CN105726593B - 中药当归提取物在制备抗耐药菌药物中的应用 - Google Patents

中药当归提取物在制备抗耐药菌药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及当归提取物的一种新的用途，实验结果显示本发明的当归提取物及其有机溶剂萃取流份和大孔吸附树脂梯度洗脱部分可以抑制铜绿假单胞菌和耐药铜绿假单胞菌的生物膜，更突出的是本发明的当归提取物及其有机溶剂萃取流份和大孔吸附树脂梯度洗脱部分对于耐药铜绿假单胞菌同样显示了明显的抑制作用，从而提供了一种非抗生素类的抗耐药菌药物，并有助于避免抗生素耐药问题。

Description

中药当归提取物在制备抗耐药菌药物中的应用
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及中药当归提取物在制备抗耐药菌药物中的应用。
背景技术
随着抗生素的广泛应用，微生物的耐药强度越来越高、耐药谱越来越广，耐药性形成的速度与抗菌素灭菌能力成比例上升。耐药性一旦产生，将会保持下去。抗生素的继续使用，只会为高耐药菌株继续提供选择压力，促进其复制、组构及共同享用耐药基因，导致多重耐药菌株的加快形成。目前，抗生素耐药性已经成为全球严重的公共卫生问题。
我国每年因抗生素滥用导致800亿元医疗费用增长，同时致使8万病人因其不良反应死亡。因为，不论疾患轻重、手术大小，都在使用抗生素、并且倾向于高效价抗生素和经常大量盲目长时间联合用药、个别甚至在短期内用到4种以上的抗生素而导致新的耐药菌株不断出现。有专家预言，我国可能率先进入“后抗生素时代”，即回到抗生素发现之前的时代。
我国拥有极其丰富的中药和天然药物资源，药用植物近万种，为新药发现提供了丰富的物质基础和来源。而且，用中成药替代抗生素进行抗菌、消炎，具有不良反应及副作用相对较小、不产生耐药性等优点。另一方面，世界医学界已有40年的时间里没有真正意义上的新型抗生素诞生。因此，许多科研工作者不由自主地把目光集中在天然药材“抗生素”上。从传统中药资源中找到同样有抗菌消炎疗效的抗生素替代性产品，将能很好地解决抗生素耐药性这一世界难题。
近年来，细菌群体感应(Quorum sensing，QS)系统已成为研究新型抗耐药菌药物的重要靶标。QS是细菌细胞内或细胞间信号传递的一种方式，通过监控某些信号分子(又称自体诱导分子)如高丝氨酸内酯(acy1-homoserine lactone，AHL)的浓度，来控制并协调整个细菌群体行为，共同对周围环境刺激做出反应，极大增强了整个细菌群体的生存能力。
绿假单胞菌(P.aeruginosa)具有很强的在组织表面形成生物膜的能力，并且其QS系统研究得也最为透彻，因此铜绿假单胞菌被选做本项目研究的模式菌。铜绿假单胞菌是一种重要的条件致病菌，常常引起呼吸道感染、肺炎、泌尿道感染等医院内感染，被认为是病人在医院期间发生感染的第三大致病菌，严重危害着人类的健康与生命。铜绿假单胞菌高的内在抗药性与其群体感应系统密不可分，该QS系统控制着包括生物膜、外毒素、弹性蛋白酶、溶血素、绿脓菌素等几乎所有致病因子的表达。这些致病因子决定了铜绿假单胞菌对宿主的致病能力。其中，生物膜的形成和扩散是造成P.aeruginosa多重耐药的一个重要机制。美国国立卫生研究院(NIH)发布的一份权威调查报告指出，人类微生物感染有超过80％是通过细菌生物被膜(Biofilm，BF)介导的。BF作为一种细菌群体行为，其分化与发育与细菌群体感应密切相关。细菌群体感应系统完整的细菌可以形成发育和分化正常的、典型的能对抗杀菌剂的生物膜，而细菌群体感应系统残缺的的细菌则不能形成典型的生物膜，对抗生素的抵抗力显著下降，并且容易被冲洗掉以及对杀菌剂敏感。因此，通过猝灭控制细菌生物膜形成和病原菌毒力因子表达的QS系统，因不直接抑制细菌生长、不会对细菌产生选择性压力，将很有希望获得作用于新靶点、不会使细菌产生耐药性的群感抑制剂(QSinhibitors，QSI)。
