋白中(插入六邻体或纤突)具有免疫优势CS蛋白B表位的环子孢子(CS)腺病毒载体。该转基因可以在启动子(如CMV)之下，以增强对CS蛋白的细胞调节的和体液的免疫反应。
在疟原虫物种之中，中央重复区域是CS蛋白的保守结构，针对此重复序列的抗体已经被证明具有子孢子中和活性。疟原虫CS蛋白中的重复序列的例子是(NANP)n重复片段(P.falciparum；SEQIDNO:60)，ANGAGNQPG重复片段(P.vivax；SEQIDNO:63)和NAAG重复片段(P.malariae；SEQIDNO:64)，其可以被插入腺病毒衣壳蛋白。在一些实施方式中，四个或四个以上PfCSP的(NANP)n重复片段(SEQIDNO:60)可以被插入腺病毒血清型5六邻体的HVR1中。在一些实施方式中，PfCSP的二，四，六，八，十，十四，十六，十八，二十，二十二，二十四，二十六，或二十八个(NANP)n重复片段(SEQIDNO:60；n＝2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28)被插入腺病毒血清型5六邻体的HVR1中。该(NANP)n重复序列可以被额外插入纤突的HI环中。
在一些实施方式中，变换对CS的免疫优势的中和B细胞表位来研发改进的CS蛋白腺病毒疫苗。用重组P.yoeliiCS蛋白(PyCS)免疫的小鼠产生对两个主要的免疫优势B表位，QGPGAP(SEQIDNO:59)和QQPP(SEQIDNO:65)的高滴度，但体外中和分析显示，对QGPGAP表位(SEQIDNO:59)的体液免疫反应本身可归因于中和活性，因为该中和可以通过加入(QGPGAP)3肽(SEQIDNO:59；n＝3)至该介质而被逆转。在一些实施方式中，三个或三个以上PyCS的(QGPGAP)n重复片段(SEQIDNO:59)被插入腺病毒血清型5六邻体的HVR1中。在一些实施方式中，PyCS的三，四，五，六，七，八，九，十，十一，或十二个(QGPGAP)n重复片段(SEQIDNO:59；n＝3，4，5，6，7，8，9，10，11，12)被插入腺病毒血清型5六邻体的HVR1中。该(QGPGAP)n重复序列可以被额外插入纤突的HI环中。
该B细胞表位肽应被呈现在腺病毒毒粒的表面上，以使得免疫系统可以有效识别该表位。这种插入位点可以是六邻体的HVR和纤突的环结构，并且不同的插入位点可以组合。
修饰腺病毒和芯蛋白以增强T辅助细胞活化
在另一实施方式中，对用于腺病毒载体的转基因特异性的CD4+表位可以被并入腺病毒蛋白，如pVII，pV和六邻体，以增加该基于腺病毒的疫苗的致免疫力。专门的抗原递呈细胞(APC)，如树突状细胞(DC)和B细胞可以通过胞吞摄入微粒病原体状的病毒颗粒并将该病原体中的CD4+表位呈递至CD4+T细胞，该T细胞作为体液和/或细胞免疫反应的辅助细胞。由于一个毒粒中的高拷贝数的pVII(700-800拷贝)和六邻体(720拷贝)，pVII和六邻体可以易于被用作腺病毒靶蛋白来插入抗原性的CD4+肽。
修饰腺病毒衣壳蛋白以规避存在的腺病毒免疫
在一些实施方式中，腺病毒纤突和六邻体衣壳蛋白可以被修饰以插入B细胞或T辅助细胞表位，来克服存在的对腺病毒的免疫和/或增强对腺病毒疫苗的体液反应。在人类人口中估计有80％的年轻成年人具有通行的对腺病毒，特别是对于血清型5(Ad5)的中和抗体(Douglas2007)。在利用腺病毒作为基因治疗载体的研究中，发现动物中的中和抗体的存在限制由腺病毒输送的转基因的表达。除中和抗体之外，CD8+T细胞反应也帮助限制重组基因表达(Yang等人1995，Yang等人1996)。先前曾报道这种前存的对腺病毒的免疫抑制重组腺病毒疫苗的效力(Papp等人1999)并在临床试验中降低基于腺病毒的疫苗的致免疫力(Priddy等人2008)。
六邻体是主要的用于抗Ad衣壳免疫反应的靶标(Roy等人2005，Wohlfart1988)，并且可能具有腺病毒的有效佐剂效应，包括诱导CD4+和CD8+T细胞反应。因此，已经采用了的规避前存的抗腺病毒免疫的一种策略是用不同的蛋白全部或部分替换六邻体，例如，用稀少的血清型如腺病毒11，24，26和35。因为六邻体是主要的抗腺病毒中和抗体的靶标(Youil等人2002，Sumida等人2005)，可以用该稀少血清型替换全部六邻体或六邻体的HVR(Wu等人2002，Roberts等人2006)。
在此处一个实施方式所述的另一策略中，腺病毒六邻体可以通过用抗原性的肽置换HVR1或HVR5进行修饰，以规避前存的抗腺病毒免疫或由先前接种腺病毒载体诱导的抗腺病毒中和抗体。在一些实施方式中，抗原性的肽可以是疟原虫CS蛋白的免疫原性的表位，并且在某些方面，该表位可以包括中央重复序列，CD4+表位序列或CD8+表位序列。
由于免疫之后为抗Ad免疫，不能用相同血清型的Ad载体重复给药。因此，许多Ad疫苗妨碍了通过阻止该转基因编码的抗原的表达和呈现的疫苗激发(Yang1995，Hackett等人2000，Harvey等人1999，Mastrangel等人1996)。根据一些实施方式，添加特异性表位至该Ad衣壳，如以下例子所述，可以减少或去除此种障碍。
以下例子用于更好地阐述实施方式，其不可被解释为限制所要求保护的实施方式范围。所提及的特定材料的范围仅仅是为了说明，而不是为了限制本发明。在不离开本发明范围的前提下，本领域技术人员无需进行发明性的劳动即可以发展等价的手段或试剂。应当理解，此处所述的步骤中可以进行许多变化，但其仍然在本发明范围中。发明人的意图是将这种变化也包括于本发明的范围中。
