CN105717251A - 一种烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法 - Google Patents

一种烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法，所述烟蒂包括滤嘴和残留烟丝，所述杀菌剂为多菌灵、霜霉威、稻瘟灵、三唑醇和三唑酮中的一种或多种，包括以下步骤：选取样品烟支,收集抽吸卷烟后的滤嘴；将烟蒂中的滤嘴和烟丝进行拆分,分别提取；经过涡漩振荡冷冻后的第一旋盖离心管和第二旋盖离心管中分别依次加入无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠，第三次涡旋振荡后离心，离心完成后冷冻保存；再经过N?丙基乙二胺纯化：最后使用LC?MS/MS分析测定。本发明既保留了较好的提取效果，又不会将滤嘴中聚丙烯纤维或醋酸纤维溶解，从而降低了从提取溶剂中提取所述杀菌剂的难度。

Description

一种烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法
技术领域
本发明属于农药残留检测领域，涉及烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法。
背景技术
叶斑病和黑茎病是烟草中最为常见的细菌性病害，对烟草的产量和治疗影响很大。霜霉威、多菌灵、稻瘟灵、三唑醇和三唑酮都是烤烟生产中常用杀菌剂，能防治烟草叶斑病和黑胫病，具有高效、低毒等特点。除多菌灵外，其它四个指标均被列入《中国烟叶公司2015年度烟草上推荐使用农药名单》，在各烟区均有施用，由于其施用广泛，这几种杀菌剂为烟叶高残留指标，经常在烤后烟叶中检出。烟叶中杀菌剂的残留会对吸烟者产生健康风险，其中多菌灵还被列入国际烟草科学研究合作中心(CORESTA)2013年的烟草农药指导性残留限量名单，指导限量为2.00mg/kg。
烟草中杀菌剂残留量的分析方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-串联质谱法(GC–MS/MS)和液相色谱–串联质谱法(LC–MS/MS)，而烟气及滤嘴中杀菌剂的检测方法相对报道较少。由于卷烟烟气直接进入吸烟者体内，转移到烟气中的杀菌剂会对吸烟者产生较大的健康风险，因此，准确定量分析烟蒂中五种常用杀菌剂并研究烟蒂截留率具有较为重要的意义。研究截留率主要手段是测定烟蒂对五种杀菌剂的截留量，通过计算即可得到截留率。前期有研究者较为关注有机磷、菊酯和氨基甲酸酯类农药的烟气及滤嘴中转移行为，而这些农药大部分为禁用或烟草中不推荐施用农药，在烟草中检出率较低。另外有研究者关注烟用抑芽剂马来酰肼的烟气、烟灰和滤嘴转移行为，此研究通过成品卷烟加标的方式研究其转移行为，而部分农药为内吸型农药，这可能与实际吸烟过程中农药的转移过程存在较大的差异。
发明内容
鉴于此，本发明目的在于提供一种准确定量检测五种常用杀菌剂的方法，特别是测定烟蒂中五种常用杀菌剂的方法，这五种常用杀菌剂分别为多菌灵、霜霉威、稻瘟灵、三唑醇和三唑酮。
发明人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法，所述烟蒂包括滤嘴和残留烟丝，所述杀菌剂为多菌灵、霜霉威、稻瘟灵、三唑醇和三唑酮中的一种或多种，包括以下步骤：
步骤a)根据ISO 8243:2006来选取样品烟支,按照ISO 3402:1999来平衡烟支；采用ISO标准抽吸模式(ISO 3308:2000)来抽吸5支卷烟，收集抽吸卷烟后的滤嘴；
步骤b)将烟蒂中的滤嘴和烟丝进行拆分,分别提取；
将卷烟烟丝合并放入第一旋盖离心管中，加入超纯水，静置充分浸润，向第一离心管中加入乙腈和内标，第一涡旋震荡，完成后冷冻保存；
将滤嘴分为多瓣，合并放入第二旋盖离心管中，向离心管中加入甲醇，振荡到样品被甲醇充分浸润，静置，向第二离心管中加入内标，第二涡漩振荡，完成后冷冻保存；
步骤c)经过涡漩振荡冷冻后的第一旋盖离心管和第二旋盖离心管中分别依次加入无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠，第三次涡旋振荡后离心，离心完成后冷冻保存；
步骤d)N-丙基乙二胺(PSA)纯化：
