CN110687289B - Fgl2蛋白作为疟疾感染标志物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及FGL2蛋白作为疟疾感染标志物的应用，通过检测FGL2蛋白表达水平，判断和预示是否存在疟疾感染，提高疟疾检出率及降低误诊率并使疟疾患者第一时间得到有效救治；通过监控FGL2蛋白表达水平的变化，判断疟疾感染进程，为疟疾患者的疾病风险及治疗方案提供重要依据；通过检测FGL2蛋白表达水平，作为判断疟疾患者预后的重要指标。本发明无需特殊设备，操作简便，只需通过制备血清即可进行检测，患者在医院就医进行常规查血检验时即可。

Description

FGL2蛋白作为疟疾感染标志物的应用
技术领域
本发明属于疟疾检测技术领域，涉及FGL2蛋白作为疟疾感染标志物的应用。
背景技术
疟疾是严重危害公共卫生健康的传染病之一，时至今日每年全球死亡人数仍有40余万之多，与结核病、艾滋病并称世界三大传染病。疟疾在人体内的感染时期分为肝期和红内期，其中红内期是引起疟疾患者发病并出现死亡的关键时期。但是，由于疟疾红内期的早期症状与流感等常见疾病非常相似而常常引起误诊，致使疟疾患者错过或延误最佳治疗时机而无法得到及时救治，且如果是恶性疟感染，疾病进程可以相当迅速，据报道恶性疟可使患者在感染后14天内发病死亡。因此，提高疟疾感染的检出率及减低误诊率无疑将挽救许多疟疾患者的宝贵生命。
目前对疟疾的诊断方法主要有病原学诊断(血涂片法)和免疫学诊断(抗原抗体法)。其中血涂片检出率较低，特别是恶性疟原虫有粘附宿主毛细血管内壁的特性，致使疟疾患者外周血中原虫率极低而不易检出。而免疫学诊断方法虽特异且检出率高，但须建立在医师高度怀疑为疟疾感染时方可得到检测，但如前所述，多数疟疾患者通常因为疾病症状的相似性而被误诊，并且疟原虫检测抗体的制备十分繁琐。
此外，目前对疟疾患者的疾病的判断、进程及预后，还没有一种有效的标志物。因此，研究一种简易有效的标志物及检测方法对提高疟疾检出率及预示疾病进程以及判断预后均具有十分重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供FGL2蛋白作为疟疾感染标志物的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
FGL2蛋白作为疟疾感染标志物的应用。
优选的，所述应用包括：判断和预示是否存在疟疾感染、判断疟疾感染进程、判断疟疾患者预后。
进一步优选的，通过检测血清FGL2蛋白表达水平，判断和预示是否存在疟疾感染，其中，所感染疟原虫包括：恶性疟原虫、间日疟原虫、约氏疟原虫、伯氏疟原虫或夏氏疟原虫。
进一步优选的，通过监控血清FGL2蛋白表达水平的变化，判断疟疾感染进程，其中，所感染疟原虫包括：约氏疟原虫、伯氏疟原虫或夏氏疟原虫。
进一步优选的，通过检测血清FGL2蛋白表达水平，判断疟疾患者预后，其中，所感染疟原虫包括：恶性疟原虫、间日疟原虫、约氏疟原虫、伯氏疟原虫或夏氏疟原虫。
更进一步优选的，利用FGL2蛋白检测试剂盒进行FGL2蛋白表达水平的检测。
更进一步优选的，血清的制备方法为：将血样置于37℃孵箱放置20min，然后10000rpm离心10min，小心收集上层清亮液体即为血清。
本发明的有益效果在于：
本发明将FGL2蛋白作为疟疾感染的有效标志物，具体如下：
1、通过检测FGL2蛋白表达水平，判断和预示是否存在疟疾感染，提高疟疾检出率及降低误诊率并使疟疾患者第一时间得到有效救治；
2、通过监控FGL2蛋白表达水平的变化，判断疟疾感染进程，为疟疾患者的疾病风险及治疗方案提供重要依据；
3、通过检测FGL2蛋白表达水平，作为判断疟疾患者预后的重要指标。
本发明无需特殊设备，操作简便，只需通过制备血清即可进行检测，患者在医院就医进行常规查血检验时即可。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为人疟患者血清中FGL2表达水平。
图2a～2c为约氏疟原虫感染小鼠原虫率及血清中FGL2表达水平。
图3a～3c为夏氏疟原虫感染小鼠原虫率及血清中FGL2表达水平。
图4a～4c为伯氏疟原虫感染小鼠原虫率及血清中FGL2表达水平。
图5a～5b为夏氏疟原虫感染小鼠原虫率与FGL2表达水平相关性分析。
图6a～6b为约氏疟原虫感染小鼠原虫率与FGL2表达水平相关性分析。
图7a～7b为伯氏疟原虫感染小鼠原虫率与FGL2表达水平相关性分析。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1通过检测FGL2蛋白表达水平，判断和预示是否存在疟疾感染
(1)材料
恶性疟和间日疟患者血液样本来自美国宾夕法尼亚州立大学崔立旺教授于中缅边境设立的疟疾监测点，正常人血液样本来自中缅边境疟疾监测点和重庆本地人群。
(2)制备检测血清
将疟疾患者及正常人血样置于37℃孵箱放置20min，然后10000rpm离心10min，小心收集上层清亮液体备用。
(3)动物感染