实施例1：衣壳-经修饰的疟原虫环子孢子蛋白腺病毒质粒载体和重组腺病毒颗粒 的构建
表位定位
首先，选取PyCS中免疫优势的中和B细胞表位。用重组PyCS-蛋白以不完全的弗氏佐剂免疫小鼠三次，并用该混合血清测定中和抗体的关键表位。
简言之，在该中和分析中，表达HepG2细胞的人CD81被用作靶细胞。CD81是疟疾寄生虫在肝细胞中形成纳虫空泡所需的分子，它们在肝细胞中繁衍和发展成为裂殖体(Silvie等人2006)，由此大幅增加子孢子的体外感染性。
在此分析中，PyCS合成肽被添加至阱，以阻断肽特异性抗体。表位定位结果显示该PyCS中央重复序列，QGPGAP(SEQIDNO:59)在PyCS中是比QQPP(SEQIDNO:65)更有效的中和表位。因此，采用插入该(QGPGAP)n表位(SEQIDNO:59)来修饰腺病毒衣壳蛋白，六邻体和/或纤突。
衣壳-经修饰的质粒载体的构建
通过在该克隆位点下插入GFP-表达盒修饰腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV(突变)。首先，pmaxGFP(Lonza，Cologne，德国)的BsmBI-SacI片段(pCMV+GFP)和SacI-BsmBI片段(SV40聚A信号)被末端齐平并分别插入pUC19的已齐平Sall和Kpnl位点。所得pCMVGFP/pUC19的BamHI-EcoRI片段被插入SV40pA/pUC19的相同位点，以形成SV40pA-pCMV-GFP片段。该片段被齐平并插入pShuttle-CMV的EcoRV位点。所得穿梭载体(GFP/pShuttle-CMV)具有双pCMV启动子和转基因和GFP的SV40pAs。
进行该腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV的另一修饰，用来自pQBI-AdCMV5(QBIO基因)的CMV5启动子替换该CMV启动子区域。用包含该CMV5启动子序列的片段和来自pShuttle-CMV中的CMV启动子的上游序列代替pShuttle-CMV的SgrAI-KpnI片段，以构建pShuttle-CMV5载体。
除(QGPGAP)n重复片段(SEQIDNO:59)之外，该P.yoeliiCS(PyCS)基因通过基于JCat密码子优化算法(http://wwwjcatde/)重叠PCR反应而被密码子优化。
P.falciparum3D7菌株的PfCSP氨基酸序列被用作模板序列，用于密码子优化。通过IntegratedDNATechnologies(Coralville，IAUSA)的优化软件进行用于人类中蛋白表达的密码子优化。通过IntegratedDNATechnologies合成DNA片段，其编码除在C-末端(图10；SEQIDNO:2)的GPl锚定基序之外的完整的PfCSP。
密码子优化的PyCS基因(图9；SEQIDNO:1)或PfCSP基因(图10；SEQIDNO:2)被被插入pShuttle-CMV，pShuttle-CMV5，或GFP/pShuttle-CMV的KpnI和HindIII位点中。将所得的编码腺病毒穿梭载体的疟原虫环子孢子蛋白用于和AdEasy-1同源重组，以构建具有疟原虫环子孢子抗原性基因和无损的腺病毒蛋白编码序列的腺病毒基因组。简言之，编码腺病毒穿梭载体的疟原虫环子孢子蛋白由PmeI酶切消化线性化，用该线性化的穿梭载体和pAdEasy-1载体(Bruna-Romero等2003)共同变换大肠杆菌BJ5183细胞，用于同源重组。
图1总结和示意了腺病毒衣壳蛋白的修饰。在该腺病毒基因组DNA中的HVR1序列的修饰被示意于图2。简言之，用SfiI消化AdEasy-1，并用EcoRI-SfiI和PstI-SfiI连结体低聚物将6.4kbp片段亚克隆进入pUC19的EcoRI和PstI位点。为了用疟原虫环子孢子蛋白的B细胞表位替换HVR1，通过二步骤的PCR放大包含AgeI和NdeI位点的该区域，其采用具有代替HVR1序列的表位序列的先导物。用AgeI和NdeI消化该PCR产品，然后在SfiI/pUC19载体中将其用于替换SfiI片段的天然的AgeI-NdeI区域。确定该序列后，用包含该环子孢子表位序列的SfiI片段代替腺病毒基因组DNA的SfiI片段，以产生HVR1-经修饰的六邻体。在一些实施方式中，HVR-经修饰的六邻体可以具有核苷酸序列：SEQIDNO:3(图11),SEQIDNO:4(图12),SEQIDNO:5(图13),SEQIDNO:6(图14),SEQIDNO:7(图15),SEQIDNO:8(图16),SEQIDNO:9(图17),SEQIDNO:10(图18),SEQIDNO:11(图19),SEQIDNO:12(图20),SEQIDNO:13(图21),SEQIDNO:14(图22),SEQIDNO:15(图23),SEQIDNO:16(图24),SEQIDNO:17(图25),SEQIDNO:18(图26),SEQIDNO:19(图27),SEQIDNO:20(图28),SEQIDNO:21(图29),SEQIDNO:22(图30),或SEQIDNO:23(图31).
