JP5947719B2 - 免疫原性マラリア原虫周辺スポロゾイトタンパク質エピトープによる組換えアデノウイルスの改変 - Google Patents
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Description
優先権主張
本出願は、2009年8月18日に提出された国際出願PCT/US09/054212に対する優先権を主張し、かつ一部継続出願である。該国際出願の全体を完全に記述するように参照によって本明細書に組み入れる。
米国連邦政府による委託研究に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所の一部である国立アレルギー・感染症研究所(NIAID)によって与えられた助成金番号1R01A1081510−01A1の下で政府支援によってなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
アデノウイルスは、一連のウイルスカプシドタンパク質(以下に記述する)と、1つのウイルスゲノムを含む非エンベロープ被覆型DNAウイルスであり、1種もしくは複数種の治療用導入遺伝子または抗原導入遺伝子をin vitroおよびin vivoで種々の細胞に送達するために広範に用いられてきた。アデノウイルス血清型は数多く存在する。既知のアデノウイルス血清型のうち、血清型5(Ad5)は、in vivoでその高い感染性のために、外来遺伝子の導入のためのベクターとして好ましくは用いられている(Abbinkら 2007)。抗原導入遺伝子の発現は、当技術分野で既知のいずれのプロモーターまたはエンハンサーのエレメントによって制御されうる。遺伝子発現を制御するのに用いられてもよいプロモーターはとしては、サイトメガロウイルス前初期プロモーター(CMV)、シミアンウイルス40(SV40)初期プロモーター、細胞ポリペプチド鎖伸長因子1α(EF1)プロモーター、Rous肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、およびテトラサイクリン調節(TR)プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。コード配列の後のポリアデニル化(pA)シグナルは、効果的な転写および翻訳のためにも用いられうる。本明細書に記述する組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルゲノムの少なくともE1領域において欠失を有する複製欠損でありうる。これはE1領域が複製、転写、翻訳およびパッケージングのプロセスに必要とされるからである。一部の態様では、E2、E3および/またはE4の領域も欠失しうる。さらなる態様において、Kozak共通配列は、より効果的な翻訳のために用いられうる(Kozak 1987)。
アデノウイルスは、マラリアに対して重要なCD8+ T細胞介在防御免疫を誘発するための魅力あるベクターである(Rodriguesら 1997、Rodriguesら 1998)。ネズミマラリア原虫(齧歯目のマラリア寄生虫)CSタンパク質(AdPyCS)を発現する組換えアデノウイルスの免疫原性は、齧歯目のマラリアモデルを使用して決定された。AdPyCSをマウスに接種すると、かなりの割合のマウスにおいて、完全免疫が誘発され、寄生虫血症の発生を予防する(Rodriguesら 1997)。T細胞集団を枯渇させることによって明らかになり、かつAdPyCSがマラリア寄生虫に対して高力価の抗体応答を誘発することができなかった事実によって実証されているように、この防御効果は、主にCD8+ T細胞によって介在される。
CSタンパク質を発現する組換えアデノウイルスベクターがCD8+ T細胞によって強力な細胞性免疫応答を誘発するが、はっきりと認識できる体液性応答は誘発されないことを上述の研究で確認された。したがって、野生型アデノウイルスに対する体液性応答がカプシドタンパク質に起因しうることが多いので、改変型カプシドタンパク質およびコアタンパク質で組換えアデノウイルスベクターを構築することで、1)B細胞活性を介する体液性免疫を増強し、2)Tヘルパー細胞活性を介する体液性免疫を増強し、および3)既存するアデノウイルス免疫を回避する。
一部の実施形態では、アデノウイルスカプシドタンパク質(HexonまたはFiberに挿入された)内に免疫優性CSタンパク質Bエピトープを有する、スポロゾイト周囲(CS)アデノウイルスベクターが記述されている。導入遺伝子は、CSタンパク質に対する細胞介在免疫応答および体液性免疫応答を増強するために、CMVなどのプロモーター下に存在しうる。
別の実施例では、アデノウイルスベクターで用いられる導入遺伝子に特異的なCD4+エピトープを、pVII、pVおよびHexonなどのアデノウイルスタンパク質に取り込んでアデノウイルスベースワクチンの免疫原性を増強させうる。樹状細胞(DC)およびB細胞などの専門の抗原提示細胞(APC)は、エンドサイトーシスを介して微粒子状の病原体様ウイルス粒子を取り込むことができ、次いで該病原体中のCD4+エピトープをCD4+ T細胞に提示し、それによって体液性免疫応答および/または細胞性免疫応答のヘルパー細胞として作用する。1ビリオンあたりのコピー数がpVII(700〜800コピー)およびHexon(720コピー)と高いため、pVIIおよびHexonをアデノウイルス標的タンパク質として用いて、抗原CD4+ペプチドに容易に挿入することができる。