当归为伞形科藁本植物当归Angelica sinenSis(Oliv)Diels的干燥根茎，味甘，性辛、温，归肝、心、脾经，具补血和血、调经止痛之功效。始载于《神农本草经》，列为中品，其药效独特，历来是医家珍品，素有“十方九归”之称。系统查阅当归的文献发现，现代药理和临床研究也表明当归具有良好的抗菌抗炎作用，但是没有发现其抗耐药菌及其抑制细菌群体感应系统的文献报道。
发明内容
本发明的首要目的在于提供当归提取物制备抗耐药菌药物的用途，具体的为当归提取物制备抗耐药铜绿假单胞菌药物的用途，所述当归提取物通过抑制细菌生物膜发挥其抗菌和/或抗耐药菌的效果，具体的所述当归提取物进一步的使用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，获得当归提取物浸膏的氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层和水层流份或其提取物大孔吸附树脂的乙醇水溶液洗脱部分。
优选的所述提取浸膏采用回流提取或冷浸提取。
优选的大孔吸附树脂乙醇水溶液洗脱液依次为20％、50％、70％和95％的乙醇水溶液。
更优选的当归回流提取的溶剂为50％-95％的乙醇溶液，当归冷浸提取的溶剂为甲醇。
本发明的另一目的是提供一种当归提取物的抗耐药菌药物组合物，所述药物组合物包含上述当归提取物和药学上可接受的辅料。
优选的所述药物组合物为口服制剂。
更优选的所述口服制剂为胶囊剂、片剂和颗粒剂等。
本发明的再一目的为提供一种抗耐药菌的当归提取物的制备方法，所述当归提取物采用当归回流提取或冷浸提取，提取液进一步采用有机溶剂进行萃取或使用大孔吸附树脂进行乙醇溶液梯度洗脱制得。
优选的有机溶剂为氯仿、乙酸乙酯、正丁醇；
优选的进行大孔吸附树脂梯度洗脱的乙醇溶液依次为20％、50％、70％和95％乙醇水溶液。
更优选的当归回流提取的溶剂为50％-95％的乙醇溶液，当归冷浸提取的溶剂为甲醇。
具体的所述抗耐药菌的当归提取物按照以下回流提取、有机溶剂萃取或大孔吸附树脂梯度洗脱方法制备，具体的包括以下步骤：
(1)当归干燥根粉碎，50％-95％乙醇回流提取2-3次，每次1-2小时，合并提取液；
(2)减压浓缩提取液，得到乙醇浸膏；
(3)乙醇浸膏采用有机溶剂萃取或大孔吸附树脂的梯度洗脱，即得有机溶剂萃取流份和大孔吸附树脂洗脱部分。
优选的，步骤(1)采用60％-95％乙醇回流提取2-3次，更优选的为采用95％乙醇回流提取2次，每次提取2小时，合并提取液。
优选的当步骤(3)乙醇浸膏采用有机溶剂萃取时，其具体步骤为乙醇浸膏依次用等体积的氯仿、乙酸乙酯和水饱和正丁醇分别萃取三次，分别减压回收各萃取部分溶剂，得到氯仿可溶部分(ASC)，乙酸乙酯可溶部分(ASE)，正丁醇可溶部分(ASB)，和水层(ASW)，即得。
优选的当步骤(3)采用大孔吸附树脂梯度洗脱时，其具体步骤为进行大孔树脂开放柱层析，依次用体积百分比为20％的乙醇水溶液、50％的乙醇水溶液、70％的乙醇水溶液、95％的乙醇水溶液洗脱大孔树脂开放柱，得到各部分洗脱液，减压回收各洗脱部分溶剂，得到20％乙醇水溶液洗脱部分，50％乙醇水溶液洗脱部分，70％乙醇水溶液洗脱部分和95％乙醇水溶液洗脱部分，即得。
本发明的有益效果：