为了在HVR1中插入(NANP)28(SEQIDNO:60；n＝28)，通过PCR采用在5'具有六邻体特异性序列和在3'具有NANP特异性序列的先导物放大密码子优化的PfCSP的一部分中央重复区域，并且将所得的DNA片段通过第二PCR插入该AgeI-NdeI区域中。
对于HVR5-修饰，如图3所示，XbaI地点被引入六邻体的L1环中的HVR5，然后被合成，将编码疟原虫环子孢子蛋白表位的磷酸化的双链低聚物插入该XbaI位点。通过序列测定确认插入(图31；SEQIDNO:23)。
对于纤突修饰，如图4所示，采用EcoRI-PacI和PstI-SpeI连结物低聚物，将AdEasy-1的SpeI-PacI片段亚克隆进入pUC19的EcoRI和PstI位点。为了将疟原虫环子孢子蛋白B细胞表位序列插入纤突结节的Hl环，采用具有该表位序列的先导物通过二步骤的PCR放大包含EcoNI(或NheI)和MfeI位点的区域。用EcoNI(或NheI)和Mfel消化该PCR产品，然后将其用于替换Spel-PacI/pUC19载体中的纤突的天然的EcoNI(或NheI)-MfeI区域。确认该序列后(图32，SEQIDNO:24；图33，SEQIDNO:25)，用包含该表位序列的SpeI-PacI片段代替AdEasy-1的SpeI-PacI片段。将所得的纤突-经修饰的腺病毒DNA用于和编码腺病毒穿梭载体的疟原虫环子孢子蛋白同源重组，以产生纤突-经修饰的疟原虫环子孢子蛋白腺病毒DNA。
为了构建具有两个表位插入物的HVR1和纤突-经修饰的腺病毒DNA，使用图5所示的在HVR1具有环子孢子蛋白表位的SfiI-SfiI片段代替纤突-经修饰的腺病毒DNA的SfiI-SfiI片段。
为了修饰pVII的的C-末端，采用具有该环子孢子蛋白表位序列的先导物通过两步骤PCR放大包含SfiI和SalI位点的区域。用SfiI和SalI消化该PCR产品，然后将其用于替换SfiI/pUC19载体的天然SfiI-SalI区域(图6，7和8)。确认该序列后(图34，SEQIDNO:26；图35，SEQIDNO:27)，在pVII中用具有该环子孢子蛋白表位的SfiI-SfiI片段代替HVR1和/或纤突-经修饰的环子孢子蛋白腺病毒DNA的SfiI-SfiI片段。
为了在pVII中插入环子孢子蛋白CD4+表位序列EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQIDNO:62)，通过酶切消化制备7.7kb的pAdEasy-1的片段，并采用RsrII连结物(RsrII/pUC19)将其克隆于pUC19质粒的EcoRI和HindIII位点之间。采用具有该表位序列的先导物通过两步骤PCR放大在RsrII/pUC19中包含AscI和BglII位点的该区域。用AscI和BglII消化该PCR产品，然后将其用于替换RsrII/pUC19质粒中的天然AscI和BglII区域。确认该代替区域的序列后(图36，SEQIDNO:28；图37，SEQIDNO:29)，用包含该表位序列的RsrII片段代替HVR1-经修饰的腺病毒DNA的RsrII片段。
生成下表1(P.yoelii)和表2(P.falciparum)所列的重组腺病毒，以评估表位插入在感染性，致免疫力和对前存的抗腺病毒免疫的敏感性上的作用。使用的重组腺病毒载体是复制有缺陷的，E1和E3-删减的腺病毒血清型5(启动基因)。图1显示了衣壳-经修饰的疟原虫环子孢子蛋白重组腺病毒的示意结构。
表1.重组腺病毒(约氏疟原虫环子孢子蛋白)
表2.重组腺病毒(镰状疟原虫环子孢子蛋白)
通过PacI酶切消化纯化和线性化该衣壳-经修饰的腺病毒基因组DNA质粒，并将其用于AD293细胞的转染。
由该转染的AD293细胞通过四轮冷冻/解冻制备腺病毒颗粒，并将其用于进一步的病毒扩增。最后一次扩增后，以CsCl梯度离心纯化腺病毒颗粒。集中该频带并针对渗析缓冲液渗析以去除CsCl。根据O.D.260(1O.D.260＝1.25x1012v.p./mL)计算病毒颗粒(v.p.)(Bruna-Romero等人2003)。
在该腺病毒扩增步骤期间，在衣壳-经修饰的腺病毒之间观察到腺病毒生长上的细小差异，证明腺病毒感染性和产率未受到该修饰的不良影响。
实施例2：约氏疟原虫环子孢子蛋白特异性免疫反应
约氏疟原虫重组腺病毒的确认
编码腺病毒穿梭载体的疟原虫环子孢子蛋白被用于瞬时转染，以用AD293细胞确认疟原虫环子孢子蛋白表达(图38)。转染24小时后，在SDS样品缓冲液中裂解细胞，随后用抗PyCS单克隆抗体(9D3)进行SDSPAGE电泳和蛋白质印迹。