一部の実施形態では、アデノウイルスに対する既存の免疫を克服するため、および/またはアデノウイルスワクチンに対する体液性応答を増強するために、アデノウイルスFiberおよびHexonのカプシドタンパク質は、B細胞エピトープまたはTヘルパー細胞エピトープを挿入するよう改変されうる。ヒト集団において若年成人の推定80%がアデノウイルスに対する循環中和抗体(Douglas 2007)、特に血清型5(Ad5)を有する。遺伝子治療ベクターとしてアデノウイルスを利用する研究では、動物内の中和抗体の存在が、アデノウイルスによって送達される導入遺伝子の発現を限定していることが判明した。中和抗体に加えて、CD8+ T細胞応答も、組換え遺伝子発現を限定する一因となっている(Yangら 1995、Yangら 1996)。アデノウイルスに対するかかる既存の免疫は、組換えアデノウイルスワクチンの有効性を阻害することがいままでに報告されており(Pappら 1999)、また臨床試験において、アデノウイルスベースワクチンの免疫原性を低下させている(Priddyら 2008)。
まず、PyCSの免疫優性中和B細胞エピトープを選択した。ナイーブBALB/cマウスにフロイント不完全アジュバントと共に組換えPyCSタンパク質を3回免疫し、プールした血清を用いて、中和抗体の重要なエピトープを決定した。
クローニング部位下にGFP発現カセットを挿入することでアデノウイルスシャトルベクターpShuttle−CMV(STRATAGENE)を改変した。まず、pmaxGFP(Lonza,Cologne,Germany)のBsmBI−SacI断片(pCMV+GFP)とSacI−BsmBI断片(SV40ポリAshigunaru)を平滑末端化して、pUC19の平滑末端化Sall部位とKpnI部位にそれぞれ挿入した。もたらされたpCMV−GFP/pUC19のBamHI−EcoRI断片をSV40pA/pUC19の同じ部位に挿入して、SV40pA−pCMV−GFP断片を作製した。該断片を平滑末端化して、pShuttle−CMVのEcoRV部位に挿入した。結果として生じるシャトルベクター(GFP/pShuttle−CMV)は、導入遺伝子とGFPのためのデュアルpCMVプロモーターとSV40pAを有する。
マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質をコードするアデノウイルスシャトルベクターを一過性トランスフェクションのために用いて、AD293細胞を用いてマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質発現を確認した(図38)。トランスフェクションから24時間後に、細胞をSDS試料緩衝液中で溶解し、続いてSDS PAGE電気泳動および抗PyCSモノクローナル抗体(9D3)によるウエスタンブロットを行った。
6〜8週齢の雌BALB/cマウスをTaconic(Hudson,NY, USA)から購入して,Rockefeller UniversityのLaboratory Animal Research Centerにおいて標準条件下で維持した。免疫化のために、アデノウイルスをPBSで希釈して、表示された用量で筋肉内に注射した。
次に、スポロゾイト投与の後、カプシド改変型rAdによる免疫化が赤血球期マラリア感染症の発現からマウスを防御するかどうかを決定した。実験を2回行った。各実験では、各群で20匹のBALB/cマウスに、図42Aに示すように、野生型PyCS−GFPまたは(QGPGAP)3−HVR1/PyCS−GFPで3回免疫した。最後の免疫化から4週目に、マウスに50ネズミマラリア原虫スポロゾイトを静脈内投与した。抗原投与から3〜12日後に、Giemsa染色した血液塗沫標本を分析して、赤血球期マラリア寄生虫感染を検出した。野生型CS−GFP免疫群では、40匹中30匹(75%)のマウスが感染し、一方ナイーブ群では40匹中35匹(87.5%)が感染した(以下の表3)。(QGPGAP)3−HVRI/CS−GFP予免疫マウスは、野生型CS−GFPよりもより防御された;40匹中わずかに15匹(37.5%)が感染した。これは肝臓での寄生虫負荷によって測定された防御実験(図42C)の結果と一致する。
次に、図44Aに示すように、ナイーブBALB/cマウスに、(QGPGAP)nの4または6の反復(配列番号59;n=4、6)を有するHVR1−改変型PyCSアデノウイルスの「追加免疫」をアジュバントと共にまたはアジュバントを含まずに、用量を増加して(すなわち、1×108、1×109、および1×1010v.p.)3週間間隔で投与した。この実験で使用したアジュバントは、200μg/mLのSaponin(Sigma−Aldrich)を含有するSigma Adjuvant System(Sigma−Aldrich)である。Sigma Adjuvant System(1mL)のバイアルは、Salmonellaミネソタ由来のモノホスホリルリピドA(解毒化内毒素)を0.5mgおよび水中2%オイル(スクアレン)−Tween80中の合成トレハロースジコリノミコラートを0.5mg含有する。免疫の前に、アデノウイルス溶液を同量のアジュバントと混合した。100マイクロリットルのアデノウイルス−アジュバント混合液を筋肉内に注射した。PyCS特異的体液性免疫応答および細胞介在性免疫応答を上述のように測定した。6反復を有するHVR1改変型アデノウイルスは、4反復を有する該改変型アデノウイルスよりも高い抗体価を誘発し、かつアジュバントの使用が抗体価を増強する傾向が観察された(図44B)。対照的に、CMIへのアジュバントの効果はみられなかった(データ図示せず)。