在第一旋盖离心管中移取其上清液于第三旋盖离心管中，在第二旋盖离心管中移取其上清液于第四旋盖离心管中，分别向第三旋盖离心管和第四旋盖离心管中加入无水硫酸镁及PSA吸附剂，第四次漩涡振荡混合，然后高速离心；吸取上清液经有机相滤膜过滤，移取滤液，并用超纯水稀释定容后待测；
步骤e)配制标准溶液
分别准确称取杀菌剂标准品,精确至0.0001g，用乙腈溶解定容，制得单一标准储备液；
用乙腈准确配制混合标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，冷冻保存备用；
稀释混合标准储备液得到混合标准工作液，储存于棕色玻璃瓶中，冷冻保存备用；
准确配置TPP内标标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，冷冻保存；取一定量的内标标准储备液，用乙腈稀释定容，制得内标工作液；
所有的冷冻的储备液使用前将其恢复到室温；
步骤f)LC-MS/MS分析测定
色谱条件：Atiantis UPLC HSS T3(100mm×2.1mm，1.8μm)；流动相A：体积分数为0.1％的甲酸水溶液，流动相B：体积分数为0.1％的甲酸甲醇溶液；流速0.4mL/min；柱温35°C；进样量2μL；
梯度洗脱条件：0～2min，90％A～50％A；2～2.4min，50％A～30％A；2.4～4.0min，30％A～20％A；4.0～6.0min，20％A～5％A；6.0～9.8min，5％A～5％A；9.8～10.0min，5％A～90％A；10.0～12.0min，90％A～90％A；
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，喷雾电压(IS)：2.6kV；离子化温度350℃；雾化气流量：1000L/Hr；锥孔气(cone)流量50L/Hr；碰撞气流量为0.15ml/min；碰撞气为氩气，其余气体为氮气；驻留时间为30msec，正离子MRM模式采集。
根据本发明烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法的一个具体实施方式，所述冷冻温度为-20℃。
根据本发明烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法的一个具体实施方式，所述单一标准储备液的浓度为1.0mg/mL；所述混合标准储备液中，霜霉威：0.20mg/mL、多菌灵和稻瘟灵：0.04mg/mL、三唑醇和三唑酮：0.10mg/mL；所述混合标准工作液中，霜霉威：0.020mg/mL；多菌灵和稻瘟灵：0.004mg/mL；三唑醇和三唑酮：0.010mg/mL。
根据本发明烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法的一个具体实施方式，所述内标标准储备液为0.99mg/mL TPP。
根据本发明烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法的一个具体实施方式，所述第一旋盖离心管的容积为50mL；所述第二旋盖离心管的容积为50mL；所述第三旋盖离心管的容积为1.8mL，所述第四旋盖离心管的容积为1.8mL。
根据本发明烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法的一个具体实施方式，所述第一旋盖离心管中加入超纯水的体积为10mL，静置浸润的时间为10min；加入乙腈和内标的体积分别为10mL和100μL；所述第二离心管中加入甲醇和内标的体积分别为20mL和200μL；所述内标浓度为10μg/mL。
根据本发明烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法的一个具体实施方式，所述第一涡旋震荡速率为2000r/m，时间为2min；所述第二涡旋震荡速率为2000r/m，时间为5min；所述第三涡旋震荡速率为2000r/m，时间为2min；所述第四涡旋震荡速率为2000r/m，时间为2min。
根据本发明烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法的一个具体实施方式，步骤(c)中，依次加入的无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠的质量分别为4g、1g、1g和0.5g。