为了确认该表位插入腺病毒衣壳蛋白，用识别该(QGPGAP)n(SEQIDNO:59)重复片段的抗子孢子抗体通过SDS-PAGE(2x109v.p./列)和蛋白质印迹(1x109v.p./列)分析纯化的重组腺病毒，如图39A和40A所示。图39A中的谱带强度与腺病毒毒粒中衣壳蛋白的拷贝数有关：纤突的拷贝数(每毒粒36拷贝)是六邻体(每毒粒720拷贝)的二十倍。图39A第4列中的低谱带可能为降解的六邻体。图40A中的谱带强度与被插入HVR1中的(QGPGAP)n(SEQIDNO:59)重复片段的数目有关。
为了评价PyCS-B表位是否被暴露于腺病毒毒粒外，将顺次稀释纯化的重组腺病毒涂覆在酶联免疫吸附分析(ELISA)板上，并用识别(QGPGAP)n(SEQIDNO:59)重复片段的抗PyCS抗体检测。该抗体识别所有的衣壳-经修饰的腺病毒(图39B和40B)。ELISA分析结果提示被并入衣壳蛋白的PyCS-B表位良好地暴露于腺病毒毒粒之外。
用衣壳-经修饰的PyCS腺病毒免疫后的约氏疟原虫环子孢子蛋白特异性免疫反应
从Taconic(Hudson，NY，美国)购买六至八周大的雌性BALB/c小鼠，并将其在洛克菲勒大学实验室动物研究中心保持在标准条件下。将腺病毒稀释在PBS中并以指示剂量注入肌内用于免疫。
为了评估单一免疫后的重组腺病毒的致免疫力，用1x109v.p.的各种重组PyCS腺病毒肌内免疫BALB/c小鼠组(每组五只)，免疫2周后通过ELISPOT测量PyCS特异性细胞调节的免疫反应(CMl)(图41A)。
采用相当于PyCS蛋白中的CD8+T细胞表位(SYVPSAEQI；SEQIDNO:66)的合成肽，通过ELISPOT分析测定被免疫小鼠的脾脏中的PyCS特异性的IFN-γ-分泌CD8+T细胞的数目。简言之，用抗小鼠干扰素γmAb，R4覆盖96阱硝酸纤维素板(微滴度HA，微孔)过夜。在室温下培育过夜后，用培养液重复洗涤这些阱并用培养液阻滞4小时。在存在或不存在10μg/mLCD8+T细胞表位肽下，将5x105来自被免疫小鼠的脾细胞添加至该ELISPOT阱，并在37℃和5％CO2下培养24小时。用含0.05％吐温20的PBS(PBST)大量洗涤后，加入生物素酰化的抗小鼠干扰素γmAb，XMG1.2的PBST溶液，并在40℃培养过夜。用PBST洗涤后，用过氧化物酶标记的亲和素(eBiosciences)培养该板。通过加入AEC基质发展斑点(BDBiosciences)。
在此剂量所有的衣壳-经修饰的腺病毒均诱导可比较水平的CMI至具有完好衣壳蛋白的腺病毒(图41B)。
之后，以渐增的剂量向BALB/c小鼠给予多剂量的重组腺病毒，即，以3周间隔，1x108，1x109，和1x1010v.p.，如图42A所示。通过ELISA测定PyCS特异性的体液反应。收集该来自免疫小鼠尾部静脉的血液五微升，并在495mlPBS中稀释，然后在5,000转/分离心该样品5分钟，以制备稀释的血浆样品(x100)。在4℃下用5mg/ml的CS特异性肽((QGPGAP)3；SEQIDNO:59，n＝3)在0.1M碳酸钠缓冲液(pH9.5)中的溶液涂覆MaxisorpELISA板过夜。在室温下洗涤板，并用1x稀释剂阻滞2小时。再洗涤该板，并将100ml顺次双倍稀释的血浆或血清在1x稀释剂中的溶液加入该板，并在室温下培养该板一小时。用100ml的HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体洗涤和培养该板。所有的肽均通过Biosyntheis(Lewisville，TX，美国)合成。
采用此免疫方式，在第10周所有的衣壳-经修饰的腺病毒均比wt/PyCS-GFP诱导明显较高水平的抗(QGPGAP)3抗体反应(图42B)。
为了确定衣壳-经修饰的腺病毒的疫苗效力，在第10周用2x104感染性的P.yoelii子孢子通过尾部静脉注射侵袭被免疫小鼠。在子孢子侵袭42小时后通过量化小鼠肝中的寄生虫特异性核糖体RNA的量测定寄生虫携带，并将其描述为寄生虫核糖体RNA纯拷贝数与小鼠GAPDHmRNA的纯拷贝数的比。数值经过log变换，然后单向变量分析，随后进行Dunnett测试以测定差值，用于统计分析。
采用(QGPGAP)3-HVR1/PyCS-GFP,(QGPGAP)3-Fib/PyCS-GFP或(QGPGAP)3-HVR1/Fib/PyCS-GFP的免疫比wt/PyCS-GFP诱导更高水平的保护，其在受疟疾侵袭小鼠中导致明显更低的寄生虫携带(图42C)。