図45Aに示すように、ナイーブBALB/cマウスに、(QGPGAP)nの反復を6、9、または12有する(配列番号59;n=6、9、12)HVR1改変型PyCSアデノウイルスの「追加免疫」を、アジュバント共に、またはアジュバントを含まずに、1×1010v.p.の用量で、3週間間隔で3回、投与した。この実験で使用したアジュバントは、200μg/mLのSaponin(Sigma−Aldrich)を含有するSigma Adjuvant System(Sigma−Aldrich)である。免疫の前に、アデノウイルス溶液を同量のアジュバントと混合した。PyCS特異的体液性免疫応答および細胞介在性免疫応答を上述のように測定した。(QGPGAP)nの反復を12有する(配列番号59;n=12)HVR1改変型PyCSアデノウイルスとアジュバントは、9週目に群の間で最も高い抗体価を誘発した(図45B)。PyCS特異的CMIに関して、群の間で差はみられず、最高12の長いエピトープ挿入がin vivoでアデノウイルス感染力を損なわないことを示した(図45C)。さらに、アジュバンントはCMIを誘発するるアデノウイルスの能力に影響を及ぼさなかった(図45C)。
一過性トランスフェクションのために、マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質をコードするアデノウイルスシャトルベクターを用いて、AD293細胞を用いるマラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質発現を確認した(図46A)。
トランスフェクションから24時間後に、細胞をSDS試料緩衝液中で溶解し、続いてSDS PAGE電気泳動および抗NANPモノクローナル抗体(2A10)によるウエスタンブロットを行った。
図49Aに示すように、ナイーブBALB/cマウスに 、組換えPfCSPアデノウイルスを複数回、用量を増加して(すなわち、1×108、1×109、および1×1010v.p.)、3週間間隔で投与した。上述のように、PfCSP特異的体液性応答を、(NANP)n反復配列(配列番号60)を含有する1μg/mL(T1B)4、CS反復ペプチドでコーティングしたELISAプレートを用いるELISAによって決定した(Calvo−Calleら 2006)。統計分析のために、値を対数変換し、次いで一元配置分散分析の後にDunnett検定を用いて、野生型PfCSPとカプシド改変型アデノウイルスとの差異を決定した。すべてのカプシド改変型アデノウイルスは、野生型PfCSPよりも統計学的に高い抗NANP抗体価を誘発した。
次に、図50Aに示すように、ナイーブBALB/cマウスに、(NANP)nの反復を4、6、8、または10有する(配列番号60;n=4、6、8、10)HVR1改変型PfCSPアデノウイルスの「追加免疫」を、用量を増加して複数回(すなわち、1×108、1×109、および1×1010v.p.)、3週間間隔で投与した。PfCSP特異的体液体性免疫応答を上述のように測定した。9週目に、すべてのHVR1改変型アデノウイルスは、野生型PfCSPよりも有意に高い抗NANP抗体価を誘発した(図50B)。統計分析のために、値を対数変換し、次いで一元配置分散分析の後にDunnett検定を用いて、差異を決定した。
次に、図51Aに示すように、ナイーブBALB/cマウスに、(NANP)nの反復を10、16、または22有する(配列番号60;n=10、16、22)HVR1改変型アデノウイルスの「追加免疫」を、アジュバントと共に、またはアジュバントを含まずに、1×1010v.p.の用量で、3週間間隔で3回投与した。この実験で使用したアジュバントは、200μg/mLのSaponin(Sigma−Aldrich)を含有するSigma Adjuvant System(Sigma−Aldrich)である。免疫の前に、アデノウイルス溶液を同量のアジュバントと混合した。PfCSP特異的液体性免疫応答を上述のように測定し、次いで長いBエピトープを有するHVR1改変型アデノウイルスがより高い抗体価を誘発したことを決定した(図51B)。
抗原特異的CD4 T細胞は、抗原特異的B細胞の発現と増殖のために必要とされる。したがって、PyCS CD4エピトープのアデノウイルスタンパク質への挿入によるカプシド改変型アデノウイルスによってPyCS特異的体液性免疫応答を増強することが可能であるかどうかを決定するために、pVII内にPyCS CD4エピトープを有する(QGPGAP)3−Fib/PyCS−GFP、((QGPGAP)3−Fib/CD4−pVII−1/PyCS−GFP)を構築した。pVIIは、アデノウイルスコアタンパク質のうちの1つであり、1ビリオンあたりのコピー数は700〜800である。これは、MHCクラスII分子上への効率的なCD4エピトープ提示に理想的である。図52Aに示すように、PyCS CD4エピトープをSDS−PAGEゲル上でpVIIに挿入することによってpVIIバンドを移動させる。