复苏液氮冻存夏氏疟原虫、伯氏疟原虫和约氏疟原虫(来源于疟疾研究和参考试剂资源中心(The Malaria Research and Reference Reagent Resource Center，MR4))，分别腹腔注射感染C57BL/6小鼠各2只；感染3-4天后查种鼠体内原虫率，待原虫增殖至15％左右时，以105原虫/只，每种疟原虫分别感染15只实验小鼠，所用C57BL/6小鼠购于本校实验动物中心。
(4)检测FGL2蛋白表达水平
采用Biolegend试剂盒说明书进行。操作步骤如下：取出试剂盒中的ELISA检测板及试剂并置于室温平衡至少20分钟；用灭菌超纯水制备1×wash buffer，充分震荡混匀后备用。蛋白标准品及检测样品的制备：蛋白标准品采用Assay Buffer A进行梯度稀释，浓度分别为40pg/ml、20pg/ml、10pg/ml、5pg/ml，2.5pg/ml，1.25pg/ml，0.625pg/ml；待测样品用Assay Buffer A进行10倍稀释并充分混匀。分别设置标准品孔、待测样品孔及空白孔(空白孔加入Assay Buffer A，其余步骤操作相同)。在标准品孔、待测样品孔和空白孔中加入300μL洗液，让洗液在孔内停留2分钟后弃去，在洁净滤纸上拍干残余液体，重复至少4次。将各待测样本及对照小心加至各反应孔中，避免触及孔壁及孔底，50μL/孔，轻轻晃动混匀并避免产生气泡。用封板膜封板后于室温孵育2小时。小心揭去封板膜，弃去孔内液体，每孔加入300μL wash buffer，停留2分钟后弃去，在洁净滤纸上拍干残余液体，重复至少4次。在各反应孔加入100μL FGL2 detection antibody，避免触及孔壁和孔底以及产生气泡。用封板膜封板后于室温孵育1小时。洗板方法同上。各反应孔加入100μL anti-rabibit IgG HRPconjugate，避免触及孔壁和孔底以及产生气泡，室温孵育1小时。洗板方法同上。每孔加入100μL Substrate Solution F，室温避光孵育5-30分钟，根据孔内液体颜色判断终止时间。将终止液迅速加入至孔中，100μL/孔，终止显色，可见检测孔内液体颜色迅速由蓝色变为黄色。最后于酶标仪上选择450nm波长的吸光度值(OD450)进行检测，加入终止液后20分钟内进行测定为宜。根据标准品绘制标准曲线并计算出样品浓度。
(4)结果
结果见图1，NC为重庆本地正常人样本，EC为中缅边境流行区正常人样本，Pf为恶性疟患者，Pv为间日疟患者。从图中可以看出，无论是何种疟原虫，患者在感染后血清中FGL2的表达水平较正常人显著提高，差异具有统计学意义。此外，动物实验结果更好的展示了，在感染早期(感染后第2、4天)，特别是感染后第2天，血涂片镜检都检测不到疟原虫，但是，此时检测血清中FGL2的表达水平，无论是约氏疟原虫(图2a～2c)、夏氏疟原虫(图3a～3c)或伯氏疟原虫(图4a～4c)感染，与正常小鼠相比，FGL2的表达水平均显著升高。此结果说明，通过检测FGL2蛋白表达水平，可以及早判断和预示是否存在疟疾感染。
实施例2通过监控FGL2蛋白表达水平的变化，判断疟疾感染进程及预后指标
动物感染
复苏液氮冻存夏氏疟原虫、伯氏疟原虫和约氏疟原虫，分别腹腔注射感染小鼠；感染3-4天后查种鼠体内原虫率，待原虫增殖至15％左右时，以105原虫/只分别感染实验小鼠，此后隔天检测每只实验小鼠体内原虫率。
(2)检测FGL2蛋白表达水平
方法同实施例1。检测时间点与原虫率检测时间相同。
(3)结果
分别将小鼠原虫率和FGL2蛋白表达水平作曲线图，并将两组曲线图叠合，观察小鼠原虫率和FGL2蛋白表达水平是否存在相关性，发现无论是夏氏疟原虫(图5a～5b)或伯氏疟原虫(图6a～6b)还是约氏疟原虫(图7a～7b)，FGL2蛋白表达水平随原虫的增殖而升高，随原虫的减少率而降低，原虫增殖曲线与FGL2蛋白表达水平曲线重合度非常高，相关性分析显示，原虫增殖与FGL2蛋白表达在三种疟原虫中均存在强烈的正相关。此结果说明通过检测FGL2蛋白表达水平，可判断原虫在宿主体内的载量，进而推断宿主目前是处于感染初期还是急性期，亦或是通过监测FGL2蛋白表达水平反映患者治疗效果，这对疟疾患者第一时间得到有效治疗或治疗方案的选择均具有重要意义。此外，在疟疾患者接受治疗后，也可通过检测FGL2蛋白表达水平，作为判断疟疾患者预后的指标。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1.FGL2蛋白作为疟疾感染标志物在制备疟疾感染检测试剂盒中的应用，其特征在于，利用FGL2蛋白检测试剂盒进行血清FGL2蛋白表达水平的检测。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，血清的制备方法为：将血样置于37℃孵箱放置20min，然后10000rpm离心10min，小心收集上层清亮液体即为血清。
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