CN105727269B - 神经氨酸酶及其抑制剂在心肌缺血及心肌梗死中的应用 - Google Patents

神经氨酸酶及其抑制剂在心肌缺血及心肌梗死中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了神经氨酸酶及其抑制剂在心肌缺血及心肌梗死中的应用，提供了神经氨酸酶与心肌缺血损伤的关联性，证明通过抑制神经氨酸酶的活性可以缓解心肌缺血损伤，神经氨酸酶可以作为筛选预防、缓解和/或治疗心肌缺血损伤药物的靶标；本发明还证明了神经氨酸酶抑制剂对心肌缺血损伤的缓解作用，神经氨酸酶抑制剂通过降低神经氨酸酶的水平改善心肌缺血损伤；本发明进一步提供了一种药物制剂，该药物制剂中含有神经氨酸酶抑制剂和药学上可以接受的载体，可以用于降低神经氨酸酶的水平从而改善心肌缺血损伤。本发明与现有技术相比，具有突出的实质性特点和显著的进步。

Description

神经氨酸酶及其抑制剂在心肌缺血及心肌梗死中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及药物靶标的发现和应用，具体涉及神经氨酸酶及其抑制剂在心肌缺血及心肌梗死中的应用。
背景技术
心血管疾病是威胁人类生命健康的重大疾病，随着社会进步和人民生活水平提高，其发病率逐年增长，2014年因心血管疾病死亡人数约占全球总死亡人数的30％，而心肌缺血性疾病又是心血管疾病中的焦点，并可发展为心律失常、心肌梗死，常可危及生命。因而如何切实有效地减轻因心肌缺血引起的损伤已成为当今医药界面临的一个热点问题。
心肌缺血损伤是由于心肌细胞供氧不足而造成的心肌细胞坏死或功能受损，目前临床常用药物多是通过改善细胞能量代谢、抑制炎症反应、保护血管、减轻心肌细胞钙超载等机制治疗心肌缺血，常见的包括硝酸脂类药物如硝酸甘油，硝酸异山梨酯；β-受体阻断剂如普萘洛尔；钙通道阻断剂如硝苯地平，维拉帕米以及抗血小板和抗血栓形成药如双嘧达莫等。
神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)是流感病毒表面的一种糖蛋白，具有糖苷外切酶活性，它可以裂解细胞表面唾液酸和邻近乳糖之间的α-糖苷键。在流感病毒的整个生命周期中，NA对于流感病毒感染细胞起着识别受体的作用，同时可以促进病毒进入受体细胞，这个过程对于病毒感染和传播都起着十分关键的作用。因此神经氨酸酶是抗流感药物研发的重要靶标。目前临床上使用的神经氨酸酶抑制剂扎那米韦和磷酸奥司他韦在流感的预防和治疗中发挥了重要作用。
发明内容
本发明的第一目的在于提供神经氨酸酶作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗心肌缺血损伤的药物中的应用；
本发明的第二目的在于提供神经氨酸酶的抑制剂在制备用于预防、缓解和/或治疗心肌缺血损伤的药物中的应用；
本发明的第三目的在于提供一种药物制剂，该药物制剂中含有神经氨酸酶抑制剂和药学上可以接受的载体。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
神经氨酸酶作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗心肌缺血损伤的药物中的应用。
进一步地，所述心肌缺血为心肌梗死引发的心肌缺血。
神经氨酸酶的抑制剂在制备用于预防、缓解和/或治疗心肌缺血损伤的药物中的应用。
一种药物制剂在预防、缓解和/或治疗心肌缺血损伤中的应用，包含神经氨酸酶的抑制剂和药学上可以接受的载体。
进一步地，根据所述的药物制剂在预防、缓解和/或治疗心肌缺血损伤中的应用，所述神经氨酸酶的抑制剂为扎那米韦。
进一步地，根据所述的药物制剂在预防、缓解和/或治疗心肌缺血损伤中的应用，所述神经氨酸酶的抑制剂为磷酸奥司他韦。