アデノウイルスコアタンパク質内の異なる位置へのPfCSP CD4+エピトープ挿入の、アデノウイルス誘発免疫応答への効果を評価するために、第1の核移行シグナル(NLS)の前、または2つのNLSの間にPfCSP CD4+エピトープを有するHVR1改変型PfCSPアデノウイルスを構築した(図53A)。
次に、図54Aに示すように、ナイーブBALB/cマウスに、HVR1にNANPの4反復と、pVIIにPfCD4+エピトープとを有するHVR1およびpVIIの改変型PfCSPアデノウイルスの「追加免疫」を、用量を増加して複数回(すなわち、1×108、1×109、および1×1010v.p.)、3週間間隔で投与した。PfCSP特異的体液性免疫応答を上述のように測定した。6週目に、(NANP)4−HVR1/CD4−pVII−2/PfCSPおよび(NANP)4−HVRI/CD4−pVII−3/PfCSPは、(NANP)4−HVR1/PfCSPより有意に高い抗NAN
P抗体価を誘発した。CMIに関して、(NANP)4−HVR1/CD4−pVII−3/PfCSPは、(NANP)4−HVR1/PfCSPより有意に高いIFNγおよびIL−4分泌PfCSP特異的CD4+ T細胞を誘発した(図54C)。
in vitroアデノウイルス中和実験のために、アデノウイルス感染の前に表示した希釈の血清をAD293細胞に加えた。Caucasian血清試料は、Innovative Research(Novi,MI,USA)から入手した。すべてのフローサイトメトリーデータは、FlowJo v8.8ソフトウェア(Tree Star,Inc.Ashland,OR,USA)で分析した。表示した希釈のヒトアデノウイルス中和血清試料の存在下で、AD293細胞に各カプシド改変型アデノウイルスを感染させ、続いてフローサイトメトリーによってGFP発現を測定した。HVR1のPyCS−Bエピトープとの置換によって、アデノウイルスは抗アデノウイルス血清型5血清に対して明らかに回復力があるようになり、一方HVR5またはFiberの改変は効果がなかった(図55)。
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配列番号2:コドン最適化熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質
配列番号3:(QGPGAP)3−HVR1改変型Hexonタンパク質
配列番号4:(QGPGAP)4−HVR1改変型Hexonタンパク質
配列番号5:(QGPGAP)5−HVR1改変型Hexonタンパク質
配列番号6:(QGPGAP)6−HVR1改変型Hexonタンパク質
配列番号7:(QGPGAP)7−HVR1改変型Hexonタンパク質
配列番号8:(QGPGAP)8−HVR1改変型Hexon配列
配列番号9:(QGPGAP)9−HVR1改変型Hexonタンパク質
配列番号10:(QGPGAP)11−HVR1改変型Hexonタンパク質
配列番号11:(QGPGAP)12−HVR1改変型Hexonタンパク質
配列番号12:(NANP)4−HVR1改変型Hexonタンパク質
配列番号13:(NANP)6−HVR1改変型Hexonタンパク質
配列番号14:(NANP)8−HVR1改変型Hexonタンパク質
配列番号15:(NANP)10−HVR1改変型Hexonタンパク質
配列番号16:(NANP)12−HVR1改変型Hexonタンパク質
配列番号17:(NANP)14−HVR1改変型Hexonタンパク質
配列番号18:(NANP)16−HVR1改変型Hexonタンパク質
配列番号19:(NANP)18−HVR1改変型Hexonタンパク質
配列番号20:(NANP)20−HVR1改変型Hexonタンパク質
配列番号21:(NANP)22−HVR1改変型Hexonタンパク質
配列番号22:(NANP)28−HVR1改変型Hexonタンパク質
配列番号23:(QGPGAP)3−HVR5改変型Hexonタンパク質
配列番号24:(QGPGAP)3改変型Fiberタンパク質
配列番号25:(NANP)4改変型Fiberタンパク質
配列番号26:ネズミマラリア原虫CD4+エピトープ改変型pVII配列
配列番号27:熱帯熱マラリア原虫CD4+エピトープ改変型pVII−1配列
配列番号28:熱帯熱マラリア原虫CD4+エピトープ改変型pVII−2配列
配列番号29:熱帯熱マラリア原虫CD4+エピトープ改変型pVII−3配列
配列番号30:合成コンストラクト
配列番号31:合成コンストラクト
配列番号32:合成コンストラクト
配列番号33:合成コンストラクト
配列番号34:合成コンストラクト
配列番号35:合成コンストラクト
配列番号36:合成コンストラクト
配列番号37:合成コンストラクト
配列番号38:合成コンストラクト
配列番号39:合成コンストラクト
配列番号40:合成コンストラクト