随后评价由衣壳-经修饰的腺病毒诱导的PyCS特异性抗体的功能。首先，为测试第10周的腺病毒免疫小鼠的血清(图42A)是否可以识别完好子孢子，进行了间接免疫荧光分析(IFA)。在IFA中，用3％牛血清白蛋白(BSA)在PBS中的溶液培养在多点载玻片上的空气干燥的子孢子一小时，然后用稀释的血清培养一小时。水洗后，用荧光标记的第二抗体培养这些玻片一小时。洗涤这些玻片，并在最高稀释物在荧光显微镜下产生荧光时测定IFA滴度。
(QGPGAP)3-HVR1/PyCS-GFP和(QGPGAP)3-HVR1/Fib/PyCS-GFP均诱导对子孢子的最高IFA滴度(图43A)，这表示腺病毒六邻体的HVR1的(QGPGAP)3表位的插入使PyCS腺病毒能够引起良好的抗体反应，不仅是针对合成肽，也针对存在于疟疾寄生虫中的天然的表位。
其次，为了确定用衣壳-经修饰的腺病毒(图42A)免疫的小鼠发展了可以中和子孢子感染性的“功能”抗体，进行了体外子孢子中和分析。
在该体外中和分析中，在30倍稀释的来自腺病毒免疫的小鼠的混合血清存在下，P.yoelii子孢子被添加至96阱板中的CD81/HepG2。培育两小时后，用培养基洗出未感染的子孢子，然后培养该细胞42小时。通过实时PCR测量寄生虫核糖体RNA和人类GAPDHmRNA的相对量(Ophorst等人2006)。
来自用衣壳-经修饰的腺病毒免疫的小鼠的混合血清样品，特别是(QGPGAP)3-HVR1/PyCS-GFP和(QGPGAP)3-HVR1/Fib/PyCS-GFP，几乎彻底抑制(99％)体外子孢子感染性(图43B)。注意此分析中的抑制程度和图43A所示的IFA滴度反相相关。
对血液阶段疟疾感染的防护
随后测定用衣壳-经修饰的rAd的免疫是否保护小鼠，使其在受子孢子侵袭后不发展血液阶段的疟疾感染。该实验在每一实验中进行两次，每组中的20只BALB/c小鼠在上次免疫后4周用wt/PyCS-GFP或如图42A所示的(QGPGAP)3-HVR1/PyCS-GFP免疫三次，用50P.yoelii子孢子静脉内侵袭该小鼠。在侵袭后3至12天分析Giemsa染色的血涂片，以检测血液阶段的疟疾寄生虫感染。在wt/CS-GFP免疫组中，40只小鼠中的30只(75％)受感染，而在组中40只中35只(87.5％)受感染(下表3)。(QGPGAP)3-HVR1/CS-GFP免疫的小鼠比wt/CS-GFP保护的小鼠受到更好的保护；其中只有40只中的15只(37.5％)受感染，这和肝脏中寄生虫携带所测得的保护实验结果一致(图42C)。
表3.用wt/PyCS-GFP或(QGPGAP)3-HVR1/PyCS-GFP免疫后检测血液阶段疟疾寄生虫感染
初期-激发免疫1
随后，在有或者没有佐剂情形下，如图44A所示，用多个渐增剂量(即1x108，1x109，和1x1010v.p.)以3周间隔给予BALB/c小鼠HVR1-经修饰的PyCS腺病毒的“激发剂”，其具有四或六个(QGPGAP)n(SEQIDNO:59；n＝4，6)重复片段用于此实验的佐剂是Sigma佐剂系统(Sigma-Aldrich)，其包含200mg/mL的皂草苷(Sigma-Aldrich)。一瓶Sigma佐剂系统(1ml)包含来自明尼苏达沙门氏杆菌的0.5mg单磷酰脂A(去毒的内毒素)和0.5mg的合成海藻糖Dicorynomycolate的2％油(角鲨烯)-吐温80的水溶液。在该免疫前将腺病毒溶液与等量的该佐剂混合。将一百微升该腺病毒-佐剂混合物注入肌内。如上所述测量PyCS-特异性体液和细胞调节的免疫反应。观察到趋势为，具有六个重复片段的HVR1-经修饰的腺病毒比具有四格重复片段的HVR1-经修饰的腺病毒诱导更高的抗体滴度，并且佐剂的使用增加抗体滴度(图44B)。相反，佐剂在CMI上没有效果(数据未示出)。
为了确定HVR1-经修饰的PyCS腺病毒的疫苗效力，在第9周用2x104感染性的P.yoelii子孢子通过尾部静脉注射侵袭每组五只小鼠。如上所述在在子孢子侵袭42小时后测定寄生虫携带。数值经过log变换，然后单向变量分析，随后进行Dunnett测试以测定差值，用于统计分析。具有六个重复片段的HVR1-经修饰的腺病毒比具有四个重复片段的有更多的减少寄生虫携带的趋势，并且佐剂的使用增长了该防护(图44C)。
为了评估HVR1-经修饰的PyCS腺病毒诱导的抗体的功能，我们进行了如上所述的体外子孢子中和分析。第9周的来自以HVR1-经修饰的PyCS腺病毒免疫的小鼠的混合血清样品在50倍稀释度中和子孢子侵入(图44D)。
初期-激发免疫2