进一步地，根据所述的药物制剂在预防、缓解和/或治疗心肌缺血损伤中的应用，所述神经氨酸酶的抑制剂为黄连碱。
进一步地，根据所述的药物制剂在预防、缓解和/或治疗心肌缺血损伤中的应用，所述神经氨酸酶的抑制剂为扎那米韦和黄连碱的组合物。
进一步地，根据所述的药物制剂在预防、缓解和/或治疗心肌缺血损伤中的应用，所述神经氨酸酶的抑制剂为磷酸奥司他韦和黄连碱的组合物。
进一步地，根据所述的药物制剂在预防、缓解和/或治疗心肌缺血损伤中的应用，所述心肌缺血为心肌梗死引发的心肌缺血。
本发明的优点：
1、本发明提供了神经氨酸酶与心肌缺血损伤的关联性，证明通过抑制神经氨酸酶的活性可以缓解心肌缺血损伤，神经氨酸酶可以作为筛选预防、缓解和/或治疗心肌缺血损伤药物的靶标；
2、本发明证明了神经氨酸酶抑制剂对心肌缺血损伤的缓解作用，神经氨酸酶抑制剂通过降低神经氨酸酶的水平改善心肌缺血损伤；
3、本发明提供了一种药物制剂，该药物制剂中含有神经氨酸酶抑制剂和药学上可以接受的载体，可以用于降低神经氨酸酶的水平从而改善心肌缺血损伤。
附图说明
图1A为空白对照组大鼠心电图；
图1B为异丙肾上腺素造模后模型组大鼠心电图；
图2A为异丙肾上腺素造模后扎那米韦低剂量组大鼠心电图；
图2B为异丙肾上腺素造模后扎那米韦高剂量组大鼠心电图；
图3A为异丙肾上腺素造模后磷酸奥司他韦低剂量组大鼠心电图；
图3B为异丙肾上腺素造模后磷酸奥司他韦高剂量组大鼠心电图；
图4A为空白对照组大鼠心脏病理切片电镜图；
图4B为异丙肾上腺素造模后模型组大鼠心脏病理切片电镜图；
图5A为异丙肾上腺素造模后扎那米韦低剂量组大鼠心脏病理切片电镜图；
图5B为异丙肾上腺素造模后扎那米韦高剂量组大鼠心脏病理切片电镜图；
图6A为异丙肾上腺素造模后磷酸奥司他韦低剂量组大鼠心脏病理切片电镜图；
图6B为异丙肾上腺素造模后磷酸奥司他韦高剂量组大鼠心脏病理切片电镜图；
图7为异丙肾上腺素造模后各组心肌神经氨酸酶表达水平的影响。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。本发明中，未做详细描述或特别强调的试验材料或试验方法均为本领域常规试验材料或试验方法，本领域普通技术人员可以获得该试验材料或具备开展该试验的能力。
实施例1：神经氨酸酶抑制剂扎那米韦和磷酸奥司他韦对心肌缺血损伤的改善作用
一、试验材料
1、仪器和试剂
生理记录仪：BL-420S生理机能实验系统(中国成都泰盟)、动物呼吸机HX-300S(中国成都泰盟)、MP120-1电子秤(上海第二天平仪器厂)、动物手术器械等。
盐酸异丙肾上腺素(ISO)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度>99％、0.9％生理盐水购自国药集团、扎那米韦(ZA)购自大连美仑生物技术有限公司，纯度>98％、磷酸奥司他韦(OS)购自大连美仑生物技术有限公司，纯度>98％、3％水合氯醛。
2、试验动物
SD雄性大鼠120只，购自上海西普尔-必凯公司。
二、试验方法
1、ISO造大鼠急性心肌缺血模型：选取SD大鼠，根据体重分为空白对照组、模型组、ZA高剂量组(0.5 mg/kg i.v.)、ZA低剂量组(0.2 mg/kg i.v.)、OS高剂量组(10 mg/kgp.o.)、OS低剂量组(5 mg/kg p.o.)六组，每组10只。给药组连续给药3天，第二天给药30min后皮下注射ISO，剂量为60mg/kg，第三天同样给药30 min后皮下注射ISO，剂量为60mg/kg，第4天收集血液、心脏等组织样本。