本发明提供了当归提取物的一种新的用途，实验结果显示本发明的当归提取物及其有机溶剂萃取流份和大孔吸附树脂梯度洗脱部分可以抑制铜绿假单胞菌和耐药铜绿假单胞菌的生物膜，显示了本发明当归提取物及其有机溶剂萃取流份和大孔吸附树脂梯度洗脱部分对于铜绿假单胞菌的抑制效果，更突出的是本发明的当归提取物及其有机溶剂萃取流份和大孔吸附树脂梯度洗脱部分对于耐药铜绿假单胞菌同样显示了明显的抑制作用，从而提供了一种非抗生素类的抗耐药菌药物，并有助于避免抗生素耐药问题。
附图说明
图1为当归提取物各萃取层对铜绿假单胞菌生物膜的吸光度值；
图2为当归提取物及各溶剂萃取部分对铜绿假单胞菌生物膜的抑制活性的电子扫描显微镜图像。
具体实施方式
下面将进一步的来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
实施例1：当归提取物的制备方法
(1)当归干燥根10kg，粉碎，用10倍量当归重量的95％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液；
(2)减压浓缩提取液，得到乙醇浸膏1700g。
(3)乙醇浸膏依次用等体积的氯仿、乙酸乙酯和水饱和正丁醇分别萃取三次；
(4)分别减压回收各萃取部分溶剂，得到氯仿可溶部分(ASC)420g，乙酸乙酯可溶部分(ASE)87g，正丁醇可溶部分(ASB)725g，和水层(ASW)356g。
实施例2：当归提取物的制备方法
(1)当归干燥根5kg，粉碎，用20倍当归重量的甲醇冷浸，冷浸两次，每次两个星期，合并冷浸液；
(2)减压浓缩冷浸液，得到甲醇提取物800g；
(3)将甲醇提取物的水混悬液，进行大孔树脂开放柱层析，依次用体积百分比为20％的乙醇水溶液、50％的乙醇水溶液、70％的乙醇水溶液、95％的乙醇水溶液洗脱大孔树脂开放柱，得到各部分洗脱液；
(4)分别减压回收各洗脱部分溶剂，得到20％乙醇水溶液洗脱部分236g，50％乙醇水溶液洗脱部分125g，70％乙醇水溶液洗脱部分183g，和95％乙醇水溶液洗脱部分117g。
实施例3：当归提取物的制备方法
(1)当归干燥根3kg，粉碎，用8倍当归重量的60％乙醇回流提取三次，每次2小时，合并提取液；
(2)减压浓缩提取液至无醇味，得到乙醇提取物的水混悬液。
(3)乙醇提取物的水混悬液进行大孔树脂开放柱层析，依次用体积百分比为10％的乙醇水溶液、30％的乙醇水溶液、50％的乙醇水溶液、70％的乙醇水溶液、95％的乙醇水溶液洗脱大孔树脂开放柱，得到各部分洗脱液；
(4)分别减压回收各洗脱部分溶剂，得到10％乙醇水溶液洗脱部分82g，30％乙醇水溶液洗脱部分31g，50％乙醇水溶液洗脱部分75g，70％乙醇水溶液洗脱部分68g，和95％乙醇水溶液洗脱部分43g。
实施例4：当归提取物对铜绿假单胞菌的生长抑制效果实验
取实施1所制得的当归提取物及各溶剂萃取部分进行了对铜绿假单胞菌的菌生长抑制实验。具体试验方法如下：
采用经典的二倍稀释法测定。取13支无菌试管，第1管加1.8mL营养肉汤，第2～13管每管各加1mL营养肉汤；在无菌操作条件下，吸取稀释好的药物0.2mL加入到第1管，混匀后吸取1mL入第2管中，依次倍比稀释至第13管，最后保持其浓度依次是512μg/mL，256μg/mL，128μg/mL，64μg/mL，32μg/mL，16μg/mL，8μg/mL，4μg/mL，2μg/mL，1μg/mL，0.5μg/mL。各管均加入供试菌液0.05mL，混匀之后置于37℃培养24h，在生长对照管的细菌生长状况良好的前提下，以肉眼观察药物最低浓度管无菌生长者，即为该受试药物的MIC。阳性对照物为：呋喃酮C31((Z)-4-溴-5-(溴亚甲基)-2(5H)-呋喃酮)-文献(EMBO.J.2003，22，3803-3815)报道的生物膜抑制活性最强的化合物。