在有或者没有佐剂情形下，如图44A所示，用三个1x1010v.p.的剂量以3周间隔给予BALB/c小鼠HVR1-经修饰的PyCS腺病毒的“激发剂”，其具有六，九或十二个(QGPGAP)n(SEQIDNO:59；n＝6，9，12)重复片段，如图45A所示。用于此实验的佐剂是Sigma佐剂系统(Sigma-Aldrich)，其包含200mg/mL的皂草苷(Sigma-Aldrich)。在免疫之前用等量的该佐剂与腺病毒溶液混合。如上所述测量PyCS特异性体液和细胞调节的免疫反应。各组间，在第9周(图45B)，具有十二个(QGPGAP)n(SEQIDNO:59；n＝12)的重复片段的HVR1-经修饰的PyCS腺病毒和该佐剂一起诱导最高的抗体滴度。对于PyCS特异性CMI，各组间没有差异，这表示长达十二的更长表位的插入不削弱腺病毒的体内感染性(图45C)。进一步地，该佐剂未影响腺病毒诱导CMI的能力(图45C)。
为了确定HVR1-经修饰的PyCS腺病毒的疫苗效力，如上所述在第9周用2x104感染性的P.yoelii子孢子通过尾部静脉注射侵袭每组五只小鼠。所有具有(QGPGAP)n重复片段SEQIDNO:59，n＝6，9，12)的HVR-1经修饰的PyCS腺病毒，在有或者没有佐剂情形下，都显示出增加了保护。然而具有十二个(QGPGAP)n(SEQIDNO:59，n＝12)重复片段的HVR1-经修饰的PyCS腺病毒和佐剂一起显示了最佳的保护(图45D)，其明显比其它处理更为保护性。
实施例3：镰状疟原虫环子孢子蛋白特异性免疫反应
镰状疟原虫重组腺病毒的确认编码腺病毒穿梭载体的疟原虫环子孢子蛋白被用于瞬时转染，以用AD293细胞确认疟原虫环子孢子蛋白表达(图46A)。转染24小时后，在SDS样品缓冲液中裂解细胞，随后用抗NANP单克隆抗体(2A10)进行SDSPAGE电泳和蛋白质印迹。
为了确认该表位插入腺病毒衣壳蛋白，用识别该(NANP)n(SEQIDNO:60)重复片段的抗子孢子抗体通过SDS-PAGE(2x109v.p./列)和蛋白质印迹(1x109v.p./列)分析纯化的重组腺病毒，如图47A和48A所示。图47A中的谱带强度与腺病毒毒粒中衣壳蛋白的拷贝数有关：纤突的拷贝数(每毒粒36拷贝)是六邻体(每毒粒720拷贝)的二十倍。图48A中的谱带强度与NANPHVR1重复片段的数目有关。
为了评价PfCSP-B表位是否被暴露于腺病毒毒粒外，将顺次稀释纯化的重组腺病毒涂覆在酶联免疫吸附分析(ELISA)板上，并用识别(NANP)n(SEQIDNO:60)重复片段的抗PyCS抗体检测。该抗体识别所有的衣壳-经修饰的腺病毒(图47B和48B)。ELISA分析结果提示被并入衣壳蛋白的PfCSP-B表位良好地暴露于腺病毒毒粒之外。
初期-激发免疫3
如图49A所示，多个渐增剂量的重组PfCSP腺病毒(即，1x108，1x109，和1x1010v.p.)以三周间隔被给予BALB/c小鼠。如上所述采用ELISA板通过ELISA测定PfCSP特异性的体液反应，该ELISA板被涂覆以1mg/ml的(T1B)4，一种包含(NANP)n重复序列(SEQIDNO:60)的CS重复肽(Calvo-Calle等人2006)。数值经过log变换和单向变量分析，随后进行Dunnett测试以测定wt/PfCSP和衣壳-经修饰的腺病毒之间的差值，用于统计分析。所有衣壳-经修饰的腺病毒均比wt/PfCSP在统计学上诱导更高的抗NANP抗体滴度。
初期-激发免疫4
随后，如图50A所示，用多个渐增剂量(即1x108，1x109，和1x1010v.p.)以3周间隔给予BALB/c小鼠HVR1-经修饰的PfCSP腺病毒的“激发剂”，其具有四，六，八，或十个(NANP)n(SEQIDNO:60；n＝4，6，8，10)重复片段。如上所述测量PfCSP特异性的体液免疫反应。在第9周，所有的HVR1-经修饰的腺病毒均比wt/PfCSP诱导明显更高的抗NANP抗体滴度。数值经过log变换和单向变量分析，随后进行Dunnett测试以测定差值，用于统计分析。
初期-激发免疫5
在有或者没有佐剂情形下，用三个1x1010v.p.的剂量以3周间隔给予BALB/c小鼠HVR1-经修饰的PyCS腺病毒的“激发剂”，其具有十，十六，或二十二个(NANP)n(SEQIDNO:60；n＝10，16，22)重复片段，如图51A所示。用于此实验的佐剂是Sigma佐剂系统(Sigma-Aldrich)，其包含200mg/mL的皂草苷(Sigma-Aldrich)。在免疫之前用等量的该佐剂与腺病毒溶液混合。如上所述测量PfCSP特异性体液和细胞调节的免疫反应，其确定具有更长B细胞表位的HVR1-经修饰的腺病毒诱导更高的抗体滴度(图51B)。