2、左冠状动脉前降支结扎造大鼠急性心肌缺血模型：选取SD大鼠，根据体重分为空白对照组、模型组、ZA高剂量组(0.5 mg/kg i.v.)、ZA低剂量组(0.2 mg/kg i.v.)、OS高剂量组(10 mg/kg p.o.)、OS低剂量组(5 mg/kg p.o.)六组，每组10只。给药组预先24 h和12 h给药，而后将大鼠3％水合氯醛10 ml/kg麻醉，仰卧固定于大鼠板上。于左侧4、5肋间切口撕开心包，暴露心脏，轻压胸廓挤出心脏，于肺动脉圆锥及左心房间找出冠状动脉左前降支，以0号线立即结扎冠状动脉左前降支根部(肺动脉圆锥与左心耳处)，将心脏送回胸腔，并挤出胸腔内血液和气体，迅速关闭胸腔，缝合皮肤，开胸时间不超过30 s。采用BL-420S生理机能实验系统对每只大鼠进行心电图的测定。造模后24h收集血液、心脏等组织样本：摘眼球取血，分离血清，-20℃保存待测；脱颈椎处死动物，迅速取出心脏，以冰生理盐水洗去残留血液，除去大血管、结缔组织，滤纸吸干，称全心重。取心尖部位至10％福尔马林溶液中固定，用于病理学检查，其余心脏减碎后，以10倍量Tris-HCl(pH7.4)缓冲液在冰浴下制成10％的心脏匀浆，于4℃，1000g离心10min，弃沉淀，取上清进行各项酶学指标的检测。
3、观察指标及方法
3.1记录心电图
采用标准Ⅱ导联记录各组大鼠心电图
3.2观察心脏病理切片
取心尖部位的心肌组织经10％甲醛溶液固定，常规取材，脱水，石蜡包埋，制片(4μm厚)，HE染色，在光学显微镜下观察。
3.3心肌神经氨酸酶水平测定方法
使用ELISA法检测大鼠心肌神经氨酸酶水平，检测试剂盒为神经氨酸酶检测试剂盒，按照检测试剂盒的操作说明书进行测定。
3.4血清心肌损伤指标CK-MB和D-LDH检测方法
分别按照CK-MB检测试剂盒(罗氏)和D-LDH检测试剂盒(Invitrogen)操作说明书测定CK-MB和D-LDH。
三、试验结果
1、对心电图的影响
图1～图3所示的典型心电图记录结果表明：异丙肾上腺素造模后，模型组出现明显心肌损伤，神经氨酸酶抑制剂扎那米韦和磷酸奥司他韦能有效改善心肌损伤，并呈现剂量依赖性。
2、对心肌细胞形态的影响
图4～图6所示的典型心脏病理切片表明：异丙肾上腺素造模后，模型组出现明显心肌损伤，表现为心肌细胞形态不规则，细胞间裂隙明显，大量炎症细胞浸润，神经氨酸酶抑制剂扎那米韦和磷酸奥司他韦能有效改善心肌损伤，并呈现剂量依赖性。
3、对心肌神经氨酸酶表达水平的影响
从表1和图7可以看出，异丙肾上腺素造模后，ELISA法检测大鼠心肌细胞中神经氨酸酶表达，结果显示模型组心肌缺血后神经氨酸酶表达上调，神经氨酸酶抑制剂扎那米韦和磷酸奥司他韦能有效抑制心肌缺血引起的神经氨酸酶表达升高，并呈现剂量依赖性。
表1各组心肌神经氨酸酶表达水平
4、对心肌损伤指标在血清中表达水平的影响
CK-MB和D-LDH是心肌缺血损伤的血清标志物，异丙肾上腺素造急性心肌缺血模型后，血清CK-MB、LDH水平上升，给药组则显著性降低。结果见表2。
表2血清CK-MB、D-LDH表达水平
在大鼠冠状动脉左前降支结扎模型中，我们得到了与异丙肾上腺素造急性心肌缺血模型类似的结论。冠脉结扎模型组心肌神经氨酸酶活力升高，血清CK-MB、LDH水平上升，给药组则显著性降低。同时，扎那米韦与奥司他韦给药能显著改善大鼠心电图及心脏病理切片。
实施例2：黄连碱对神经氨酸酶的抑制作用和对心肌缺血损伤的改善作用
一、试验材料
1、仪器和试剂
黄连碱购买自四川维克奇生物科技有限公司，纯度>98％；其它仪器和试剂同实施例1。
2、试验动物
大鼠100只，来源同实施例1。
二、试验方法
1、ISO造大鼠急性心肌缺血模型：选取SD大鼠，根据体重分为空白对照组、模型组、黄连碱高剂量组(100mg/kg p.o.)、黄连碱中剂量组(25mg/kg p.o.)、黄连碱低剂量组(10mg/kg p.o.)五组，每组10只。给药组连续给药3天，第二天给药30 min后皮下注射ISO，剂量为60 mg/kg，第三天同样给药30 min后皮下注射ISO，剂量为60 mg/kg，第4天收集血液、心脏等组织样本。