根据本发明烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法的一个具体实施方式，步骤(d)中，加入无水硫酸镁及PSA吸附剂的质量为150mg和25mg。
根据本发明烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法的一个具体实施方式，步骤(e)中，移取滤液体积为200μL，加入超纯水定容到1mL。
与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：
a)本文针对烟草中常施用的五种杀菌剂霜霉威、多菌灵、稻瘟灵、三唑醇和三唑酮中的任意一种或多种，利用超高效液相色谱-串联质谱仪(UPLC–MS/MS)，建立UPLC–MS/MS同时快速分析烟蒂滤嘴、烟蒂中残留烟丝(烟蒂烟丝)中所述杀菌剂截留量的方法，可以应用此方法研究所述五种杀菌剂在标准卷烟添加农药标准品(标烟加标样品)和挑选高杀菌剂高烟叶利用小型卷烟机卷制的卷烟样品(自制卷烟样品)中的滤嘴转移率，为滤嘴风险评价提供数据支撑。
b)发明人在实施本发明的过程中，尝试了多种提取溶剂对滤嘴中杀菌剂截留量的提取方式，最终选择甲醇作为提取溶剂，既保留了较好的提取效果，又不会将滤嘴中聚丙烯纤维或醋酸纤维溶解，从而降低了从提取溶剂中提取所述杀菌剂的难度。
c)发明人在实施本发明的过程中，尝试了多种UPLC色谱柱，包括UPLC HSS T3，UPLC BEH Shield RP18和Atlantis dC18等，最终选择了UPLC HSS T3柱，配合本发明的流动相体系，能够获得更好的分离度与峰形。
d)发明人尝试了多种不同的流动相体系，最终确定了0.1％甲酸水和0.1％甲酸甲醇体系与UPLC HSS T3柱配合，能够获得更好的分离度与峰形。
e)发明人选用了适当的梯度洗脱程序使得所述五种杀菌剂完全分离，整个梯度洗脱时间为12min。
f)发明人采用针泵注射(5μL/min)对目标物单独进样，将五种农药及内标(0.5μg/mL)的标准溶液进行全扫，得到最大响应值的准分子离子[M+H]+为母离子，通过优化喷雾电压、锥孔电压、碰撞能等参数使得母离子强度最大。
附图说明
图1是本发明加标样品的选择离子流色谱图。
具体实施方式
下面结合一个具体实施例进行说明。
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，本实施例同时还对捕集过烟气总粒相物的滤片、烟蒂(包括滤嘴和烟蒂烟丝)、烟灰和主流烟气气相物中的杀菌剂残留进行同时分析，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
本实施例对烟草中常施用的五种杀菌剂，利用超高效液相色谱-串联质谱仪(UPLC–MS/MS)，同时快速分析主流烟气总粒相物、气相物、滤嘴、烟蒂中残留烟丝(烟蒂烟丝)和烟灰中霜霉威、多菌灵、稻瘟灵、三唑醇和三唑酮五种农药截留量。应用此方法研究五种杀菌剂在标准卷烟添加农药标准品(标烟加标样品)和挑选高杀菌剂高残留烟叶利用小型卷烟机卷制的卷烟样品(自制卷烟样品)中的烟气及滤嘴转移率，为烟气及烟气的风险评价提供数据支撑。需要指出的是，利用本实施例的方法，可以仅对霜霉威、多菌灵、稻瘟灵、三唑醇和三唑酮中的任意一种杀菌剂进行测定，也可以对所述杀菌剂中的多种进行同步测定。本实施例是对所述五种杀菌剂进行同步测定。
霜霉威、多菌灵、稻瘟灵、三唑醇和三唑酮标准品来自于Labor Dr.Ehrenstorfer-Schafers(化学纯度：≥98.5％，Augsburg，德国)，内标磷酸三苯酯(TPP)来自于LaborDr.Ehrenstorfer-Schafers(化学纯度：≥98.5％，Augsburg，德国)，甲酸(HPLC级，德国Sigma公司)；甲醇，乙腈(色谱纯，美国Thermo-Fisher公司)；试剂包(内含1g柠檬酸钠和0.5g柠檬酸二氢钠，4g无水硫酸镁和1g氯化钠)和N-丙基乙二胺(PSA)购自安捷伦公司(美国)，水为超纯水。标准卷烟由国家烟草标准化中心提供，63个烟叶样品选自国内外农残普查分析样品。
超高效液相色谱-串联质谱仪(Xevo TQ，美国Waters公司)，配备电喷雾电离源(ESI)；涡旋振荡器(VtexMixer 230VeU，美国Labnet公司)；斯茹林直线型吸烟机(SM450，英国斯茹林公司)，离心机(Sigma 3K15，德国Sigma公司)。