实施例4：PyCSCD4表位插入腺病毒芯蛋白pVII
抗原特异性B细胞的发展和增殖需要抗原特异性的CD4T细胞。因此，为了确定是否可能通过在腺病毒蛋白中插入PyCSCD4表位增强衣壳-经修饰的腺病毒诱导的PyCS特异性的体液免疫反应，在pVII中构建了((QGPGAP)3-Fib/CD4-pVII-1/PyCSGFP)具有PyCSCD4表位的(QGPGAP)3-Fib/PyCS-GFP。pVII是腺病毒芯蛋白之一，每毒粒拷贝数是700-800，其是理想的供CD4表位在MHC类别II分子上呈递的蛋白。如图52A所示，通过PyCSCD4表位插入pVII，该pVII频带在SDS-PAGE凝胶上偏移。
为了测试PyCSCD4表位插入pVII的效果，用如图42A所示的(QGPGAP)3-Fib/PyCS-GFP或(QGPGAP)3-Fib/CD4-pVII-1/PyCS-GFP免疫BALB/c小鼠，并且在第10周通过ELISA测定抗QGPGAP抗体滴度。
(QGPGAP)3-Fib/CD4-pVII-1/PyCS-GFP明显比(QGPGAP)3-Fib/PyCS-GFP诱导更高的抗QGPGAP抗体滴度(图52B)，这表明PyCSCD4表位插入pVII可增加衣壳-经修饰的腺病毒诱导的体液免疫反应。
PyCSCD4表位插入腺病毒芯蛋白pVII
为了评估PfCSPCD4+表位插入腺病毒芯蛋白pVII中不同位置对腺病毒诱导的免疫反应的效果，构建了PfCSPCD4+表位正好在第一核定位信号(NLS)之前，或在两个NLS之间的HVR1-经修饰的PfCSP腺病毒(图.53A)。
为了确认该表位插入pVII，通过如上所述的SDS-PAGE分析纯化的重组腺病毒。如图53B所示，由于该表位插入，(NANP)4-HVR1/CD4-pVII-2/PfCSP和(NANP)4-HVR1/CD4-pVII-3/PfCSP的pVII谱带向上偏移。
由HVR1和pVII-经修饰的PfCSP腺病毒诱导的PfCSP特异性免疫反应
随后，用多个渐增剂量(即1x108，1x109，和1x1010v.p.)以3周间隔给予BALB/c小鼠HVR1和pVII-经修饰的PfCSP腺病毒的“激发剂”，其具有四个HVR1中的NANP和pVII中的PfCD4+表位重复片段，如图54A所示。如上所述测量PfCSP特异性的体液免疫反应。在第6周，(NANP)4-HVR1/CD4-pVII-2/PfCSP和(NANP)4-HVR1/CD4-pVII-3/PfCSP明显比(NANP)4-HVR1/PfCSP诱导更高的抗NANP抗体滴度(图54B)。在CMI上，(NANP)4-HVR1/CD4-pVII-3/PfCSP明显比(NANP)4-HVR1/PfCSP诱导更高的IFNγ和IL-4-分泌PfCSP特异性CD4+T细胞。
实施例5：衣壳修饰对于抗腺病毒免疫的效果
在腺病毒感染之前，以标示的稀释度将血清添加至AD293细胞，用于体外腺病毒中和实验。白种人血清样品来自InnovativeResearch(Novi，MI，美国)。用FlowJov8.8软件(TreeStar公司，Ashland，OR，美国)分析所有的流细胞计数法数据。以标示的稀释度在中和血清样品的人类腺病毒存在下用每一种衣壳-经修饰的腺病毒感染AD293细胞，随后通过流细胞计数法测量GFP表达。用PyCS-B表位替换HVR1明显产生更多的抗腺病毒血清型5血清的弹性，而HVR5或纤突的修饰则没有效果(图55)。
随后测定HVR1是否为该体内中和的决定性的分子。为此目的，将小鼠用1x1010v.p.wt/空腺病毒感染两次，以设置足够的前存抗腺病毒免疫(图56A)，并根据ELISA测定的它们的抗腺病毒抗体滴度随机化。然后给予小鼠单免疫剂量的衣壳-经修饰的腺病毒或未改性的腺病毒，如上所述测量PyCS特异性的CD8+T细胞反应水平。和通过其它衣壳-经修饰的或未改性的腺病毒诱导相比，只有用(QGPGAP)3-HVR1/PyCS-GFP或(QGPGAP)3-HVR1/Fib/PyCS-GFP进行的接种能够诱导明显更有效的CS特异性CD8+T细胞反应(图56B)。
还测量了对(QGPGAP)3表位的抗体反应水平，其被表达在感染wt/空Ad，随后接种衣壳-经修饰的rAd的小鼠中，rAd的衣壳蛋白上(图57A)。和用wt/PyCS-GFP进行接种相比，只有用(QGPGAP)3-HVR1/PyCS-GFP和(QGPGAP)3-HVR1/Fib/PyCS-GFP接种的小鼠能够设置明显更高的抗QGPGAP抗体滴度(图57B)。