2、左冠状动脉前降支结扎造大鼠急性心肌缺血模型：选取SD大鼠，根据体重分为空白对照组、模型组、黄连碱高剂量组(100mg/kg p.o.)、黄连碱中剂量组(25mg/kg p.o.)、黄连碱低剂量组(10mg/kg p.o.)五组，每组10只。给药组预先24 h和12 h给药，而后将大鼠3％水合氯醛10 ml/kg麻醉，仰卧固定于大鼠板上。于左侧4、5肋间切口撕开心包，暴露心脏，轻压胸廓挤出心脏，于肺动脉圆锥及左心房间找出冠状动脉左前降支，以0号线立即结扎冠状动脉左前降支根部(肺动脉圆锥与左心耳处)，将心脏送回胸腔，并挤出胸腔内血液和气体，迅速关闭胸腔，缝合皮肤，开胸时间不超过30 s。采用MPA200生物信号分析系统对每只大鼠进行心电图的测定。造模后24 h收集血液、心脏等组织样本。
3、观察指标及方法
3.1记录心电图：同实施例1。
3.2观察心脏病理切片：同实施例1。
3.3心肌神经氨酸酶水平测定方法：同实施例1。
3.4血清心肌损伤指标CK-MB和D-LDH检测方法：同实施例1。
3.5测定黄连碱对神经氨酸酶的抑制率
用神经氨酸酶检测试剂盒测定神经氨酸酶活力。精密称取黄连碱标准品，依次配制200μM(高剂量组)、100μM(中剂量组)、50μM(低剂量组)溶液备用。为配制标准曲线，在96孔荧光酶标板内每孔加入70微升神经氨酸酶检测缓冲液，再分别加入0、1、2、5、7.5、10微升神经氨酸酶后每孔加入0-20微升Milli-Q水使每孔总体积为90微升。为检测样品，在96孔荧光酶标板内每孔加入70微升神经氨酸酶检测缓冲液，然后每孔加入10微升神经氨酸酶及10微升不同浓度黄连碱溶液，每孔再加入0-10微升Milli-Q水使每孔总体积为90微升。振动混匀约1分钟后37℃孵育2分钟使抑制剂和神经氨酸酶充分相互作用，每孔加入10微升神经氨酸酶荧光底物，振动混匀，37℃孵育30分钟后于激发波长322nm，发射波长450nm处进行荧光测定。
三、试验结果
1、对心电图的影响
典型心电图记录结果表明：异丙肾上腺素造模后，模型组出现明显心肌损伤，黄连碱能有效改善心肌损伤，并呈现剂量依赖性，黄连碱高剂量组的心电图与空白对照组基本一致。
2、对心肌细胞形态的影响
典型心脏病理切片表明：异丙肾上腺素造模后，模型组出现明显心肌损伤，表现为心肌细胞形态不规则，细胞间裂隙明显，大量炎症细胞浸润，黄连碱能有效改善心肌损伤，并呈现剂量依赖性，黄连碱高剂量组的心肌细胞形态和细胞间裂隙与空白对照组基本一致，且无炎症细胞浸润。
3、对心肌神经氨酸酶表达水平的影响
异丙肾上腺素造模后，ELISA法检测大鼠心肌细胞中神经氨酸酶表达，结果显示模型组心肌缺血后神经氨酸酶表达上调(约40％)，黄连碱能有效抑制心肌缺血引起的神经氨酸酶表达升高，并呈现剂量依赖性(黄连碱低剂量组比模型组下调约21％；黄连碱中剂量组比模型组下调约29％；黄连碱高剂量组比模型组下调约40％)。
4、对心肌损伤指标在血清中表达水平的影响
CK-MB和D-LDH是心肌缺血损伤的血清标志物，异丙肾上腺素造急性心肌缺血模型后，血清CK-MB、LDH水平上升，给药组则显著性降低(黄连碱低剂量组比模型组下调约20％；黄连碱中剂量组比模型组下调约30％；黄连碱高剂量组比模型组下调约40％)。
5、测定黄连碱对神经氨酸酶的抑制率
表3为黄连碱对神经氨酸酶的抑制率，表明黄连碱为神经氨酸酶的有效抑制剂，其对神经氨酸酶的抑制率呈浓度相关，黄连碱对心肌缺血损伤的改善作用可能与黄连碱对神经氨酸酶的抑制作用有关。
表3黄连碱对神经氨酸酶的抑制率
黄连碱浓度(μM) 抑制率(％)