1、标准溶液配制
分别准确称取10mg的杀菌剂标准品，精确至0.0001g,用乙腈溶解定容至10mL，制得1.0mg/mL的单一标准储备液。用乙腈准确配制混合标准储备液，其中，霜霉威：0.20mg/mL；多菌灵和稻瘟灵：0.04mg/mL；三唑醇和三唑酮：0.10mg/mL，所述混合标准储备液储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。稀释所述混合标准储备液得到混合标准工作液，浓度分别为霜霉威：0.020mg/mL；多菌灵和稻瘟灵：0.004mg/mL；三唑醇和三唑酮：0.010mg/mL，所述混合标准工作液储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。
准确配置0.99mg/mLTPP内标标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。取一定量的所述内标储备液，用乙腈稀释定容，制得10μg/mL内标工作液。所有的储备液和工作液于冰箱-20℃保存，使用前将其恢复到室温。
2、样品的提取和净化
按照GB/T 16447-2004平衡烟支，ISO标准抽吸模式(ISO 3308:2000/GB/T 19609-2004)来捕集转移到主流烟气中的农药，每个滤片抽吸5支烟。捕集烟气后的捕集过烟气总粒相物的滤片放入50mL具盖离心管中，并用空白滤片擦干净捕集器上的烟气总粒相物，一并加入具盖离心管；分别收集每个孔道的滤嘴、烟蒂中残留烟丝(烟蒂烟丝)、烟灰于不同的50mL具盖离心管；在每个捕集器后接100mL吸收瓶，吸收瓶预先加入20mL乙腈和100μL内标，用于捕集烟气气相物中的杀菌剂。
烟蒂中烟丝的处理方法按照以下步骤顺序进行：将烟蒂中的烟丝剥离，合并放入50mL第一旋盖离心管中，加入10mL超纯水震荡直至烟丝充分浸润，静置10min，向第一旋盖离心管中加入10ml乙腈和200μL内标，第一涡旋震荡1min，速率2000r/min。，随后放入-20℃冰箱中冷冻保存。
捕集过烟气总粒相物的滤片和烟灰的处理方法与烟丝的处理方法相同。
样品经乙腈提取，基质分散固相萃取，过滤后用LC-MS/MS分析测定。
滤嘴的处理方法按照以下步骤顺序进行：取剔除烟丝滤嘴，每个滤嘴用剪刀剪成四瓣，加入50mL第二旋盖离心管。每个所述第二旋盖离心管中放入5个滤嘴。向所述第二离心管中加入20mL甲醇，振荡到样品被甲醇充分浸润，静置10min。随后向所述第二离心管中加入200μL、10μg/mL内标，第二涡漩振荡5min，2000r/m，振荡完成后放入-20℃冰箱中冷冻保存。
向经过涡漩振荡冷冻后的所述第一旋盖离心管和所述第二旋盖离心管中分别然后依次加入4g无水硫酸镁、1g氯化钠、1g柠檬酸钠和0.5g柠檬酸二氢钠，第三涡漩振荡5min，2000r/m。
在第一旋盖离心管中移取其上清液于容积为1.8mL的第三旋盖离心管中，在第二旋盖离心管中移取其上清液于容积为1.8mL的第四旋盖离心管中。分别向第三旋盖离心管和第四旋盖离心管中加入150mg无水硫酸镁及25mgPSA吸附剂，所述第三旋盖离心管和所述第四旋盖离心管经过第四漩涡振荡混合2min，2000r/m，然后6000r/m高速离心2min；吸取上清液经有机相滤膜过滤，移取200μL滤液，并用超纯水稀释定容到1mL后待测。
烟气气相物的处理方法：直接吸取收集烟气吸收瓶的乙腈1mL于1.8mL旋盖色谱瓶，直接进入LC-MS/MS分析。
3、LC-MS/MS条件
色谱条件：Atiantis UPLC HSS T3(100mm×2.1mm，1.8μm)；流动相A：水(含0.1％甲酸，体积分数)，流动相B：甲醇(含0.1％甲酸，体积分数)；流速0.4mL/min；柱温35℃；进样量2μL。梯度洗脱条件：梯度洗脱条件：0～2min，90％A～50％A；2～2.4min，50％A～30％A；2.4～4.0min，30％A～20％A；4.0～6.0min，20％A～5％A；6.0～9.8min，5％A～5％A；9.8～10.0min，5％A～90％A；10.0～12.0min，90％A～90％A。
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，喷雾电压(IS)：2.6kV；离子化温度350℃；雾化气流量：1000L/Hr；锥孔气(cone)流量50L/Hr；碰撞气流量为0.15ml/min；碰撞气为氩气，其余气体为氮气；驻留时间为30msec，正离子MRM模式采集，监测离子对及其相应的碰撞能量(CE)见表1。