表1当归提取物各萃取层对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(MIC，g/mL)
“+”表示混浊(细菌生长良好)，“-”表示澄清(细菌生长受抑制)
实施例5：当归提取物的生物膜抑制效果实验
取实施1所制得的当归提取物及各溶剂萃取部分进行了对铜绿假单胞菌生物膜的抑制活性。
具体试验方法如下：依照细菌粘附到微量聚氯乙烯96孔板的能力进行分析。将100μL含有0.2％酪蛋氨酸和甘油加入稀释培养过夜的菌液(OD600，0.05)，加入到96孔微量板的各孔中。然后每孔加入系列浓度(1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC)的测试样品。同时，加入同当量的呋喃酮C31((Z)-4-溴-5-(溴亚甲基)-2(5H)-呋喃酮)-文献(EMBO.J.2003，22，3803-3815)报道的生物膜抑制活性最强的化合物-做为阳性对照物。30℃培养20h后，用蒸馏水洗涤2次、除去浮游生物细胞，然后加入125μL 1％龙胆紫。室温放置15min后，用蒸馏水小心洗涤3次，加入300μL 95％乙醇以溶解染色的生物膜，其溶液在630nm的吸光度进行分析。平行测定三次。结果以生物膜抑制率(％)表示。吸光度值与生物膜的形成程度正相关。
生物膜抑制率(％)＝(OD阴性组-OD样品)/OD阴性组×100
表2各萃取层对铜绿假单朐菌生物膜的抑制活性
测定结果显示当归的乙醇提取物及各个萃取层均呈现不同强度的生物膜抑制活性。其中，以氯仿层活性最好，正丁醇层次之。
实施例6：利用电子扫描显微镜观察实施1所制得的当归提取物及各溶剂萃取部分对铜绿假单胞菌生物膜的抑制活性。
具体试验方法如下：将经培养有细菌生长的生物膜载体用2.5％戊二醛固定，依次用50％，70％，90％，无水乙醇梯度脱水，然后用醋酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，载体表面在真空条件下镀金粉，电子扫描显微镜观察，确认生物膜形成，实验结果显示了本发明的当归提取物各溶剂萃取部分均对铜绿假单胞菌生物膜具有显著的抑制活性，具体结果参见附图2。
实施例7：抗耐药菌的当归提取物胶囊剂
当归提取物每粒胶囊的组成为：取实施1所制得的当归提取物100mg，乳糖116mg，玉米淀粉40mg，硬脂酸镁4mg。先将当归提取物、乳糖和玉米淀粉混合10～15分钟，再加入硬脂酸镁混合1～3分钟。将混合物装入合适大小的胶囊中。
当归氯仿可溶部分的每粒胶囊的组成为：取实施1所制得的当归氯仿可溶部分30mg，乳糖116mg，玉米淀粉40mg，硬脂酸镁4mg。先将当归提取物、乳糖和玉米淀粉混合10～15分钟，再加入硬脂酸镁混合1～3分钟。将混合物装入合适大小的胶囊中。
当归乙酸乙酯可溶部分的每粒胶囊的组成为：取实施1所制得的当归乙酸乙酯可溶部分80mg，乳糖116mg，玉米淀粉40mg，硬脂酸镁4mg。先将当归提取物、乳糖和玉米淀粉混合10～15分钟，再加入硬脂酸镁混合1～3分钟。将混合物装入合适大小的胶囊中。
当归正丁醇可溶部分的每粒胶囊的组成为：取实施1所制得的当归正丁醇可溶部分50mg，乳糖116mg，玉米淀粉40mg，硬脂酸镁4mg。先将当归提取物、乳糖和玉米淀粉混合10～15分钟，再加入硬脂酸镁混合1～3分钟。将混合物装入合适大小的胶囊中。
实施例8：抗耐药菌的当归提取物胶囊剂片剂