50 5.64
100 28.69
200 56.25
实施例3：黄连碱与扎那米韦或磷酸奥司他韦对心肌缺血损伤的协同改善作用
以Median-effect Principle(中效原理)为评价基础，绘制剂量-效应曲线及不同效应下合用指数曲线(Fa-CI曲线)，从两药合用指数的关系图表定量评价两药之间是否存在协同关系。
合用指数CI＝D1/DX1+D2/DX2+αD1D2/DX1DX2，其中DX1、DX2为两药单独使用时产生X效应时两药各自的浓度，D1和D2为两药合用时产生X效应时的两药各自所需浓度。黄连碱与扎那米韦、磷酸奥司他韦作用机制相同，都是通过抑制神经氨酸酶的活性发挥作用，故α＝1。当CI＜1，表明两药合用效应为协同；CI＝1，表明两药合用效应为相加；CI＞1表明两药合用效应为拮抗。根据单药或联合用药对神经氨酸酶的抑制率，绘制剂量-效应曲线，并进一步绘制不同效应(Fa)下的合用指数(CI)关系曲线。
参照实施例2中“3.5测定黄连碱对神经氨酸酶的抑制率”的方法分别测定不同浓度黄连碱、扎那米韦、磷酸奥司他韦单药对神经氨酸酶的抑制率，以及黄连碱与扎那米韦合用、黄连碱与磷酸奥司他韦合用对神经氨酸酶的抑制率，绘制剂量-效应曲线，并进一步绘制不同效应(Fa)下的合用指数(CI)关系曲线。两药联合效应分析结果如下：
黄连碱与扎那米韦联合作用于神经氨酸酶时，当Fa＝0.40(即40％神经氨酸酶被抑制)时，CI≈1，两药联合效应为协同，当Fa＞0.40时，CI＞1，两药合用效应为拮抗，当Fa＜0.40时，CI＜1，两药合用效应为协同。联合效应分析结果提示黄连碱与扎那米韦在低剂量作用于神经氨酸酶时存在协同作用，进一步提示二者在低剂量时对心肌缺血损伤存在协同改善作用。
黄连碱与磷酸奥司他韦联合作用于神经氨酸酶时，当Fa＝0.45(即45％神经氨酸酶被抑制)时，CI≈1，两药联合效应为协同，当Fa＞0.45时，CI＞1，两药合用效应为拮抗，当Fa＜0.45时，CI＜1，两药合用效应为协同。联合效应分析结果提示黄连碱与磷酸奥司他韦在低剂量作用于神经氨酸酶时存在协同作用，进一步提示二者在低剂量时对心肌缺血损伤存在协同改善作用。
两药联合效应分析结果表明，可以开发黄连碱与扎那米韦的组合物或黄连碱与磷酸奥司他韦的组合物用于治疗心肌缺血损伤。由于黄连碱与扎那米韦或黄连碱与磷酸奥司他韦在低剂量时存在协同作用，可以将黄连碱与扎那米韦的组合物或黄连碱与磷酸奥司他韦的组合物开发成低剂量规格的药物制剂通过反复给药实现改善治疗心肌缺血损伤的目的。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (6)

1.神经氨酸酶抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗心肌缺血损伤的药物中的应用，且该抑制剂不为黄连碱。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述神经氨酸酶抑制剂为扎那米韦。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述神经氨酸酶抑制剂为磷酸奥司他韦。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述神经氨酸酶抑制剂为扎那米韦和黄连碱的组合物。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述神经氨酸酶抑制剂为磷酸奥司他韦和黄连碱的组合物。
6.根据权利要求1~5任一所述的应用，其特征在于：所述心肌缺血为心肌梗死引发的心肌缺血。
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