表1多反应监测模式下五种农药及其内标的部分质谱参数
注：*为定量离子对。
4、烟气转移率研究
加标样品的农残转移率研究：选取两个不同焦油释放量卷烟(1号标烟：8.89mg；2号标烟：11.05mg)，挑选重量和吸阻合格的烟支，分别向其中加入各农药标样40μL混合标准储备液，用微量注射器均匀注射，将加标卷烟置于温度为(22±1)℃，湿度为(60±3)％的环境中平衡48小时，按照GB/T16450调整检查吸烟机抽吸参数，留取每轮烟蒂和烟灰，分别放入50mL旋盖离心管中，烟蒂包含滤嘴和烟丝；用剑桥滤片收集主流烟气总粒相物，然后将捕集过烟气总粒相物的滤片取下用脱脂棉擦洗捕集器内壁合并放入50mL旋盖离心管中；用20mL乙腈(预先加入100μL内标)吸收主流烟气气相物。按照上面的处理方法分别处理捕集过烟气总粒相物的滤片、滤嘴、烟蒂烟丝、烟灰以及烟气气相物，并引入LC-MS/MS分析测定。
自制卷烟样品的转移率研究：选取国内外烟叶样品63个，利用建立的方法测定烟叶中的五种杀菌剂截留量，选取截留量较高的烟叶样品6个，利用小型卷烟机切丝并卷制卷烟，挑选重量合格的烟支，将卷烟置于温度为(22±1)℃，湿度为(60±3)％的环境中平衡48小时，按照GB/T16450调整检查吸烟机抽吸参数，用剑桥滤片收集主流烟气总粒相物，然后将捕集过烟气总粒相物的滤片取下用脱脂棉擦洗捕集器内壁合并放入50mL旋盖离心管中；留取每轮烟蒂(包含滤嘴和烟丝)，分别放入50mL旋盖离心管中。按照上面的处理方法分别处理捕集过烟气总粒相物的滤片和滤嘴，并引入LC-MS/MS分析测定。
采用针泵注射(5μL/min)对目标物单独进样，将五种农药及内标(0.5μg/mL)的标准溶液进行全扫，得到最大响应值的准分子离子[M+H]+为母离子，通过优化喷雾电压、锥孔电压、碰撞能等参数使得母离子强度最大。在子离子扫描(PI)模式下，调整CE找到该母离子对应的子离子，其中响应最高的锥孔电压和碰撞能量见表1。加标样品的选择离子流色谱图如图1所示。
标准曲线和检出限
分别移取混合标准储备液0μL，25μL，50μL，100μL，250μL，500μL，1000μL和2500μL混合标液工作液到8个10mL容量瓶中，每个容量瓶移入100μL内标工作液(10μg/mL)，配制成溶剂配制标准工作曲线。基质匹配标准曲线的配制方法为分别移取200μL每个标准工作曲线溶液于8个1.8mL旋盖色谱瓶，加入200μL空白烟叶样品萃取液，用乙腈定容至1mL，各杀菌剂的线性范围见表2。分别对这些标准溶液进行UPLC-MS/MS分析，并对各标样峰面积与内标的峰面积的比值(y)和其浓度(x)进行线性回归分析，得到标准曲线，各化合物线性关系良好(相关系数r≥0.99)，可以满足定量分析的需要。以3倍信噪比确定方法的检出限，各个基质中五种杀菌剂的LOD范围为0.325-1.551ng/cig(表2)。
表2五种农药的线性范围、检出限和定量限
5、方法的回收率
采用直线型吸烟机抽吸卷烟后，分别向各个部分添加的混合标准溶液，分别按照“2、样品的提取和净化”的方法处理样品后上机检测，然后分别计算主流烟气总粒相物、气相物、滤嘴、烟蒂中烟丝和烟灰的回收率。每个水平测5次，得出平均回收率(表3)。如表3所示，五种农药平均回收率在90.9－111.8％之间，其中回收率高低为气相物>烟灰>滤嘴>烟蒂中烟丝>主流，RSD范围为1.3％-10.1％。
表3主流烟气总粒相物(滤片)、滤嘴、烟蒂中烟丝、烟灰和气相物中五种农药的回收率和RSD(n＝5)
6、标准卷烟加杀菌剂标准品样品的烟气转移率研究
通过不同焦油释放量的标准卷烟样品中加入五种杀菌剂标准品进行转移率测定，分别计算五种杀菌剂向主流烟气总粒相物、气相物、滤嘴、烟蒂烟丝和烟灰中的转移率，如表4所示。从表4可以看出，五种杀菌剂向主流烟气总粒相物、滤嘴和烟蒂烟丝中均有不同程度的转移，而烟灰和主流烟气气相物中基本没有农药转移。主流烟气总粒相物中除多菌灵的转移率较低(<5％),其它四种杀菌剂的转移率菌接近或超过30％。主要原因可能是多菌灵遇热(温度>306℃)易分解成其它化合物，从而导致滤嘴和烟气中多菌灵的转移率较低。不同焦油量的卷烟添加农药标准品后，农药的转移率有所不同，1号标烟(焦油8.89mg)中，烟气转移率最高的指标为三唑醇；2号标烟(焦油11.05mg)中烟气转移率最高的指标为霜霉威；滤嘴的转移率基本都在10％左右。可能的原因是不同的焦油释放量的卷烟，滤嘴和卷烟纸的通风率有所不同，这也可能导致杀菌剂向烟气和滤嘴的转移率发生变化。