配列番号41:合成コンストラクト
配列番号42:合成コンストラクト
配列番号43:合成コンストラクト
配列番号44:合成コンストラクト
配列番号45:合成コンストラクト
配列番号46:合成コンストラクト
配列番号47:合成コンストラクト
配列番号48:合成コンストラクト
配列番号49:合成コンストラクト
配列番号50:合成コンストラクト
配列番号51:合成コンストラクト
配列番号52:合成コンストラクト
配列番号53:合成コンストラクト
配列番号54:合成コンストラクト
配列番号55:合成コンストラクト
配列番号56:合成コンストラクト
配列番号57:合成コンストラクト
配列番号58:合成コンストラクト
配列番号59:ネズミマラリア原虫
配列番号60:熱帯熱マラリア原虫
配列番号61:ネズミマラリア原虫
配列番号62:熱帯熱マラリア原虫
配列番号63:三日熱マラリア原虫
配列番号64:四日熱マラリア原虫
配列番号65:ネズミマラリア原虫
配列番号66:ネズミマラリア原虫
Claims (9)
- 組換えアデノウイルスベクター由来の組換えアデノウイルスであって、前記組換えアデノウイルスベクターが、
異種プロモーター配列に作用可能に連結された熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)スポロゾイト周囲タンパク質遺伝子またはその抗原部分をコードするヌクレオチド配列と、
改変型カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、
前記改変型カプシドタンパク質は、Hexon高頻度可変領域1(HVR1)タンパク質のアミノ酸配列番号138から164までが前記熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の免疫原性エピトープ配列によって置換されており、前記免疫原性エピトープ配列が(NANP)16、(NANP)18、(NANP)20、及び(NANP)22からなる群より選択されるB細胞エピトープ配列である、組換えアデノウイルス。 - 前記熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質遺伝子が、コドン最適化熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質遺伝子である、請求項1に記載の組換えアデノウイルス。
- 前記コドン最適化熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質遺伝子が、配列番号2によってコードされる、請求項2に記載の組換えアデノウイルス。
- 前記改変型カプシドタンパク質遺伝子が、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、および配列番号22からなる群から選択される核酸配列によってコードされる請求項1から3のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
- 請求項1から4のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスとアジュバントを含む、医薬組成物。
- 組換えアデノウイルスベクター由来の組換えアデノウイルスであって、前記組換えアデノウイルスベクターが、
異種プロモーター配列に作用可能に連結された熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)スポロゾイト周囲タンパク質遺伝子またはその抗原部分をコードするヌクレオチド配列と、
改変型カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列および改変型コアタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、
前記改変型カプシドタンパク質は、Hexon高頻度可変領域1(HVR1)タンパク質のアミノ酸配列番号138から164までが前記熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の免疫原性エピトープ配列によって置換されており、かつ前記免疫原性エピトープ配列が(NANP)4からなるB細胞エピトープ配列であり、
前記改変型コアタンパク質は、pVIIタンパク質およびEYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(配列番号62)で表されるCD4+ T細胞エピトープ配列を含み、前記CD4+ T細胞エピトープ配列が、pVIIタンパク質のアミノ酸配列番号198から終止コドン、92から93、または140から141に挿入されている、組換えアデノウイルス。 - 前記改変型コアタンパク質遺伝子が配列番号27、配列番号28または配列番号29によってコードされる、請求項6に記載の組換えアデノウイルス。
- 請求項6または7に記載の組換えアデノウイルスを含む、医薬組成物。
- 請求項6または7に記載の組換えアデノウイルスを含む、マラリア感染症用のワクチン。
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