当归提取物每片的组成为：取实施1所制得的当归提取物100mg，乳糖122mg，玉米淀粉10％糊剂30mg，玉米淀粉45mg，硬脂酸镁3mg。先将当归提取物和乳糖混合10～15分钟，用配置好的玉米淀粉10％糊剂将混合物制成颗粒。通过粗筛将湿颗粒碾碎，之后干燥。将干燥的颗粒过筛并与玉米淀粉混合10～15分钟。再加入硬脂酸镁混合1～3分钟。在压片机上将混合物压制成合适大小和重量的片剂。
当归氯仿可溶部分的每片的组成为：取实施1所制得的当归氯仿可溶部分30mg，乳糖122mg，玉米淀粉10％糊剂30mg，玉米淀粉45mg，硬脂酸镁3mg。先将当归氯仿可溶部分和乳糖混合10～15分钟，用配置好的玉米淀粉10％糊剂将混合物制成颗粒。通过粗筛将湿颗粒碾碎，之后干燥。将干燥的颗粒过筛并与玉米淀粉混合10～15分钟。再加入硬脂酸镁混合1～3分钟。在压片机上将混合物压制成合适大小和重量的片剂。
当归乙酸乙酯可溶部分的每粒胶囊的组成为：取实施1所制得的当归乙酸乙酯可溶部分80mg，乳糖122mg，玉米淀粉10％糊剂30mg，玉米淀粉45mg，硬脂酸镁3mg。先将当归乙酸乙酯可溶部分和乳糖混合10～15分钟，用配置好的玉米淀粉10％糊剂将混合物制成颗粒。通过粗筛将湿颗粒碾碎，之后干燥。将干燥的颗粒过筛并与玉米淀粉混合10～15分钟。再加入硬脂酸镁混合1～3分钟。在压片机上将混合物压制成合适大小和重量的片剂。
当归正丁醇可溶部分的每粒胶囊的组成为：取实施1所制得的当归正丁醇可溶部分50mg，，乳糖122mg，玉米淀粉10％糊剂30mg，玉米淀粉45mg，硬脂酸镁3mg。先将当归正丁醇可溶部分和乳糖混合10～15分钟，用配置好的玉米淀粉10％糊剂将混合物制成颗粒。通过粗筛将湿颗粒碾碎，之后干燥。将干燥的颗粒过筛并与玉米淀粉混合10～15分钟。再加入硬脂酸镁混合1～3分钟。在压片机上将混合物压制成合适大小和重量的片剂。
以上所述仅为本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原料的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.当归提取物制备抗耐药菌药物的用途，其特征在于：所述耐药菌为耐药铜绿假单胞菌，所述当归提取物通过抑制细菌生物膜发挥其抗耐药菌的作用，所述当归提取物按照如下方法进行制备：
(1)当归干燥根，粉碎，50％-95％乙醇回流提取2-3次，每次1-2小时，合并提取液；
(2)减压浓缩提取液，得到乙醇浸膏；
(3)乙醇浸膏用等体积的氯仿萃取三次，减压回收萃取部分溶剂，得到氯仿可溶部分(ASC)，即得。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：当归提取物添加药学上可接受的辅料后制备成口服制剂。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述口服制剂为胶囊剂、片剂或颗粒剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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中药当归丙酮提取物抗菌活性及成分鉴定;张金霞;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20141015;摘要部分，第12页实验方法部分，第17页表2.1，第17页正文第2-3段 *

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