表4加标样品中五种杀菌剂向主流烟气总粒相物(滤片)、气相物、滤嘴、烟灰和烟蒂烟丝中转移率
注：n.d.表示未检出。
7、高杀菌剂截留量烟叶卷制样品的转移率
挑选的6个农药截留量较高的烟叶样品，利用小型卷烟机，切丝卷制自制卷烟，按照标准方法抽吸卷烟，由于标烟加标样品的转移率研究表明五种杀菌剂基本不向烟灰和主流烟气气相物中转移，烟蒂中残留烟丝对五种杀菌剂的截留也较低，个别指标在烟蒂烟丝中有一定截留量，可能是由于向烟丝中加入标准品的过程中人为加入引起的，因此只选取滤片捕集主流烟气总粒相物和收集滤嘴，分别计算五种杀菌剂向主流烟气总粒相物和滤嘴中的转移率，如表5所示。
从表5可以看出，实际样品中农药向烟气总粒相物和滤嘴的转移率普遍较低，除一个样品的三唑酮转移率大于20％，其它样品的各个指标转移率都低于20％。这与实际样品加标实验的转移率进行比较差异较大，主要原因可能是成品卷烟烟支加入标准品后，虽然有经过48小时的平衡，但是标准品一般会分散在烟叶的表面，基本不会渗入细胞间隙或者进入细胞中，卷烟在燃吸的过程中，添加在烟丝表面的杀菌剂标准品可能会通过热蒸馏作用进入成为气体，通过滤嘴，从而进入卷烟主流烟气总粒相物。而多菌灵、稻瘟灵、三唑醇和三唑酮作为内吸性强的杀菌剂，主要是通过进入植物组织或细胞产生作用，霜霉威为局部内吸性杀菌剂，施用后也会进入植物组织或细胞，由于此类结合较为紧密，或者深入植物组织或细胞内部，在卷烟的燃烧过程中，不容易被热蒸馏出来，一般可能会通过高温分解或者直接生成其它物质。
表5自制高残留样品中五种杀菌剂向主流烟气总粒相物和滤嘴中的转移率
注：n.d.表示未检出。
本实施例对烟草中常用杀菌剂残留进行同时快速分析，采用基质分散固相萃取法提取捕集过烟气总粒相物的滤片、滤嘴、烟蒂烟丝和烟灰，内标定量，UPLC-MS/MS分析检测，总分析时间为12min。建立的方法分析时间短，灵敏度高，应用此方法研究加标卷烟样品和自制卷烟样品五种杀菌剂的烟气转移率。结果表明，主流烟气气相物和烟灰中未见杀菌剂转移，不同种类杀菌剂的转移率差异较大；加标卷烟中除多菌灵外，其它四种杀菌剂的转移率达到30％；自制卷烟中，杀菌剂的烟气转移率普遍低于20％。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法，所述烟蒂包括滤嘴和残留烟丝，所述杀菌剂为多菌灵、霜霉威、稻瘟灵、三唑醇和三唑酮中的一种或多种，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a)根据ISO 8243:2006来选取样品烟支,按照ISO 3402:1999来平衡烟支；采用ISO标准抽吸模式(ISO 3308:2000)来抽吸5支卷烟，收集抽吸卷烟后的烟蒂；
步骤b)将烟蒂中的滤嘴和烟丝进行拆分,分别提取；
将卷烟烟丝合并放入第一旋盖离心管中，加入超纯水，静置充分浸润，向第一离心管中加入乙腈和内标，第一涡旋震荡，完成后冷冻保存；
将滤嘴分为多瓣，合并放入第二旋盖离心管中，向离心管中加入甲醇，振荡到样品被甲醇充分浸润，静置，向第二离心管中加入内标，第二涡漩振荡，完成后冷冻保存；
步骤c)经过涡漩振荡冷冻后的第一旋盖离心管和第二旋盖离心管中分别依次加入无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠，第三次涡旋振荡后离心，离心完成后冷冻保存；
步骤d)N-丙基乙二胺(PSA)纯化：
在第一旋盖离心管中移取其上清液于第三旋盖离心管中，在第二旋盖离心管中移取其上清液于第四旋盖离心管中，分别向第三旋盖离心管和第四旋盖离心管中加入无水硫酸镁及PSA吸附剂，第四次漩涡振荡混合，然后高速离心；吸取上清液经有机相滤膜过滤，移取滤液，并用超纯水稀释定容后待测；
步骤e)配制标准溶液
分别准确称取杀菌剂标准品,精确至0.0001g，用乙腈溶解定容，制得单一标准储备液；
用乙腈准确配制混合标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，冷冻保存备用；
稀释混合标准储备液得到混合标准工作液，储存于棕色玻璃瓶中，冷冻保存备用；