如上所述的实施例是为了更充分地阐述实施方式，其不应被解释为限制任一所要求保护的实施方式的范围。此外，此公开中引用的参考文献，以及以下所列出的参考文献在此以参考方式被全文合并于此，如同其被全文叙述于此。
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Claims (8)

1.来源于重组腺病毒质粒载体的重组腺病毒在制备治疗或防止疟疾的药物中的应用，其中该疟疾的治疗或防止诱导抗疟原虫环子孢子蛋白的细胞和体液免疫反应，并且其中该重组腺病毒质粒载体包括核苷酸序列，该核苷酸序列编码：
疟原虫环子孢子蛋白基因，或其抗原性的部分，其可操作地与异源启动子序列相连，以及
一个或多个经修饰的衣壳和/或芯蛋白基因，其中疟原虫环子孢子的免疫原性的表位序列已经被插入或替换至少一部分的该一个或多个衣壳或芯蛋白基因；其中：
该免疫原性的表位序列是选自(NANP)12、(NANP)14、(NANP)16、(NANP)18、(NANP)20或者(NANP)22中的B细胞表位序列；并且
该疟原虫环子孢子蛋白基因进一步包括由SEQIDNO：2编码的密码子优化的镰状疟原虫环子孢子蛋白基因；
其中该一个或多个经修饰的衣壳和/或芯蛋白基因包括六邻体高变区(HRV)序列，该HRV序列包括HRV1或HRV5序列，并且B细胞表位序列：
a)被插入该HVR1或HVR5序列；或
b)替换一部分该HVR1或HRV5序列；
其中该经修饰的衣壳蛋白基因由下列核苷酸序列编码：SEQIDNO：16，SEQIDNO：17，SEQIDNO：18，SEQIDNO：19，SEQIDNO：20，SEQIDNO：21，或SEQIDNO：22。
2.来源于重组腺病毒质粒载体的重组腺病毒在制备治疗或防止疟疾的药物中的应用，其中该疟疾的治疗或防止诱导抗疟原虫环子孢子蛋白的细胞和体液免疫反应，并且其中该重组腺病毒质粒载体包括核苷酸序列，该核苷酸序列编码：
由SEQIDNO：2编码的疟原虫环子孢子蛋白基因，或其抗原性的部分，其可操作地与异源启动子序列相连，以及
一个或多个经修饰的衣壳和/或芯蛋白基因，其中疟原虫环子孢子的免疫原性的表位序列已经被插入或替换至少一部分的该一个或多个衣壳或芯蛋白基因；其中：
该免疫原性的表位序列是选自(NANP)12、(NANP)14、(NANP)16、(NANP)18、(NANP)20或者(NANP)22中的B细胞表位序列；
该一个或多个经修饰的衣壳和/或芯蛋白基因包括衣壳纤维蛋白基因，并且B细胞表位序列被被插入该纤维蛋白基因中；并且
该经修饰的衣壳蛋白基因由SEQIDNO：25编码。
3.来源于重组腺病毒质粒载体的重组腺病毒在制备治疗或防止疟疾的药物中的应用，其中该疟疾的治疗或防止诱导抗疟原虫环子孢子蛋白的细胞和体液免疫反应，并且其中该重组腺病毒质粒载体包括核苷酸序列，该核苷酸序列编码：
由SEQIDNO：2编码的疟原虫环子孢子蛋白基因，或其抗原性的部分，其可操作地与异源启动子序列相连，以及
一个或多个经修饰的衣壳和/或芯蛋白基因，其中疟原虫环子孢子的免疫原性的表位序列已经被插入或替换至少一部分的该一个或多个衣壳或芯蛋白基因；其中：
该免疫原性的表位序列是选自(NANP)12、(NANP)14、(NANP)16、(NANP)18、(NANP)20或者(NANP)22中的B细胞表位序列；
该芯蛋白基因进一步包括pVII蛋白基因，并且CD4+T细胞表位序列被插入该pVII蛋白基因中；并且
该经修饰的芯蛋白基因由SEQIDNO：27，SEQIDNO：28或SEQIDNO：29编码。
4.如权利要求1-3所述的任何腺病毒的应用，其中所述药物进一步包括佐剂。
5.如权利要求1-5所述的任何腺病毒的应用，其中所述疟疾的治疗或防止要求至少两个剂量的该药物。
6.如权利要求1-3所述的任何腺病毒的应用，其中该CD4+T细胞表位序列是镰状疟原虫环子孢子蛋白基因CD4+T细胞表位序列，并且该CD4+T细胞表位序列是EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQIDNO：62)。
7.如权利要求6所述的腺病毒的应用，其中所述药物进一步包括佐剂。
8.如权利要求6所述的腺病毒的应用，其中所述疟疾的治疗或防止要求至少两个剂量的该药物。
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