准确配置TPP内标标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，冷冻保存；取一定量的内标标准储备液，用乙腈稀释定容，制得内标工作液；
所有的冷冻的储备液使用前将其恢复到室温；
步骤f)LC-MS/MS分析测定
色谱条件：Atiantis UPLC HSS T3(100mm×2.1mm，1.8μm)；流动相A：体积分数为0.1％的甲酸水溶液，流动相B：体积分数为0.1％的甲酸甲醇溶液；流速0.4mL/min；柱温35℃；进样量2μL；
梯度洗脱条件：0～2min，90％A～50％A；2～2.4min，50％A～30％A；2.4～4.0min，30％A～20％A；4.0～6.0min，20％A～5％A；6.0～9.8min，5％A～5％A；9.8～10.0min，5％A～90％A；10.0～12.0min，90％A～90％A；
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，喷雾电压(IS)：2.6kV；离子化温度350℃；雾化气流量：1000L/Hr；锥孔气(cone)流量50L/Hr；碰撞气流量为0.15ml/min；碰撞气为氩气，其余气体为氮气；驻留时间为30msec，正离子MRM模式采集。
2.根据权利要求1所述的烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法，其特征在于，所述冷冻温度为-20℃。
3.根据权利要求1所述的烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法，其特征在于，所述单一标准储备液的浓度为1.0mg/mL；所述混合标准储备液中，霜霉威：0.20mg/mL、多菌灵和稻瘟灵：0.04mg/mL、三唑醇和三唑酮：0.10mg/mL；所述混合标准工作液中，霜霉威：0.020mg/mL；多菌灵和稻瘟灵：0.004mg/mL；三唑醇和三唑酮：0.010mg/mL。
4.根据权利要求1所述的烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法，其特征在于，所述内标标准储备液为0.99mg/mL TPP。
5.根据权利要求1所述的烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法，其特征在于，所述第一旋盖离心管的容积为50mL；所述第二旋盖离心管的容积为50mL；所述第三旋盖离心管的容积为1.8mL，所述第四旋盖离心管的容积为1.8mL。
6.根据权利要求7所述的烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法，其特征在于，所述第一旋盖离心管中加入超纯水的体积为10mL，静置浸润的时间为10min；加入乙腈和内标的体积分别为10mL和100μL；所述第二离心管中加入甲醇和内标的体积分别为20mL和200μL；所述内标浓度为10μg/mL。
7.根据权利要求1所述的烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法，其特征在于，所述第一涡旋震荡速率为2000r/m，时间为2min；所述第二涡旋震荡速率为2000r/m，时间为5min；所述第三涡旋震荡速率为2000r/m，时间为2min；所述第四涡旋震荡速率为2000r/m，时间为2min。
8.根据权利要求1所述的烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法，其特征在于，步骤(c)中，依次加入的无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸二氢钠的质量分别为4g、1g、1g和0.5g。
9.根据权利要求1所述的烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法，其特征在于，步骤(d)中，加入无水硫酸镁及PSA吸附剂的质量为150mg和25mg。
10.根据权利要求1所述的烟蒂中杀菌剂截留量的检测方法，其特征在于，步骤(e)中，移取滤液体积为200μL，加入超纯水定容到1mL。
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